Teses - Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada) - IBRC

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  • ItemTese de doutorado
    Fungal-helper-bacteria communities in higher attine ant gardens
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-19) Sutta Martiarena, Maria Jesus; Rodrigues, Andre [UNESP]; Flórez Patino, Laura Victoria; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As bactérias desempenham papéis metabólicos fundamentais para a sobrevivência de outros organismos, criando sistemas complexos. Os jardins de fungos das formigas attine (Hymenoptera: Attini: Attina) são exemplos didáticos dessa complexidade, pois esses insetos dependem obrigatoriamente de fungos basidiomicetos para sua alimentação. Embora esse mutualismo seja o cerne das colônias attinas, outros organismos estão envolvidos na manutenção desse microhabitat. Vários estudos mostraram comunidades bacterianas na matriz do jardín de fungo compostas por Pantoea, Klebsiella, Pseudonocardia, Streptomyces e outros gêneros considerados envolvidos na ciclagem de nutrientes e defesa contra fungos antagônicos que ameaçam o jardín. Por outro lado, a função de grupos bacterianos localizados na hifosfera, região que envolve a hifa fúngica e sob sua influência, não foi abordada em previos estudos. Nesta tese, objetivamos avaliar as comunidades bacterianas da hifosfera de Leucoagaricus gongylophorus e seus potenciais efeitos diretos sobre o cultivar das formigas. Isolamos bactérias da superfície da estafila (grupo de hifas inchadas onde os nutrientes do fungo são armazenados) com potenciais funções metabólicas para o desenvolvimento do cultivar e do jardim. Nossos resultados mostraram a presença de comunidades bacterianas como parte da microbiota do fungo. Ensaios in vitro mostraram que as bactérias que habitam a hifosfera podem ser benéficas para o fungo, aumentando a produção da biomassa e auxiliando na mineralização de compostos. Análise transcriptômica de L. gongylophorus na presença de Staphylococcus sp. mostraram vias antimicrobianas down-regulated permitindo o estabelecimento bacteriano nas hifas, bem como transcritos up-regualted relacionados à síntese de lipídios e carboidratos. Além disso, usando técnicas moleculares e microscópicas mostramos evidências de bactérias dentro da hifa de L. gongylophorus. Implicações ecológicas dessas bactérias para o fungo e para as formigas são discutidas. Nossos resultados coletivamente, mostram bactérias na superfície da hifa, bem como dentro da hifa, que constituem a microbiota fúngica que sustenta a vida microbiana no jardim de fungos.
  • ItemTese de doutorado
    Biodegradação de lodo de ETA e ETE avaliada mediante ensaios de toxicidade e caracterização microbiológica
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-16) Santos, Ralyvan Araújo dos; Morales, Dânia Elisa Christofoletti Mazzeo [UNESP]; Angelis, Dejanira de Franceschi de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A população mundial em 2022 atingiu cerca de 8 bilhões de pessoas e, consequentemente, levou ao aumento no consumo de fontes de energia e na geração de resíduos oriundos da atividade humana como resultado do processo de tratamento das águas brutas e residuais (esgoto). Os lodos derivados de Estações de Tratamento de Água (LTA) e do tratamento do esgoto (LE), embora apresentem grandes quantidades de matéria orgânica e nutrientes, também contém microrganismos, dentre eles alguns patogênicos e contaminantes químicos de origem orgânica e inorgânica, de modo que, se não descartados em locais adequados, acabam gerando alteração no ambiente negativa em que se encontram. Contudo, um tratamento apropriado poderia possibilitar a utilização desses lodos como condicionadores de solos agrícolas. Diante destes fatos, o objetivo deste trabalho foi propor tratamentos para o LTA e o LE, isolados ou em associação, a partir do emprego de biofertilizantes (Bokashi (Inóculo I - In I) e Fermentado líquido (Inóculo II - In II) como indutores da biodegradação, a fim de diminuir sua carga poluidora e toxicidade, bem como caracterizar a microbiota de fungos e bactérias, buscando elucidar o processo de biorremediação dos lodos. Para isso, a biodegradação dos lodos foi avaliada por respirometria, mensurando alterações nas quantidades de CO2 produzidas pelos diferentes tratamentos durante 68 dias. Foram testados dois biofertilizantes comercialmente disponíveis (In I e In II) para promoção da bioestimulação e bioaumentação. A toxicidade dos tratamentos, antes e após a biodegradação, foi avaliada por ensaios de toxicidade aguda com microcrustáceos (Artemia salina e Daphnia similis) e germinação de sementes (Lactuca sativa e Eruca sativa). Alterações na comunidade microbiana durante a biodegradação desses resíduos foram avaliadas por sequenciamento de alto rendimento. A incorporação dos biofertilizantes aos tratamentos não resultou em aumento da eficiência da biodegradação. Além disso, o biofertilizante In I, quando adicionado ao LTA ou ao LE, ocasionou elevada toxicidade nas amostras iniciais, porém esse efeito foi diminuído ao longo do processo de biodegradação e consequentemente a comunidade bacteriana. O filo das Proteobacteria foi o mais predominante para os tratamentos de LTA+ In I e LE+ In I. A ausência de toxicidade nas amostras biodegradadas sugere que os lodos, após tratamento adequado, podem ser destinados para solos agrícolas como uma alternativa mais sustentável à sua disposição.
  • ItemTese de doutorado
    Estrategias up-stream para a otimização da produção de ramnolipídios a partir de fontes alternativas de carbono: um enfoque na linhagem
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-03) Salazar-Bryam, Ana Maria [UNESP]; Contiero, Jonas [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os ramnolipídeos são biosurfactantes que podem ser produzidos por microorganismos utilizando substratos alternativos, porém a sua produção ainda precisa ser otimizada pois os custos de produção são altos. O objetivo deste projeto foi abordar estratégias up-stream para melhorar a produção de ramnolipídios ao usar fontes de carbono hidrofílicas presentes em resíduos da agroindústria. Foi realizado um processo de otimização do meio de cultivo por meio de planejamento experimental, para encontrar as melhores condições a partir de um meio de cultivo existente, para produzir ramnolipídios a partir de glicerol utilizando a linhagem P. aeruginosa LBI 2A1, foi otimizada a produção e em escala de biorreator e foram obtidos 5,99 g/L de ramnolipídio, um rendimento Yp/s = 0,126, ao utilizar uma proporção C/N de 18. A partir do meio otimizado, foi proposto um processo de evolução adaptativa visando uma melhora no consumo de glicerol para aumentar indiretamente a produção de ramnolipídio; em comparação com a cepa Parental, P. aeruginosa LBI 2A1- T16A, após 65 gerações, aumentou a sua capacidade de produção de ramnolipídio 1,7 vezes (10,21 g/L) utilizando 5% de glicerol (condição inicial do processo de evolução). O experimento de evolução adaptativa permitiu melhorar o consumo de glicerol, direcionando maior fluxo de carbono à síntese da porção hidrofílica (dTPD-L-ramnose), e o crescimento da linhagem estudada, aumentando de forma indireta a produção de ramnolipídios. Como ultima estratégia foi proposta P. fluorescens DSM 50090 pSynPro_8o como um possível candidato para produção heteróloga de ramnolipídios utilizando glicerol e açucares presentes em hidrolisados de biomassa utilizada na agroindústria, respectivamente. Usando glicerol como fonte de carbono foi encontrado que o micro-organismo é um bom candidato para utilizar este substrato na produção de ramnolipídios, foram obtidos 1,65 g/L de ramnolipídio utilizando nitrato de sódio como fonte de nitrogênio e 10 g/L de glicerol. Finalmente, arabinose, glicose, manose e xilose foram avaliadas como possíveis fontes de carbono e P. fluorescens DSM 50090pSynPro_8o produziu 1,37 g/L utilizando glicose como fonte de carbono, e o micro- organismo foi capaz de consumir tanto hexoses quanto pentoses. Ao utilizar um meio simulando as proporções dos açucares de cultivo energético P. fluorescens DSM 50090pSynPro_8o produziu 0,65 g/L de ramnolipídios. Foi possível estabelecer a aptidão da Pseudomonas fluorescens para expressão heteróloga de ramnolipídios utilizando fontes de carbono não convencionais que favorecem o desenvolvimento da bioeconomia.
