Dissertações - Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

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    Análise do potencial antifúngico e antibiofilme de peptídeos antimicrobianos frente ao Histoplasma capsulatum e análise toxicológica de um derivado de mastoparano
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-06-27) Carvalho, Angélica Romão; Fusco-Almeida, Ana Marisa [UNESP]; Gomes, Paulo César; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A histoplasmose é uma doença que afeta gravemente populações imunossuprimidas, cujo tratamento apresenta opções farmacológicas limitadas com efeitos adversos consideráveis. O seu agente etiológico, Histoplasma capsulatum, distribui-se globalmente e de forma endêmica pelo território brasileiro. Ademais este fungo possui a habilidade de formar biofilmes, estruturas que intensificam a gravidade das infecções causadas por ele. No presente trabalho, cinco peptídeos antimicrobianos foram testados frente ao fungo. Três derivados de mastoparano e dois derivados de moricin C3 foram testados contra as formas planctônica e de biofilme das cepas G186A e EH-315 de H. capsulatum. O peptídeo MK58911, apresentou a melhor performance, causando a inibição da biomassa dos biofilmes em ambas as cepas de H. capsulatum. Observou-se 33,8% de inibição com 31,2 μg/mL para a cepa G186A e 32,9% com 125 μg/mL para a cepa EH-315. Quanto a viabilidade metabólica nenhum dos peptídeos testados, incluindo o MK58911, foi capaz de afetá-la em nenhuma das formas fúngicas. A análise da atividade sinérgica entre o MK58911 e o itraconazol frente ao biofilme revelou a existência de atividade aditiva entre as moléculas, com valores de ICIF de 0,53 para a cepa G186A e 0,62 para a cepa EH-315. A toxicidade do MK58911 foi analisada em diversos modelos. Para a linhagem celular A549, foram determinados os valores de IC50 de 292 μg/mL para a monocamada e 500 μg/mL para os esferóides. Em modelo alternativo Tenebrio molitor não foi observada toxicidade em nenhuma das doses analisadas (10, 50 e 100 mg/Kg). No entanto, o mesmo peptídeo mostrou-se embriotóxico e teratogênico em modelo Danio rerio, para o qual encontrou-se um valor de LC50 de 6,9 μg/mL. Ademais observou-se diminuição na movimentação espontânea (em 15,6 e 7,8 μg/mL) e na frequência cardíaca (em 15,6; 7,8 e 3,9 μg/mL) dos embriões. Finalmente, realizou-se a cromatografia de afinidade com extrato proteico total de H. capsulatum em coluna acoplada com o peptídeo MK58911. Nas alíquotas eluidas analisadas por SDS-PAGE, observou-se duas bandas diferenciais possivelmente relacionadas a interação entre proteínas do extrato e o peptídeo MK58911, podendo ser estas, indicativos para a explicação dos mecanismos exercidos por este peptídeo.
  • ItemDissertação de mestrado
    Avaliação de isolados bacterianos a partir de hamsters sírios (Mesocricetus auratus) antes e após a infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-29) Oliveira, Cintia Marcelo de; Pinto, Mara Cristina [UNESP]; Souza Neto, Jayme Augusto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os flebotomíneos são insetos dípteros hematófagos, pertencentes à subfamília Phlebotominae, responsáveis por transmitirem o protozoário do gênero Leishmania (Trypanosomatidae), agente etiológico das leishmanioses. Estima-se que anualmente surjam entre 700.000 a 1 milhão de novos casos ao redor do mundo dessa parasitose. Durante o ano de 2020, a forma visceral da doença (LV) esteve presente em 10 países, totalizando 90% dos casos, dos quais 97% concentrados no Brasil. Em relação à leishmaniose tegumentar (LT), forma mais comum da doença, estima-se que 85% dos casos globais estejam concentrados em 10 países, dos quais, 15.484 são pertencentes ao Brasil. Uma das abordagens para o monitoramento e/ou controle dos insetos hematófagos é o estudo dos compostos orgânicos voláteis (COV) envolvidos na comunicação entre o hospedeiro e o inseto, denominados de cairomônios. Além disso, tem-se diferenças individuais na composição e concentração dos cairomônios o que, consequentemente, influencia na atratividade dos insetos. Estudos recentes têm apontado que hospedeiros infectados com parasitas, como Plasmodium spp e Leishmania infantum, podem ser mais atrativos para os insetos que os não infectados. Uma hipótese que explicaria tais alterações no padrão de voláteis emitidos é a microbiota da pele, que contém diversas espécies e cepas de bactérias capazes de produzir mais de 350 compostos voláteis diferentes. O presente projeto teve por objetivo avaliar as alterações causadas na microbiota das patas de hamsters sírios (Mesocricetus auratus) antes e após a infecção por L. amazonensis, assim como os voláteis produzidos por meio de isolamento e sequenciamento das bactérias cultiváveis, assim como os voláteis produzidos. Através da biblioteca Blastn (NCBI), foi possível identificar os gêneros das bactérias cultivadas (Bacillus e Staphylococcus), todas gram positivas. Além disso, foram realizados ensaios de microextração em fase sólida acoplado à cromatografia gasosa (CG-EM) para a identificação dos voláteis produzidos pelas bactérias cultivadas. Em relação aos compostos voláteis, foram identificados 46, com destaque para o ciclooctatetraeno, biomarcador para a bactéria Staphylococcus aureus e piridina-3-carboxilato de metila, volátil que indicou a presença de bactérias do gênero Mycobacterium, potencial agravadora das lesões leishmanióticas. Através do sequenciamento genético confirmou-se a presença dos gêneros Staphylococcus spp. e Bacillus spp. nos animais saudáveis e infectados, ambos pertencentes a classe Bacilli. O estudo demonstra, portanto, a associação existente entre a liberação de diferentes COV a partir de diferentes gêneros de bactérias. Além disso, destaca-se a presença frequente do gênero Staphylococcus na pele do hospedeiro, considerada uma bactéria oportunista, capaz de, ao adentrar o organismo do hospedeiro, criar biofilmes resistentes à ação de antibióticos. Deste modo, a identificação, o entendimento e a compreensão dos COV emitidos pela microbiota presente na pele de diferentes indivíduos se fazem necessárias, uma vez que podem servir como iscas atrativas passíveis de serem aplicadas no monitoramento ou controle destes insetos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Cruzipaína (Czp1) como bioindicador no diagnóstico de Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) em suco de açaí (Euterpe oleraceae) por ensaio Imunoenzimático
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-15) Garcia, Alef Henrique; Rosa, João Aristeu da; Costa, Paulo Inácio da; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A doença de Chagas é uma enfermidade infecciosa que afeta principalmente populações carentes em países menos desenvolvidos. É endêmica em 21 países das Américas, atingindo cerca de 6 a 7 milhões de pessoas e causando uma média de 14.000 mortes anualmente. O agente causador é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, que é veiculado por triatomíneos, insetos hematófagos conhecidos como "barbeiros". Este estudo teve como objetivo avaliar as proteínas secretadas pela cepa Y (TcII) de T. cruzi em sua forma tripomastigota em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para tanto, técnicas de biologia molecular e bioquímica foram utilizadas para identificar a cisteína protease cruzipaína por anticorpos e analisar a quantidade secretada em suco de açaí por meio de Western blot. A solução de formas tripomastigotas em PBS foi utilizada como padrão para verificar se a quantidade secretada de cruzipaína era suficiente para um teste imunoenzimático. Utilizou-se o plasmídeo pET21a contendo o gene da cisteína protease natural cruzipaína Wild Type (W.T), com uma cauda His6-tag, transformado para expressão em E. coli resistente à ampicilina como controle positivo. Para a metaciclogênese induzida in vitro, utilizou-se a cepa Y de T. cruzi e camundongos heterogênicos machos da linhagem Swiss. Os animais com parasitemia alta foram eutanasiados para coleta de sangue, que foi cultivado em meio LIT. A cruzipaína recombinante expressa em Bl21 foi confirmada por Western blot com banda de 37 kDa. Os dados apresentados indicam que o método utilizado para expressar a cruzipaína em Bl21 foi eficiente, produzindo uma quantidade satisfatória de secretomas. As etapas foram consideradas efetivas para alcançar esse resultado. Os métodos são considerados preliminares e requerem validação e testes adicionais para determinar sua eficácia na detecção de cruzipaína em suco de açaí. No entanto, os resultados obtidos são promissores e ajudam a entender as propriedades da cruzipaína recombinante em ensaios imunoenzimáticos e em amostras de suco de açaí. É importante enfatizar que medidas devem ser tomadas para preservar a integridade da proteína durante o processo de quantificação de proteínas. A degradação do anticorpo usado afeta a eficiência do método dot blot.
