Teses - Ciências Biológicas (Genética) - IBB

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https://hdl.handle.net/11449/77215

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Genômica populacional no estudo da diversidade genética do gênero Rhamdia, com foco no complexo Rhamdia quelen de populações de cultivo e selvagens.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-10) Magalhães, Carolina de Oliveira; Porto-Foresti, Fábio; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O gênero Rhamdia é composto por bagres neotropicais de ampla distribuição. No sul do Brasil e norte da Argentina eles são encontrados em rios e também produzidos em sistemas semi-intensivos para comercialização, devido à boa qualidade da carne. Estudos descritos na literatura constataram que a taxonomia desse gênero é controversa, sendo as espécies, alvo de constantes realocações. Há hibridação e introgressão, o que caracteriza um complexo de espécies e isso dificulta os estudos de delimitação e filogeografia do gênero. Considerando a importância comercial e ecológica dessas espécies na América do Sul e a escassez de informação genética, o presente estudo visa caracterizar a estrutura genética populacional e identificar padrões de diversidade genética de três espécies do gênero Rhamdia (complexo Rhamdia quelen, Rhamdia voulezi e Rhamdia branneri) em grupos amostrais provenientes de rios e importantes fazendas de peixes do estado de Santa Catarina, Paraná, Rio Grande do Sul, São Paulo e norte da Argentina, utilizando marcadores moleculares do tipo SNPs. Após dupla digestão (ddRADseq), sequenciamento Illumina e filtragens, foram obtidos 1734 loci, distribuídos em 141 indivíduos. Detectou-se baixa diversidade genética nos grupos; para todos os grupos, sendo os indivíduos de cultivo os que possuem menores índices. Os valores de heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He) foram semelhantes, sendo He maior que Ho, exceto em um cultivo. Os valores de Fis foram positivos e significativos em duas pisciculturas, indicando possível endogamia dentro desses grupos. A análise AMOVA indicou que a maior diferenciação genética está entre os indivíduos e não entre os grupos, o que também foi corroborado pela análise de componentes principais. O DAPC mostrou-se coerente com a divisão em 5 grupos, com dois deles mais distantes e o restante formando um aglomerado, inclusive sem a diferenciação dos clusters das espécies. Assim conclui-se que o complexo Rhamdia quelen e as outras espécies aqui estudadas possuem uma certa distância genética, porém são muito relacionados entre si. A baixa diversidade genética e os indícios de endogamia mostram que, tanto os grupos de cultivo quanto os selvagens, estão sujeitos às ações antrópicas que podem modificar a composição genética da população. Corientes, São Paulo e comercial Toledo se diferenciaram dos outros grupos, apesar de possuírem índices de diversidade e endogamia muito parecidos. Essa diferenciação confirma sua distância genética, porém a baixa diversidade e os indícios de endogamia evidenciam a alta taxa de cruzamento entre os indivíduos daquele lugar. Para a piscicultura isso não é necessariamente ruim, porém quando temos a introdução desses indivíduos na natureza é possível que haja contaminação genética dos estoques locais. Dessa maneira, reforçamos a importância de mais estudos de delimitação de espécies e diversidade do complexo Rhamdia quelen e espécies relacionadas, uma vez que são ecologicamente importantes da América do Sul.
A novel approach to assemble the complex B chromosome using a combination of modern genomics technologies
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-23) Jehangir, Maryam; Martins, Cesar; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
B chromosomes (Bs) are nonvital extra chromosomes found in diverse eukaryotic species including fungi, plants and animals. Among hundreds of investigated species, cichlid genomes offer fascinating models for studying B chromosome biology. Despite the extensive investigations, Bs are poorly understood mainly in relation to mechanisms of their own evolutionary survival as well as their structural and functional impact on genome organization. Our previous studies identified several sequences (genes and repeats) on the B of the cichlid fish Astatotilapia latifasciata but the complete genomic map of B chromosome has been missing. Here, we generated a chromosome- scale A. latifasciata genome with the B chromosome assembly by adopting integrative approach that combined deep coverage Pacific Biosciences single-molecule real-time (Pacbio long reads), high-throughput chromatin conformation capture (Hi-C) mapping, and Illumina (short-reads) sequencing. The assembled genome spans a total of 0.93 giga base pairs (Gb) genome with contig and scaffold N50 values of 3.4 and 36.2 mega base pairs (Mb) respectively. Compared with our previous Illumina based assembly, this upgraded genome is much more complete, and accurate. The annotation of core eukaryotic genes and universal single-copy orthologs has also been significantly improved and a total 150 Mb region has now been recovered, which was missing (in the previous assembly). We identified 759 protein-coding genes in the 34 Mb genomic content of B chromosome, of which at most of the genes showed a reduced level of expression as compared to A chromosomes. Our results demonstrate a substantial higher amount of transposable elements (TEs) mainly long terminal repeats (LTRs) retrotransposons (mean density 47.6) on the B chromosome as compared to the standard A chromosome set (mean density 10.45). We further applied whole- genome chromosome conformation capture (Hi-C) and in silico modeling methods to characterize the three dimensional (3D) architecture of and A and B chromosomes in the A. latifasciata genome. Remarkably, we observed a differential level organization of the chromatin into topologically associated domains (TADs) between 0B and 1B genomes. On a global level, the Hi-C interaction matrices of 1B genome are characterized by a relative gain of long-range and loss of short-range interactions within chromosomes indicating the impact of B chromosome on three-dimensional landscape of genome. Additionally, comparative analysis of A. latifasciata genome with othercichlids genomes enabled us to detect the phylogenomic diversification and chromosomal rearrangements including fusions and inversions providing interesting insights in co-ancestral cichlids gene evolution.
