Dissertações - Farmacologia e Biotecnologia - IBB

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    Avaliação dos efeitos do tratamento com nitrito de sódio na atividade gelatinolítica das metaloproteinases 2 e 9 em modelo de hipertensão gestacional em ratas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-08-23) Martins, Laisla Zanetoni; Dias Junior, Carlos Alan Candido [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A pré-eclâmpsia (PE) é um distúrbio hipertensivo materno associado a disfunção vascular e restrições de crescimento fetal e placentário. A isquemia placentária é sugerida como o principal desencadeador de deficiências associadas à PE tanto do óxido nítrico (NO) endotelial quanto da atividade da metaloproteinase-2 da matriz extracelular (MMP-2) vascular. A pressão de perfusão uteroplacentária reduzida (RUPP) é um modelo de isquemia placentária de PE. A redução do nitrito de sódio em NO pode ocorrer durante condições isquêmicas. No entanto, os efeitos do nitrito de sódio no modelo RUPP de PE ainda não foram investigados. Portanto, o presente estudo investigou a redução de nitrito de sódio a NO durante condições isquêmicas induzidas por RUPP e se a restauração da biodisponibilidade de NO circulante protege contra hipertensão gestacional e disfunção vascular associadas à redução da atividade gelatinolítica de MMP-2. Para atingirmos estes objetivos, ratas prenhes foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos: ratas prenhes normotensas (Norm-Preg), ratas prenhes tratadas com nitrito de sódio (Preg+Nitrito), ratas com PE (RUPP) e ratas com PE tratadas com nitrito de sódio (RUPP+Nitrito). A pressão arterial materna,os parâmetros fetais e placentários foram registrados. A função vascular, os metabólitos circulantes do NO e a atividade gelatinolítica da MMP-2 vascular também foram examinados. Nossos resultados mostraram que o nitrito de sódio atenua a hipertensão da gravidez, previne a perda de peso fetal e placentário, neutraliza a hiperreatividade vascular e restaura parcialmente os metabólitos do NO e a atividade da MMP-2. Nós concluímos que a redução do nitrito de sódio em NO pode ocorrer durante a isquemia placentária induzida por RUPP, atenuando assim a hipertensão da gravidez, a restrição do crescimento fetal e placentário e a hiperreatividade vascular associada à PE e possivelmente restaurando os níveis de NO e a atividade da MMP-2 que estão relacionados aos efeitos anti-hipertensivos .
  • ItemDissertação de mestrado
    Avaliação dos efeitos do isoflurano na biodisponibilidade de óxido nítrico na hipertensão gestacional em ratas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-31) Rodrigues, Serginara David; Dias Junior, Carlos Alan Candido [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A disfunção endotelial induzida por hipertensão na gravidez associada a distúrbios hemodinâmicos é um desafio para procedimentos urgentes que requerem anestesia materna. O anestésico volátil isoflurano demonstrou efeitos protetores associados ao óxido nítrico (NO). O comprometimento da biodisponibilidade do NO também tem sido relacionado a distúrbios hipertensivos da gravidez. No entanto, esse efeito induzido pelo isoflurano ainda não está claro na hipertensão na gravidez. Portanto, o presente estudo examinou os potenciais efeitos protetores da anestesia com isoflurano na disfunção endotelial e nas alterações hemodinâmicas induzidas pela gravidez hipertensiva associada à restrição do crescimento fetal e placentário. Os animais foram distribuídos em quatro grupos: ratas grávidas normotensas (Preg), ratas grávidas anestesiadas (Preg+Iso), ratas grávidas hipertensas (HTN-Preg) e ratas grávidas hipertensas anestesiadas (HTN-Preg+Iso). Pressões arteriais sistólica, diastólica e média, frequência cardíaca, peso fetal e placentário, contração vascular, vasodilatação dependente de NO derivado do endotélio e níveis de NO foram avaliados. Os níveis do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a expressão da fosforilação da NO sintase (eNOS) Serina (1177) (p-eNOS) também foram examinados. Nossos resultados demonstram que a anestesia com isoflurano produziu efeitos hipotensores mais expressivos, efeitos relacionados à prevenção contra perdas de peso fetal e placentário, resposta vasocontrátil hiper-reativa, vasodilatação dependente de NO derivado do endotélio prejudicada, níveis reduzidos de VEGF e expressão diminuída de p-eNOS nas ratas HTN-Preg+Iso comparadas ao grupo HTN-Preg. Em conclusão, a anestesia com isoflurano protege a função endotelial materna na hipertensão da gravidez e, possivelmente, o NO derivado do endotélio está envolvido.
  • ItemDissertação de mestrado
    Investigação de parâmetros reprodutivos em ratos machos expostos ao psicoestimulante Lisdexanfetamina do período juvenil a peripuberdade
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-28) Stein, Julia [UNESP]; Arena, Arielle Cristina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um distúrbio do neurodesenvolvimento comum em crianças e adolescentes, com maior incidência de diagnósticos no sexo masculino. Desatenção, hiperatividade e impulsividade em níveis acima do esperado são os principais sintomas do TDAH, afetando negativamente a vida diária dos pacientes. O tratamento adequado é essencial e baseia-se numa estratégia multimodal, com intervenções cognitivo-comportamentais e tratamento farmacológico, geralmente com medicações estimulantes. Um dos principais medicamentos utilizado é o Dimesilato de Lisdexanfetamina (LDX), uma formulação de liberação prolongada, pois é uma pró-droga da dextroanfetamina, hidrolisada no interior dos eritrócitos. Sua ação é mediada pelo aumento dos níveis de catecolaminas, principalmente dopamina e noradrenalina, nas fendas sinápticas. Como os neurotransmissores influenciam o controle hormonal e atuam diretamente nas gônadas, a LDX poderia interferir no desempenho reprodutivo. O período juvenil e a peripuberdade são janelas críticas do desenvolvimento, mais susceptíveis ao efeito de substâncias exógenas. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da exposição ao LDX do período juvenil até a peripuberdade sobre os parâmetros de toxicidade sistêmica e reprodutiva de ratos machos. Ratos Wistar machos (23 dias de idade) foram divididos em um grupo controle (água deionizada) e três grupos expostos a LDX em doses terapêuticas (convertidas para dose animais): 5,2; 8,6 e 12,1 mg/kg/dia. O tratamento ocorreu do dia pós natal 23 (DPN) ao 53, via gavage. Durante o tratamento, foram avaliados sinais clínicos de toxicidade, peso corporal, ingestão de água e ração, comportamento social de brincar e estabelecimento da puberdade. No dia pós-natal (PND) 54, metade dos animais foi morta para peso dos órgãos, análise hematológica e bioquímica, histologia testicular e estresse oxidativo do testículo. Na vida adulta (PND 90), os animais foram avaliados quanto ao comportamento sexual masculino e parâmetros de fertilidade. No DPN 120, os animais foram mortos para registro do peso dos órgãos, parâmetros hematológicos e espermáticos, contratilidade do ducto deferente, histologia testicular e estresse oxidativo do testículo. Observou-se redução no consumo diário de ração e água durante o período de tratamento. Na avaliação do comportamento social de brincar, os animais apresentaram redução nos comportamentos sociais totais. Nenhum grupo experimental teve o dia da separação prepucial alterado em relação ao controle, mas o peso dos animais do grupo de maior dose foi reduzido neste dia. No DPN 54, vários parâmetros foram alterados, principalmente relacionados à toxicidade sistêmica: redução do ganho de peso corporal, aumento do peso relativo do fígado, baço e glândula seminal, redução da contagem de eritrócitos e leucócitos, redução dos níveis de proteínas totais e alterações em parâmetros oxidativos. Na idade adulta, o comportamento sexual masculino e a fertilidade não foram alterados. Já no DPN 120, houve aumento de espermatozoides do tipo C (imóvel), diminuição da contagem nos testículos e epidídimos, alterações histológicas nas células de Leydig e nos túbulos seminíferos e alteração dos parâmetros oxidativos. Com base nos dados apresentados, o LDX foi capaz de induzir distúrbios nos parâmetros toxicológicos sistêmicos (principalmente durante o tratamento) e na função reprodutiva (principalmente na vida adulta), indicando que o uso deste medicamento deve considerar esses aspectos
  • ItemDissertação de mestrado
    É possível diferenciar tumores primários e metástases cerebrais utilizando análises de textura?