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    Biofilmes monoespécie e mistos de Trichophyton e Staphylococcus: influência de nutrientes e presença de células persisters
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-04-28) Belizario, Jenyffie Araujo [UNESP]; Giannini, Maria José Soares Mendes [UNESP]; Pires, Regina Helena; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Dermatófitos são fungos causadores de dermatofitose, doença fúngica que afeta os tecidos queratinizados e, a associação de fungos dermatófitos com bactérias tende a provocar um quadro infeccioso exacerbado e de difícil tratamento. Ambos os microrganismos podem formar biofilmes e a disponibilidade de nutrientes pode influenciar a capacidade de adesão e a arquitetura destes. Além disso, a resistência microbiológica e clínica dos dermatófitos pode estar associada não apenas à formação de biofilmes, mas também à presença de células persistentes (células persisters), as quais poderiam contribuir para o surgimento de infecções recalcitrantes, crônicas. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação de biofilme misto entre Trichophyton rubrum e Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epidermidis em diferentes meios de cultura. Adicionalmente, foi avaliada a presença de células persistentes nos biofilmes monoespécie. Os biofilmes foram formados em diferentes tempos de incubação, meios de cultura e quantificados pelas metodologias do cristal violeta (biomassa), atividade metabólica (redução do sal de tetrazólio) e por metodologia de plaqueamento em ágar (unidades formadoras de colônia). Estes foram fotodocumentados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). A determinação da presença de células persistentes foi realizada por ensaio de UFC após exposição à antimicrobianos. As comunidades sésseis apresentaram maior produção de biomassa e de células metabolicamente ativas em meio Brain Heart Infusion (BHI) comparativamente ao Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e caldo Muller-Hinton (MHI). Ambas as espécies bacterianas, quando combinadas com T. rubrum, foram capazes de formar biofilmes maduros em 72h nos três meios de cultura avaliados; no entanto, diferenças foram observadas entre as populações. A maior quantidade de biomassa e atividade metabólica foi presenciada quando o inóculo bacteriano foi adicionado ao biofilme fúngico nos tempos finais de formação. O ensaio de UFC mostrou que o desenvolvimento de T. rubrum, nos biofilmes mistos, foi dependente do tempo de adição da bactéria ao biofilme fúngico em formação e, a falta de pré-adesão do dermatófito prejudicou diretamente na evolução do biofilme. As eletromicrografias dos biofilmes monoespécie de T. rubrum mostraram uma extensa rede de hifas robustas e entrelaçadas, enquanto uma vasta quantidade de cocos aglomerados foi observada nos biofilmes de Staphylococcus spp. Quando combinados, o predomínio de T. rubrum ou Staphylococcus spp. foi dependente da condição de interação, sendo que as comunidades bacterianas prevaleceram nos tempos iniciais, não sendo possível observar de forma confiável a presença de estruturas do dermatófito; já nos tempos finais, a comunidade fúngica mostrou-se dominante no biofilme. Dados de CLSM mostraram que o biofilme de T. rubrum apresentou uma espessura de 363 μm, com hifas septadas, entrelaçadas e bem desenvolvidas enquanto os biofilmes de S. aureus (177 μm) e S. epidermidis (178 μm), demonstraram ampla quantidade de cocos por toda extensão do campo. Nos biofilmes mistos, as espessuras dos biofilmes nas condições de interação finais assemelharam-se ao biofilme monoespécie de T. rubrum, especialmente quando associado à S. epidermidis (369 µm). Nos tempos iniciais, no entanto, constatou-se escassas hifas com formas e tamanhos irregulares. O estudo da presença de células persistentes nos biofilmes sugeriu que a falha terapêutica com antibióticos em infecções crônicas pode estar relacionada a presença da subpopulação e que desempenha um papel significativo na tolerância do biofilme, sendo necessário selecionar antimicrobianos eficazes e em concentrações não tóxicas para garantir o sucesso no tratamento destas infecções. O conhecimento da interação entre T. rubrum e espécies de estafilococos bem como a avaliação da presença de células persistentes em biofilmes de T. rubrum são inéditos e podem contribuir para o avanço do conhecimento da resposta imunológica do hospedeiro, da resistência aos antimicrobianos e progressão da doença, além de subsidiar novos alvos terapêuticos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Bioprospecção de bactérias com propriedades antivirais da microbiota intestinal e ovariana do mosquito Aedes aegypti
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-28) Fernandes, Maria Raquel Gomes [UNESP]; Souza Neto, Jayme Augusto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor dos arbovírus dengue, Zika, Chikungunya e febre amarela e representa um grande problema de saúde pública. Os microrganismos simbiontes que constituem a microbiota do intestino-médio e ovários do Ae. aegypti podem interferir na replicação do arbovírus e consequentemente na sua competência vetorial. No entanto, pouco se sabe sobre as bactérias cultiváveis desses órgãos e seu papel na resposta antiviral. O objetivo do presente estudo foi identificar bactérias cultiváveis da microbiota do intestino-médio e dos ovários do mosquito Ae. aegypti com atividade antiviral contra o vírus da Zika (ZIKV). Após 24h e 72h do repasto sanguíneo pelos mosquitos fêmea Ae. aegypti, foram dissecados os intestinos-médio e ovários, semeados em ágar sangue e ágar chocolate e mantidos a 24ºC e 37ºC por 48h. A identificação das bactérias foi realizada via gene 16S rRNA por sequenciamento de Sanger e as sequências foram alinhadas e comparadas no GenBank, SILVA Ribosomal RNA gene database project e Ribosomal Database Project (RDP). Foram dissecados 42 intestinos-médio e ovários, 31 bactérias cultiváveis foram isoladas e identificadas. Houve o predomínio de bactérias gram-negativas pertencentes ao filo Proteobacteria (71%), classe Gammaproteobacteria (71%) e ordem Enterobacteriales (61,3%). Em relação ao gênero, Serratia (35,6%) seguida da Elizabethkingia (25,8%), Klebsiella (16,2%), Enterobacter (9,6%), Pseudomonas (9,7%) e Staphylococcus (3,2%). Todos os gêneros de bactérias identificadas foram encontrados em ambos os órgãos, exceto Staphylococcus que foi apenas nos ovários. As espécies de bactérias pertencentes ao mesmo gênero compartilhadas no intestino-médio e nos ovários apresentaram pouca divergência entre si. Sendo assim, a composição da microbiota cultivável do intestino-médio e dos ovários foi semelhante. Nenhum gênero causou redução ou inibição de ZIKV in vitro. Portanto, as bactérias cultiváveis da microbiota do intestino-médio e dos ovários não mostraram atividade anti-ZIKV.