  • ItemTese de doutorado
    Compostos bioativos produzidos por fungos da Antártica: produção, isolamento e identificação
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-26) Vieira, Gabrielle [UNESP]; Sass, Daiane Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os produtos naturais são uma importante fonte de compostos bioativos com estruturas químicas complexas e diversificadas. Na busca por compostos bioativos, estudos têm explorado a bioprospecção de moléculas produzidas por microrganismos provenientes de ambientes extremos, entre eles, os ambientes terrestre e marinho da Antártica. As condições severas desse habitat requerem a adaptação dos microrganismos ali encontrados para sobrevivência, adaptações que podem ser fisiológicas ou bioquímicas e trazem consigo o desenvolvimento de rotas metabólicas alternativas ou novas, o que potencializa a produção de estruturas químicas únicas por esses isolados. Na agricultura, o interesse pelo emprego de metabólitos bioativos consiste em alternativa aos produtos químicos sintéticos tradicionalmente empregados no controle de pragas, doenças e na promoção do crescimento vegetal, visto que o amplo e continuo uso de alguns produtos pode levar à pressão de seleção entre fitopatógenos e outros impactos ambientais. Na indústria, a procura por compostos alternativos é ponto de interesse de diversos estudos para reduzir a toxicidade de resíduos. Neste contexto, o isolamento e identificação de compostos bioativos produzidos por fungos da Antártica é o foco dessa pesquisa, com o objetivo de explorar o potencial de tais compostos no desenvolvimento de formulações viáveis para a agricultura e, ao mesmo tempo, contribuir para a ampliação do conhecimento da diversidade de metabólitos produzidos por esses isolados. Quatro isolados de sedimentos marinhos, CRM1545A, CRM1540, CRM 1527 e CRM1545B foram cultivados em três meios distintos. O cultivo e bioprospecção da linhagem Penicillium sp. CRM1540 resultou no isolamento de dois compostos bioativos contra fitopatógenos, o ácido penicílico (AP) e o ácido ciclopáldico (AC). O ácido penicílico inibiu o crescimento de Xanthomonas citri subsp. citri em 90% a 25 μg/mL in vitro e diminuiu a emergência de sintomas de cancro cítrico em folhas de Citrus sinensis (L.) Osbeck em 75,31% em casa de vegetação. Experimentos com ácido ciclopáldico, revelaram o potencial desse composto como agente antifúngico contra Macrophomina phaseolina e Rhizoctonia solani. Um composto de interesse na indústria da biomassa, ácido 5- hidroximetil-furano-2-carboxílico foi isolado e identificado a partir do extrato produzido pelo isolado CRM 1545A. Os compostos isolados pela aplicação de métodos de cromatografia e espectroscopia, consistem em potenciais alternativas na formulação de novas moléculas-chave para a agricultura e indústria e provam o potencial de microrganismos de ambientes marinhos extremos como um reservatório de compostos úteis ainda inexplorado.
  • ItemTese de doutorado
    Produção e caracterização de exopolissacarídeo (EPS) bacteriano
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-08) Minari, Guilherme Deomedesse [UNESP]; Contiero, Jonas [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os EPS são polímeros naturais, não tóxicos, biodegradáveis e desempenham um papel importante em uma variedade de mecanismos biológicos. São macromoléculas secretadas por microrganismos compostas por resíduos de monossacarídeos e derivados de açúcares divididos em dois grupos de acordo com sua composição: homopolissacarídeos e heteropolissacarídeos, sendo a diferença entre estes dois grupos os tipos de açúcares que os compõem. A produção de EPS via lactobacilus tem basicamente glicose e lactose como fontes de carbono e, neste estudo, foi demonstrada a possibilidade de utilizar resíduos como melaço de cana-de-açúcar e glicerol como fonte de carbono para produção deste polímero. Para tal, um screening entre 22 cepas de Lactobacillus foi realizado a fim de se determinar a cepa que apresentasse a maior produção, com base no peso seco a 37 ºC, de EPS produzido a partir da composição do meio contendo glicerol como principal fonte de carbono. O processo fermentativo para produção de EPS foi realizado em triplicata em 3 L de meio semi definido (SDM) modificado em bioreator (Zeta). O EPS obtido foi extraído, dialisado, liofilizado e purificado. A quantidade de EPS foi mensurada através da concentração de açúcares totais presente nas amostras por meio do método do fenol ácido sulfúrico e o teor de proteínas foi quantificado de acordo com o método de Lowry. O Lactobacillus casei foi capaz de crescer em meios utilizando fontes de carbono alternativas e capaz de produzir EPS. A caracterização da molécula foi realizada em HPLC, cromatografia por exclusão de tamanho, GC-MS, FT-IR e RMN 1H13C. Os resultados obtidos sugerem que o EPS obtido utilizando glicerol e glicose como fonte de carbono é classificado como heteropolissacarideo composto por glicose e manose com 106 g.mol-1 , e 39,4% de carboidratos e 18% de proteínas, enquanto o EPS obtido utilizando melaço como fonte de carbono é caracterizado como heteropolissacarídeo composto por glicose, galactose e arabinose com 81 g.mol-1 , 52,9% de carboidratos e 11,69% de proteínas. A existência dos polissacarídeos foi comprovada pelas análises de FT-IR e RMN.