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-11-22) Guassu, Raissa Alexia Camargo; Pina, Diana Rodrigues de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A diferenciação entre tumores cerebrais primários e metástases solitária cerebral são de suma importância, pois requerem condutas de tratamentos diferentes. O diagnóstico definitivo em procedimentos invasivos, como a biópsia cerebral estereotáxica, apresenta certo risco aos pacientes. Dessa forma, alternativas para diagnóstico não invasivo estão sendo intensivamente estudadas para auxiliar na diferenciação dessas lesões, de modo a otimizar na relação risco benefício do paciente e custo para a instituição. Essa pesquisa, teve como objetivo a diferenciação entre tumores cerebrais primários e metástases solitária cerebral. Para atingir esse objetivo, foram utilizados métodos computacionais, para classificação e diferenciação dessas lesões cerebrais, com aprendizado de máquina (AM) aplicado em análises de texturas nas regiões de interesse (ROI). O banco de dados foi constituído a partir de exames retrospectivos de Ressonância Magnética (RM) de encéfalo de pacientes do Hospital das Clínicas de Botucatu (HCFMB)-UNESP. As sequências utilizadas foram: imagem ponderada em difusão (DWI), sequência de recuperação de inversão atenuada por fluido (FLAIR), imagem ponderada em T1 com e sem contraste endovenoso, imagem ponderada em T2. ROIs de 10x10 pixels e 32x32 pixels foram posicionadas nas imagens. Para cada ROI, 40 parâmetros de textura foram extraídos através do software Matlab® e aplicados aos seguintes métodos de AM: naive bayes, support vector machine (SVM), stochastic gradient descente (SGD), random forest (RF), tree e neural network (NN). Com a ROI de 10x10 pixels, foram obtidos diferenciação entre os casos estudados de até 97,5% de AUC usando o SVM na sequência DWI e 94,9% de F1 usando a SGD na sequência ponderada em T1. Para o estudo com ROI de 32x32 pixels, o melhor resultado alcançado foi na sequência T2 com uma AUC de 99,8%, obtendo uma excelente diferenciação e 98,5% de F1, ambos com o classificador NN. A ROI de 32x32 pixels apresentou resultados consistentes e ligeiramente superiores ao da ROI 10x10 pixels e menor variação entre os classificadores analisados. Essa pesquisa traz contribuições originais para a comunidade científica, além de apresentar um grande potencial técnico, como uma ferramenta para auxiliar no diagnóstico diferencial clínico na análise de imagens de ressonância magnética do sistema nervoso central.
  • ItemDissertação de mestrado
    Predição de batimento cardíaco fetal por meio de inteligência artificial e de variáveis morfológicas, morfocinéticas e relacionadas com a paciente
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-02) Chéles, Dóris Spinosa; Nogueira, Marcelo Fábio Gouveia [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As tecnologias de reprodução assistida vêm sendo cada vez mais utilizadas e aprimoradas com o passar do tempo. Para a transferência embrionária, a escolha do embrião de melhor qualidade é uma etapa decisiva para a ocorrência de gestação. Para isso, os embriologistas dispõem de sistemas de classificação no momento da avaliação embrionária. Entretanto, esta avaliação é dependente da experiência que os embriologistas possuem e consequentemente é influenciada pela subjetividade intrínseca, tanto entre avaliadores diferentes quanto pelo mesmo avaliador. Além disso, os conhecimentos acerca dos tempos do desenvolvimento embrionário – facilitado pela implementação do sistema time-lapse na rotina laboratorial – e acerca das características relacionadas com a paciente que passa pelo tratamento de reprodução assistida são fatores que podem auxiliar no momento da seleção embrionária, e potencialmente, melhorar a taxa de gestação obtida em clínicas. Portanto, uma forma de avaliação objetiva é necessária para melhorar o sucesso destas tecnologias. Assim, foram utilizados três conjuntos de variáveis de entrada distintas (morfologia do blastocisto, morfocinética embrionária e características relacionadas com a paciente) para a aplicação em inteligência artificial (redes neurais artificiais e algoritmo genético). Para a morfologia, foi realizado o processamento digital de imagens de blastocistos humanos para a obtenção de variáveis preditivas da qualidade do blastocisto. Para a morfocinética, foram utilizados parâmetros relacionados aos tempos do desenvolvimento embrionário. Para a paciente, foram elaboradas pontuações para cada variável de entrada com base em pesquisa bibliográfica. Estes conjuntos de variáveis foram treinados e simulados separadamente e em conjunto para predizer o batimento cardíaco fetal. Além disso, os três conjuntos juntos também foram utilizados para predizer o nascimento vivo. Considerando os três conjuntos juntos como entrada, a melhor rede neural artificial encontrada para a predição de batimento cardíaco fetal obteve uma acurácia geral de 95,2% no treinamento e 78,4% na simulação. Já a melhor rede encontrada para a predição de nascimento vivo obteve uma acurácia geral de 98,0% no treinamento e 81,1% na simulação. Dessa forma, a aplicação de inteligência artificial apresenta potencial para auxiliar, de forma objetiva, os embriologistas durante a escolha do embrião mais apto para a transferência, e assim, transpassar do campo in silico (laboratorial) em direção à prática clínica na reprodução assistida.