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    Análise de esteróides isolados do veneno de Rhinella marina (Sapo-cururu) na indução de apoptose em câncer cervical associado ao Papilomavírus Humano (HPV)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-31) Brandi, Juliana Cristina; Valente, Valéria; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer cervical é o terceiro tipo mais comum entre as doenças oncológicas femininas no mundo. A cada ano, mais de 300.000 mortes são registradas por câncer do colo do útero associado ao vírus do papiloma humano (HPV), que por sua vez é um dos principais agentes das infecções sexualmente transmissíveis (ISTs), que infectam mais de 80% das pessoas em algum momento de suas vidas. Embora 90% das infecções por HPV regridam naturalmente em dois anos, 10 a 20% terão uma infecção persistente. Considerando a baixa adesão vacinal em todo o mundo e a ausência de uma terapia antiviral comercial, o uso de compostos naturais, direcionados às vias celulares que são desreguladas pela infecção pelo HPV, pode ser relevante para a descoberta de novos fármacos. Rhinella marina também conhecida popularmente como sapo-cururu é uma das espécies venenosas mais encontradas no continente australiano e na América do Sul, cujo veneno é extraído para o isolamento de inúmeras substâncias puras. Vários estudos tem avaliado compostos isolados do veneno do sapo-cururu australiano, retirado da secreção da glândula parótida, que contêm compostos denominados bufadienolideos, contendo marinobufagina (MBG) (C24H32O5), telocinobufagina (TBG) (C24H34O5) e bufadienotoxinas como a marinobufotoxina (MBT) (C38H56N4O9). Neste estudo, as linhagens celulares de câncer cervical HPV positivas (SiHa e CasKi), HPV negativas (C-33A) e queratinócitos da pele imortalizados espontaneamente (HaCaT) foram tratadas com MBG, TBG e MBT. A citotoxicidade foi avaliada em diferentes concentrações (7,81uM, 15,62uM, 31,25uM, 62,50uM e 125uM), realizada pelo do ensaio MTT. Concentrações capazes de inibir a viabilidade celular em 50% das células tratadas, bem como o índice de seletividade (IS) foram calculados para todos os experimentos. Em seguida, foi avaliado o potencial apoptótico pela determinação dos níveis de caspases 3/7, por luminescência (Promega). O ensaio de MTT demonstrou menor viabilidade das células SiHa tratadas com MBG (CI50 de 12,4uM, IS de 12,89). Os níveis das caspase 3/7 foram significativamente maiores para células SiHa tratadas com MBG, quando comparados às demais linhagens celulares. Portanto, MBG foi a substância que apresentou maior capacidade de reduzir a viabilidade celular, em 24 horas de tratamento (CI50 12,4uM), induzindo apoptose dependente de caspases para células SiHa. Os resultados foram confirmados posteriormente por imagens de fluorescência utilizando Hoescht e LDR. Em conclusão, a MBG demonstrou um efeito apoptótico seletivo para células SiHa e deve ser explorado futuramente como um potencial agente terapêutico para o câncer cervical associado ao HPV16.
  • ItemDissertação de mestrado
    Desenvolvimento de sistema de controle de fluxo de carbono em vias metabólicas sintéticas de levedura
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-08) Lelis, Maria Cecília de Souza; Pedrolli, Danielle Biscaro; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O limoneno é um monoterpeno cíclico amplamente utilizado por seu aroma agradável na indústria de cosméticos, sendo também utilizado nas indústrias de biomateriais e biocombustíveis por ser um precursor químico nestes ramos. Assim, a produção em microrganismos surge como uma opção rápida e prática para atender a demanda comercial. Entretanto, a rota metabólica dos terpenoides compete por recursos com a maquinaria celular. Até o momento, as linhagens de Saccharomyces cerevisiae que foram construídas visando o aumento da produção de terpenos, sofrem com o acúmulo de isopentanil pirofosfato (IPP), um dos precursores da rota dos isoprenoides, que é tóxico para a célula em altas concentrações. Através da reconstrução dos genes IDI1, ERG20W e ClLS, buscamos aumentar o fluxo de carbono pela via de biossíntese de monoterpenos e reduzir a disponibilidade citoplasmática de IPP, visando direcionar o fluxo de carbono para a produção de limoneno pela canalização de substrato, que consiste na formação de complexos proteicos formados por enzimas que catalisam reações subsequentes em uma via metabólica. Assim, buscou-se clonar os genes das enzimas da via metabólica fusionados a synzips, que consistem em peptídeos sintéticos capazes de formar heterodímeros. Desta forma, sondamos três configurações para a canalização de substrato, heterodímero linear, heterotrímero linear e heterotetrâmero em anel, para comparar a capacidade de produção de limoneno entre as linhagens. Para as etapas de clonagem, utilizamos o plasmídeo pYES2, que possui origem de replicação para Escherichia coli e S. cerevisiae. As etapas consistiram em ligar ao plasmídeo os genes CILS-synzip21 e ERG20w-synzip19, para formar o heterodímero, IDI1-synzip18, ClLS-synzip21 e ERG20w-synzip19, para formar o heterotrímero, e ligar ClLS-synzip20 aos genes anteriores, para formar o heterotetrâmero.