Construção de um modelo preditivo para o prognóstico de pacientes com neuroblastoma baseado em assinaturas transcricionais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-21) Molan, André Luiz; Rybarczyk Filho, José Luiz; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O neuroblastoma é o tumor sólido extracraniano mais comum em indivı́duos com idade inferior a 15 anos. É uma doença extremamente heterogênea, podendo regredir ou evoluir de forma espontânea e, em alguns casos, se mostrar bastante agressiva. Alguns sistemas como o International Neuroblastoma Staging System (INSS) e o International Neuroblastoma Patho- logy Classification (INPC), permitem classificar o estágio da doença, relacionando-o a um prognóstico favorável ou desfavorável com base em caracterı́sticas histológicas. Com o surgimento das tecnologias de sequenciamento NGS, associadas a técnicas como o RNA-seq, mo- delos preditivos robustos e versáteis puderam ser desenvolvidos e aplicados ao câncer. Várias abordagens para o estudo de neoplasias pediátricas, entretanto, foram adaptadas de pesquisas oncológicas relacionadas a adultos. Porém, cânceres infantis apresentam taxas de mutações recorrentes muito baixas em relação a adultos, demandando novas abordagens para melhor compreender vulnerabilidades e etiologias especı́ficas. Nos últimos anos, um aumento de memória, poder de processamento e capacidade de armazenamento aumentaram a importância da computação para a biologia, tornando possı́vel a implementação de abordagens capazes de resolver problemas antes considerados difı́ceis. Dentre elas, destaca-se o aprendizado de máquina, o qual permite modelar a relação entre um conjunto de valores observáveis (entradas) e um grupo de variáveis relacionadas a estes valores (saı́das). Neste contexto, utilizamos regressão logı́stica, redes neurais artificiais com multilayer perceptron e árvore de decisão, todas técnicas de aprendizado supervisionado, para a análise de assinaturas transcricionais em dados de RNA-seq de pacientes com neuroblastoma. Desenvolvemos diferentes modelos preditivos baseados nas variáveis sobrevivência, progressão do tumor, alto risco e classe tumoral, com o propósito de caracterizar prognósticos clı́nicos favoráveis e desfavoráveis. Aplicamos recursos de bibliotecas das linguagens Python e R na criação dos modelos, seleção de features e ba- lanceamento dos dados. Dentre os principais resultados, conseguimos, por exemplo, predizer a sobrevivência (vivo ou morto) com 91,33% de acurácia. Além disso, para compreendermos biologicamente o melhor modelo encontrado, conduzimos uma análise de enriquecimento funcional em termos de processos biológicos do Gene Ontology e ontologias relacionadas à doenças - este, através da biblioteca DOSE da linguagem R. Isso nos permitiu associar as fe- atures (subconjunto de transcritos utilizados pelo modelo) a processos biológicos relacionados à funções de desenvolvimento e divisão celular, além de ontologias de doenças referentes ao neuroblastoma.
Análise modular de dados de expressão para avaliação de múltiplos tumores com auxílio de métodos heurísticos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-26) Seco, Giordano Bruno Sanches; Rybarczyk Filho, José Luiz [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os grandes avanços nas ciências biológicas, especialmente na área das ciências ômicas, tem permitido aos pesquisadores realizar a coleta de grandes quantidades de dados biológicos. O TCGA (The Cancer Genome Atlas) é uma base de dados online que contém dados de diversos tipos de tumores e níveis de informação biológica, como por exemplo: expressão de mRNA (RNA-seq), expressão de microRNA (miRNA; miRseq) e metilação. Apesar das possibilidades que essa abundância de dados traz para os pesquisadores, tal área ainda carece de métodos de integração desses dados. O objetivo desta tese é o desenvolvimento de uma metodologia integrativa para avaliação de tecidos tumorais com o uso de três níveis de informação biológica (dados de RNA-seq, metilação e miRNA). Essa metodologia é baseada em machine learning não supervisionado, para obter um mapa modular que é composto por tumores e seus processos biológicos. Os processos biológicos foram prospectados do Gene Ontology e avaliados os níveis de profundidade de cada processo biológico para os módulos, bem como a frequência média de sondas induzidas ou reprimidas dos processos. Por meio de análise estatística, foi possível elaborar os mapas modulares que foram capazes de determinar vias biológicas de importância geral em 32 tumores. Tais achados envolvem vias como: síntese e transporte de lipídios, regulação da metilação, fibrinólise, regulação da atividade transcricional, transição epitélio-mesênquima, homeostase iônica, regulação de receptores de células do sistema imune e regulação de vias de sinalização mediadas por proteínas tirosina quinase. Foi realizada também uma análise mais específica do tumor mamário (BRCA),com auxílio de redes mRNA-mRNA (RNAseq e metilação) e miRNA-mRNA (miRseq). Esta última análise, conseguiu demonstrar que o tumor mamário tinha como alteradas, principalmente, as vias de diferenciação e desenvolvimento tecidual, efluxo de colesterol, angiogênese e vascularização. Em especial, a metodologia foi capaz de determinar genes e miRNAs cuja expressão ou metilação apresentam-se significantemente induzidos ou reprimidos nos dados como: o AR, ARHGDIG, PPARG, SUMO1 e o STAT3. Saliento que essa é uma metodologia de análise exploratória alternativa desenvolvida para reaproveitamento de grandes quantidades de dados biológicos. Especialmente quando esses dados não apresentem paridade caso/controle, o que dificulta a realização da análise de expressão diferencial, considerada como padrão ouro.
Perfil transcricional do secretoma do microambiente tumoral para identificação de potenciais mediadores de caquexia
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-06) Cury, Sarah Santiloni [UNESP]; Carvalho, Robson Francisco [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A caquexia é uma síndrome metabólica comumente encontrada em pacientes com cânceres de pâncreas ou pulmão. É caracterizada pela perda de massa muscular, com ou sem perda de tecido adiposo, a qual não pode ser revertida por suporte nutricional, e que induz pior resposta aos tratamentos radio e quimioterápicos e menor sobrevida. Os pacientes com caquexia apresentam alterações funcionais em processos fisiológicos, metabólicos e imunológicos, que resultam em desequilíbrio energético e proteico. Mediadores plasmáticos circulantes (fatores indutores de caquexia; FICs) desempenham um papel crucial no desenvolvimento de alterações sistêmicas que ocorrem na caquexia associada ao câncer. Embora muitos fatores derivados do tumor já tenham sido implicados com a patogênese da síndrome, as associações foram geralmente baseadas em seus níveis plasmáticos ou no perfil de expressão gênica na massa tumoral, mas ainda não é conhecido perfil de expressão dos FICs em células específicas que compõe o microambiente tumoral (MAT). Além das células tumorais, o MAT é composto por células residentes e recrutadas e pelas moléculas secretadas por essas células (secretoma). O presente projeto tem como objetivos caracterizar: 1) o perfil transcricional do secretoma de células do MAT de pacientes com câncer de pulmão (carcinoma pulmonar de células não pequenas; CPCNP), e 2) o perfil de expressão de FICs secretados em células individuais de pacientes com câncer de pâncreas (adenocarcinoma ductal pancreático; ADP). Para isso, foram utilizados dados de expressão gênica global, disponíveis publicamente, de pacientes potencialmente caquéticos com CPCNP (determinados por análises tomográficas) e ADP, separadamente. Os dados transcriptômicos dos componentes do secretoma foram correlacionados com dados clínicos e de composição de células do sistema imune do MAT. Finalmente, avaliamos computacionalmente a potencial ação sinérgica de FICs, selecionados do secretoma, e sua interação com tecidos e órgãos afetados na caquexia através de predições de ligantes e receptores. Nossa estratégia permitiu identificar que pacientes caquéticos com CPCNP apresentam altos níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias derivadas principalmente de células T CD8. Além disso, esses pacientes apresentam um aumento de células exauridas em seu MAT. Para a análise dos pacientes com câncer de pâncreas, foi possível caracterizar o perfil celular de mediadores centrais da caquexia em resolução de células única, e predizer suas interações com receptores de tecidos-alvo na caquexia. Esses mediadores foram detectados como expressos em altos níveis pelas células neoplásicas pancreáticas. Dessa forma, nossos achados caracterizam o perfil de expressão de FICs secretados por células específicas do MAT em tumores de pulmão e pâncreas, bem como suas interações com o músculo esquelético, fígado e tecido adiposo. Em conjunto, nossos resultados servirão de base para o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas visando à minimização da perda de massa muscular, aumentando, assim, a sobrevida e a qualidade de vida dos pacientes com caquexia associada aos cânceres de pulmão e pâncreas.