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    Análise da ploidia de embriões humanos por meio da Inteligência Artificial com o uso de variáveis de morfologia, morfocinética e variáveis relacionadas com a paciente
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-24) Souza, Rebeca Colauto Milanezi de; Rocha, José Celso [UNESP]; Nogueira, Marcelo Fábio Gouveia [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A infertilidade é considerada um problema de saúde mundial que afeta cerca de 15% dos casais em idade reprodutiva. As atuais tecnologias empregadas pelas técnicas de reprodução assistida não são totalmente eficazes, sendo a taxa de sucesso gestacional consideravelmente baixa (cerca de 25 a 40%). Assim, a escolha do embrião de melhor qualidade é fundamental para o sucesso das duas principais técnicas de reprodução assistida, a fertilização in vitro e a injeção intracitoplasmática de espermatozoides. A taxa de sucesso dessas técnicas pode ser influenciada pela presença de aneuploidias embrionárias, as quais podem resultar em falha de implantação, em abortos e mesmo em malformações nos nascidos vivos. Para evitar técnicas invasivas de análise genética dos embriões, (por exemplo, a biópsia embrionária que utiliza irreversivelmente parte das células embrionárias para a análise genética), a Inteligência Artificial associada ao processamento de imagens do blastocisto, pode vir a ser um caminho alternativo. Nesse sentido, essa técnica pode vir a viabilizar a análise genética embrionária de forma não invasiva, a um baixo custo e de forma objetiva. Com isso, o objetivo deste trabalho foi adaptar um software já desenvolvido (como uma plataforma inicial) para a previsão da ploidia dos embriões humanos, distinguindo os embriões euploides dos embriões aneuploides. Para isso foram utilizadas as técnicas de Inteligência Artificial, como as Redes Neurais Artificiais e os Algoritmos Genéticos, associadas com a aplicação das variáveis oriundas do processamento digital de imagens dos blastocistos (variáveis morfológicas), da morfocinética (tempos de clivagem e de desenvolvimento do embrião) e variáveis da paciente em conjunto com as variáveis celulares que possam auxiliar na verificação da ploidia embrionária. No total, 574 embriões – com respectivos dados da morfocinética e dados das pacientes – foram avaliados. Esses dados foram obtidos de pacientes submetidas a ciclos de fertilização de maio de 2019 a março de 2021. A melhor rede neural artificial obtida foi aquela em que foram aplicadas as variáveis da morfologia, morfocinética e da paciente com as variáveis celulares (com diagnóstico específico para os fatores de infertilidade). Nesta rede, o acerto geral foi de 98,6% no treinamento, de 80,0% no teste, de 69,2% na simulação e de 64,7% no teste-cego. Com esses resultados, é possível concluir que a rede neural artificial obtida tem uma acurácia considerável na predição da classificação embrionária quanto à ploidia, sendo uma alternativa para viabilizar a análise genética embrionária de forma não invasiva, a um baixo custo e de forma objetiva. No entanto, apesar dos resultados promissores, concluímos que essas tecnologias precisam ser analisadas em estudos prospectivos e não somente em estudos retrospectivos, como o do presente trabalho, objetivando uma melhor análise de sua eficácia.
  • ItemDissertação de mestrado
    Influência da exposição in utero a ondansetrona: possíveis efeitos teratogênicos e repercussão tardia em parâmetros reprodutivos e comportamentais em ratos machos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-25) Reis, Ana Carolina Casali; Arena, Arielle Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A ondansetrona é um antagonista altamente seletivo do receptor de serotonina 5HT3, utilizado na prevenção e tratamento de náuseas e vômitos. É considerada uma droga de categoria B, contraindicada para mulheres grávidas sem orientação médica ou do cirurgião dentista, no entanto é amplamente utilizada para aliviar náuseas e vômitos na gestação. Poucos dados avaliando o uso deste medicamento durante a período gestacional estão disponíveis na literatura. Dessa forma o objetivo é avaliar os possíveis efeitos teratogênicos e impactos tardios da ondansetrona em parâmetros reprodutivos e comportamentais na prole masculina após exposição intrauterina. Para isso, ratas Wistar com diagnóstico de prenhez foram alocadas em três grupos (n=20/grupo), sendo um grupo controle (água destilada) e dois grupos tratados com diferentes doses de ondansetrona (1,7 ou 2,5 mg/kg/dia, via oral). Parte dos animais n=10/grupo foi exposta ao medicamento do 6° ao 15° dia de prenhez (período correspondente a organogênese), e a outra parte foi exposta durante todo o período de prenhez, abrangendo o primeiro pico de testosterona, essencial para o processo de diferenciação sexual hipotalâmica. Os resultados gerados indicam que ondansetrona não foi capaz de alterar significativamente o processo de diferenciação sexual hipotalâmica, não havendo alterações em marcadores de masculinizacão e puberdade respectivamente: distância anogenital e separação prepucial. Demais parâmetros espermáticos e férteis avaliados permaneceram inalterados, limitando seus impactos a vida peripubere alterando o padrão de comportamento social. Avaliações do caráter teratogênico não indicou que o uso de ondansetrona durante a organogênese aumenta o risco de malformações externas, viscerais ou esqueléticas. No entanto mudanças em parâmetros bioquímicos e histológicos de ratas prenhas tratadas do dia de prenhez 6 ao 15 apontaram para lesão renal.
  • ItemDissertação de mestrado
    Nova metodologia de estimativa de exposição ocupacional em radiologia intervencionista
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-29) Oliveira, Abner Alves [UNESP]; Pina, Diana Rodrigues de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A Radiologia Intervencionista é uma área da medicina que utiliza radiação ionizante como guia de intervenções. Os valores de dose aos quais os intervencionistas são expostos são difíceis de padronizar. Nesta pesquisa é apresentado uma avaliação das exposições ocupacionais nos seguintes procedimentos vasculares: angiografia coronariana, angioplastia coronariana, angiografia cerebral, angiografia de extremidades e angioplastia de extremidades. Essa pesquisa foi abordada em 2 etapas. A primeira etapa caracterizou-se a exposição ocupacional, através de dosimetria de Luminescência Opticamente Estimulada (OSL) em diferentes partes do corpo: cristalino, tireoide, tórax, abdômen, pés e mãos. Foi realizado em três modalidades diferentes de procedimentos de radiologia intervencionista: coronariano, cerebral e periféricas. Na segunda etapa foi determinado a dose efetiva através da dosimetria, utilizando a conversão de 6 regiões com dose superficial em aventais plumbíferos para 26 regiões internas. Através de parâmetros de rotina, foi estimado a dose efetiva através do Produto Kerma Área (PKA) obtido através de equipamentos fluoroscópicos, onde a estimativa é realizada através de fator obtido para cada modalidade. As doses efetivas, calculada através da dosimetria e estimada por PKA, foram comparadas através do método de Bland Altman avaliando a concordância entre os dois métodos. A utilização de fatores experimentais para estimar a dose efetiva é proposta para auxiliar o programa de radioproteção. As maiores doses equivalentes encontradas foram abdômen e mãos para as modalidades coronarianas e periféricas, cristalino e mãos para modalidades cerebrais. A dose no tórax como representativo para o corpo todo pode subestimar outras doses como abdômen, extremidades e cristalinos. As modalidades coronarianas e cerebral apresentaram viés entre -1 e 0 µSv, onde a estimativa através do PKA infere valores de dose efetiva próximos ao calculado por dosímetros. As modalidades periféricas apresentaram um viés entre -11 e -7 µSv subestimando a dose efetiva, onde a proximidade do intervencionista implica em maiores níveis de exposições de radiação espalhada em contraste com menores valores de PKA, devido as regiões de extremidades.