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    Síntese, caracterização e purificação de bioconjugados peptídicos que apresentam atividade antitumoral
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-16) Nunes, Letícia Oliveira Catarin; Santos-Filho, Norival Alves; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Atualmente, o câncer é uma das principais causas de morte, principalmente nos países em desenvolvimento, representando hoje uma crise real para os sistemas de saúde em todo mundo. O tratamento convencional contra as células tumorais, como a quimioterapia e radioterapia, apresentam eficiência parcial, além de produzir uma gama de efeitos colaterais, diminuindo a qualidade de vida do paciente, além de estarem relacionados com a multirresistência por parte das células tumorais. Nesse contexto, estudos buscam o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras para combater a doença. Pequenas moléculas, como peptídeos antitumorais, surgem como moléculas de interesse na terapia contra o câncer. Porém, a baixa especificidade e alta toxicidade sobre células normais, levam à busca por trabalhar com peptídeos antitumorais bioconjugados com peptídeos aptâmeros. Aptâmeros são moléculas relativamente pequenas que apresentam grande seletividade por apresentar interações com marcadores de membrana celular, como a glicoproteína de membrana CD44. Esses marcadores, geralmente são superexpressos em linhagens tumorais, e quando conjugados com peptídeos antitumorais, podem levar a maior eficácia na morte de células tumorais em decorrência a um direcionamento do peptídeo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho é sintetizar os peptídeos LO1904, LO1908 e LO1908oxi, bem como avaliar os seus potenciais de ligação em alvos específicos em linhagens celulares, como adenocarcinoma de mama (MCF-7, ATCC HTB-22), adenocarcinoma de pulmão (A549, ATCC CCL-185) e células não tumorais de pulmão (MRC-5, ATCC CCL-171). Para tanto, foi realizada a síntese dos peptídeos em fase sólida e a purificação dos peptídeos LO1904, LO1908 e LO1908oxi por cromatografia líquida de alta eficiência. Além disso, culturas celulares foram submetidas à microscopia automática através do In Cell Analyzer, após incubação prévia com os peptídeos , apresentando marcações evidentes em diferentes concentrações. Em seguida, foi realizado o ensaio de viabilidade celular pela técnica de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) para as três linhagens testadas, bem como com a Melitina e Aureína. Com a seleção do aptâmeros LO1903, o qual apresentou marcações evidentes nas linhagens testas, foi realizada a síntese dos bioconjugados LO2121, LO2122 e LO2123. No ensaio de viabilidade celular foi possível concluir que todos os bioconjugados apresentam maior especificidade quando comparados com a Melitina. Colaborando com os resultados da viabilidade celular, no ensaio de degradação no soro foi possível constatar que os bioconjugados são estáveis em soro e não sofrem degradação por proteases em diferentes concentrações. Contudo, um fator interessante é que apesar da conjugação da Melitina com o aptâmeros, as moléculas não apresentaram modificações em sua estrutura, muito menos na sua atividade, como visto no ensaio de viabilidade.
  • ItemDissertação de mestrado
    Desenvolvimento de biossensores para o diagnóstico do vírus sars-cov-2
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-11-29) Brenner, Gabriel; Pedrolli, Danielle Biscaro; Lins, Milca Rachel da Costa; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O diagnóstico preciso de COVID-19 é feito hoje, principalmente, por técnica de RT-PCR, que demanda equipamentos laboratoriais e mão de obra especializada para a realização do teste, o que encarece o diagnóstico e, principalmente, torna o processo moroso. Além disso, essa dependência de estrutura laboratorial torna o diagnóstico inviável em regiões remotas do Brasil, outra opção é a utilização de testes de antígeno, que são mais rápidos e baratos, porém possuem uma menor eficácia pois eles não conseguem detectar os anticorpos antes do sétimo dia de infecção. Como contrapartida ao teste utilizando a reação de PCR, o desenvolvimento de um riboregulador do tipo toehold switch se torna uma alternativa interessante devido ao seu baixo custo, fácil manuseio e alta sensibilidade e especificidade. Este projeto propõe o desenvolvimento de biossensores do tipo para a identificação rápida de RNA viral de Sars-Cov-2. Para tanto, foi construído um dispositivo de RNA regulatório capaz de ativar a expressão de um gene repórter a partir da identificação do RNA viral. Os toehold switch construídos à partir das sequências de RNA viral do SARS-CoV-2 foram clonados em um plasmídeo contendo o gene repórter Epic Luciferase através da técnica de digestão e ligação e testados em reações de tradução e transcrição cell free, obtendo resultados promissores onde o switch 8a apresentou um aumento de expressão de 3 vezes quando comparado o trigger específico com os controles. Os resultados obtidos mostram que a utilização de riboreguladores do tipo toehold switch para detecção do vírus SARS-CoV-2 é promissora.
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    Investigação do perfil metabólico de células dendríticas durante a eferocitose de células tumorais apoptóticas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-25) Pereira, Ludmilla da Silva; Medeiros, Alexandra Ivo de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Dentro do microambiente tumoral (TME, do inglês tumor microenvironment), a apoptose é um dos principais padrões de morte celular mediante os tratamentos antitumorais convencionais, como a quimioterapia e radioterapia. A remoção dessas células mortas por fagócitos, denominada eferocitose, torna-se um processo prejudicial para a resposta antitumoral, uma vez que células dendríticas (DCs) e os macrófagos adquirem um perfil imunossupressor após a internalização e digestão de corpos apoptóticos tumorais. Frente a isso, o objetivo desse projeto foi investigar quais vias metabólicas sustentariam o perfil tolerogênico adquirido por DCs após a eferocitose dentro do TME. Como fonte de células apoptóticas tumorais foram utilizadas células Renca (Adenocarcinoma de córtex renal murino) tratadas com doxorrubicina, um inibidor das topoisomerases I e II, resultando em uma taxa de apoptose de cerca de 75%. Nossos dados demonstraram que a eferocitose de células Renca apoptóticas (Renca-ACs) resulta na geração de BMDCs com um perfil tolerogênico, observado pela redução na co-expressão de MHC II e CD86. Além disso, a internalização e digestão de corpos apoptóticos tumorais elevou significativamente a expressão de PD-L1, bem como a produção de IL-10 e IL-6, em comparação a condição controle. A deficiência de TIM-4, AXL e, principalmente, MertK, resultou em uma tendência de redução na MFI de PKH, sugerindo que BMDCs são menos hábeis em eferocitar subsequentes Renca-ACs. Utilizando inibidores farmacológicos, observamos que a produção de IL-10 e IL-6 durante a eferocitose de Renca-ACs depende da ativação da via glicolítica e da glutaminólise. Além disso, a produção de IL-6 parece também depender da síntese de ácidos graxos, e a produção de IL-10 da oxidação de ácidos graxos. Após a eferocitose de Renca-ACs, BMDCs sofrem um aumento na expressão gênica de enzimas glicolíticas como Glut1, Pkm2 e Ldha, e há uma tendência de aumento na expressão de Cpt1a, sugerindo também a envolvimento do metabolismo oxidativo no processo de eferocitose. Interessantemente, após 18h de co-cultura, foi observada uma diminuição da reserva e da capacidade glicolítica de BMDCs, sugerindo que a demanda glicolítica seja mais precoce e, em fases mais tardias, outras vias metabólicas podem estar envolvidas na manutenção do perfil tolerogênico dessas células. Ainda, a eferocitose de Renca-ACs mediada pelos receptores TIM4, AXL e MertK parecem estar envolvida na ativação do metabolismo glicolítico, visto que a ausência desses receptores reduziu a expressão de Glut1 e Ldha, comprovando que a interação com os receptores eferocíticos impacta diretamente na ativação das vias metabólicas envolvidas na geração do perfil tolerogênico de BMDCs adquirido durante a eferocitose de células tumorais apoptóticas. Em conjunto, os dados apresentados nesse trabalho sugerem que eferocitose de Renca-ACs gera BMDCs tolerogênicas, sendo esse perfil sustentado majoritariamente pelo metabolismo glicolítico e, em menor escala, pelo metabolismo oxidativo.