Estudo visando a produção de uma cápsula para transplantação fecal: da seleção de doadores de fezes aos ensaios laboratoriais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-29) Missio, Aline Parisoto [UNESP]; Rodrigues, Josias [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Inúmeros estudos apontam a importância da microbiota intestinal na manutenção da homeostase do organismo, de modo que alterações em sua composição de espécies podem estar associadas a causa de várias doenças. Em muitos casos, estas alterações - conhecidas como disbiose - podem ser revertidas pela administração de probióticos, que são microrganismos com algum papel modulador, com efeitos benéficos para além do intestino. Uma estratégia de restauração da normobiose intestinal é a aplicação direta de fezes de indivíduos saudáveis naqueles apresentando algum tipo de patologia associada com disbiose. Esta abordagem, que tem surtido efeito em muitos ensaios clínicos, sendo até mesmo recomendada para doenças como a diarreia por Clostridioides difficile refratária à antibioticoterapia, apresenta uma série de desafios, tendo em vista a necessidade de se evitar a transmissão de patógenos intestinais (segurança) e de garantia (eficácia) de restauração da normobiose. Este trabalho teve como propósito explorar pontos que assegurem o alcance destes objetivos, aplicando-os ao formato de transplantação fecal menos invasivo - a cápsula. A primeira etapa do trabalho consistiu na seleção de doadores de fezes, iniciando-se com uma chamada pública que teve alcance nacional, seguida de um processo de seleção, compreendendo uma triagem por entrevista, exames clínicos e laboratoriais para atestar a saúde e ausência de patógenos nas fezes de potenciais candidatos. Após ou em paralelo a esta fase de avaliação do nível de segurança das fezes de interessados em participar do processo de seleção, foi feita a análise do microbioma fecal, para eventualmente atestar sua eficácia. Além de atestar a segurança do candidato para ser um doador, excluindo, por exemplo, aqueles apresentando doenças crônicas, a entrevista permitiu coletar informações que poderiam dificultar ou comprometer a colheita e manutenção da viabilidade microbiana nas fezes. As questões foram divididas em duas categorias: aquelas visando a obtenção de informações de natureza transitória ou aquelas que poderiam comprometer definitivamente a participação do interessado. De um total de 221 candidatos, 196 foram eliminados por apresentarem limitações tais como, diagnóstico de doenças crônicas ou residirem em local impeditivo de realização de colheita (fora da cidade de Botucatu). Aos 25 candidatos que passaram na triagem da entrevista, foi solicitado o encaminhamento para os exames laboratoriais preliminares. Destes, 11 desistiram do processo de seleção e 6 foram desqualificados, por terem se mudado de Botucatu. Os oito remanescentes incluíram 2 que vieram a se mudar de Botucatu, nesta etapa, 1 que teve restrição nos exames laboratoriais, 1 que passou a apresentar constipação intestinal crônica e 1 que iniciou um regime terapêutico com possível implicação no equilíbrio na microbiota. De modo que restaram apenas 3 indivíduos elegíveis e que forneceram amostras fecais para análise de microbioma, que também foram utilizadas para a avaliação de protocolos de produção de cápsulas de administração oral. Foram coletadas 3 amostras, de cada um destes indivíduos, em dias diferentes, que serviram para a comparar a diferença na riqueza e abundância de OTUs (Operational Taxonomic Units) do microbioma deles, bem como do microbioma das fezes e das cápsulas correspondentes, durante a estocagem a -80°C, visando a definição de um protocolo para produção de cápsulas em série. A análise do microbioma das triplicatas de cada um dos três potenciais doadores não mostrou variação estatisticamente significativa na diversidade alfa entre eles, medida pelo índice de Shannon. Foram avaliados 4 protocolos de produção de cápsulas, 3 dos quais tinham como ingrediente básico, além das fezes, mistura de manteiga de cacau e glicerol, acrescidas ou não de salina 0,9% e que eram dispensados diretamente em invólucros de liberação tardia (DRcaps), de tamanho 00 ou em invólucros de gelatina, tamanho 0, que seriam transferidos posteriormente para os invólucros 00 DRcaps. Além de diferenças na composição de ingredientes, estes protocolos variavam quanto ao procedimento de remoção de resíduos das fezes e homogeneização da mistura. Todos os protocolos implicaram em perda na riqueza e abundância de OTUs, que chegaram a -98%, na comparação entre fezes e cápsulas correspondentes, um deles, adicionalmente, produziu um concentrado fecal sem fluidez insuficiente para a dispensação no invólucro, um deles apresentou baixo rendimento e um terceiro comprometia a estrutura dos invólucros. O protocolo que não apresentou estas limitações técnicas foi testado e aprovado quanto à capacidade de manter a abundância e riqueza de OTUs, durante estocagem das cápsulas por 124 dias, tendo sido o escolhido para a produção em série de cápsulas. Dois dos 3 potenciais doadores de fezes desistiram do processo de seleção, após a análise de seu microbioma fecal. De modo que um deles – na verdade uma potencial doadora – se submeteu aos exames finais para atestar a segurança de seu material fecal, tendo apresentado apenas restrições temporárias, posteriormente revertidas, passou a colaborar com o projeto. Seu microbioma fecal foi confrontado com o microbioma de mucosa de dois pacientes com retocolite ulcerativa, vindo a apresentar profundas diferenças no sentido de apresentar OTUs característicos de uma microbiota saudável, tais como Christensenellaceae, Faecalibacterium e Lachnospiraceae, sendo que estas duas últimas fizeram parte do core microbiome de suas fezes e das cápsulas correspondentes estocadas. A experiência de seleção de doadores, em que, ao final do processo, se conseguiu apenas 1 entre 221 (0,45%) candidatos, mostra uma taxa inferior aos estudos já realizados segundo os quais ~3% ao final são elegíveis.
Sexagem molecular em aves: abordagens genéticas e epigenéticas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-24) Jeronimo, Bruna Cristina [UNESP]; Wasko, Adriane Pinto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Estima-se que aproximadamente 50% das espécies de aves não podem ter o sexo identificado por meio de características externas. A capacidade de identificar de maneira correta o sexo das aves é fundamental para o sucesso de estudos comportamentais, ecológicos, como também programas de reprodução em cativeiro com espécies ameaçadas de extinção. A identificação do gene CHD1 (Chromodomain Helicase DNA Binding Protein 1) possibilitou inúmeros avanços na sexagem molecular de aves. Este gene está presente nos cromossomos sexuais Z e W, as fêmeas possuem duas cópias diferentes, CHD1-Z e CHD1-W, enquanto os machos possuem duas cópias iguais do gene CHD1-Z. Recentemente, foi descrito um novo marcador associado a um loco que também apresenta homólogos nos cromossomos Z e W do gene Spindlin. Adicionalmente alguns autores também sugerem explorar diferenças epigenéticas entre machos e fêmeas com o intuito de identificar o sexo dos mesmos. No presente trabalho foram testados marcadores que exploram diferenças de tamanhos entre alelos dos genes CHD1 (P2/P8) e Spindlin (SPIN12/SPIN13), de genes específicos ao cromossomo W (ASW e XhoI) e também de um locus que apresenta diferenças de metilação de DNA entre machos e fêmeas de membros da superordem Galloanserae (MHM). Os marcadores relacionados ao cromossomo W não apresentaram resultados positivos, em contraposição os primers P2/P8 mostraram-se efetivos na sexagem molecular de indivíduos das ordens Piciformes e Psitaciformes, já amplicações com os marcadores SPIN12/SPIN13 apresentaram padrões sexo-específicos facilmente observáveis em géis de agarose em espécies das ordens Galliformes, Apodiformes e em exemplares de Corujinha-orelhuda. Nossos resultados demonstram que a escolha de um marcador molecular adequado para a identificação do sexo em aves está diretamente ligada a espécie em estudo e ao modo de visualização dos fragmentos gerados. Enquanto em algumas espécies os padrões sexo-especificos podem ser facilmente observáveis em agarose, outros dependem de métodos mais resolutivos, como poliacrilamida ou ainda, eletroforese capilar.