  • ItemTese de doutorado
    Proteção de citros com peptídeos antibacterianos e galatos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-20) Dilarri, Guilherme [UNESP]; Ferreira, Henrique [UNESP]; Regasini, Luis Octávio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O Brasil é o maior exportador de suco de laranja concentrado do mundo. Apesar do sucesso da citricultura no país, uma das principais doenças bacterianas que causam grandes perdas na produtividade é o cancro cítrico. Essa doença é causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Para fazer o controle da doença realiza-se o manejo integrado com aplicação constante de soluções cúpricas nos pomares. Porém, o cobre é um metal pesado tóxico para o meio ambiente e para a saúde humana, sendo importante encontrar alternativas, diminuindo assim a aplicação desse metal na citricultura. Logo, o objetivo deste trabalho foi testar dois novos protetivos para folhas de citros contra infecção por X. citri. A primeira plataforma desenvolvida foi baseada em microgéis para liberação controlada de agentes antibacterianos e que contém um peptídeo de ancoragem em sua superfície capaz de promover sua adesão às folhas de citros. Tais géis possuem o galato G6 como agente bactericida imobilizado em sua matriz polimérica. A segunda plataforma proposta foi a de peptídeos antimicrobianos em fusão com peptídeo de ancoragem também para fixação foliar. Os resultados mostraram que de oitos diferentes microgéis sintetizados apenas GMA_hDerm_G6 e GMA_hDerm_AT_G6 apresentaram inibição de X. citri in vitro, com atividade bactericida nas concentrações de 1,375 e 0,343 mg mL-1, respectivamente. Dos peptídeos produzidos, apenas o Melittin_Cg-Def na concentração de 125 µg mL-1 apresentou efeito bactericida em ensaios in vitro. Ensaios de microscopia mostraram que o G6 presente no microgel era o principal agente antimicrobiano, mantendo seu mecanismo de ação mesmo após ter sido imobilizado na matriz polimérica do microgel, afetando a estrutura da membrana citoplasmática e desfazendo o anel divisional da X. citri. O Melittin também continuou apresentando seus mecanismos de ação mesmo após ser fusionado com o peptídeo de ancoragem Cg-Def, apresentando ainda ação na perturbação e rompimento da membrana citoplasmática bacteriana. Os testes de fitotoxicidade e citotoxicidade mostraram que os microgéis e o peptídeo bifuncional eram tóxicos para as sementes de Eruca sativa e para as células J774A.1. Porém, suas toxicidades eram menores que o composto cúprico comercial (Difere). Os resultados em casa de vegetação confirmaram que os microgéis na concentração de 2,75 mg mL-1 e o Melittin_Cg-Def na concentração de 250 µg mL-1 apresentavam uma proteção efetiva contra a infecção da X. citri, reduzindo significantemente o número de lesões por área foliar. Destacou-se nos testes o microgel GMA_hDerm_G6, que mesmo após uma simulação de chuva, continuava protegendo eficientemente as plantas contra a X. citri. Pode-se concluir que ambas as plataformas propostas, utilizando as respectivas construções mostradas no presente trabalho, são uma possível alternativa aos compostos cúpricos aplicados em campo para o controle do cancro cítrico, podendo vir a ser uma alternativa menos tóxica e mais sustentável no manejo da doença.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação de diferentes prebióticos, probióticos e seus metabólitos na inibição de bactérias patogênicas e potenciais aplicações na preservação de alimentos e benefícios à saúde.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-06) Figueiredo, Franciane Cristina de [UNESP]; Oliva Neto, Pedro de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A microbiota intestinal tem papel fundamental na saúde, sendo os suplementos alimentares e outros produtos que proporcionam equilíbrio à microbiota intestinal amplamente estudados nos dias atuais. Dentre esses produtos, destacam-se os probióticos, prebióticos e pós-bióticos. Probióticos são definidos como microrganismos vivos que, quando ingeridos em quantidades adequadas, afetam positivamente a saúde do hospedeiro. Os prebióticos são substratos que alcançam a microbiota intestinal intacta e são capazes de estimular seletivamente o crescimento de probióticos. Postbiotics, contudo, é um novo conceito que define extratos ou sobrenadantes de origem probiótica, livres de células e benéficos à saúde. Esses ingredientes são apresentados como possíveis alternativas ao uso de antibióticos ou podem atuar como conservantes de alimentos, evitando o crescimento de bactérias patogênicas como Salmonella enterica serovar Typhimurium, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, responsáveis por infecções graves. A presente tese teve como objetivo avaliar a inibição dessas bactérias patogênicas por esses ingredientes alimentícios, aplicados isoladamente ou em mistura. Além disso, a estabilidade da atividade antimicrobiana foi avaliada em diferentes condições, juntamente com a caracterização de ácidos orgânicos e testes de aumento de escala. As cepas probióticas foram Bifidobacterium animalis, B. breve, B. lactis, B. longum, Lactobacillus acidophilus e Levilactobacillus. brevis. E. coli foi inibida por todos os postbiotics, tanto isoladamente quanto em misturas. Nenhum postbiotic em dosagens de 6% (v / v) foi capaz de inibir S. aureus. Para Salmonella typhimurium, os postbiotics de B. animalis, B. breve e B. lactis inibiram com sucesso o crescimento do patógeno. Testes com a mistura dos prebióticos frutooligossacarídeos (FOS) e xilooligossacarídeos (XOS) mostraram que, com 10h de cultivo, apenas L. brevis e B. longum foram estimulados, superando o crescimento do controle (glicose). A mistura postbiotic de todas as linhagens de Bifidobacterium inibiu com sucesso o crescimento de Salmonella, entretanto, a adição de postbiotic de Lactobacillus e Levilactobacillus à mistura diminuiu sua atividade inibitória, mostrando um possível antagonismo entre os gêneros. Nenhum postbiotic inibiu o crescimento de qualquer bactéria probiótica, mostrando o potencial para o uso combinado de postbiotic e prebióticos. Os testes de estabilidade revelaram atividade inibitória dos postbiotics após tratamentos com alta temperatura, exceto para os postbiotics de B. longum, provavelmente devido à sua bacteriocina não termo-resistente. Quatro ácidos orgânicos (acético, lático, succínico e fórmico) estiveram presentes em todos os postbiotics, com os ácidos acético e lático presentes em maiores concentrações. Os testes em diferentes faixas de pH revelaram que os ácidos orgânicos apresentam atividade inibitória quando em pH ácido, devido à sua presença na forma indissociada, capaz de entrar na parede celular da bactéria e se dissociar no interior da célula, matando o patógeno. Testes de aumento de escala para fermentadores de 2 litros mostraram que postbiotics da linhagem de B. breve com atividade inibitória satisfatória podem ser produzidos em 24 horas. A concentração de 6% (v / v) deste postbiotic em meio BG contendo açúcares comerciais inibiu com sucesso o crescimento de Salmonella typhimurium, mesmo na presença de açúcares de fácil fermentação. Postibiotic secos de B. breve em estufa (105º C) apresentaram atividade inibitória semelhante com concentrações de 0,9% (m / v). Embora mais estudos sejam necessários para esclarecer a complexa interação dos metabólitos presentes nos postbiotics, a estabilidade da atividade inibitória dessas substâncias após tratamentos com altas temperaturas, baixo pH e após secagem é um atributo que destaca seu potencial de utilização na indústria alimentícia.
  • ItemTese de doutorado
    Características físico-químicas, microbiológicas e ecotoxicológicas de efluentes têxteis e proposta de tratamento por coagulação/floculação
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-05) Mainardi, Pedro Henrique [UNESP]; Bidoia, Ederio Dino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Efluentes têxteis são túrbidos, alcalinos, geralmente constituídos por altas concentrações de corantes, sólidos suspensos e dissolvidos, compostos orgânicos e inorgânicos, além de apresentarem quantidades significativas de bactérias viáveis, coliformes totais, termotolerantes e elevados níveis de ecotoxicidade. Devido ao grande potencial que efluentes têxteis detêm em causarem danos à saúde de humanos e ao meio ambiente, seus tratamentos são considerados como fundamentais. Métodos de coagulação/floculação e adsorção têm sido vistos por serem uma alternativa atraente no tratamento de efluentes têxteis. Os métodos, ainda que tenham demonstrado grande eficácia em estudos laboratoriais, têm enfrentado limitações quanto às suas implementações em escalas reais de tratamento têxteis, relacionadas principalmente com os custos dos processos e com o potencial ecotoxicológico que alguns compostos sedimentadores podem apresentar. Nesta Tese, utilizando-se de planejamentos estatísticos fatoriais e testes ecotoxicológicos de germinação da L. sativa, foi avaliado a eficiência da descoloração e efeito ecotóxico que o sulfato ferroso, policloreto de alumínio, carvão ativado e poliacrilamida aniônica ocasionavam em uma solução que continha o corante Acid Red 114. Os planejamentos experimentais, que possuíam as características de rotatabilidade e ortogonalidade, permitiram analisar com robustez os efeitos individuais e combinados dos fatores, calcular a magnitude da variabilidade experimental e derivar funções que descreviam o comportamento dos resultados. Os modelos estatísticos, sobretudo, foram capazes de estimar as concentrações de coagulantes, floculante e adsorvente que ocasionavam as melhores eficiências de descolorização e os menores efeitos ecotoxicológicos, assim, favorecer a implementação dos métodos em escalas reais de tratamento de efluentes têxteis.
