Purificação, caracterização, cristalização e modelagem molecular teórica da fração giroxina do veneno de Crotalus durissus terrificus (Laurenti 1768)

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dc.contributor.advisorBarravieira, Benedito [UNESP]
dc.contributor.advisorFontes, Marcos R. M. [UNESP]
dc.contributor.authorBuchi, Alisson Teixeira [UNESP]
dc.contributor.institutionUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.date.accessioned2014-06-11T19:24:15Z
dc.date.available2014-06-11T19:24:15Z
dc.date.issued2010-02-26
dc.description.abstractAs serpentes do gênero Crotalus durissus terrificus possuem em seu veneno diversas substâncias, entre elas uma serinoprotease com atividade trombina símile denominada giroxina, a qual é capaz de coagular o fibrinogênio plasmástico, promovendo a formação de fibrina. O objetivo do estudo foi a purificação e caracterização estrutural da enzima giroxina de Crotalus durissus terrificus. Para tanto, foram utilizadas métodos cromatográficos de gel filtração em Sephadex G75 e afinidade em Benzamidina-Sepharose 6B para isolamento e purificação; eletroforéticos de SDSPAGE 12% reduzido e de seqüenciamento do N-terminal da enzima purificada para identificação e avaliação do grau de pureza; clonagem e expressão do cDNA da glândula venenífera por RT-PCR e testes de cristalização. A modelagem teórica molecular foi realizada a partir de ferramentas de bioinformática baseadas em análises comparativas de outras serinoproteases depositadas no NCBI (National Center for Biotechnology Information). O seqüenciamento N-terminal da giroxina purificada, produziu uma proteína de cadeia única com massa molecular aproximada de 30 KDa e sua seqüência completa de cDNA apresentou 714 pb os quais codificaram uma proteína completa contendo 238 aminoácidos. Foram obtidos cristais a partir das soluções nos 2 e 5 do Kit Crystal Screen® 2 e 1 respectivamente, verificando-se sua constituição protéica. Para os alinhamentos múltiplos da sequência molde giroxina símile B2.1 com outras seis serinoproteases derivadas de veneno de serpentes (SVSPs) indicou-se a preservação de resíduos de cisteína e de seus principais elementos de estruturais (α-hélices, β-barris e loops).Evidenciou-se a localização da tríade catalítica nos aminoácidos His57, Asp102, Ser198 e os sítios de atividade especifica S1 e S2 nos aminoácidos Thr193 e Gli215 respectivamente...pt
dc.description.abstractThe venom of snakes Crotalus durissus terrificus genus have in their various substances, including a serinoproteases with thrombin-like activity called gyroxin, which clot the plasmatic fibrinogen and promote the fibrin formation. The objective of this study was purificate and characterize structurally the gyroxin enzyme from Crotalus durissus terrificus. For this, we used chromatographic gel filtration with Sephadex G75 and affinity benzamidine-Sepharose 6B for isolation and purification, SDS-PAGE 12% in reduce conditions for assessment purity, N-terminal sequencing of purified enzyme for identification and assessment purity; the cloning and expression of cDNA from venom gland by RT-PCR and crystallization tests. The theoretical molecular modeling was performed with bioinformatics tools based on comparative analysis of other serinoproteases deposited in the NCBI (National Center for Biotechnology Information). The N-terminal sequencing purified gyroxin protein produced a single chain with a molecular mass of approximately 30 kDa and its full-length cDNA had 714 bp which encoded a complete protein containing 238 amino acids. Crystals were obtained from the solutions 2 and 5 of the Crystal Screen Kit ® 2 and 1 respectively and was verificated a protein constitution. For multiple sequence alignments such gyroxin-like B2.1 with six other serinoproteases derived from snake venom (SVSPs) indicated the preservation of cysteine residues and its main structural elements (α helices, β-barrel and loops). Identificated the amino acids positions in the catalytic triad His57, Asp102, Ser198 and sites of specific activity in S1 and S2 amino acids Thr193 and Gli215 respectively. The recognition area of fibrinogen cleavage in SVSPs to template sequence gyroxin B2.1 was located in residues Arg60, Arg72, Gln75, Arg81, Arg82, Lis85, Glu86, Lis87... (Complete abstract click electronic access below)en
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.description.sponsorshipUniversidade Estadual Paulista (UNESP)
dc.format.extent51 f.
dc.identifier.aleph000611754
dc.identifier.capes33004064065P4
dc.identifier.citationBUCHI, Alisson Teixeira. Purificação, caracterização, cristalização e modelagem molecular teórica da fração giroxina do veneno de Crotalus durissus terrificus (Laurenti 1768). 2010. 51 f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu, 2010.
dc.identifier.filebuchi_at_me_botfm.pdf
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11449/89940
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.rights.accessRightsAcesso aberto
dc.sourceAleph
dc.subjectMedicina tropicalpt
dc.subjectSerpente venenosa - Venenopt
dc.subjectCrystalizationen
dc.subjectTheoretical modelingen
dc.titlePurificação, caracterização, cristalização e modelagem molecular teórica da fração giroxina do veneno de Crotalus durissus terrificus (Laurenti 1768)pt
dc.typeDissertação de mestrado
unesp.campusUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Medicina, Botucatupt
unesp.graduateProgramDoenças Tropicais - FMBpt
unesp.knowledgeAreaDoenças tropicaispt
unesp.researchAreaEstudo do efeito de venenos de serpentes e seus derivadospt

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