Avaliação funcional das proteínas desacopladoras mitocondriais em Arabidopsis thaliana utilizando mutantes de inserção
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-08) Lima, Rômulo Pedro Macêdo; Maia, Ivan de Godoy [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As proteínas desacopladoras mitocondriais (UCPs) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial capazes de dissipar o gradiente eletroquímico de prótons gerados na respiração independente da síntese de ATP. Essas proteínas fazem parte da família de carreadores aniônicos mitocondriais e desempenham um papel fundamental na manutenção da função mitocondrial. Em plantas, a importância das UCPs como componentes da tolerância celular ao estresse oxidativo já foi demonstrada em estudos prévios. Três genes codificando UCP já foram descritos em Arabidopsis thaliana (nomeados AtUCP1-3), sendo boa parte dos dados funcionais obtidos para a isoforma AtUCP1. Portanto, o papel desempenhado pelas demais isoformas é ainda pouco estudado. Diante disso, mutantes de inserção de arabidopsis foram empregados para investigar a existência de redundância funcional entre essas isoformas. Para tal, numa primeira abordagem, duplo-mutantes de inserção para diferentes combinações gênicas (atucp1/atucp2, atucp1/atucp3 e atucp2/atucp3) foram obtidos e analisados funcionalmente durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. Em uma segunda etapa foram empreendidas análises de metabólitos durante a fase vegetativa destes duplo-mutantes. Em paralelo, baseado em dados prévios da primeira abordagem que indicaram fenótipos mais evidentes na fase vegetativa do duplo-mutante atucp1/atucp3 em relação ao controle selvagem, o perfil global de expressão gênica deste duplo-mutante na fase vegetativa foi determinado usando RNA-Seq. Análises subsequentes de bioinformática com datasets encontrados na literatura foram empreendidas. Os dados obtidos na primeira etapa indicam que as três isoformas parecem atuar de forma complementar em diferentes processos associados ao crescimento e desenvolvimento de A. thaliana. As isoformas AtUCP1 e AtUCP2 atuariam de forma conjunta na manutenção da homeostase e função mitocondrial durante a fase reprodutiva. Por outro lado, as isoformas AtUCP2 e AtUCP3 teriam maior relevância funcional na atividade fotossintética, enquanto que a AtUCP1 atuaria na manutenção do aparato fotossintético. Além disso, as isoformas AtUCP2 e AtUCP3 atuariam em conjunto na manutenção do equilíbrio redox. Os dados indicam ainda que todas as três isoformas atuam em conjunto para a redução das espécies reativas de oxigênio (ERO) na mitocôndria. Cabe ressaltar que o duplo knockdown dos genes AtUCP1 e AtUCP3 foi o que promoveu as maiores alterações fenotípicas e de função mitocondrial na fase vegetativa. Curiosamente, uma maior atividade respiratória foi registrada no duplo-mutante atucp2/atucp3, o que pode ser justificado pela forte expressão compensatória do gene AtUCP1 sob condições normais. De maneira similar, uma forte expressão compensatória da isoforma não inativada foi detectada em todas as três combinações de duplo-mutantes crescidos em condições normais ou em presença de estresse (salino e osmótico), o sugerindo uma redundância parcial entre elas. As análises de metabólitos revelaram profundas alterações no teor de alguns metabólitos primários (açúcares, aminoácidos, ácidos orgânicos e componentes de ácidos nucléicos) e secundários nos três duplo-mutantes. Em consonância, diversos genes diferencialmente expressos associados ao cloroplasto, mitocôndria e à resposta aos estresses abióticos foram detectados no duplo-mutante atucp1/atucp3. As análises comparativas de RNA-Seq para validação com o dataset selecionado de A. thaliana tipo selvagem reforçam os impactos causados por toda a célula. Em conjunto, os resultados obtidos evidenciaram uma intensa reprogramação transcricional e metabólica em decorrência do duplo Knockdown de genes AtUCP1 and AtUCP3. As análises apontaram ainda para a existência de uma redundância funcional parcial entre as três isoformas, que atuariam ora de forma isolada, ora de maneira conjunta na manutenção da homeostase e função mitocondrial durante o crescimento e desenvolvimento de A. thaliana. Essas descobertas fornecem novos subsídios para fundamentar o papel desempenhado pelas diferentes isoformas e fornecem insights sobre a atuação in planta da isoforma AtUCP3 em associação com a AtUCP1.
Aplicabilidade de redes PPI em Biologia de sistemas no contexto da síndrome de Williams-Beuren
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-07) Medeiros, Priscila; Ribeiro-Bicudo, Lucilene Arilho [UNESP]; Gamba, Bruno Faulin; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Uma microdeleção hemizigótica de 1,5Mb a 1,8Mb na região do braço longo do cromossomo 7 (7q11.23) ocasiona uma doença genética rara multigênica. Faces típicas, doenças cardiovasculares, alterações do tecido conjuntivo combinados com déficit de aprendizado e crescimento, personalidade e perfil cognitivo característicos representam o conjunto de sinais clínicos que caracteriza a síndrome de Williams-Beuren (SWB). Embora a técnica da FISH permita o diagnóstico citomolecular da síndrome, a existência de deleções de tamanhos típicos e atípicos, as quais não são evidenciadas pela FISH, acarreta em diferentes genes afetados. Por isso, o objetivo deste estudo foi investigar e caracterizar a microdeleção mediante análise por CMA (do inglês Chromosome Microarray Analysis) e analisar o impacto desta através de uma abordagem in silico utilizando redes de interação entre proteínas (PPI). Dentre os 14 indivíduos recrutados e avaliados no estudo, apenas um apresentou uma FISH negativa. Clinicamente, todos os participantes exibiram características da SWB com escore acima de 3. Uma deleção típica de 1,367,201Kb foi confirmada e caracterizada por CMA em 13 participantes do estudo e o impacto desta foi analisado em duas redes biológicas, uma representando a rede de um indivíduo sem alterações (GN) e outra representando o indivíduo acometido (PN). As proteínas codificadas pelos genes deletados foram extraídos da rede GN para simular a rede PPI do indivíduo com a deleção (PN). Análises topológicas de ambas redes foram analisadas, assim como nas redes no contexto de comunidades. Os resultados não mostraram diferenças significativas entre as redes. Pela análise de enriquecimento com termos ontológicos relacionados a processos biológicos, foi possível identificar as regiões onde houve enriquecimento dentro de cada comunidade, bem como identificar quais proteínas e termos ontológicos são compartilhados. Com isso, foi possível analisar diferenças entre as redes após a deleção e apontar diferentes proteínas até então não correlacionadas à síndrome. Embora a abordagem in silico utilizada neste estudo não tenha apresentando diferenças estatísticas, a utilização de estudos com redes biológicas além de trazer novas descobertas para o estudo da SWB, pode também ser uma ferramenta importante para esclarecer a variabilidade fenotípica e fisiopatologia da doença.