  • ItemDissertação de mestrado
    Análise e desenvolvimento de processos de separação de biomoléculas utilizando Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-16) Oshiro, Ariane Alves; Pereira, Jorge Fernando Brandão; Ebinuma, Valéria de Carvalho Santos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) une o princípio de extração líquido-líquido à eficácia das técnicas cromatográficas, promovendo inúmeras etapas sequenciais de partição do soluto, e podendo, assim, aumentar a eficiência da extração. Devido à existência de uma fase estacionária líquida, esta técnica destaca-se por sua elevada capacidade preparativa e versatilidade na separação de compostos em uma vasta gama de polaridades. Apesar de suas vantagens, ainda existem uma série de obstáculos a serem superados para que a CPC seja amplamente empregada na recuperação de biomoléculas, tais como: i) conservação da estabilidade do equilíbrio hidrodinâmico entre as fases líquidas imiscíveis (representado pela retenção de fase estacionária (SF)); ii) aumento da pressão de retorno do sistema decorrente do escoamento das fases na coluna. Isto posto, este trabalho consistiu em compreender as condições hidrodinâmica de sistemas líquidos bifásicos aplicados em CPC capazes de promover a operação adequada do equipamento e realizar a partição e separação seletiva de biomoléculas. Para tanto, foi realizado, primeiramente, um estudo hidrodinâmico dos efeitos sob a pressão de retorno e na SF devido à variação de três parâmetros operacionais: velocidade de rotação da coluna; fluxo de fase móvel; modo de operação (ascendente ou descendente). Numa segunda fase, foram realizados estudos de casos para avaliar a capacidade de partição e separação de biomoléculas em CPC, utilizando sistemas aquosos bifásicos (SAB) para partição de L-tirosina, riboflavina, ácido gálico e ácido vanílico, e sistema líquido-líquido tradicional (i.e., aquosoorgânico) para partição dos carotenoides β-caroteno e astaxantina. Os resultados obtidos permitiram compreender o comportamento dos fenômenos hidrodinâmicos em função das variáveis operacionais. Nesse sentido, foram identificados dois efeitos hidrodinâmicos principais, a saber, uma forte influência da velocidade de rotação da coluna e viscosidade das fases do sistema no aumento da pressão de retorno, e um efeito negativo na SF devido ao aumento do fluxo de fase móvel. A compreensão da hidrodinâmica do CPC permitiu definir limites aos parâmetros operacionais adequados à operabilidade do equipamento para o SAB composto por K2HPO4 e etanol. Embora do ponto de vista processual o SAB composto por K2HPO4 e etanol seja promissor para a separação de compostos hidrofílicos, a separação das biomoléculas modelo foi inviabilizada, provavelmente devido à degradação destas no pH altamente alcalino (pH ≈ 10) das fases do sistema. Por outro lado, a aplicação do sistema bifásico aquoso-orgânico (Hexano + Acetona + Etanol +H2O) possibilitou a separação dos carotenoides β-caroteno e astaxantina, apresentando um potencial para a extração seletiva destes pigmentos a partir de matrizes complexas (p.ex. meios de cultivo).
  • ItemDissertação de mestrado
    Desenvolvimento de um kit para auxiliar o ensino da tecnologia de edição genética CRISPR/Cas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-04) Kundlatsch, Guilherme Engelberto [UNESP]; Pedrolli, Daniele Biscaro [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Neste trabalho, uma ferramenta foi desenvolvida utilizando corte a laser para ensinar a técnica de edição genética CRISPR/Cas. CRISPR/Cas é uma poderosa ferramenta de edição genética com amplas aplicações na indústria, agricultura e, principalmente, na saúde humana. Apesar de vários autores terem desenvolvido metodologias para seu ensino, em geral esses trabalhos necessitam infraestrutura significativa. Para democratizar o ensino da técnica, nós desenvolvemos uma ferramenta de baixo-custo (menos de 15 reais por estudante) que não necessita de qualquer infraestrutura laboratorial e que pode ser produzida localmente através de ferramentas de fabricação digital. Peças de MDF foram desenvolvidas e manufaturadas para permitir ao usuário montar fitas de DNA, RNA e polipeptídeo, assim como editar sequências de DNA empregando peças que representam o sistema CRISPR/Cas. A ferramenta, composta por 186 peças, for denominada LeDNA, e 10 unidades foram produzidas para avaliação. Seu impacto em estudantes de nível médio foi avaliado em comparação e em conunto com aulas práticas e teóricas. Um novo plasmídeo foi desenvolvido para aulas práticas, permitindo a edição de uma linhagem de Bacillus subtilis produtora de fluorescência verde para passar a produzir fluorescência vermelha. Um protocolo simplificado para aplicação de CRISPR/Cas também foi desenvolvido e validado, viável em laboratórios educacionais com limitado acesso a equipamentos. As diferentes metodologias foram analisadas em três grupos de trinta estudantes de ensino médio de escola pública. Uma nova ferramenta de avaliação foi desenvolvida e validada para mensurar a performance dos estudantes e foi aplicada antes da primeira intervenção e após cada uma das três. LeDNA promoveu significativo ganho na performance educacional dos participantes tanto individualmente quanto quando associado com metodologias tradicionais.
