Papel de cepas de Streptococcus mutans e Bifidobacterium spp. na etiologia ou proteção contra doenças bucais

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Data

2016-03-17

Autores

Argandoña Valdez, Remberto Marcelo [UNESP]

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

A boca é um ecossistema complexo composto por centenas de espécies microbianas que apresentam características genotípicas e fenotípicas distintas que permitem sua adaptação e sobrevivência às adversidades desse ambiente. Streptococcus mutans é a espécie bacteriana mais relacionada à etiologia da cárie dentária, devido principalmente ao seu potencial acidogênico, acidúrico e na aderência e formação de biofilme dental. Outras espécies bacterianas, como as bifidobactérias, foram detectadas em diversos sítios bucais incluindo lesões cariosas iniciais ou cavitadas e estão sendo relacionadas à etiologia da cárie precoce da infância (CPI). Contrariamente, efeito benéfico na prevenção da doença periodontal tem sido observado para as bifidobactérias pelo fato dessas espécies competirem e interferirem na aderência e formação do biofilme de patógenos periodontais. Assim, ambiguidade em relação ao papel das bifidobactérias na etiologia ou prevenção de doenças bucais está sendo observada na literatura. Este trabalho foi dividido em três capítulos. Os objetivos foram: 1) avaliar a diversidade genotípica e as características fenotípicas de cepas de S. mutans, isoladas do biofilme dental de crianças CPI e CPI-severa (CPI–S) em comparação com crianças livres de cárie (LC); 2) avaliar a capacidade de produzir e tolerar ácidos, de formar biofilme e de induzir lesões iniciais de cárie in vitro por espécies de bifidobactérias comparadas à de espécies bacterianas já reconhecidas no contexto da cárie dentária e 3) investigar o efeito antagonista in vitro de algumas espécies de bifidobactérias sobre biofilmes de Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis e Streptococcus oralis. No capítulo 1, cepas de S. mutans de amostras de biofilme de crianças com CPI, CPI-S e LC foram isoladas em meio Agar Mitis Salivarius com bacitracina e avaliadas geneticamente pelo método de AP-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase usando Iniciadores Arbitrários) e fenotipicamente pelos métodos de acidogenicidade, verificando o pH final das culturas após exposição a alta concentração de glicose; de aciduricidade, medida pelo crescimento bacteriano após exposição à pHs ácidos e de formação de biofilme in vitro com a quantificação da biomassa do biofilme em leitor de ELISA. No Capítulo 2, as seguintes espécies bacterianas foram incluídas: Bifidobacterium lactis, B. longum, B. animalis, B. dentium, S. mutans, S. sobrinus, Lactobacillus acidophilus, L. casei e Actinomyces israelli. Para avaliação do potencial cariogênico dessas espécies bacterianas foram realizados os testes de acidogenicidade, aciduricidade, formação de biofilme in vitro e ensaios de indução de lesão de cárie inicial em dentes bovinos verificando a dureza superficial do esmalte em microdurômetro. Os ensaios de biofilme e de indução de lesão de cárie foram realizados com todas as espécies isoladas ou combinadas com S. mutans ou S. mutans/S.sobrinus. No capítulo 3, os periodontopatógenos F. nucleatum, P. gingivalis e uma espécie da microbiota bucal indígena, S. oralis, foram cultivados em microplacas para formar biofilmes na presença de B. longum, B. lactis, B. infantis, isoladamente ou em combinação. A capacidade de competição dessas espécies foi avaliada por meio das contagens das bactérias após 24, 72 e 168 h de crescimento empregando a técnica de checkerboard DNA-DNA hybridization. Os resultados do capítulo 1 mostraram que não houve diferença na diversidade genotípica nem na capacidade acidogênica de cepas de S. mutans obtidas de crianças CPI e CPI-S em comparação com aquelas isoladas de crianças LC. Os genótipos de S. mutans de CPI-S formaram mais biofilmes e foram mais tolerantes a ácidos que os isolados LC. Com relação ao capítulo 2, B. animalis e B. longum foram as espécies mais acidogênicas e acidúricas, comparáveis à S. mutans e L. casei. Todas as espécies tiveram um aumento significativo na biomassa do biofilme quando combinados com S. mutans ou com S. mutans/S. sobrinus. A maior perda de esmalte superficial foi produzida quando B. longum ou B. animalis foram inoculados com S. mutans ou S. mutans/S. sobrinus. No capítulo 3, os resultados mostraram que B. infantis e B. lactis tiveram um melhor efeito antagonista sobre crescimento de F. nucleatum (24h e 72h) e P. gingivalis (168 horas) e não apresentaram influência sobre o crescimento de S. oralis (168 horas). Conclui-se que a tolerância ácida parece ser o fator de virulência de S. mutans mais importante para a patogênese da cárie precoce da infância. Assim como as bactérias cariogênicas, B. longum e B. lactis apresentam potencial acidogênico e acidúrico e também capacidade de formar biofilmes e induzir a desmineralização de esmalte em associação com S. mutans. Enquanto, B. lactis e B. infantis exerceram efeito inibitório sobre o crescimento de patógenos periodontais.