Biogeografia histórica e filogenômica de Erythrinoidea e taxonomia integrativa para o estudo do gênero neotropical Hoplerythrinus (Characiformes: Erythrinidae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-25) Conde-Saldaña, Cristhian Camilo; Oliveira, Claudio de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Erythrinoidea é um clado de Characiformes composto pela enigmática família Tarumaniidae, representada por uma única espécie altamente especializada, Tarumania walkerae, que habita poças isoladas da floresta amazônica central, e pela família de ampla distribuição geográfica Erythrinidae, que habita em ambientes lênticos e lóticos na maioria das drenagens da América Central e do Sul. Erythrinidae é composta por três gêneros com representantes viventes (Erythrinus, Hoplias e Hoplerythrinus), onde complexos de espécies têm sido hipotetizados com base na notável variação cariotípica e uniformidade nos dados merísticos e morfométricos. A diversidade e os padrões de distribuição geográfica, bem como os aspectos ecológicos de Erythrinoidea, levantam questões interessantes com relação à diversificação evolutiva de suas linhagens. A maioria dos estudos taxonômicos e filogeográficos têm sido focados em Hoplias, no entanto, Erythrinus e Hoplerythrinus aguardam revisões detalhadas abrangendo toda a sua distribuição geográfica. O presente trabalho tem como objetivo principal investigar padrões biogeográficos e cronológicos de diversificação da superfamília Erythrinoidea e implementar uma abordagem integrativa para investigar a diversidade e a história evolutiva de um grupo particular dentro deste clado, o gênero Hoplerythrinus. Combinando dados filogenômicos com elementos ultraconservados (UCEs), paleontológicos (calibrações fósseis), biogeográficos e fontes geológicas, encontramos que a origem de Erythrinoidea é estimada para o Cretáceo Superior ca. 80 Ma, com divergência de clados principais durante o Paleogeno ca. 51-31 Ma, e Erythrinidae se diversificou rapidamente após a formação do rio Amazonas transcontinental ca. 10 Ma, de oito linhagens para pelo menos 28 espécies atuais. Padrões de diversificação em Erythrinoidea também são discutidos à luz da evolução da paisagem. Por outro lado, a integração de DNA barcode, filogenômica com UCEs e informações morfológicas forneceram evidências para investigar a história evolutiva de Hoplerythrinus e definir este táxon como um gênero monotípico geograficamente difundido na região Neotropical. Aqui também discutimos detalhes sobre a variação fenotípica e níveis de diferenciação genômica considerando o tempo de divergência e suas afinidades ecológicas.
Variabilidade genética de bagres marinhos dos gêneros Cathorops e Genidens (Siluriformes: Ariidae) no oceano Atlântico Ocidental
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-24) Cerqueira, Najila Nolie Catarine Dantas; Oliveira, Claudio de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os bagres marinhos dos gêneros Cathorops e Genidens, apresentam uma história evolutiva recente resultando em plasticidade fenotípica, refletida em uma taxonomia complexa. Diante dessa complexidade, o objetivo deste estudo foi avaliar a divergência, diversidade e estruturação genética desses gêneros ao longo da costa do Brasil, e testar a hipótese de que as barreiras ecológicas e marinhas podem estar influenciando nas características biológicas das espécies do presente estudo. No gênero Cathorops quatro espécies foram identificadas morfologicamente Cathorops arenatus, Cathorops spixii, Cathorops agassizii, e Cathorops sp. para 68 indivíduos, enquanto que as análises com mtDNA (CytB e ATPase 6/8) identificaram as espécies C. agassizii/C. spixii e C. arenatus/Cathorops sp. Um total de 5.578 SNPs para as espécies do gênero Cathorops foram obtidos, através da metodologia ddRAD, os resultados da RaxML e das análises de divergência genética (FST, STRUCTURE e DAPC) indicaram a ocorrência das espécies C. agassizii (n=22), C. arenatus (n=14) e Cathorops sp. (n=32) para a costa do Brasil. A diversidade genética das espécies C. arenatus, C. agassizii e Cathorops sp. com base nos valores da heterozigosidade (HO/HE) e FIS indicaram excesso de homozigotos e endogamia, sugerindo baixa diversidade genética para as três espécies. Os resultados populacionais da espécie C. agassizii da costa do Brasil, indicaram ausência de estruturação populacional (FST >0,025). Em contrapartida, na espécie Cathorops sp. foi detectada uma estruturação genética (FST = 0,070) entre a costa Nordeste e Sudeste. O STRUCTURE resultou em um K=3, um cluster com amostras do Ceará, o segundo cluster na Bahia e Espírito Santo e o terceiro cluster para os indivíduos de Sergipe, Rio de Janeiro e São Paulo. Quando avaliados os valores de FST entre os clusters (FST >0,108) indicaram também uma estruturação populacional. No gênero Genidens 51 indivíduos foram amostrados da costa Sudeste ao Sul do Brasil, com três espécies identificadas morfologicamente como Genidens barbus (n=18), Genidens genidens (n=27) e Genidens machadoi (n=06). A análise de identificação molecular com o uso de mtDNA sugeriu a existência de apenas uma espécie. Todavia, a divergência genética utilizando 1.099 SNPs permitiu identificar uma divergência genética entre as espécies G. barbus e G. genidens (FST 0,415, STRUCTURE e DAPC). A comparação entre as espécies G. machadoi e G. barbus resultou num valor moderado de FST = 0,052. Esses dados mostram que há uma diferenciação genética entre G. barbus e G. genidens, e uma baixa diferenciação genética entre as espécies G. machadoi e G. barbus. Os resultados de diversidade genética para a espécie G. barbus e G. genidens dos valores da heterozigosidade (HO/HE) indicaram excesso de heterozigotos, mesmo tendo sido verificado um valor de FIS positivo, sugerindo presença de diversidade genética para as espécies do gênero Genidens. Os indivíduos da G. barbus amostrados na costa Sudeste e Sul do Brasil não apresentaram estruturação genética (FST = 0,031). Contudo, quando avaliado o valor de FST com base nos clusters detectados no STRUCTURE (K=2), foi identificado um FST = 0,330, resultando na estruturação genética entre exemplares de G. barbus e três indivíduos do Rio Grande do Sul. As hipóteses para compreender os resultados obtidos neste estudo, indicam que a ausência de estruturação populacional em C. agassizii, pode ser devida ao fato das espécies se adaptarem a ambientes estuarinos heterogêneos. Em relação a espécie Cathorops sp. a presença de estruturação genética observada entre as populações, pode estar associada a distância geográfica de amostragem, e as variações do nível do mar, que poderiam influenciar a dispersão destas populações. Enquanto que no gênero Genidens, a ausência de estruturação pode estar relacionada à capacidade das espécies migrarem para diferentes porções estuarinas no período de reprodução, e as conectividade das populações através dos ciclos pluviais, não ocorrendo influência de possíveis barreiras biogeográficas (temperatura, salinidade e sedimentos). Assim, apesar da complexidade taxonômica dos bagres marinhos dos gêneros Cathorops e Genidens, que apresentam grande plasticidade fenotípica, foi possível identificar as espécies que estão distribuídas na Costa do Brasil, e entender como, as barreiras biogeográficas estão influenciando os indivíduos das espécies do gênero Cathorops e Genidens a uma estruturação populacional.