  • ItemTese de doutorado
    Synergy between chemical additives and pretreatments of sugarcane biomass favoring enzymatic hydrolysis and production of fuel ethanol
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-26) Schmatz, Alison Andrei [UNESP]; Brienzo, Michel [UNESP]; Contiero, Jonas [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O bagaço de cana-de-açúcar é matéria-prima na produção de etanol de segunda geração (2G) e produtos de valor agregado com potencial biotecnológico. No entanto, a biomassa precisa de pré-tratamentos para quebrar o complexo celulose-hemicelulose-lignina. Durante os pré-tratamentos ácido e hidrotérmico, pode ocorrer a formação de produtos de degradação de açúcares (tóxico para microrganismos fermentadores), que podem se condensar com fragmentos de lignina formando a pseudo-lignina, prejudicial à hidrólise enzimática. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a remoção de hemicelulose e lignina da biomassa da cana-de-açúcar durante o pré-tratamento ácido diluído e organosolv com adição de antioxidantes de baixo custo, e suas influências na supressão da formação de inibidores e produção de açúcares fermentáveis na fermentação e sacarificação simultânea (SSF). Diferentes frações da cana-de-açúcar apresentaram diferentes recalcitrâncias. A fração externa apresentou menores rendimentos na hidrólise enzimática e 5 g L-1 de ácido acético no hidrolisado do pré-tratamento ácido. O conteúdo de extrativos e lignina foram identificados como fatores chave contribuindo para a formação de pseudo-lignina. A biomassa parcialmente deslignificada e pré-tratada com ácido apresentou rendimentos de aproximadamente 90% de conversão de celulose na hidrólise enzimática (até 12 g L-1). O hidroxibutil tolueno (BHT) demonstrou potencial efeito na remoção de lignina da biomassa no pré-tratamento ácido (121 ° C). Com 50% etanol (v/v), o BHT induziu 10 g 100 g-1 a mais de remoção de lignina. A adição de BHT no pré-tratamento ácido resultou em menor formação de inibidores na fração líquida (0,01 g L-1 de furfural, 0,01 g L-1 de HMF e 0,68 g L-1 de ácido acético) e baixo teor residual de hemicelulose e lignina na biomassa pré-tratada. Todos os 6 compostos químicos (terc-butil hidroquinona; 3-terc-butil-4-hidroxianisol; 3,4,5-trihidroxi benzoato de metila; Tween 20; Tween 80 e dimetilsulfóxido) melhoraram individualmente a remoção de lignina e o rendimento da hidrólise enzimática. O 3-terc-butil-4-hidroxianisol apresentou 71% de remoção de lignina, enquanto o Tween 80 utilizado no pré-tratamento resultou em um material com alta digestibilidade, 98,9% de rendimento de glicose na hidrólise enzimática. Após 48 h de SSF, 17,06 g L-1 de glicose e 15,17 g L-1 de etanol foram observados na biomassa deslignificada e pré-tratada com ácido (DL-PT). A remoção de hemicelulose e lignina resultou em maiores rendimentos de conversão de açúcares. Antioxidantes e surfactantes foram identificados como potenciais removedores de lignina, indicando que podem ser aplicados em processos biotecnológicos.
  • ItemTese de doutorado
    Fungos de solos de recuo de geleiras antárticas: avaliação da diversidade e ecologia
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-09-16) Santos, Juliana Aparecida Dos; Sette, Lara Durães [UNESP]; Duarte, Rubens Tadeu Delgado; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A retração frontal de geleiras é frequentemente considerada como um sinal evidente de aquecimento global. Os solos de geleiras abrigam uma comunidade microbiana ativa de decompositores e frente à retração contínua do gelo, o solo passa a representar um gradiente de fatores físicos, químicos e biológicos que refletem as mudanças regionais ao longo do tempo. A micologia antártica é uma ciência relativamente recente e pouco se conhece sobre a natureza biológica desse grupo de micro-organismos. O presente trabalho é parte dos projetos FAPESP 2016/07957-7, PROANTAR/CNPq MICROSFERA e CNPq Universal (407986/2018-9) e teve como objetivo principal conhecer a diversidade de fungos (utilizando métodos dependentes e independentes de cultivo) de amostras de solo de recuo de duas geleiras situadas na Península Fildes (Ilha Rei George), bem como avaliar a estrutura da comunidade de fungos e correlacioná-la à composição dos solos amostrados. Os resultados obtidos no método dependente de cultivo revelaram a diferença na composição das comunidades fúngicas ao longo do recuo da geleira Collins e a presença de isolados ainda não reportados no ambiente Antártico. Foi isolado um total de 309 fungos distribuídos em 19 gêneros. Os representantes dos gêneros Pseudogymnoascus e Mortierella apresentaram alta prevalência e dominância em todas as amostras. Os dados revelaram a presença de fungos filamentosos pertencentes ao Filo Basidiomycota, raramente isolados na Antártica. As variações ambientais demonstraram ter influenciado os gêneros Pseudogymnoascus e Pseudeutorium. A abordagem independente de cultivo (metabarcoding de DNA ITS1) das amostras do transecto das geleiras Collins e Baranowski, forneceu informações sobre a diversidade e composição das comunidades fúngicas desses ecossistemas. As geleiras Baranowski e Collins apresentaram diferenças na composição das comunidades fúngicas, com predominância de fungos pertencentes aos Filos Ascomycota e Basidiomycota. A composição da comunidade foi espacialmente auto-correlacionada e os resultados indicam uma certa relação com diferentes fatores ambientais, tais como, Argila, Ca e Mn. Os dados obtidos pelo método independente de cultivo possibilitaram acessar uma maior diversidade de fungos quando comparado com o método baseado em cultivo utilizado para avaliar as amostras de solos da geleira Collins. Contudo, os dois métodos revelaram a predominância do Filo Ascomycota no ambiente. No método dependente de cultivo o gênero Pseudogymnoascus foi o mais abundante, corroborando os resultados de outros estudos onde este gênero se apresenta como predominante em amostras marinhas e terrestres da Antártica. Porém, no método independente de cultivo representantes do gênero Pseudogymnoascus não foram os prevalentes nas amostras de solo estudadas. Esta abordagem revelou um total de 190 gêneros nas amostras de solos do recuo da geleira Collins e Baranowski. Os gêneros Verrucaria, Mortierella e Peniophora apresentaram alta abundância e prevalência em todas as amostras. Os resultados gerados nesse trabalho contribuem para a elucidação de lacunas no meio científico, trazendo inovação, conhecimento e dados que podem ser futuramente explorados em âmbito ecológico biotecnológico.