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    Inovações metodológicas para estimar densidade da mama em distintas composições mamárias
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-01) Santos, Alexandre Locci Nogueira dos; Miranda, Diana Rodrigues de Pina [UNESP]; Alves, Allan Felipe Fattori [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A mama é uma glândula sudorípara modificada, e apresenta em sua composição elementos como, gordura, glândulas, componentes fibrosos e uma rede vascular. A densidade mamária, considerada um biomarcador do câncer, está diretamente relacionada com o risco aumentado de desenvolver câncer de mama. A mamografia continua a ser a mais importante técnica de imagem para as mamas. Trata-se do método de escolha para o rastreamento populacional do câncer de mama em mulheres assintomáticas. Sendo a primeira técnica de imagem indicada para avaliar a maioria das alterações clínicas mamárias, podendo levar ao diagnóstico precoce do câncer de mama. Entretanto uma atenção especial deve ser dada à um órgão tão radio sensível como a mama. Devemos considerar possíveis efeitos biológicos devidos à radiação em pacientes que realizam um exame mamográfico bienalmente (a partir dos 50 anos) até a expectativa de vida da mulher (em torno de 79 anos). Rotineiramente a composição mamária é realizada de maneira subjetiva por especialistas da área de radiologia, onde este apresenta um score de 25% entre distintas mamas. Esta pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento de uma ferramenta computacional para estimar com precisão o percentual da densidade mamária, em exames de mamografia (CR e FFDM) e avaliar a lipossubstituição dos tecidos da mama ao longo dos anos de vida da paciente. Foi utilizado um algoritmo, previamente desenvolvido pelo grupo de pesquisa, o qual segmenta a área do tecido fibroglanduar da imagem mamográfica. As imagens obtidas foram classificadas conforme a área de tecido fibroglandular e comparados com a avaliação do BI-RADS. Uma correspondência da liposubstituição mamária deve ser obtido, utilizando um banco de dados de 5000 exames do HCFMB-UNESP. Os resultados que foram obtidos nessa pesquisa podem auxiliar diretamente na prática clínica, determinando a correta quantidade de cada tecido mamário, e consequentemente a correta porcentagem de densidade mamária, podendo ajudar a selecionar precocemente indivíduos que apresentam elevado risco de desenvolvimento de câncer e assim iniciar intervenções de forma preventiva. As análises estatísticas de regressão linear entre a quantificação da densidade mamária na mamografia e a quantificação da densidade mamária na ressonância magnética apresentaram coeficiente de correlação R2 = 0,8491. A diferença percentual média entre os dois métodos foi de 3,73% ± 5,66%. Os coeficientes de correlação de Pearson adquiridos foram de 0,9214. Esses resultados mostraram uma forte associação entre o percentual de densidade mamária obtido pela metodologia da mamografia e os resultados obtidos pela análise direta de ressonância magnética. A metodologia desenvolvida para mensurar a densidade mamária apresentou boa correlação com a verdade fundamental. Podendo ser utilizada em sistemas de mamografia CR e FFDM utilizando imagens processadas, auxiliando assim o médico radiologista no diagnóstico. Em paralelo, analisamos a lipossubstituição dos tecidos constituintes da mama ao longo dos anos de rastreamento do câncer de mama. Portanto, como nosso banco de dados é composto por mulheres assintomáticas, pudemos analisar esse comportamento de lipossubstituição tecidual ao longo dos anos de vida da mulher.
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    Prospecção de ativos vegetais para o controle da dilatação de poros faciais
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-06) Henrique, Lais Janaína Aparecida; Di Stasi, Luiz Cláudio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os poros são pequenas estruturas presentes na superfície da pele, associadas as glândulas sudoríparas e sebáceas, as quais podem ser afetadas por fatores endógenos e exógenos com decorrente aumento de seu tamanho. As principais causas para essa ocorrência são a alta excreção de sebo e a diminuição da elasticidade da pele, resultante especialmente do envelhecimento cutâneo. Atualmente, são encontrados produtos referidos para minimizar a aparência dos poros faciais, no entanto, o tratamento padrão para este tipo de característica envolve o uso do ácido retinóico, que apesar de promover bons resultados, também possui efeitos colaterais relevantes. Neste contexto, o presente estudo foi desenvolvido, visando identificar ativos vegetais capazes de interferirem na dilatação dos poros da pele, com potencial para posterior desenvolvimento de dermocosméticos. Para tanto, foi avaliada a atividade de 45 extratos vegetais na expressão de 45 genes associados ao processo de envelhecimento cutâneo e 14 relacionados à sebogênese, utilizando explantes de pele humana, como estratégia de seleção de produtos mais promissores para a realização de posteriores testes in vitro acerca da síntese proteica de elastina. As análises de expressão gênica mostraram que o produto composto por 2% de frutos da banana nanica verde (Musa sp AAA) aumentou a expressão dos genes FN1, NFE2L2, SMAD2, PRMD1 e SMURF2. Além disso, o produto composto por 0,05% de lenteína (Lentein complete) aumentou a expressão dos genes COL5A1; COL7A1; RXRA; HSP47; SIRT3; SIRT6; SOD1; HYAL1; JUN; MMP12; DGTA1 e SRD5A1. Nos testes in vitro, o extrato de banana nanica verde promoveu aumento na síntese de elastina em concentrações adequadas após tratamento, assim como a lenteína também foi capaz de aumentar esta produção. Dessa maneira, é possível concluir que ambos os extratos foram capazes de modular importantes genes associados aos processos de envelhecimento e de sebogênese, assim como de aumentar a produção de elastina. Os resultados indicam a potencialidade de desenvolvimento de dermocosméticos com esses ativos vegetais, com ação antienvelhecimento da pele e na redução de poros.
  • ItemDissertação de mestrado
    Contração uterina em ratas prenhes: comparação entre as técnicas de biosusceptometria de corrente alternada e banho de órgãos isolados.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-17) Bittencourt, Gabriela Nogueira [UNESP]; Miranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A contração muscular uterina é um processo fisiológico característico das fibras musculares. Durante o período gestacional, o útero passa por diversas alterações visando o desenvolvimento sadio do feto. Sendo assim, o monitoramento das contrações uterinas durante a gravidez é fundamental para fornecer dados acerca da saúde materna e fetal e consequentemente, garantir que a gestação transcorra bem. Em experimentação animal, a técnica de banho de órgãos isolado é a mais utilizada. No entanto, se faz necessário o desenvolvimento de metodologias in vivo para monitorar esse processo. A Biosusceptometria de Corrente Alternada (BAC) é uma técnica in vivo capaz de detectar e monitorar materiais magnéticos em sistemas biológicos. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo a validação da BAC (in vivo) com a técnica de Banho de Órgãos Isolado (ex vivo) para avaliação da contratilidade uterina de ratas prenhes. Foram utilizadas vinte e oito ratas Sprague-Dawley com 60 dias de idade, distribuídas aleatoriamente em três grupos: dia 0 (n = 6), dia 14 (n = 5) e dia 21 (n = 17) de prenhez. Cada animal foi submetido a medidas no sensor de BAC e em seguida foram eutanasiados e tiras do corno uterino foram preparadas para análise no banho de órgãos isolados. Os evento de contratilidade uterina obtidos por ambas as técnicas foram classificados em oscilações basais e contrações intensas. Os perfis registrados pela BAC nos dias 0 e 14 foram similares, em contraste com o perfil obtido no dia 21. Com relação aos perfis obtidos através do banho de órgãos isolados, foi registrado um padrão de contrações intensas e regulares em todos os dias de prenhez analisados. A análise dos resultados obtidos pela BAC mostrou que o útero exibe perfis de contrações distintos ao longo da prenhez, sendo caracterizado por um período de quiescência e próximo ao parto, contrações intensas e regulares. A diferença entre os perfis obtidos entre as duas técnicas sugerem que hormônios sexuais exercem um papel fundamental na regulação das contrações durante a prenhez. Este estudo sugere que a BAC pode ser uma ferramenta interessante para estudos in vivo, podendo contribuir para estudos futuros envolvendo patologias, hormônios e fármacos que podem alterar a contratilidade uterina durante a gestação.