Investigação sobre o papel dos RNAs longos não codificantes no contexto do sarcoma de Ewing
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-10) Coan, Rafael Luiz Buogo; Lemke, Ney [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O sarcoma de Ewing (SE) é um câncer que tipicamente afeta ossos e tecidos moles, especialmente em crianças e adultos jovens. As células neoplásicas do SE apresentam uma translocação recorrente entre os genes EWSR1 e FLI1, localizados respectivamente nos cromossomos 11 e 22. Esta translocação resulta na proteína fusionada EWS-FLI1, que age como um fator de transcrição aberrante desregulando a expressão de ampla gama de genes. Por exemplo, via ligação em repetições GGAA presentes de genes codificadores de proteínas, EWS-FLI1 recruta histonas deacetilases (HDACs), enzimas que modulam epigeneticamente a transcrição de genes codificadores e não codificadores, como os RNAs longos não codificantes (lncRNA). Estes atuam sob diversas formas, por exemplo, inibindo complexos enzimáticos, interferindo diretamente no DNA ou com outras moléculas de RNA. Como característica em comum, lncRNAs e HDACs participam em complexos remodeladores de cromatina (e.g. NuRD), assim regulando a expressão gênica globalmente. Estudos experimentais e clínicos recentemente reportaram que inibidores de HDACs (HDACi) têm promissor potencial antineoplásico contra células de SE. No entanto, pouco é conhecido sobre a associação entre os moduladores epigenéticos e os lncRNA no contexto do SE. Este estudo emprega a biologia de sistemas para investigar as relações entre as principais formas da translocação EWS-FLI1 encontradas no SE e moléculas envolvidas em mecanismos conhecidos de modulação epigenética da expressão gênica, como no remodelamento de cromatina (HDACs) e regulação pós-transcricional (lncRNA). Objetivamos, além, estabelecer um pipeline computacional para identificar novos transcritos não codificantes no SE. Por meio de dados de RNA-Seq provenientes de tumores sequenciados de SE, depositados no dbGaP, calculamos a expressão gênica de codificadores e não codificadores de proteína. Após, construímos uma rede de coexpressão que revela as associações entre lncRNA conhecidos e HDACs. O enriquecimento de vias e o uso de banco de dados auxilia-nos na interpretação dos resultados nas diferentes etapas do estudo. Ademais, encontramos lncRNA candidatos a novos transcritos no contexto do SE. Por fim, nosso estudo estabelece conexões entre HDACs e lncRNA, além de encontrar novos transcritos associados ao SE.
Caracterização de pequenos RNAs não-codificantes (microRNAs e PIWI-interacting RNAs) na presença do cromossomo B do ciclídeo africano Astatotilapia latifasciata
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-18) Nascimento-Oliveira, Jordana Inacio; Martins, Cesar [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os supranumerários cromossomos B são elementos extras ao genoma encontrados em diversas espécies de eucariotos, desde fungos, plantas a animais. A origem independente nos mais diversos organismos também reflete a sua variedade quanto a número, morfologia e constituição. Desta forma, sabe-se que os cromossomos B são constituídos por DNA repetitivo, genes codificadores de proteína e genes que transcrevem RNAs não-codificantes (ncRNA). Os ncRNAs participam de uma infinidade de processos biológicos, desde os fundamentais como transcrição e tradução, até regulação durante o desenvolvimento embrionário e ciclo celular. Desta forma, conhecendo a baixa densidade de genes codificadores de proteínas nos cromossomos B, o presente estudo focou em caracterizar os ncRNAs, ainda pouco explorados e que trazem perspectivas interessantes no entendimento da origem e comportamento desse elemento extra. Foi utilizado como modelo de estudo o peixe Astatotilapia latifasciata, pertencente à família Cichlidae, modelo em estudos evolutivos. Dentre uma infinidade de classes de ncRNA optou-se por explorar a partir do RNAseq de A. latifascita os pequenos RNAs não-codificantes: microRNAs (miRNA) e PIWI- interacting RNAs (piRNA). Foram encontrados diversos miRNAs diferencialmente expressos em amostras com cromossomo B. Esses miRNAs tem como alvos diversos genes codificadores de proteínas e propõe-se que o cromossomo B, a partir da atuação dos miRNAs impacta em diversos processos biológicos. Adicionalmente, clusters de piRNAs presentes no cromossomo B foram detalhadamente descritos indicando o envolvimento deste elemento extra em arquitetar o silenciamento de elementos transponíveis. Complementarmente, essa tese adicionou dois objetivos suplementares. Uma revisão sobre as pesquisas de RNAs e cromossomos B é apresentada e fornece uma linha do tempo e principais resultados que foram reunidos em uma árvore filogenética representativa dos organismos com cromossomo B e estudos relacionando RNAs. Outrossim, essa tese encerra com reflexões sobre divulgação científica, relatando alguns dos trabalhos publicados ao longo do período e propondo diretrizes para a expansão da popularização da ciência e educação científica no nosso país.