  • ItemDissertação de mestrado
    Aprimoramento de matrizes poliméricas naturais para liberação controlada de compostos atrativos para Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 28-09-22) Bueno, Ana Carolina; Pinto, Mara Cristina; Gremião, Maria Palmira Daflon; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Flebotomíneos são insetos responsáveis pela transmissão dos agentes etiológicos das leishmanioses e são de difícil controle e monitoramento. A busca por iscas atrativas a fim de auxiliar nas coletas desses vetores, impulsiona estudos relevantes do ponto de vista epidemiológico. A ecologia química contribui com a investigação de novas alternativas de iscas atrativas, pois aborda possíveis substâncias químicas responsáveis pela interação entre organismos. Além da identificação de compostos atrativos, outra necessidade, dentro dessa área, é a forma como esses atrativos são liberados em campo. Em estudos prévios, foi desenvolvido um liberador a partir dos polímeros naturais, goma gelana e pectina para liberação de compostos atrativos para flebotomíneos e, o presente trabalho buscou o aprimoramento desse sistema de liberação. Foram desenvolvidas quatro formulações do sistema de liberação, alterando as proporções da goma gelana e pectina e a concentração do AlCl3: Sistema 1 (1:1 3%), Sistema 2 (1:1 5%), Sistema 3 (4:1 3%) e Sistema 4 (4:1 5%). Nesses sistemas foram acrescentados compostos atrativos para Lutozomyia longpipalpis, hexanol, octenol e nonanol, anteriormente estudados em laboratório. Foi possível identificar o formato que obteve melhor estabilidade na volatilização desses compostos: 21 cm3 – cilíndrico e achatado, além de compreender melhor os processos físicos e químicos envolvidos, como a capacidade de reutilização do material. Observou-se que a cada reuso, a liberação do 1-hexanol se tornou-se mais estável. Foi possível atingir a máxima estabilidade de liberação do 1-hexanol após introduzir as matrizes poliméricas em cápsulas de plástico e, consequentemente, aumentar o tempo de liberação do composto. O Sistema 2, introduzido em cápsula, apresentou ótimos resultados de liberação do 1-hexanol nas condições de umidade natural e elevada e também apresentou eficiência na atratividade de fêmeas de Lu. longipalpis nos testes em túnel de vento. Os resultados obtidos conferem um caráter promissor para a utilização desse sistema de liberação como iscas de captura para o vetor.
  • ItemDissertação de mestrado
    Análise da dispersão temporal e epidemiológica das variantes do SARS-CoV-2 no período de pré-vacinação em massa na cidade de Botucatu-SP
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-27) Costa, Felipe Allan da Silva da; Souza-Neto, Jayme Augusto; Grotto, Rejane Maria Tommasini; Fortaleza, Carlos Magno Castelo Branco; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Após a circulação das Variantes de Preocupação (VOC) do SARS-CoV-2, Alpha, Beta, Gamma, Delta e a atual predominante Ômicron, e a ampla cobertura vacinal, houve uma drástica redução nos números de óbitos por Covid-19. Em maio de 2021, o município de Botucatu-SP foi palco de uma pesquisa que avaliou a efetividade da Vacina COVID-19 Recombinante/Fiocruz® contra variantes do SARS-CoV-2, possibilitando a imunização de mais de 60 mil pessoas em um único dia. Objetivos: O objetivo central do presente estudo foi avaliar a dispersão temporal e epidemiológica das variantes do SARS-CoV-2 antes da vacinação massiva que ocorreu em Botucatu, além de relacioná-las às características clínicas da doença. Metodologia: Foram selecionadas aleatoriamente 400 amostras positivas para SARS-CoV-2, referentes as 4 Semanas Epidemiológicas (SE 16, 17, 18 e 19 de 2021) que antecederam o dia da vacinação. O Sequenciamento de Nova Geração foi utilizado para produzir as sequências e determinar as variantes. Resultados: Foram geradas 371 sequências de alta qualidade. Dessas sequências, 98,4% eram da VOC Gamma, enquanto 1,3% eram da VOC Alpha e 0,3% eram da Variante de Interesse Zeta. Durante as 4 SE as linhagens de Gamma P.1 e P.1.14 foram as mais frequentes. A linhagem P.1 foi mais frequente tanto em homens quanto em mulheres e nas pessoas mais jovens e nos adultos (0-59 anos). Não houve correlação entre as variantes e a presença de comorbidades, tampouco entre elas e os quadros clínicos moderados e graves da Covid-19 ou óbito. Entretanto, P.1 foi mais frequente do que P.1.14 em pessoas que apresentaram algum sintoma da Covid-19. Não houve diferença entre os valores de PCR em tempo real (CT) para essas linhagens. Nas análises filogenéticas, foi possível observar um pequeno agrupamento de 9 amostras de P.1.14 contendo as mutações em ORF1a: M584V e A3620V, até então, não encontradas em nenhuma sequência dessa sublinhagem. Conclusão: A alta predominância de P.1 e P.1.14 em um cenário pré-vacinação em massa pode nos fornecer insights sobre a evolução e a epidemiologia molecular do SARS CoV-2 e suas VOCs. Dessa forma ressaltamos a importância da vigilância genômica do SARS-CoV-2, que pode ajudar a subsidiar as tomadas de decisões dos setores públicos e manejo da Covid-19.
  • ItemDissertação de mestrado
    Otimização da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana em S. aureus via inibição da catalase
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-26) Surur, Amanda Koberstain [UNESP]; Fontana, Carla Raquel; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Uma alternativa ao combate ao uso irracional de antimicrobianos é a terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDa), uma forma moderna e não invasiva de terapia, a qual tem seu mecanismo de ação fundamentado na ativação pela irradiação de um fotossensibilizador (FS) na presença de oxigênio e sob fluências especificas de luz no comprimento de onda adequado. O objetivo desse estudo é avaliar possíveis alterações da ação antimicrobiana da TFDa mediadas por Azul de metileno (AM) e Curcumina (CUR) na presença do inibidor de catalase 3-AT sobre S. aureus ATCC 25923 em fase planctônica. Para tanto foram realizados os testes de Concentração Inibitória Mínima (MIC) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) sobre o 3-AT através do método de microdiluição, a avaliação da fotodegradação dos FS, a padronização dos parâmetros ideais de TFDa e a avaliação de sinergismo entre TFDa e 3-AT em diferentes tempos de inibição (10 a 40 minutos). A análise estatística dos dados foi feita através do teste de Análise de Variância (one-way ou two-way ANOVA) com pós-teste de Tukey. O 3-AT não apresentou MIC e CBM para as concentrações avaliadas e demonstrou um padrão de redução do crescimento bacteriano na presença do inibidor, sem morte bacteriana após a retirada do mesmo. Os parâmetros ideais para TFDa mediada por AM solubilizada em salina estéril e por CUR dissolvida em DMSO 1% e sacarose 0,5% foram 10 minutos de pré-irradiação, 50 µg/mL AM, 72,96 mW/cm2 , 65,66 J/cm2 e 30 minutos de pré-irradiação, 6,25 µg/mL CUR, 55 mW/cm2 e 25 J/cm2 , respectivamente. Na terapia combinada (TC) entre TFDa e 3-AT foram avaliados diferentes tempos de inibição da catalase necessário para redução bacteriana total. Com isso, pode-se concluir que a TC demonstrou possuir sinergismo entre TDFa e 3-AT, ser dependente do tempo de inibição da catalase e do tempo de pré-irradiação dos FSs e ter grande potencial para estudos futuros.