  • ItemDissertação de mestrado
    Efeitos da dieta enriquecida com resíduo da indústria alimentícia e fibra solúvel isolada sobre dieta obesogênica em camundongos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-13) Cruz, Vinícius Marques da; Di Stasi, Luiz Claudio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Atualmente a obesidade é considerada um dos principais problemas de saúde pública no âmbito global. Diversas evidências sugerem que o desenvolvimento da obesidade está associado a inflamação de baixo grau e a disbiose da microbiota intestinal (MI). Dessa maneira intervenções dietéticas capazes de modular a produção de ácidos graxos de cadeia curta e a MI tem sido utilizadas como formas alternativas de tratamento complementar para a obesidade. No presente estudo foi avaliado o efeito preventivo de uma fibra solúvel isolada e de um resíduo da indústria alimentícia administrados de maneira isolada ou em associação sobre modelo de indução da obesidade em camundongos e foi verificado se este efeito está associado à modulação da produção de ácidos graxos de cadeia curta. Foram utilizados 72 camundongos da linhagem C57BL/6 machos distribuídos em 8 grupos (n = 8 – 10): O período de experimentação foi de 12 semanas, durante o qual foi registrada a evolução ponderal e o consumo de ração e água. Após às 12 semanas os animais foram decapitados e tiveram seus órgãos, tecido adiposo e sangue coletados para posterior análise de parâmetros relacionados aos perfis bioquímico, histológico e molecular, indicadores toxicológicos e dosagem de ácidos graxos de cadeia curta. Todas as estratégias de intervenções dietéticas associadas RH foram capazes de evitar o ganho de peso e atuaram sobre níveis séricos de leptina de maneira positiva em comparação ao grupo Controle. Nenhum indicativo de toxicidade foi observado durante o período experimental. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que as três estratégias de tratamento foram capazes de evitar o ganho de peso frente a exposição a RH atuando sobre o perfil lipídico, inflamatório e/ou através da modulação da produção de ácidos graxos de cadeia curta.
  • ItemDissertação de mestrado
    Papel da EPPIN (Epididymal protease inhibitor) sobre a maturação pós-testicular de espermatozoides de camundongos: consequências para a função espermática.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-09) Silva, Alan Andrew S. [UNESP]; Silva, Erick Jose Ramo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Cerca de 40% das 215 milhões de gestações que ocorrem anualmente no planeta não são planejadas pelos casais, das quais 20% acabam em abortamentos. Este cenário reforça a necessidade do desenvolvimento de novos métodos contraceptivos, em especial os masculinos, cujas opções atuais limitam-se ao preservativo e vasectomia. A EPPIN (Epididymal protease inhibitor) é uma proteína rica em resíduos de cisteína que contém em sua sequência primária os domínios inibidores de protease do tipo WFDC (N-terminal) e Kunitz (C-terminal). A EPPIN é encontrada na superfície do espermatozoide, onde exerce um papel fundamental essencial na função do gameta masculino. A relevância da EPPIN como alvo espermático para contracepção masculina foi demonstrada pelos efeitos inibitórios de anticorpos anti-EPPIN e de ligantes orgânicos de baixo peso molecular sobre a motilidade do espermatozoide humano e de primatas não-humanos. O desenvolvimento de fármacos contraceptivos com alto grau de eficácia e segurança baseados na EPPIN como alvo molecular requer um profundo entendimento de suas funções e mecanismos moleculares pelos quais esta proteína regula a fertilidade masculina. Visando fomentar avanços nesse sentido, investigamos o papel da EPPIN em eventos associados à motilidade e capacitação espermática, bem como impacto da maturação póstesticular sobrea distribuição celular da EPPIN em espermatozoides de camundongos. Para determinar o efeito da maturação e capacitação espermática sobre a localização da EPPIN no espermatozoide murino, realizamos ensaios de Western blot e imunofluorescência. Para investigar o papel da EPPIN no controle da motilidade espermática, avaliamos o efeito de anticorpos anti-EPPIN que reconhecem epítopos nos domínios Kunitz (anticorpo S21C e F21C) e WFDC (anticorpo Q20E) sobre parâmetros de motilidade e cinemática por análise computadorizada (CASA). Detectamos uma dinâmica na presença da EPPIN na fração solúvel em Triton X-100, na fração enriquecida de membrana, e em associação com estruturas do citoesqueleto de espermatozoides epididimários, sugerindo uma associação entre o grau de maturação espermática e a distribuição celular da EPPIN. Observamos que o anticorpo S21C, mas não o F21C, inibiu a motilidade espermática progressiva e hiperativada. Em suporte a estes achados, o anticorpo S21C alterou os parâmetros de cinemática que descrevem a progressividade (VSL, VAP e STR) e o vigor (VCL, ALH e LIN) do movimento espermático. Interessantemente, o fragmento S21C Fab reproduziu efeitos similares ao total, indicando que a ligação monovalente ao epítopo S21C é suficiente para afetar a motilidade e hiperativação espermática. Por sua vez, o anticorpo Q20E (inteiro e fragmento Fab) inibiu a motilidade progressiva e os parâmetros de cinemática (VAP, VCL, ALH) de forma menos intensa em comparação ao anticorpo S21C. Visando investigar o mecanismo de ação associado aos efeitos dos anticorpos anti-EPPIN sobre a motilidade progressiva e hiperativada, avaliamos a fosforilação da proteína quinase A (PKA) e a produção de adenosina 3’-5’- monofosfato cíclico (AMPc) associados à capacitação por Western blot e AlphaScreen. Nossos resultados demonstraram que o anticorpo S21C induziu aumento na PKA total/PKA fosforilada, sem alterar e os níveis intracelulares de AMPc. Em conclusão, o domínio Kunitz da EPPIN desempenha papel essencial na regulação da motilidade espermática e hiperativação, e seu domínio WFDC pode contribuir para com estes efeitos. A presença da EPPIN em estruturas associadas ao citoesqueleto celular reforça o seu envolvimento em eventos associados à motilidade espermática. Os achados deste estudo contribuem para o desenvolvimento da EPPIN como alvo farmacológico para contracepção masculina.