  • ItemTese de doutorado
    Systematics and evolution of Escovopsis and hypocrealean relatives associated with attine ant colonies
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-12-18) Montoya, Quimi Vidaurre [UNESP]; Rodrigues, Andre [UNESP]; Bacci Junior, Maurício [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Escovopsis is a group of fungi that inhabit the colonies of fungus-growing ants. The study of this fungal genus has been based on several assumptions that became dogmas. For instance, i) many fungi associated with attines were treated as Escovopsis, without taxonomic support, ii) the genus was considered a specialized mycoparasite of the attines’ mutualistic fungi, and iii) it was thought that the genus coevolved with attines based on the assumption of its parasitic lifestyle. However, for many years the Escovopsis taxonomy, its relationship with the ants and its phylogeographic distribution were almost an empty space for the scientific community. In addition, the origin of the genus was never addressed. Therefore, the main objective of this study was to build the systematics of the Escovopsis and shed light on its origin, evolution, diversification, and phylogeographic distribution. Three manuscripts are the result of this study and are presented here as chapters. The first manuscript presents the description of two new Escovopsis species (published in MycoKeys). The second manuscript brings the reassessment of the Escovopsis taxonomy, provides a suitable taxonomic and phylogenetic framework for the systematics of the genus, and describes two new Hypocreaceae genera (submitted to IMA Fungus). The third manuscript shows the origin, evolution, phylogeographic distribution and the trait adaptations experienced by Escovopsis since its entry in fungus-growing ant colonies. This study fills an important gap in the taxonomy, systematics, and evolution of Escovopsis and related genera which certainly will help researchers to better understand the evolution of the attines’ system.
  • ItemTese de doutorado
    Produção e destoxificação de hidrolisado ácido de bagaço de cana-de-açúcar visando a otimização de leveduras fermentativas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-27) Candido, João Paulo [UNESP]; Angelis, Dejanira de Franceschi de [UNESP]; Brienzo, Michel [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O etanol de segunda geração (E2G) tem perspectiva de se tornar uma importante alternativa bioenergética. O desenvolvimento dessa tecnologia está associada à utilização de materiais lignocelulósicos, com destaque para subprodutos agrícolas e agroindustriais dos quais são extraídos açúcares fermentesíveis, principalmente xilose e glicose. A hidrólise ácida despolimeriza a hemicelulose contida nestes materiais liberando principalmente xilose. Subsequentemente a celulose é convertida em glicose por hidrólise enzimática. Contudo, os processos químicos para despolimerização da hemicelulose e para alteração da estrutura da celulose produzem compostos tóxicos, como, derivados do furano, fenólicos e ácidos orgânicos, que podem ser prejudiciais à fermentação. Desta forma, este estudo busca destoxificar o hidrolisado ácido de bagaço de cana-de-açúcar utilizando diferentes materiais adsorventes, avaliar a viabilidade celular após a destoxificação, quantificar o rendimento fermentativo utilizando Saccharomyces cerevisiae (PE-2) e Scheffersomyces stipitis (NRRL Y-7124), além de caracterizar quimicamente a vinhaça e avaliar sua biodegradação (Bartha e Pramer, 1965) e toxicidade mediante ensaios com Lactuca sativa e Daphnia similis. A fração líquida obtida do hidrolisado ácido (HA) (pH 5.5) de bagaço de cana-de-açúcar foi utilizada como fonte de pentoses (17.70 g L-1) e melaço (ME) de cana-de-açúcar como fonte de hexoses (47.00 g L-1). Diferentes concentrações ácidas foram utilizadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar (1-5% m/v H2SO4). Foram utilizados os adsorventes: carvão ativado, argila, hidrotalcita e células ativas e inativas de S. cerevisiae and S. stipitis, em concentrações que variaram (1 – 8 % m/v). A fermentação foi conduzida sob 48 h com cultura isolada e cultura mista (S. cerevisiae e S. stipitis). Subsequentemente as vinhaças (vinhaça sem o processo de destoxificação e com o processo de destoxificação) provenientes da fermentação etanólica foram avaliadas sob diferentes concentrações de condicionamento em solo (2,5; 5,0 e 10,0 %) para estudo da biodegradabilidade. O teste de toxicidade foi realizado em concentrações que variaram de 1,5 a 10 %. Resultados de crescimento celular e viabilidade permitiram selecionar as concentrações mais efetivas de adsorventes (4 e 8 % m/v), com destaque para o adsorvente biológico (células ativas de PE-2) que apresentaram remoção de 66 % de furfural, 51 % de 5-hidroxi-metil-furfural (5-HMF) e produtividade alcoólica de 23,5 g L-1 (48 h) quando foi utilizado substrato com HA e ME na presença PE-2 e NRRL Y-7124. Os ensaios de caracterização química indicam alta carga orgânica e mineral nas amostras de vinhaças, compatíveis com a vinhaça de etanol de primeira geração, que sob determinadas condições (condicionamento no solo a 2.5 %) possibilita alta eficiência na biodegradação (> 80 %). Bioensaio com L. sativa sinaliza que a vinhaça proporciona crescimento radicular quando administrada sob baixa concentração (≤ 2,5 %), e toxicidade aguda com 50 % de imobilização para D. similis em concentração na ordem de 4,5 %. Este estudo indica que o uso de adsorventes contribuiu para melhorar a qualidade do hidrolisado, com enfase para o uso do adsorvente biológico, que proporcionou melhores taxas de crescimento cellular, redimento fermentativo e para nos ensaios de biodegradação e toxicidade. Estes dados indicam uma importante aplicação deste material adsorvente na destoxificação de hidrolisado ácido de bagaço de cana de açúcar.
  • ItemTese de doutorado
    Enterobacteriales no litoral de São Paulo: diversidade, resistência e sua relação com a contaminação costeira
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-03-05) Andrade, Vanessa da Costa [UNESP]; Oliveira, Ana Júlia Fernandes Cardoso de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Ambientes costeiros apresentam elevados adensamentos populacionais, exercendo uma pressão seletiva, principalmente quando há a falta de estrutura sanitária adequada. Efluentes podem carrear bactérias patogênicas e antibióticos, gerando uma pressão seletiva aos microrganismos autóctones e criando resistomas. Desta forma, é importante o monitoramento de indicadores de contaminação, como Escherichia coli e Enterococcus sp. Além disto, faz-se importante o estudo dos mecanismos de resistência em áreas ambientais, uma vez que representam um sério risco à saúde pública global. O presente trabalho avaliou a diversidade e perfil de resistência de Enterobacteriales isolados de três áreas com diferentes níveis de contaminação: Praia da Fazenda (Ubatuba/SP), Baía do Araçá (São Sebastião/SP) and Ponta da Praia (Santos/SP).. Entre 2016 e 2018, foram coletadas amostras de água e sedimento para a avaliação da qualidade ambiental (densidades de E. coli e Enterococcus sp.) e diversidade de Enterobacteriales. As cepas de Enterobacteriales foram isoladas, purificadas e identificadas (bioquímica e molecular), e tiveram seu perfil de suceptibilidade avaliado para nove antibióticos, incluindo ertapenem (ERT), meropenem (MPM) e imipenem (IPM). Concomitantemente, as cepas resistentes à carbapenemicos (ERT, IPM e/ou MPM) foram avaliadas para verificar que mecanismo (enzimático ou proteínas da membrana externa) atuava em sua resistência. Os resultados apresentam que nos meses de verão, a Baía do Araçá e Ponta da Praia sofreram influência antrópica, apresentando densidades de E. coli e Enterococcus sp. acima da legislação permitida para água. Uma vez que não há nenhuma legislação específica para sedimento, as amostras de sedimento foram comparadas entre si e com relação aos limites apresentados para amostras de água. Tanto a Ponta da Praia, como a Baía do Araçá, apresentaram maiores densidades para as amostras de sedimento. Ambas apresentaram maiores densidades no verão, tanto para amostras de água, quanto para sedimento. Quanto a diversidade de espécies, a Baía do Araçá apresentou uma riqueza maior de espécies quando comparada com a Ponta da Praia. As amostras de Santos apresentaram uma maior abundância de bactérias patogênicas (e.g. Klebisiella pneumoniae), sendo um sério risco à saúde pública e economia local. Por fim, o perfil de suceptibilidade demonstrou que as cepas isoladas de Santos apresentam maior resistência aos antibióticos estudados. Foram detectadas 11 cepas que eram possíveis produtoras de carbapenemase. Contudo, após as análises moleculares, constatou-se que apresentavam mutações e/ou deleções em algumas Omps, conferindo assim resistência à carbapenêmicos. Em conclusão, pode-se verificar que a contaminação ambiental teve relação direta com o perfil de suceptibilidade das Enterobacteriales estudadas, bem como na sua diversidade. Entretanto, mais estudos fazem-se necessários para uma melhor avaliação de locais menos contaminados, e compreender a variação temporal a longo prazo da comunidade microbiana. O estudo também demonstrou a necessidade de políticas públicas mais rigorosas com relação à ambientes costeiros, especialmente com relação aos sedimentos.