Proteínas desacopladoras mitocondriais e transportadores de dicarboxilatos em plantas: estudos funcionais e fisiológicos.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-07) Arcuri, Mariana de Lara Campos; Maia, Ivan de Godoy [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As proteínas desacopladoras mitocondriais (UCPs) e os carreadores de dicarboxilatos (DIC) pertencem à família dos transportadores mitocondriais cujas funções são determinantes na manutenção da homeostase mitocondrial. As UCPs estão presentes na membrana mitocondrial interna e atuam dissipando o gradiente eletroquímico de prótons produzido durante a respiração. As DICs, por sua vez, são responsáveis pelo influxo de dicarboxilatos através da membrana mitocondrial interna a expensas de fosfato inorgânico e elementos derivados de enxofre. Três genes codificadores de UCPs (AtUCP1-3) e três de DICs (AtDIC1-3) foram identificados no genoma de Arabidopsis thaliana. No presente estudo, a função in planta destes carreadores foi investigada. A caracterização de mutantes de inserção de T-DNA para os genes AtUCP1 e AtUCP2 revelou uma redução no número de folhas no mutante atucp2 e um claro comprometimento do desenvolvimento reprodutivo das linhagens mutantes. Corroborando tal observação, um drástico efeito nos níveis de expressão de fatores de transcrição associados ao desenvolvimento dos órgãos reprodutivos foi evidenciado nos mutantes. Adicionalmente, a atividade do gene repórter GUS sobre controle das regiões promotoras dos genes alvos se revelou intimamente associada aos órgãos reprodutivos. Análises de marcação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e de expressão relativa de genes marcadores da função mitocondrial, incluindo a oxidase alternativa, demonstraram que a homeostase mitocondrial foi afetada nos mutantes atucp1-2 durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. Em paralelo, a caracterização de linhagens contendo inserções de T-DNA nos genes AtDIC1-3 revelou incrementos na área foliar e biomassa, aumento do acúmulo de EROs e alterações na germinação. Em contrapartida, a superexpressão do gene AtDIC2 promoveu um acometimento nos parâmetros fenotípicos supracitados com evidente redução no acumulo de biomassa quando comparado ao controle Col-0. Do ponto de vista fisiológico, a capacidade fotossintética revelou-se elevada nos referidos mutantes, fato evidenciado pelas altas taxas de assimilação de carbono e capacidade de re-oxidação da clorofila. Uma possível expressão compensatória do gene AtDIC2 foi observada nos mutantes atdic1 e atdic3. Análises do perfil metabólico de tais mutantes indicaram um maior acúmulo de carboidratos (37,6%), lipídeos (13,4%), ácidos orgânicos (11,8%) e aminoácidos (10,5%). Rotas de resposta aos estresses oxidativo e hídrico, como as vias do metabolismo de ascorbato e da prolina, respectivamente, também se mostraram alteradas. Uma alteração significativa no metabolismo de fenilalanina que, entre outros processos, está relacionada com a resposta aos estresses mecânico e biótico também foi constatada. Quando analisada de forma integrada com os níveis de chiquimato, esses dados sugerem uma alteração no ponto de convergência entre os metabolismos primário e secundário.
Impacto de atividades de interação com o ensino básico no programa de pós-graduação em ciências biológicas (genética): formação discente e inserção social
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-30) Barbosa, Cassiane Martins; Wasko, Adriane Pinto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os programas de pós-graduação têm contribuído consideravelmente para ampliação do conhecimento científico no país, por meio do desenvolvimento de projetos de pesquisa de áreas básicas e aplicadas. Grande parte dos resultados destes projetos tem sido transmitida por meio de artigos científicos direcionados à comunidade acadêmica. Entretanto, atividades de divulgação científica para a sociedade também se mostram importantes como forma de disseminar os conhecimentos produzidos em universidades e centros de pesquisa. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), responsável por subsidiar o Ministério de Educação (MEC) na formulação de políticas públicas para pós-graduação no Brasil, possui instrumentos de avaliação de cursos de mestrado e doutorado que se baseiam não somente na produção intelectual como também em atividades de inserção social e de interação com o ensino básico. Tais atividades podem ser relacionadas a ações de popularização da ciência. Nesse contexto, o Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética) do Instituto de Biociências da UNESP (Campus de Botucatu) desenvolve, desde 2007, cursos de férias para estudantes do ensino médio de escolas públicas e materiais didáticos lúdicos diversos como gibis, cartilhas e jogos. Os conteúdos dos cursos e dos materiais produzidos baseiam-se em temas do cotidiano, de forma a integrar conhecimento e diversão, e são desenvolvidos por mestrandos e doutorandos que cursam uma disciplina específica voltada à interação com o ensino básico público, o que representa um diferencial de pluralidade em programas de pós-graduação. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo principal descrever as atividades dos cursos de férias “Experimentando Genética”, direcionados a estudantes do ensino médio, e estudar suas contribuições para a formação acadêmica de pós-graduandos. A avaliação, realizada nos anos de 2018 a 2020, foi do tipo exploratória, de caráter quantitativo e qualitativo que assumiu, como procedimento técnico, o estudo de caso para avaliar dados coletados por meio de questionários e entrevistas baseados na análise de conteúdo do tipo categorial temática. Complementarmente a essas análises, foram também identificados os impactos de tais atividades extensionistas no parecer CAPES desse programa de pós-graduação, por meio de relatórios finais de avaliação deste órgão governamental referentes ao triênio 2007-2009 e ao quadriênio 2013-2016. As ações de interação com o ensino básico apresentam-se como excelentes oportunidades para uma formação mais ampla dos pós-graduandos, especialmente para que estes atuem em ações de alfabetização e divulgação científica, dado que estes se envolveram em atividades que fogem do padrão comumente encontrado em disciplinas de pós-graduação e que exigem o uso de criatividade e transposição da linguagem acadêmica para uma mais coloquial. Com base no questionário aplicado no primeiro dia da disciplina associada aos cursos de férias, foi possível identificar que na pós-graduação um baixo número de alunos participa de ações no âmbito com a educação básica, atividades mais presentes em cursos de graduação. Em contrapartida, os pós-graduandos buscaram na disciplina associada às ações com estudantes de ensino médio uma contribuição à sua formação profissional sobre “prática de ensino” e “contato com a educação básica”. Estes ainda demonstraram a expectativa de que, durante tais atividades, haveria uma troca mútua entre ensino e aprendizagem envolvendo os próprios pós-graduandos e estudantes da Rede Básica de Ensino, e que estas ocorreriam de forma diferenciada, ou seja, efetivamente a prática educativa empregada (processo de ensino) seria correlacionada à didática (técnicas de ensinar e transmitir conhecimentos). Tanto as atividades realizadas nos cursos de férias como os dados levantados com mestrandos e doutorandos indicam que estes puderam atuar como protagonistas no processo de ensino-aprendizagem, capacitando-os para uma prática docente em Genética mais efetiva e envolvente. Em consonância com os resultados apresentados nos questionários e entrevistas realizados com estudantes de pós-graduação, as análises das avaliações CAPES do programa de pós-graduação destacaram a importância das atividades de interação com o ensino básico para a formação discente. Além disso, salientaram a relevância de ações concretas de inserção social por meio da popularização da ciência para uma melhor pontuação do próprio programa de pós-graduação. O presente trabalho também gerou, como objetivo suplementar, um kit educativo voltado à área de citogenética para aplicação em escolas do ensino médio como forma de facilitar um ensino-aprendizagem mais eficaz de temas considerados de difícil compreensão e abstratos pelos alunos. Os dados levantados poderão subsidiar outros programas de pós-graduação na implementação de atividades e materiais de interação com a educação básica, baseados em processos de inclusão e integração social.