  • ItemDissertação de mestrado
    Investigação do papel da EPPIN no controle da função espermática: impacto na capacitação e no potencial fértil de espermatozoides de camundongos.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-30) Raimundo, Tamiris Rocha Fanti; Silva, Erick Jose Ramo da [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Proteínas do plasma seminal se ligam aos espermatozoides e controlam eventos associados à motilidade e capacitação espermática. Dentre essas proteínas, destacamos a semenogelina-1 (SEMG1), que é a proteína mais abundante do plasma seminal humano e inibe a motilidade progressiva e a capacitação do espermatozoide. A SEMG1 regula a função do espermatozoide ligando-se à proteína EPPIN (do inglês, Epididymal protease inhibitor protein), presente na superfície espermática. A demonstração de que ligantes da EPPIN, como anticorpos e moléculas orgânicas de baixo peso molecular mimetizaram os efeitos da SEMG1 na inibição da motilidade espermática tornou a EPPIN um alvo para a contracepção masculina. Visando avançar no entendimento dos aspectos funcionais e moleculares associados ao controle da função espermática pela EPPIN, nosso laboratório vem utilizando o camundongo como modelo experimental. Demonstramos anteriormente que a SVS2 (do inglês, seminal vesicle secretory protein 2), ortóloga à SEMG1, é uma proteína de interação da EPPIN em espermatozoides de camundongos, sugerindo que os papéis da EPPIN em eventos relacionados à função espermática são conservados entre camundongos e humanos. Essa hipótese é sustentada por observações de que a SEMG1 humana e a SVS2 murina inibem eventos associados à capacitação espermática, como a reação acrossômica e a hiperativação, via mecanismos ainda pouco conhecidos. Considerando: (i) o efeito inibitório de anticorpos anti-EPPIN miméticos à SEMG1 sobre a motilidade espermática; e (ii) o efeito inibitório da SEMG1 e da SVS2 sobre a capacitação espermática, neste trabalho testamos a hipótese de que anticorpos anti-EPPIN modulam efeitos moleculares e funcionais associados à capacitação espermática. Para isto, induzimos a capacitação de espermatozoides de camundongos na presença e ausência de anticorpos anti-EPPIN (10-300 μg/ml) que reconhecem epítopos específicos na região N-terminal (anticorpos Q20E e F15C) e C-terminal (anticorpo S21C) ou da SVS2 murina recombinante (1-25 μM) e avaliamos os seguintes parâmetros: (i) fosforilação de resíduos de tirosina, serina/treonina e de substratos da proteína quinase A (PKA); (ii) taxa de reação acrossômica espontânea e induzida por ionóforo de cálcio (A23187); e (iii) taxa de fertilização in vitro (FIV). Observamos que a incubação com a SVS2r diminuiu a fosforilação de proteínas induzida pela capacitação. Por outro lado, os anticorpos Q20E, F15C e S21C não afetaram o perfil fosfoproteico dos espermatozoides. Com relação à atividade da PKA, que foi avaliada de forma indireta pela abundância dos seus substratos fosforilados, identificamos que o anticorpo S21C, mas não o Q20E, aumentou a atividade da PKA em espermatozoides capacitados. Além disso, os anticorpos S21C e Q20E não modificaram as taxas de reação acrossômica espontânea e induzida (A23187); porém, o anticorpo F15C induziu aumento na taxa de reação acrossômica induzida por A23187. Por fim, observamos que o anticorpo S21C promoveu diminuição das taxas de FIV. Em conjunto, nossas descobertas expandem os caminhos pelas quais a EPPIN deve ser explorada com relação aos seus papéis em eventos moleculares e funcionais do espermatozoide e para o desenvolvimento de um contraceptivo masculino não hormonal.
  • ItemDissertação de mestrado
    Influência de pressões e viscosidades no tempo de flutuação e na taxa de liberação de comprimidos magnéticos flutuantes avaliados por Biosusceptometria AC
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-08) Rodrigues, Gustavo Serafim [UNESP]; Miranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O desenvolvimento de formas farmacêuticas para liberação controlada de fármacos, como comprimidos, tem aumentado significantemente ao longo dos anos, com o objetivo de se obter um tratamento mais eficaz e de melhor aceitação do paciente. Os sistemas gastrorretensivos, são um tipo de liberação controlada de fármacos, que tem por principal objetivo o aumento do tempo de retenção gástrica (TRG) de formas farmacêuticas sólidas. Dentre os sistemas gastrorretensivos, os sistemas flutuantes ou sistemas controlados dinamicamente são sistemas que apresentam baixa densidade, possuem capacidade suficiente para flutuar sobre o conteúdo gástrico e permanecer flutuando no estômago sem afetar a taxa de esvaziamento gástrico por um período de tempo prolongado. Isso resulta em um aumento do tempo de retenção gástrica (TRG) e um melhor controle na concentração plasmática do fármaco liberado. O emprego de técnicas biomagnéticas, como a Biosusceptometria AC (BAC) para avaliar formas farmacêuticas flutuantes no TGI tem apresentado bons resultados ao longo do tempo. Desta maneira, a proposta deste trabalho consistiu na avaliação do tempo de início de flutuação que vem do termo em inglês (Floating Lag Time- FLT) e a taxa de liberação de comprimidos magnéticos flutuantes de sistemas gastrorretensivos flutuantes magneticamente marcados que promovam a liberação controlada do metronidazol in vitro, aplicando diferentes pressões e viscosidades no meio, simulando diferentes partes do estômago humano em diferentes estados prandiais. Para este estudo, foram preparadas quatro soluções, sendo uma considerada padrão com viscosidade similar à da água (1 mPa.s), e as outras com 50, 120 e 320 mPa.s. Para cada solução foram aplicadas 3 pressões diferentes (atm, 150 e 300 mmHg). Foram avaliados o início do tempo de flutuação (FLT) e a taxa de liberação do metronidazol para meio viscoso, aplicando as diferentes pressões para cada meio. O dispositivo BAC monosensor foi empregado para a avaliação em tempo real do processo de início de flutuação da FFS flutuante a partir de um escaneamento e posteriormente foi feita uma imagem magnética do mesmo. Todas os experimentos foram realizados com as soluções com pH 1,2 e temperatura de 37±0,5 ºC. Os resultados da taxa de liberação do metronidazol e o tempo de início de flutuação (FLT) revelaram que o aumento de pressão não apresentou diferença significativa na taxa de liberação do metronidazol nos diferentes meios, porém aumentou de forma significativa o FLT dos comprimidos, principalmente aplicando a pressão de 300 mmHg. Já as diferentes viscosidades dos meios, apresentaram diferenças significativas na taxa de liberação do metronidazol e no FLT, principalmente para o meio com viscosidade de 320 mPa.s. Esses eventos ocorrem, pois com o aumento da viscosidade, se forma uma camada densa ao redor do comprimido, com isso o fluxo de fluído para o interior do comprimido ocorre de forma mais lenta, resultando no retardo de reação do fluído com o núcleo do comprimido, diminuindo a liberação do fármaco para o meio e consequentemente o tempo de início de flutuação (FLT).
