Caracterização dos biofilmes de dermatófitos e desenvolvimento de protótipos anti-dermatófitos nas formas planctônica e biofilme

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Data

2016-02-26

Autores

Costa-Orlandi, Caroline Barcelos [UNESP]

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Editor

Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

Dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir os tecidos queratinizados do homem e dos animais, produzindo a dermatofitose. Biofilmes são comunidades estruturadas de microrganismos que se agrupam de maneira organizada a uma superfície ou que se aderem uns aos outros, dentro de uma matriz extracelular que eles mesmos produzem. Pela primeira vez, neste trabalho, foi descrita a formação de biofilmes por isolados clínicos e cepas ATCC de dermatófitos. Também se avaliou a sensibilidade das cepas frente aos antifúngicos convencionais e derivados sintéticos do ácido protocatecuico, determinando sua toxicidade e eficiência, tanto nas formas planctônicas como de biofilme. A identificação molecular dos isolados clínicos mostrou concordância com a identificação convencional. Todas as cepas e isolados foram capazes de formar biofilmes nos quatro meios testados. Trichophyton. rubrum ATCC 28189, ATCC MYA-4438, T. rubrum 143 e Trichophyton. mentagrophytes 66 produziram mais biomassa e matriz extracelular que T. mentagrophytes ATCC 11481 (p<0.05). RPMI 1640, BHI e DMEM estimularam maior produção de biomassa e matriz extracelular que o meio de queratinócitos. Todas as espécies foram capazes de formar biofilmes maduros em 72 h e uma rede de hifas circundadas em vários pontos por uma matriz extracelular foi mostrada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Na microscopia confocal, aparentemente os meios RPMI e DMEM produziram biofilmes mais espessos e o meio BHI, biofilmes mais densos e compactos. As melhores atividades anti-dermatófitos foram expressas pelos protocatecuatos de butila, pentila, hexila, nonila e decila, que exibiram baixa toxicidade para as células HaCat, NHOK e HepG2 nas regiões da concentração inibitória mínima (CIM). Nonila foi o composto com melhor índice de seletividade para as células HaCat e HepG2; para as células NHOK os compostos mais seletivos foram hexila e nonila. Fluconazol, griseofulvina, terbinafina e nonila inibiram o crescimento das células planctônicas para todas as cepas. No entanto, os biofilmes pré-formados foram resistentes a todos os fármacos, com exceção do composto nonila. As células em formato biofilme foram mais resistentes aos antifúngicos que as células planctônicas. A maioria dos biofilmes tratados teve redução da espessura quando comparada ao não tratado. Nenhum biofilme tratado apresentou 100% de morte celular. Na sequência deste estudo, foi verificado o potencial antifúngico in vitro de nanopartículas de óxido nítrico (NO-np) e de efinaconazol a 10% (Jublia®) contra as formas planctônicas e biofilmes de T. rubrum (cepa MYA-4438 ATCC e um isolado clínico). As NO-np foram capazes de inibir in vitro, o crescimento de T. rubrum. O efinaconazol foi o fármaco que melhor inibiu o crescimento de T. rubrum, seguido pela terbinafina e o fluconazol. As combinações, entre as NO-np, o efinaconazol e a terbinafina produziram interações sinérgicas. A combinação entre as NO-np e o efinaconazol teve um comportamento fungistático na cepa ATCC de T. rubrum. As NO-np não apresentaram toxicidade para as células HaCat. Todos os fármacos testados foram capazes de inibir o crescimento das células planctônicas de T. rubrum; já as NOnp não foram capazes de inibir o crescimento e reduzir a atividade metabólica. Os biofilmes pré-formados foram resistentes a todos os fármacos testados, porém, o biofilme formado pelo isolado clínico de T. rubrum foram sensíveis às NO-np na concentração de 40 mg/mL. Já os biofilmes da cepa ATCC foram resistentes à mesma concentração de nanopartículas. A grande maioria dos resultados da MEV dos biofilmes tratados foi concordante aos resultados mostrados pelo ensaio de redução do XTT. Os tratamentos com o efinaconazol e as NO-np causaram diminuição das espessuras dos biofilmes formados pelo isolado clínico e pela cepa ATCC. Esses resultados representam um avanço para a pesquisa no campo dos dermatófitos e de biofilmes e podem contribuir de maneira significativa para a pesquisa de novos fármacos para o tratamento dessas micoses.