The mouth is a complex ecosystem composed of hundreds of microbial species with different genotypic and phenotypic characteristics that allow their adaptation and survival in the adversity of that environment. Streptococcus mutans is the bacterial species more closely related to the etiology of dental caries, mainly due to its acidogenic and aciduric potential and adherence and formation of dental biofilm. Other bacterial species, such as bifidobacteria, have been detected in oral sites including initial and cavitated carious lesions and have been related to the etiology of early childhood caries (ECC). In contrast, beneficial effect of bifidobacteria in the prevention of periodontal disease has been observed because they compete and interfere with the adherence and biofilm formation by periodontal pathogens. Thus, ambiguity regarding the role of bifidobacteria in the etiology or prevention of oral diseases has been observed in the literature. This work was divided into three chapters. The objectives were: 1) to evaluate the genotypic diversity and phenotypic characteristics of S. mutans strains isolated from dental biofilm of ECC and severe-ECC (S-ECC) children compared to caries-free children (CF); 2) to evaluate the ability to produce and tolerate acids, to form biofilm and inducing in vitro initial carious lesions by species of bifidobacteria compared to the bacterial species already recognized in the context of dental caries and 3) to investigate the in vitro antagonistic effect of some bifidobacteria species on biofilms of Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis and Streptococcus oralis. In Chapter 1, S. mutans strains from biofilm samples of children with ECC, S-ECC and CF were isolated in Agar Mitis Salivarius with bacitracin and genetically evaluated by AP-PCR method (Arbitrary Primers - Polymerase Chain Reaction) and phenotypically by acidogenicity methods, verifying the final pH of the cultures after exposure to high glucose concentration; aciduricity, measured by bacterial growth after exposure to acid pH and in vitro biofilm formation by means the quantification of the biofilm biomass in ELISA reader. In Chapter 2, the following bacterial species were included: Bifidobacterium lactis, B. longum, B. animalis, B. dentium, S. mutans, S. sobrinus, Lactobacillus acidophilus, L. casei and Actinomyces israelli. Acidogenicity, aciduricity and biofilm formation assays were performed for evaluating the cariogenic potential of these bacterial species and initial caries lesion induction tests on bovine teeth for checking the surface enamel hardness in microdurometer. Biofilm formation and carious lesion induction assays were performed with all species either alone or in combination with S. mutans or S. mutans / S.sobrinus. In Chapter 3, the periodontal pathogens F. nucleatum, P. gingivalis and a species of indigenous oral microbiota, S. oralis, were cultured in microtiter plates to form biofilms in the presence of B. longum, B. lactis, B. infantis, either alone or in combination. The competition ability of these species was assessed by bacterial counts after 24, 72 and 168 h of growth using the DNA-DNA hybridization checkerboard technique. Results from Chapter 1 showed no difference in the genotypic diversity or acidogenic ability of S. mutans strains collected from ECC and S-ECC children compared to those from CF children. The genotypes of S. mutans formed higher biofilm biomasses and were more tolerant to acids than those isolated from CF. With respect to chapter 2, B. animalis and B. longum were the most acidogenic and aciduric species, comparable to S. mutans and L. casei. All species had a significant increase in biomass of biofilm when combined with S. mutans or S. mutans / S. sobrinus. The greatest loss of surface enamel was produced when B. longum or B. animalis were inoculated with S. mutans or S. mutans / S. sobrinus. In Chapter 3, the results showed that B. infantis and B. lactis had a better antagonistic effect on F. nucleatum (24h and 72h) and P. gingivalis (168 hours) growth and showed no influence on the growth of S. oralis (168 hours). It is concluded that acid tolerance seems to be the most important virulence factor of S. mutans for the pathogenesis of early childhood caries. As well as the cariogenic bacteria, B. longum and B. lactis have acidogenic and aciduric potential and also ability to form biofilms and induce enamel demineralization in association with S. mutans. While B. infantis and B. lactis presented inhibitory effect on the growth of periodontal pathogens.

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Palavras-chave

Probióticos, Bifidobacterium, Biofilme, Acidogenicidade, Aciduricidade, Checkerboard DNA-DNA Hybridization, Cárie precoce da infância, Streptococcus mutans, Diversidade genotípica, Probiotics, Biofilm, Acidogenicity, Aciduricity, Early childhood caries, Genotypic diversity

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