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    Influência da exposição lactacional ao antidepressivo venlafaxina: repercussão tardia em parâmetros reprodutivos e comportamentais, em ratos machos.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-27) Moreira, Suyane Da Silva [UNESP]; Arena, Arielle Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A prevalência global de depressão pós-parto é estimada em 100-150 casos a cada 1000 nascimentos, e um dos medicamentos mais indicados para o tratamento é a venlafaxina, um Inibidor da Recaptação da Serotonina e Noradrenalina (IRSN). Como a serotonina possui papel chave no desenvolvimento do cérebro, estudos demonstram que a exposição pré e pós-natal aos IRSNs pode alterar os eixos hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) e hipotálamo-hipófise-gonada (HHG) e afetar processos dependentes de hormônio, como o processo de diferenciação sexual hipotalâmica. Em virtude da importância da testosterona no processo de diferenciação sexual hipotalâmica, torna-se preocupante o uso de antidepressivos durante a gestação e lactação. Desta forma, objetiva-se, neste estudo, avaliar os possíveis efeitos resultantes da exposição lactacional a venlafaxina e suas repercussões tardias sobre parâmetros reprodutivos, em ratos machos. Para tanto, ratas lactantes foram expostas a três doses de venlafaxina (3,85; 7,7 ou 15,4 mg/kg), via gavage, do 1º dia até o 20º dia pós-parto. No 5º dia de lactação, as mães foram submetidas a avaliação de comportamento materno, e ao final do período de exposição, as mesmas foram eutanasiadas e coletou-se sangue e órgãos para investigações posteriores. Após o nascimento, os filhotes machos foram avaliados através dos seguintes parâmetros: determinação do peso corporal, distância anogenital, idades de separação prepucial, descida testicular e play behavior. Na vida adulta, estes mesmos animais foram investigados em relação ao: pesos de órgãos reprodutores, contagem espermática, morfologia e motilidade espermática, teste de fertilidade, comportamento sexual masculino, presença de comportamento sexual feminino e preferência sexual, dosagem hormonal e foram coletados hipotálamos para análise da expressão de receptores de andrógenos por meio de western blotting. Em relação aos parâmetros maternos avaliados, houve aumento do peso do baço e uma elevação nos níveis de ureia e ácido úrico séricos, além disso não houve alteração no comportamento materno. A análise do desenvolvimento inicial da prole masculina mostrou um aumento do peso corporal do grupo de menor dose no 13º dia pós-natal, porém essa diferença foi normalizada no 22º dia. Também foi observado uma diminuição em parâmetros do play behavior no grupo de dose intermediária. Na idade adulta, os filhotes machos expostos a dose intermediária apresentaram um aumento no peso da vesícula seminal. As análises espermáticas indicaram uma redução do número de espermatozoides progressivos em todos os grupos experimentais, além de um aumento do número de espermatozoides moveis no grupo de maior dose. Foi observado também uma diminuição do índice de masculinização após o teste de fertilidade, e em relação aos testes de comportamento e preferência sexual não houve alterações estatísticas entre os grupos, no entanto, foi detectado uma redução da expressão de receptores de andrógenos no hipotálamo no grupo de maior dose. Conclui-se que a exposição a Venlafaxina foi levemente tóxica para as ratas lactantes e prejudicial para o desenvolvimento cognitivo da prole masculina, além de provocar alterações espermáticas relevantes, apesar de não comprometer parâmetros comportamentais sexuais na vida adulta. São necessários mais estudos para melhor compreender o papel da Venlafaxina no processo de espermatogênese, bem como no processo de diferenciação sexual hipotalâmica.
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    Efeitos da adição de Neurorregulina 1 no meio de maturação in vitro sobre o desenvolvimento oocitário e embrionário em bovinos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-01) Dellaqua, Thaisy Tino [UNESP]; Buratini Junior, José [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A produção in vitro de embriões (PIV) bovinos apresenta impacto positivo sobre melhoramento genético, produtividade e lucratividade da pecuária, embora sua eficiência seja reconhecidamente baixa. A maturação oocitária in vitro (MIV) é considerada o principal gargalo tecnológico da PIV. Os protocolos vigentes para MIV não refletem a fisiologia e determinam descompasso entre a maturação nuclear e citoplasmática do oócito, o que desperta interesse no desenvolvimento de abordagens para melhorar as taxas de maturação e fertilização. A neurorregulia 1 (NRG1), um fator EGF-like específico que modula as vias induzidas por EGFR, principalmente ampirregulina (AREG), ajustou a retomada da meiose e melhorou a taxa de fertilização em camundongos. O objetivo central deste estudo foi investigar os efeitos da adição de NRG1 durante a MIV sobre a progressão meiótica e desenvolvimento embrionário em bovinos, associada a uma estratégia de MIV induzida com AREG. A NRG1 atrasou a quebra da vesícula germinativa e melhorou o desenvolvimento embrionário, aumentando a produção de embriões transferíveis e o número total de células dos blastocistos. O presente estudo mostrou, pela primeira vez, a atividade da NRG1 durante a maturação de oócitos bovinos, capaz de beneficiar a competência oocitária e, consequentemente, a PIV.
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    Aplicações do problema inverso na Biosusceptometria AC para reconstrução e quantificação de distribuições de nanopartículas magnéticas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-26) Biasotti, Gabriel Gustavo de Albuquerque; Miranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Próspero, André Gonçalves; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Aplicações biomédicas de nanopartículas magnéticas (MNPs – do inglês Magnetic Nanoparticles) têm se tornado cada vez mais comuns, onde as aplicações mais conhecidas são em diagnósticos de tumores, seu uso no tratamento por hipertermia e entrega de fármacos de maneira controlada. Para isso são essenciais técnicas capazes de detectar, localizar e quantificar as MNPs em meios biológicos. A biosusceptometria AC (BAC) é uma técnica biomagnética com histórico de estudos farmacológicos e fisiológicos utilizando marcadores magnéticos macroscópicos e, mais recentemente, na avaliação da circulação sanguínea, retenção hepática, perfusão renal e cerebral e a biodistribuição de MNPs. Diferente das outras técnicas, não há histórico da reconstrução de imagens quantitativas ou quantificação direta de materiais magnéticos via sistema BAC. Para outras técnicas biomagnéticas reconstruções quantitativas da distribuição espacial de MNPs já foram realizadas com sucesso por meio da resolução do problema inverso. A proposta desse trabalho foi criar e implementar modelos matemáticos e computacionais para a resolução do problema inverso dos sistemas BAC Mono Canal (B1C) e BAC Multi Canal 19 (B19C) para reconstruções quantitativas da distribuição 2D de MNPs. Para o B1C, foi possível reconstruir as distribuições de MNPs com boa resolução espacial (1 voxel/cm), tempo de escaneamento de 6 minutos e sensibilidade de 0.85 mg de MNPs nos objetos simuladores (fantomas cúbicos contendo MNPs de ferrita de manganês imobilizadas em gesso) distantes em 5 mm da superfície do sensor. Para o B19C, as imagens quantitativas foram reconstruídas em tempo real com resolução espacial moderada (0.33 voxels/cm) e sensibilidade de 0.71 mg de MNPs em objetos simuladores (MNP Perimag ® plain) distantes em 3 mm da superfície do sensor. A modelagem e simulação computacional do sistema BAC resultou em ganhos significativos na qualidade das imagens obtidas, além de permitir a recontrução quantitativa da distribuição espacial de MNPs pela primeira vez na literatura. Os resultados desse trabalho são de grande valia e permitirão novas aplicações e aprimoramento dos trabalhos do grupo que estão em andamento. Sendo assim, os resultados aqui obtidos podem e serão aplicados em diversos outros trabalhos envolvendo experimentação biológica in vitro e in vivo.