Dermatophytes are fungi that have the ability to invade keratinized tissues of human and animals, producing a condition called dermatophytosis. Biofilms are structured microbial communities that are organized by adhering to a surface, as well as to each other via an extracellular polymeric matrix. For the first time, in this work, the biofilm formation by ATCC strains and clinical isolates of dermatophytes was described. Also, the susceptibilities of the strains to conventional antifungal drugs and to the synthetic derivatives of protocatechuic acid were evaluated, determining its toxicity and efficacy. The molecular identification corroborated with the conventional one. All strains were able to form biofilms in the four media tested. Trichophyton. rubrum ATCC 28189, Trichophyton. mentagrophytes 66, and T. rubrum 143 produced more biomass, polysaccharide structures and extracellular matrix than T. mentagrophytes ATCC 11481 (p <0.05). RPMI 1640, BHI and DMEM stimulated increased production of biomass and extracellular matrix when compared to the medium for keratinocytes. All species were able to form mature biofilms in 72 hours. The SEM results showed a coordinated network of hyphae in all directions, surrounded by an extracellular matrix. In confocal microscopy, apparently RPMI and DMEM media produced thicker biofilms, while the BHI produced denser and compact biofilms. The greatest antidermatophytes activities were expressed by butyl, pentyl, hexyl, nonyl and decyl, protocatechuates, which exhibit low toxicity to HaCat, HepG2 and NHOK cells in the regions of minimal inhibitory concentrations (MIC). Nonyl was the compound with improved selectivity index for HaCat and HepG2 cells; for NHOK cells, the most selective compounds were nonyl and hexyl. Fluconazole, griseofulvin, terbinafine and nonyl inhibited the growth of planktonic cells for all strains. However, the pre-formed biofilms were resistant to all antifungal drugs tested except to the nonyl compound. The cells in biofilm form were more resistant to antifungal drugs than planktonic cells. Most of treated biofilms had reduced thickness when compared to the untreated biofilms. In the sequence of this study, the in vitro antifungal activity of nitric oxide nanoparticles (NO-np) and efinaconazole 10% (Jublia®) was checked against planktonic and biofilm forms of T. rubrum (strain ATCC MYA-4438 and one clinical isolate). The NO-np was able to inhibit the in vitro's growth of T. rubrum. Efinaconazole was the best drug able to inhibit the growth of T. rubrum, followed by terbinafine and fluconazole. The combinations between NO-np, efinaconazole and terbinafine, produced synergistic interactions. The combination between NO-np and efinaconazole was fungistatic against the ATCC strain of T. rubrum. The NO-np showed no toxicity to HaCat cells. Both clinical isolate and the ATCC strain ATCC MYA-4438 were able to form biofilms and 72 hours was the ideal time for biofilm maturation. The biofilms formed by ATCC strain produced more biomass than the clinical isolate. All the antifungal drugs tested were able to inhibit the growth of planktonic cells of T. rubrum; the NO-np concentrations in which the reading on the spectrophotometer was possible, were not able to inhibit growth and to reduce the metabolic activity. The pre-formed biofilms were resistant to all tested drugs; however, the biofilms formed by the clinical isolate were susceptible to NO-np in a concentration of 40 mg/ml. The biofilms formed by the ATCC strain were resistant to the same concentration of nanoparticles. The vast majority of the SEM results of the treated biofilms were consistent with the results shown by the XTT reduction assay. Treatments with efinaconazole and NO-np reduced the thickness of the biofilms formed by the clinical isolate and by ATCC MYA-4438 strain. These results represent an advance for the research in biofilms field and can contribute significantly to the research of new drugs for the treatment of dermatophytosis.

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Palavras-chave

Dermatófitos, Biofilmes, Ácido protocatecuico, Nanopartículas de óxido nítrico, Efinaconazol, Dermatophytes, Biofilms, Protocatechuic acid, Nitric oxide nanoparticles, Efinaconazole

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