  • ItemTese de doutorado
    Metais em áreas portuárias e sua influência na dinâmica microbiana: da caracterização do problema à busca de soluções
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-03-12) Del Busso Zampieri, Bruna; Fernandes, Ana Julia [UNESP]; Brucha, Gunther; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Atividades portuárias são consideradas fontes de contaminação por metais, que em altas concentrações são tóxicos aos microrganismos, podendo mudar o tamanho, a composição e a atividade da comunidade microbiana. Essa pressão seletiva faz com que bactérias desenvolvam mecanismos para combater o estresse causado por eles. Diversos grupos de microrganismos que desenvolvem sistemas de tolerância a metais podem fazer sua biorremediação. Bactérias redutoras de sulfato (BRS) podem, devido ao seu metabolismo, precipitar metais facilitando sua remoção. A hipótese é que em áreas portuárias exista uma alteração na comunidade microbiana onde são favorecidos microrganismos resistentes, aumentando a chance do isolamento de bactérias resistentes com potencial biotecnológico. Portanto o objetivo dessa tese foi avaliar a influência da contaminação de metais na comunidade microbiana em áreas portuárias e na seleção de cepas resistentes, e isolar cepas de BRS com potencial biotecnológico. Para isso, foram coletados sedimentos de 2 áreas portuárias (Santos e São Sebastião) e uma área pristina (Ubatuba). Foram caracterizadas variáveis ambientais do sedimento (como pH, salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido, porcentagem de matéria orgânica, concentrações de Cr, Cu, Cd e Zn). Foi extraído DNA total do sedimento para caracterização da comunidade utilizando sequenciamento Mi-Seq. Os sedimentos serviram como inóculo para isolamento de cepas que foram submetidas a testes de resistência aos metais. Os sedimentos mais contaminados também serviram como inóculo para enriquecimento de BRS em diferentes concentrações de Cr, Cd, Cu e Zn. Esses enriquecimentos foram monitorados através da redução de sulfato, produção de sulfeto e precipitação de metais. Os enriquecimentos onde houve crescimento de BRS em concentrações altas de metais foram utilizados para isolamento de BRS. As cepas isoladas foram identificadas, caracterizadas quanto as suas exigências nutricionais, resistência aos metais, seu genoma foi sequenciado e os genes envolvidos na resistência aos metais analisados. Houve diferença significativa na composição microbiana das áreas portuárias com a área pristina. A diversidade foi menor nas áreas portuárias. Alguns grupos demonstraram ser mais sensíveis ao Cu, Zn e Cr como Flavobacteriaceae, Pseudoalteromonadaceae, Desulfobacteraceae e Saprospiraceae; ou filo como Chloroflexi, Nitrospirae, Plactomyces. Os metais apresentaram forte influência no metabolismo nos enriquecimentos de BRS, onde havia maior concentração de metal ocorreu menor porcentagem de remoção de sulfato. Cd e Cu foram os metais que mais influenciaram na atividade de BRS. Desulfovibrio foi o gênero de BRS encontrado em maior abundância. Foi isolada a cepa Desulfovibrio sp Fe33, uma nova espécie altamente resistente aos metais testados. A cepa Desulfovibrio sp Fe33, apresenta crescimento rápido e fácil em laboratório. Seu crescimento ótimo ocorre em pH neutro e à 30°C. Apresenta grande versatilidade de crescimento pois utiliza diversos tipos de aceptores e doadores de elétrons. Portanto, em áreas portuárias existe uma alteração na comunidade microbiana devido a presença de metais onde são favorecidos microrganismos resistentes e onde a diversidade microbiana pode ser comprometida. Nessas áreas foi possível o isolamento de uma cepa de BRS altamente resistente, capaz de realizar a precipitação de metais mesmo em concentrações tóxicas desse componente fazendo com que seu uso futuro para tratamento de efluentes contaminados seja eficiente.
  • ItemTese de doutorado
    Tratamento eletrolítico de efluentes têxteis: avaliação da eficiência do processo e do potencial ecotoxicológico utilizando diferentes bioindicadores
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-08-05) Moraes Júnior, José Rubens; Bidoia, Ederio Dino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os efluentes têxteis têm capacidade de proporcionar cor à água de rios e lagos devido aos corantes presentes em sua composição. Além dos problemas estéticos, outros compostos presentes nestes tipos de efluentes podem ser tóxicos à vida aquática. Os processos oxidativos avançados (POA) vem sendo estudados devido a vantagem de serem mais rápidos, produzirem menos resíduos e não demandarem de grandes áreas de instalação quando se comparado a tratamentos convencionais. Este trabalho teve como objetivo a degradação de efluentes simulados contendo o corante Acid blue 40, o corante Acid red 151 e efluente misto contendo ambos os corantes por tratamento eletrolítico utilizando eletrodo de titânio recoberto por titânio/rutênio (70%TiO2/30%RuO2) com área de 40 cm² em um sistema de recirculação. Foi realizado planejamento experimental e por meio de análise de superfície de resposta, configurações de tratamentos otimizados foram realizadas. Foram realizadas análises de espectrofotometria, DQO, DBO, Cor, pH, cloro residual livre e condutividade durante os processos de tratamento. Análise de espectro de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi realizada de todos os tratamentos. Foi também verificada a geração de clorofórmio por meio de análise de cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS). Testes de ecotoxicidade com sementes de alface (Lactuca sativa) e rúcula (Eruca sativa) e com o microcrustáceo Artemia salina foram realizados durante os tratamentos. Teste de mutagenicidade foi realizado utilizando a cepa D7 da levedura Saccharomyces cerevisiae. Os tratamentos otimizados degradaram a cor inicial em concordância com o planejamento experimental. A relação DBO/DQO aumentou durante os tratamentos indicando maior biodegradabilidade dos efluentes simulados após o tratamento eletrolítico. A análise de cor em 3 comprimentos de onda indicou que os subprodutos finais de todos os tratamentos apresentam cor amarelada. Análise de espectro de infravermelho sugeriu a produção de subprodutos tóxicos como nitro compostos durante os tratamentos, com a maioria sendo degradada ao fim dos processos. A análise de GC-MS para clorofórmio indicou a presença de baixas concentrações deste composto. Os testes de ecotoxicidade com a semente de L. sativa indicou toxicidade para o tratamento contendo o efluente Acid blue 40 enquanto o teste com a semente de E. sativa e com o microcrustáceo A. salina indicaram toxicidade para o tratamento do efluente contendo o corante Acid red 151. Por fim, apesar de apresentar sensibilidade a ataque mutagênicos, a cepa S. cerevisiae D7 não indicou mutagenicidade para nenhum dos tratamentos realizados.