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    Papel das proteínas do plasma seminal SVS2 e SVS3 sobre a motilidade de espermatozoides de camundongos: repercussões para a função espermática e fertilidade
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-07-27) Andrade, Juliana de Jesus; Silva, Erick José Ramo da [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Proteínas do plasma seminal possuem o importante papel de regular a função espermática, sendo fundamentais para a fertilidade masculina. Em primatas e roedores, as proteínas mais abundantes do plasma seminal são as semenogelinas (SEMG1 e SEMG2) e as SVS’s (SVS2 e SVS3; seminal vesicle-secretory proteins), respectivamente, as quais possuem similaridades funcionais e estruturais. Essas proteínas fazem parte de uma família conhecida como REST (Rapidly-evolving seminal vesicle-transcribed), sendo abundantemente expressas pela glândula seminal de mamíferos. A SEMG1 interage com o espermatozoide ejaculado e inibe a sua motilidade, capacitação e reação acrossômica. Por sua vez, a SVS2 também inibe a capacitação e a reação acrossômica no espermatozoide murino, sendo estes efeitos inibitórios potencializados pela SVS3. Entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos da SVS2 e SVS3 na motilidade espermática. Neste estudo, testamos a hipótese que a SVS2 inibe a motilidade espermática em camundongos, e que a SVS3 facilita esses efeitos inibitórios. Também caracterizamos o perfil de expressão e distribuição da SVS2 e SVS3 (RNAm e proteína) no sistema reprodutor de camundongos machos, bem como sua regulação por androgênios. Para isto, processamos órgãos reprodutivos para ensaios de RT-PCR, RT-qPCR, Western blot e imuno-histoquímica, e espermatozoides epididimários para ensaios de imunofluorescência após incubação com a SVS2 e SVS3A murinas recombinantes (SVS2m e SVS3m) ou fluído da glândula seminal. Além disso, para avaliar o impacto da SVS2m e SVS3Am sobre a motilidade espermática, incubamos espermatozoides da cauda do epidídimo com diferentes concentrações de SVS2m e SVS3m recombinantes, isoladas ou em associação, e avaliamos a motilidade pela plataforma CASA (computer-assisted sperm analysis). Nossos resultados demonstraram que SVS2 e SVS3 (RNAm e proteína) são diferencialmente expressos em tecidos reprodutivos de camundongos machos. Os transcritos Svs2 e Svs3 foram detectados na glândula seminal, mas também em outros tecidos do sistema reprodutor, como cauda do epidídimo, ducto deferente, próstata ventral, e no testículo (somente Svs3). Os resultados de Western blot revelaram a expressão da SVS2 pela presença de uma banda única, com massa molecular aparente de 45 kDa na glândula seminal (tecido e fluido). Na cauda do epidídimo, entretanto, observamos a presença de uma banda menor, de ~11 kDa. Para a SVS3, observamos a presença de uma banda de 35 kDa no fluído da glândula seminal. Já em amostras de testículo, cauda do epidídimo e glândula seminal, observamos a presença de múltiplas bandas com massas moleculares aparentes de 40-43, 28-29 e 14 kDa, respectivamente. Análises de RT-qPCR e imuno-histoquímica utilizando amostras da glândula seminal de animais em diferentes fases da maturação sexual ou submetidos à orquiectomia bilateral com ou sem reposição hormonal com testosterona (8 mg/kg, s.c.) demonstraram a correlação positiva entre a expressão da SVS2 e SVS3 com os níveis plasmáticos de androgênios. Tanto a SVS2m quanto a SVS3m interagiram com espermatozoides maduros, apresentando sítios de ligação específica na cabeça e flagelo. Observamos que a SVS2m inibiu os parâmetros de motilidade e cinemática espermática de forma dependente da concentração (IC50 = ~5 µM) e tempo de incubação, os quais afetaram a motilidade progressiva e hiperativada. Por outro lado, a SVS3m apresentou apenas efeitos modestos sobre a motilidade hiperativada. Em adição, a SVS3m não demonstrou efeito sinérgico sobre os efeitos inibitórios da SVS2m sobre a motilidade de espermatozoides de camundongos. Em conjunto, nossos dados demonstram que a SVS2 é um fator endógeno do plasma seminal de camundongos com atividade inibitória da motilidade espermática. Considerando que a SVS2 é a ortóloga murina à SEMG1 humana, propomos a existência de mecanismos conservados para o controle da motilidade espermática a partir de proteínas oriundas do plasma seminal em primatas e roedores. Nossas descobertas abrem novas fronteiras para o estudo do papel das proteínas da família REST na regulação das funções espermáticas, principalmente nos parâmetros de motilidade espermática, bem como sua exploração como alvos para contracepção masculina, utilizando modelos murinos.
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    Uso de meio SOF (Synthetic Oviductal Fluid) durante o final da maturação oocitária in vitro sobre produção embrionária em bovinos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-28) Freitas, Maickon Willian de; Castilho, Anthony César de Souza [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A fim de mimetizar melhores condições do sistema in vivo, um meio de cultura mais proximo à composição do fluido do oviduto foi criado, denominado fluido ovidutal sintético (SOF), este foi formulado com base na análise bioquímica do oviduto das ovelhas. In vivo os momentos finais de maturação oocitária ocorrem em contato com o FO, já in vitro a maturação oocitária é realizada com protocolos de maturação 24h sem nenhuma alteração no meio de maturação. Portanto, o presente estudo investigou o impacto do meio de cultivo SOF durante as últimas quatro horas da maturação in vitro (MIV) e seus efeitos sobre a progressão meiótica e taxa de produção embrionária. Para tanto, os CCOs foram recuperados de ovário de vacas abatidas e maturados in vitro, nos seguintes grupos: SFB/ SFB; SFB/ SFB+SOF; BSA/BSA; BSA/BSA+SOF, todos submetidos há uma troca total de meio nas últimas quatro horas de maturação, adicionando o meio SOF de acordo com os grupos citados anteriormante. Os CCOs maturados foram fertilizados e cultivados em atmosfera e umidade controlada até o estágio de blastocisto (7 e 8 dias após a fertilização). A análise estatística foi realizada transformando os dados em arcoseno e as médias foram comparadas pelo teste T usando JMP (software JMP, SAS Institute Cary, NC). Diferenças significativas foram consideradas quando p≤ 0,05. O resultado obtido mostrou que o tratamento com SOF não tem efeito na progressão da meiose (p= 0,5944). Entretanto, quando analisamos as taxas embrionárias e a incorporação do SOF no meio BSA, o meio SOF é capaz de modular o rendimento embrionário que aumenta quando comparado ao tratamento com BSA (p= 0,0194).