  • ItemDissertação de mestrado
    Análise da atividade in vitro e in vivo de derivados nitroimizadóis frente ao Mycobacterium tuberculosis
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-19) Manieri, Karyn Fernanda [UNESP]; Pavan, Fernando Rogério; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa cujo principal agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2020 foi responsável por 1,3 milhão de mortes. A TB possui um tratamento longo, de no mínimo 6 meses, constituído do uso de 4 antibióticos concomitantes: rifampicina (RFP), isoniazida (INH), etambutol (ETH), e pirazinamida (PZA), cada um possuindo um mecanismo de ação diferente para prevenção do surgimento de cepas resistentes aos antibióticos. Entretanto, o prolongado tempo de tratamento, os efeitos colaterais adversos, e a melhora dos sintomas dos pacientes que acreditam já estarem curados fazem com que os mesmos abandonem a terapia, aumentando a pressão seletiva frente aos bacilos, e resultando em cepas resistentes, podendo ser rifampicina (RR), multidrogas (MDR-TB), pré-extensivamente resistentes (Pré-XDR) ou extensivamente resistentes (XDR-TB). Neste trabalho foram apresentados 10 compostos híbridos (19-01; 19-02; 19-03; 19-04; 19-05; 19-07; 19-08; 19-09; 19-10 e 19-13) desenvolvidos a partir do composto benzofuroxânico 8, o BZ8, anteriormente estudado por nosso grupo de pesquisa, e a pretomanida, fármaco da classe dos nitroimidazóis, utilizada em terapias de XDR-TB aprovada recentemente pelo Food and Drug Administration (FDA). Ensaios de Concentração Inibitória Mínima (CIM90) demonstraram excelente atividade dos compostos contra cepa sensível H37Rv, com o menor valor sendo de 0,18 µM, e contra isolados clínicos resistentes, com valores de 0,18 µM em MDR-TB e 0,17 µM em RR. O Índice de Citotoxicidade (IC50) apresentou segurança em células de hepato-carcinoma humano (HEPG2), macrófagos murinos (J774A.1) e fibroblastos pulmonares (MRC-5), com valores acima de 100 µM. O Índice de Seletividade (IS) foi acima de 78 µM, com a maioria apresentando valores em torno de 400 µM. A análise da atividade intramacrofágica dos compostos demonstrou que os mesmos possuem atividade semelhante à RFP e melhores que pretomanida a 5x sua CIM90. Ensaios de espectro de ação determinaram que os 10 compostos apresentaram atividade específica em Mtb. Os compostos 19-01 e 19-02 não foram tóxicos no Ensaio de Toxicidade Aguda em modelo alternativo de Galleria mellonella nas concentrações de 2.000 mg/kg e 1.000 mg/kg de peso corpóreo respectivamente. Dessa forma, nossos ensaios foram capazes de demonstrar uma excelente atividade contra Mtb sensível e resistente à medicamentos, com baixa toxicidade in vitro e in vivo, sendo escolhidos 6 compostos líderes para as próximas etapas, sendo eles os 19-01, 19-02, 19-03 e 19-05, 19-07 e 19-08.
  • ItemDissertação de mestrado
    Determinação, síntese e aplicação de peptídeos imunogênicos da proteína estrutural S do vírus SARS-CoV-2
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-21) Pinheiro, Anderson Amendola [UNESP]; Costa, Paulo Inácio da [UNESP]; Feliciano, Gustavo Troiano; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A Pandemia de COVID-19 já custou ao mundo incontáveis perdas humanas, sociais e econômicas. SARS-CoV-2, seu agente etiológico, é um Betacoronavirus envelopado com um genoma composto por RNA de fita simples e senso positivo que codifica quatro proteínas estruturais, sendo a glicoproteína Spike a mais importante devido a sua função de reconhecer o receptor ACE2 e ancorar o vírus na superfície da células hospedeira. Dado o knowhow de nosso grupo em desenvolver métodos diagnósticos inovadores para vírus de RNA, o presente trabalho propôs identificar e caracterizar na glicoproteína Spike alvos moleculares para serem aplicados em um sensor imunoeletroquímico. Para tal, um método combinatório baseado em inteligência artificial identificou 13 potenciais sítios imunodominantes espalhados por toda proteína S. Estes sítios variam de 12 a 22 aminoácidos de extensão. Através de experimentos de Dinâmica Molecular pudemos caracterizar tais epítopos e avaliar parâmetros bioquímicos e biofísicos importantes para o processo de interação antígeno-anticorpo. Foi constatado que tanto a proteína S quanto os nossos sítios apresentam boa estabilidade conformacional. Também pudemos avaliar a Área Superficial Acessível ao Solvente (SASA) em duas condições e determinar que, para os epítopos encontrados na região RBD, a mais relevante para o reconhecimento dos anticorpos, essa acessibilidade varia de acordo com a conformação adotada pelo RBD. Quando este encontra-se fechado, os epítopos estão mais inacessíveis, e quando ele está aberto, os epítopos são significativamente mais acessíveis. Por fim, após implementarmos e validarmos uma estratégia de Síntese de Peptídeos em Fase Sólida no laboratório, pudemos obter quatro epítopos a fim de os validarmos no sensor eletroquímico. Foram produzidos um epítopo Controle, publicado na literatura como sítio antigênico, e os epítopos E7, E8 e E9, alguns dos mais interessantes em termos de localização e propriedades bioquímicas. O epítopo E7 foi utilizado para validarmos o sistema sensor com bons resultados preliminares.