  • ItemTese de doutorado
    Diversidade de fungos em Eucalyptus microcorys F. Muell, da Floresta Estadual Edmundo Navarro de Andrade, Rio Claro-SP
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-10-05) Lacerda, Lorena Tigre [UNESP]; Rodrigues, Andre [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O eucalipto pode ser considerado uma das plantas economicamente mais importantes do mundo. Isso é devido às diversas aplicações na indústria, tais como: fabricação de móveis, papel e celulose, carvão vegetal, óleos essenciais, mel, entre outras. O Brasil é o maior produtor mundial de eucalipto, com mais de cinco milhões de ha plantados. A Floresta Estadual Edmundo Navarro de Andrade (FEENA) é considerada o “berço do eucalipto” no Brasil e apresenta a maior diversidade dessa planta fora do seu local de origem (Oceania). No entanto, pouco se sabe sobre a riqueza de espécies fúngicas associada à Eucalyptus spp. da FEENA. Assim, o objetivo desse trabalho foi descrever a comunidade fúngica presente em diferentes fases foliares de Eucalyptus microcorys F. Muell, uma espécie pouco explorada em relação a sua diversidade microbiana. Inicialmente foram avaliadas duas técnicas de isolamento (fragmentos foliares e filtração de partículas), a fim de delimitar o método que melhor representasse a comunidade fúngica endofítica associada às folhas frescas. Em seguida, selecionamos a técnica de filtração de partículas para investigar a comunidade sapróbia em diferentes fases foliares da serrapilheira do eucalipto. Os isolados fúngicos foram identificados quanto às características morfológicas e sequenciamento de fragmentos do DNA genômico. Ao todo, foram recuperadas 3.267 colônias fúngicas, distribuídas em 87 taxa. As principais conclusões desse estudo foram: (i) Sugerimos a utilização das técnicas de fragmentos foliares e filtração de partículas como métodos complementares de isolamento para avaliar a comunidade de fungos endofíticos; (ii) E. microcorys hospeda uma grande diversidade de espécies fúngicas associada às folhas. As comunidades de fungos da serapilheira dessa planta diferem significativamente da comunidade encontrada nas folhas frescas. Além disso, a diversidade de fungos encontrada no folhedo diminui conforme a fase de decomposição da folha. No entanto, o contrário pode ser observado em relação à abundância de algumas espécies; (iii) Relatamos novas ocorrências de fungos para o Brasil, bem como um novo gênero (Mycrocylindroseptoria), com base em marcadores morfológicos e moleculares. Portanto, nossos resultados demonstram a importância de estudos que abordem a diversidade fúngica associada às folhas de eucalipto, para descoberta de novas ocorrências e novos taxa fúngicos.
  • ItemTese de doutorado
    Estudo do metabolismo dos ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-11-21) Silva, Vinícius Luiz da [UNESP]; Contiero, Jonas [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Surfactantes são moléculas anfipáticas, que devido à presença de regiões com polaridades distintas apresentam propriedades únicas como a capacidade de reduzir a tensão interfacial e superficial. Os biossurfactantes são moléculas biológicas que podem ser sintetizados por uma ampla gama de seres vivos, no entanto os produtores mais estudados são os micro-organismos. Apesar das inúmeras vantagens dos tensoativos biológicos, como baixa toxicidade, biodegradabilidade e alta estabilidade, estes compostos não são amplamente utilizados, devido ao custo de produção. Por esse motivo, o presente estudo realizou a construção de linhagens mutantes, com a deleção de genes específicos, rhlG e rhlYZ e o mutante com a deleção dupla. Posteriormente foram realizados bioprocessos em biorreator, utilizando óleo de girassol e glicerol como fonte de carbono. Esses cultivos permitiram verificar a influência de cada um dos genes na biossíntese dos ramnolipídios. Os dados dos cultivos foram utilizados ainda para traçar os fluxos metabólicos das diferentes linhagens de P. aeruginosa MPAO1, a fim de entender melhor o metabolismo dos ramnolipídios e gerar dados para discussão de modificações genéticas dirigidas que visem o aumento da produção. Verificou-se ainda uma nova aplicação para esses glicolipídios, visando a remoção de azocorantes de soluções aquosas. Os cultivos permitiram inferir que o gene rhlG não é essencial para a produção dos ramnolipídios, pois sua deleção não resultou em queda na produção dos ramnolipídios, já o operon rhlYZ se mostrou necessário para a produção de ramnolipídios quando a fonte de carbono empregada foi hidrofóbica. As análises de fluxo levaram a inferir que a porção hidrofílica seja o gargalo na produção desses biotensoativos. Além disso estudou-se a adsorção do corante têxtil utilizando os ramnolipídios como adsorvente, demonstrou que essas biomoléculas apresentam potencial de biorremediação dos corantes em solução aquosa, a adsorção foi melhor em pHs ácidos
  • ItemTese de doutorado
    Despolimerização de Polietilenotereftalato (PET) mediada por fungos filamentosos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-10-08) Picca, Lusiane Malafatti [UNESP]; Angelis, Derlene Attili de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As características de recalcitrância e insolubilidade em água tornam a disposição final de polímeros, um grande problema para sociedade moderna. Estima-se que em 30 anos, a quantidade de garrafas de polietilenotereftalato (PET) presentes no ambiente marinho irá se igualar à quantidade de peixes. Estratégias que programem a reciclagem de polímeros pós-consumo, tais como a despolimerização ou degradação de PET têm sido estudadas. Para contribuir com essa proposta, foram pesquisadas linhagens de fungos filamentosos com potencial para despolimerização de PET. Cem linhagens foram obtidas de diversos ambientes: amostras de água de rios do entorno de uma refinaria e de dentro dessa; cutícula de formiga; solo sob o plantio de Citrus; ar e de fragmentos de garrafa. Os isolados foram submetidos a uma triagem de atividades hidrolíticas para esterases e lipases por: ensaios em placas; análises de alto desempenho (HTS) com sondas esterificadas fluorogênicas com cadeias de 2 e 8 carbonos, e avaliação da capacidade de despolimerização de nanopartículas de PET. Nove isolados foram selecionados por apresentar promissoras atividades enzimáticas e são pertencentes aos gêneros Microsphaeropsis, Mucor, Trichoderma, Westerdykella e Pycnidiophora e seis linhagens foram capazes de converter as nanopartículas de PET em concentrações acima de 0,8% de ácido tereftálico (PTA): Curvularia sp, Trichoderma spp (2), Cladosporium sp e Microsphaeropsis (2). Estudos confirmatórios de fermentação foram conduzidos em fragmentos de PET de garrafas de diferentes cristalinidades. Dados de despolimerização foram obtidos pela quantificação do monômero PTA, bis-2-hidroxietiltereftalato (BHET) e metil-2-hidroxietiltereftalato (MHET), análises de espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e avaliações de atividades de lipases e esterases nos líquidos fermentados. As linhagens eleitas liberaram PTA em concentrações acima de 12 ppm, BHET e MHET em concentrações acima de 0,6 ppm e também promoveram alterações na estrutura química e superfície dos fragmentos de PET. Os resultados corroboram que substratos associados a hidrocarbonetos são importantes fontes de microrganismos para aplicação em tecnologias ambientais. Por fim, este trabalho trouxe importante contribuição para estudos de biodegradação de polímeros, uma vez que destacou linhagens até então pouco estudadas para esta aplicação biotecnológica.