  • ItemDissertação de mestrado
    Investigação da função de HJURP (Holliday Junction Recognition Protein) no controle do estresse replicativo das células de glioblastoma multiforme
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-08-25) Navegante, Geovana [UNESP]; Valente, Valeria; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e letal, e na maioria dos casos leva o paciente à morte em aproximadamente 14 meses após o diagnóstico. O tratamento é realizado com remoção cirúrgica da massa tumoral, seguida de radioterapia e quimioterapia. Entretanto, devido à alta resistência das células tumorais, frequentemente o tumor cresce novamente poucas semanas após a cirurgia. Recentemente demonstramos que HJURP (Holliday Junction–Recognizing Protein), uma nova proteína envolvida na montagem da cromatina centromérica e reparo de DNA, está altamente superexpressa nos GBMs. A HJURP está também superexpressa em outros tumores, como câncer de pulmão, mama e fígado, sendo que quanto maior é seu nível de expressão pior é o prognóstico de sobrevida dos pacientes, para todos os tipos tumorais estudados. Neste trabalho investigamos se a superexpressão de HJURP afeta a capacidade de proliferação e de manutenção da integridade genômica da células de GBM frente ao estresse replicativo. Observamos que a superexpressão da HJURP promove aumento na capacidade proliferativa e maior resistência ao estresse replicativo para as células ACBRI371 e U87MG, uma vez que ambas as linhagens apresentaram maiores taxas de proliferação quando superexpressando HJURP, mesmo em condições de estresse replicativo adicional. Além disso, estas células também mostraram menos fragmentação de DNA, após tratamento com hidroxiuréia, na condição superexpressora de HJURP. Portanto, o ganho de competências proliferativa e clonogênica, observado previamente na linhagem U87MG superexpressora de HJURP, pode estar relacionado à maior eficiência na atividade de reparo de DNA. Conjuntamente, nossos dados indicam que os níveis elevados de HJURP favorecem a atividade de reparo de quebras na dupla-fita de DNA e, assim, conferem maior capacidade proliferativa às células tumorais.
  • ItemDissertação de mestrado
    Biorrefinaria de resíduo cítrico visando a obtenção de colorantes naturais microbianos para aplicação industrial
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-29) Lima, Caio de Azevedo; Ebinuma, Valéria de Carvalho Santos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Considerando que o Brasil é um país com alta geração de resíduos agroindustriais, estudos acerca do aproveitamento de tais resíduos, principalmente, para obtenção de produtos de valor agregado, são de grande interesse. Assim, a produção de colorantes naturais fúngicos utilizando subproduto de baixo custo, como compostos provenientes do processamento da indústria cítrica, ganha importância com vista para o desenvolvimento de biorrefinaria para produção desse bioproduto em escala industrial. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a aplicação de um subproduto da indústria cítrica como fonte de carbono para a produção de colorantes por Talaromyces amestolkiae em cultivo submerso em agitador orbital. Inicialmente, o subproduto cítrico foi caracterizado quanto a composição química, contendo compostos como a lignina (21,6 %m.m-1), hemicelulose (13,5 %m.m-1) celulose (11,9 %m.m-1). A produção dos colorantes naturais vermelhos foi realizada inicialmente aplicando diferentes fontes de carbono (glicose, xilose e pectina) e fonte de nitrogênio (glutamato monossódico-GMS) comerciais. Posteriormente, a produção dos colorantes foi avaliada utilizando o subproduto cítrico não-tratado e pré-tratado (remoção de pectina), e suplementado com as fontes de carbono e nitrogênio comerciais supracitadas. A melhor condição de produção de colorantes vermelhos observada foi empregando glicose e xilose comercial, 10,0 e 5,0 g.L-1, respectivamente, com 25 g.L-1 de GMS em cultivo submerso à 150rpm/30°C/168h, atingindo em torno de 16,1 UA500nm. Na presença do resíduo cítrico, a máxima produção observada foi com 56,0 gramas de subproduto cítrico tratado por litro de meio de cultivo, chegando a 4,27 UA500nm. Avaliou-se também a produção de enzimas celulolíticas durante o cultivo e obteve-se um máximo de, aproximadamente, 0,20 UI.mL-1 para endo-glucanase; 0,87 UI.mL-1 para xilanase e 2,90 UI.mL-1 para β-glucosidase ao se empregar subproduto cítrico pré-tratado. Esses resultados revelam o potencial de resíduos agroindustriais da indústria cítrica para a geração de colorantes naturais através do conceito de biorefinaria, contribuindo para o desenvolvimento sustentável e fortalecimento dos bioprocessos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Estudo de caracterização do complexo tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) incorporado ao sistema lípidico nanoestruturado e sua atividade anti-Mycobacterium tuberculosis
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-25) Machado, Rachel Temperani Amaral; Pavan, Fernando Rogério; Silva, Patricia Bento da; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A tuberculose (TB), apresenta cerca de 10 milhões de casos por ano em todo o mundo. Além disso, as elevadas taxas de resistência às principais classes de antimicrobianos contribuem para que a TB se encontre entre os maiores causadores de morte por um agente infeccioso. Sendo assim, faz-se evidente a necessidade de controle e combate dessa doença que representa uma séria ameaça à saúde pública global. Para tanto, é preciso enfrentar o desafio do desenvolvimento de novos agentes ativos contra a TB. Nesse trabalho, o complexo metálico tris-(1,10-fenantrolina)ferro(II) ([Fe(fen)3]2+), foi selecionado para o estudo, visto que trabalhos anteriores do nosso grupo demonstraram que este complexo é um bom candidato contra TB. Além disso, quando incorporado a um sistema lipídico nanoestruturado (SLN) demonstrou boa biodisponibilidade oral. Diante desses fatos, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o complexo incorporado ao SLN e verificar sua atividade anti-Mycobacterium. tuberculosis. A frequência de resistência do Mycobacterium tuberculosis a [Fe(fen)3]2+ é menor do que a de outros fármacos de primeira linha para o tratamento da tuberculose, como a rifampicina. Ele se mostrou específico na inibição de micobactérias. Foi possível obter sistemas lipídicos nanoestruturados constituídos de colesterol como fase oleosa, fosfatidilcolina de soja, oleato de sódio e Eumulgin® HRE 40 [óleo de rícino de polioxil 40 hidrogenado]; na proporção de 3: 6: 8, como tensoativo e tampão-fosfato pH 7,4 como fase aquosa (SLN) e incorporar com sucesso o complexo [Fe(fen)3]2+ ao mesmo (SLN+([Fe(fen)3]2+)). A formulação de SLN+[Fe(fen)3]2+ revelou-se estável por até 90 dias a 5ºC e também se apresentam estáveis após 24h em soluções de pHs que remetem os encontrados no estômago e no sangue, e em contato com meios de cultura utilizados em outras metodologias in vitro, comprovando a integridade das partículas durante estes ensaios. O SLN mostrou uma taxa de eficiência de encapsulamento próxima a 60% de [Fe(fen)3]2+. Partículas de SLN+[Fe(fen)3]2+ mostraram-se homogêneas (PdI = 0,17), apresentando carga superficial negativa de -34,7mV e tamanho médio de 163nm, definido pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e confirmado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), que também revelou sua morfologia esférica. [Fe(fen)3]2+ apresentou um valor de CIM90 de 4,17 µM na sua forma livre e 23,39 µM quando incorporado no SLN. Estudos futuros devem analisar o perfil de liberação in vitro, a atividade in vivo e segurança do SLN+[Fe(fen)3]2+ para entender se esta combinação tem potencial para prosseguir como candidato a contra a tuberculose.