  • ItemTese de doutorado
    Qualidade sanitária da Baía do Araçá, São Sebastião (SP)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-04-27) Doi, Sonia Assami [UNESP]; Oliveira, Ana Julia Fernandes Cardoso de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A Baía do Araçá apresenta grande complexidade morfofisiológica e ambiental e uma grande diversidade de organismos aquáticos e terrestres. A avaliação das densidades de microrganismos indicadores de contaminação fecal é fundamental para determinar a qualidade microbiológica, tanto da água, como do sedimento. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a qualidade microbiológica da água e do sedimento, determinando a densidade de E. coli, Enterococcus spp. e da levedura do gênero Candida. Os resultados foram correlacionados com as variáveis abióticas e comparados com a legislação vigente. Também foi analisado a densidade e diversidade de fungos filamentosos isolados da água e do sedimento. Para avaliar a qualidade microbiológica, amostras de água e de sedimento foram coletados na região entremarés da Baía do Araçá (São Sebastião/SP), em campanhas no verão e no inverno durante dois anos. Foi utilizado a Técnica de Membrana Filtrante para determinar a densidade das bactérias Escherichia coli, Enterococcus spp. e da levedura Candida spp. e a Técnica Spread Plate para determinar a densidade dos fungos filamentosos. A análise estatística foi utilizada testes não paramétricos, Análise de Correspondência Canônica e o Índice de Shannon e Chao1 para determinar a diversidade de fungos. Os resultados obtidos mostraram que as densidades microbianas foram maiores nos sedimentos em relação à amostra da água. As maiores densidades de Enterococcus spp., Candida albicans, C. krusei, C. tropicalis e C. glabrata foram obtidas no inverno, em oposição ao E. coli que foi obtida no verão. Comparando os dados coletados com a Resolução CONAMA nº 274/00, as amostras indicaram condições ambientais impróprias para uso recreativo. Não foram observadas correlações significativas das variáveis abióticas com as densidades das bactérias e leveduras. Foram detectadas elevadas densidades de Enterococcus sp. e de Candida tropicalis tanto na amostra da água como no sedimento, indicando que este resultado é preocupante quanto à qualidade sanitária do ambiente. Dentre os gêneros de Enterococcus sp. foi detectado uma elevada presença de E. faecium na água e no sedimento. A densidade dos fungos filamentosos foram muito mais elevadas em relação às bactérias, sendo identificados ao total 15 gêneros. A análise constante da densidade de bactérias e de leveduras patogênicas é importante para determinar a qualidade ambiental e os possíveis riscos que esta contaminação pode acarretar na saúde dos homens e animais. Apesar da contaminação e do impacto que caracteriza a qualidade da Baía, ela deve ser preservada por possuir microrganismos que podem servir de fonte para bioprospecção de novos produtos com potencial aplicação biotecnológica.
  • ItemTese de doutorado
    Chalconas e curcuminoides como novas alternativas para combater o cancro cítrico e alguns patógenos de interesse clínico
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-11-08) Morão, Luana Galvão [UNESP]; Ferreira, Henrique [UNESP]; Regasini, Luis Octavio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O cancro cítrico é uma das doenças mais preocupantes no âmbito da citricultura. Causado pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri está doença caracteriza-se pela aparição de lesões eruptivas e corticosas, castanho-amareladas em diversas partes aéreas das mais variadas espécies de Citros, sendo algumas mais susceptíveis que outras. Além disso, a infecção bacteriana na planta hospedeira desencadeia algumas alterações fisiológicas e metabólicas da planta dentre elas a produção demasiada de etileno, o que causa outro sintoma característico da doença, a queda prematura de frutos, o maior problema que o cancro cítrico acarreta, uma vez que os frutos não estão maduros e prontos o suficiente para serem colhidos e comercializados, podendo gerar prejuízo ao citricultor. Até o momento não há substâncias que sejam eficientes contra a bactéria Xanthomonas citri. Existem apenas medidas paliativas e, essencialmente, preventivas tais como a utilização de quebra ventos nos pomares, controle de mudas sadias, controle da larva minadora (Phyllocnistis citrella) e pulverização massiva de soluções de cobre fixo. A aplicação de soluções cúpricas é prejudicial ao meio ambiente, uma vez que o cobre tem efeito tóxico, cumulativo, carcinogênico e mutagênico, em pequenas quantidades. Sabe- se, também que há genes de resistência ao cobre, já existentes em X. citri. Paralelamente ao setor citrícola, tem-se a indústria farmacêutica e o extremo desafio em descobrir e produzir novas classes de antimicrobianos que apresentem capacidade de aniquilar diversas bactérias patogênicas de interesse clínico. O grande problema enfrentado, neste caso, é o uso incorreto de antimicrobianos existentes combinado com o aumento desenfreado de resistência bacteriana e ainda com a burocracia e alto custo nas pesquisas de ponta visando novas substâncias bioativas. Considerando a necessidade da obtenção de novas classes de substâncias potencialmente ativas e com menor taxa de toxicidade, tanto no setor citrícola quanto farmacêutico, nosso grupo de pesquisa, em colaboração com o Instituto de Química (Laboratório de Química Verde Medicinal) da UNESP de São José do Rio Preto e Universidade de Groningen, na Holanda, objetivaram a síntese de classes de compostos derivados de substâncias naturais, a fim de avaliar sua capacidade antimicrobiana frente ao fitopatógeno Xanthomonas citri subsp. citri bem como a alguns microrganismos de interesse clínico e modelos microbiológicos, tais como B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa, S. enterica Typhimurium, E. faecalis e S. aureus. Ao todo foram testadas três classes de compostos sintéticos derivadas de curcumina e chalconas pelo método de microdiluição REMA. Também foi investigado o modo de ação dos compostos que foram bioativos, através de diversas técnicas: ensaio da integridade de membrana citoplasmática, ensaio de disrupção de septo de divisão celular, análise com FT-IR, análise da atividade GTPásica de FtsZ (associado ao septo de divisão celular), avaliação de síntese de macromoléculas através de radiomarcadores (para DNA, RNA, proteínas e parede celular) e dosagem de ATP intracelular para avaliar perturbação na via energética. Nove compostos foram ativos contra B. subtilis, seis contra X. citri e dois contra S. aureus, atingindo um percentual de inibição de crescimento bacteriano maior que 90%. Testes realizados em plantas infectadas com X. citri, tratada com os compostos, mostraram a eliminação da capacidade de causar cancro comparado aos controles negativos. Os testes do modo de ação destes compostos sugeriram que alguns podem ter ação multi target, outro composto mostrou ação específica na desestruturação da integridade da membrana citoplasmática e outro ainda demonstrou agir na disrupção do septo de divisão celular bacteriana. No entanto análises futuras e novos testes do modo de ação podem confirmar e completar esses resultados.