Efeitos genéticos, endócrinos e transgeracionais do estresse térmico sobre as células germinativas em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-05-31) Butzge, Arno Juliano [UNESP]; Oliveira, Claudio [UNESP]; Hattori, Ricardo Shohei; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Em peixes, exposições a altas temperaturas podem afetar a proliferação, diferenciação ou mesmo a sobrevivência das células germinativas, comprometendo a fertilidade e, portanto, a capacidade reprodutiva das espécies. Há também evidências de alterações epigenéticas que podem eventualmente ser transmitidas às próximas gerações, tendo implicações sobre a sobrevivência e capacidade adaptativa aos ambientes sujeitos às constantes mudanças. Este trabalho buscou elucidar os mecanismos regulatórios (molecular e endócrino) e transgeracionais envolvidos na manutenção e diferenciação das células germinativas em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) submetidas a estresse térmico prolongado. Para tanto, foram avaliados inicialmente os efeitos da exposição a alta temperatura durante a fase juvenil (parr) nas gônadas de adultos, comparando os parâmetros reprodutivos e qualidade dos gametas. Em seguida, estes foram utilizados em cruzamentos, visando comparar o desempenho das respectivas progênies (WT) com as do grupo controle (CT) quando submetidas ao estresse térmico. Finalmente, foram realizados experimentos in vitro com testículos de juvenis destas progênies buscando correlacionar a tolerância térmica com a susceptibilidade ao cortisol, o principal hormônio do estresse. Os resultados da primeira etapa demonstraram que o estresse térmico afetou nitidamente mais os machos que as fêmeas, sendo os efeitos deletérios detectados no desenvolvimento testicular, na fecundidade, na motilidade e morfologia espermática, e também no desenvolvimento embrionário. Surpreendentemente, apesar de tais impactos negativos, a progênie derivada dos machos estressados submetidas às mesmas condições estressantes que os pais apresentaram sobrevida e crescimento superiores, demonstrando que o estresse térmico nos parentais pode conferir termotolerância na prole após uma única geração. Desempenho similar foi observado usando progênies de machos de três anos de idade, sugerindo alterações constitutivas nas espermatogônias-tronco. A análise in vitro demonstrou que os testículos da progênie WT apresentaram menor susceptibilidade ao cortisol comparado com o grupo CT, sugerindo que o grupo WT possui maior capacidade de neutralizar os efeitos do estresse. As demais análises de transcrição gênica, que foram interrompidas em função da pandemia do COVID-19, poderão elucidar os aspectos moleculares envolvidos na tolerância à temperatura alta. Em conclusão, este estudo demonstra que o estresse térmico durante as fases iniciais pode induzir efeitos permanentes em aspectos reprodutivos essenciais durante a fase adulta e ainda modular a capacidade adaptativa da respectiva progênie, quando submetidas às mesmas condições que os parentais. Estas descobertas agregam uma nova abrangência acerca dos impactos das mudanças climáticas em peixes, mas ao mesmo tempo indicam a existência de mecanismos que permitem os animais superarem as alterações no ambiente, desde que a sobrevivência das gerações seguintes, mesmo que limitada, seja garantida. No caso das espécies de interesse comercial, a estratégia utilizada neste estudo pode contribuir para o desenvolvimento de linhagens com maior resiliência a fatores ambientais.
Dinâmica da diversidade bacteriana intestinal do mosquito Aedes aegypti responsiva ao vírus da dengue
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-25) Carvalho, Vanessa Rafaela de; Souza Neto, Jayme Augusto de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O vírus da dengue é um arbovírus da família Flaviviridae, gênero Flavivirus, transmitido no Brasil principalmente pelo mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). A dengue é considerada uma das doenças mais infecciosas no mundo e de maior crescimento nos últimos anos, com impactos sociais e econômicos devido às altas taxas de morbidade e mortalidade desencadeadas pela infecção. A transmissão do vírus DENV por mosquitos vetores está diretamente relacionada à sua competência vetorial, isto é, a permissividade à infecção, replicação e transmissão do patógeno. Estas características têm sido associadas a fatores genéticos e a microbiota intestinal do inseto. As bactérias presentes no intestino médio são componentes-chave da competência do vetor, uma vez que o microbioma do mosquito altera características fisiológicas importantes como feminização, auxiliam na digestão, regulam a imunidade e o desenvolvimento do hospedeiro. Compreender como a microbiota intestinal influência a competência vetorial é fundamental para elucidar o controle da propagação das doenças transmitidas por estes vetores. No município de Botucatu, SP foram capturados larvas de mosquitos de Ae. aegypti e analisou-se a composição da microbiota intestinal sob diferentes dietas (açúcar ou açúcar e sangue), estágios de desenvolvimento e em resposta à infecção pelo vírus da Dengue tipo 4, através do sequenciamento de nova geração da região hipervariável V4 do gene 16S rRNA. Foram detectados um total de 2736 unidades taxonômicas operacionais e quatro filos Proteobacteria, Bacterioidetes, Firmicutes e Actinobacteria. Os resultados evidenciaram que moduladores da diversidade da microbiota, como os estágios de desenvolvimento, a idade e dieta possuem potenciais implicações na diversidade bacteriana presente no intestino dos mosquitos. Os estágios de desenvolvimento têm efeito direto nas alterações da microbiota intestinal de Ae. aegypti, enquanto a microbiota de mosquitos machos e fêmeas apresentou diferenças, independentes da dieta. O fator dieta tem uma forte influência na alteração da microbiota uma vez que a alimentação sanguínea reduz a diversidade bacteriana intestinal. Os mosquitos infectados com DENV-4 tiveram microbiota mais homogênea e após 96 horas de ingestão do alimento, ocorreu restabelecimento na microbiota. Os resultados obtidos nesse estudo permitem compreender melhor os microbiomas do intestino médio do mosquito e podem auxiliar no entendimento do microbioma de mosquitos suscetíveis e refratários, bem como contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controle do vetor e/ou redução da transmissão de arbovírus.
Investigação da função biológica dos eventos de arm switching de microRNAs e sua potencial associação com a metilação de RNA m6A utilizando zebrafish como organismo modelo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-25) Oliveira, Arthur Casulli de; Pinhal, Danillo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os microRNAs (miRNAs) são atualmente conhecidos como uma ampla classe de moléculas de RNAs reguladores da expressão gênica. Durante a biogênese, uma fita ("braço") do miRNA duplex é preferencialmente selecionada como um miRNA funcionalmente maduro, enquanto a outra fita é usualmente degradada. Eventos de arm switching ocorrem quando há mudança na preferência do braço selecionado. Isso se reflete na alteração do braço identificado como transcrito funcional, e varia de forma bastante dinâmica entre estágios do desenvolvimento, tipos de tecidos e mesmo entre espécies. Devido às particularidades de seu mecanismo de ação, os arm switching concedem aos miRNAs um ampliado potencial regulatório ao modificar o conjunto de alvos e, comumente, os processos biológicos por eles regulados. Entretanto, os mecanismos moleculares que promovem episódios de arm switching ainda necessitam ser melhor caracterizados. A identificação de metilações m6A em pri-miRNAs de linhagens celulares humanas reportada na literatura forneceu indícios de que este tipo de metilação poderia estar envolvida no processo de arm switching, principalmente devido à alteração que m6A promove na estrutura secundária de RNAs. Para testar esta hipótese, utilizamos o zebrafish, um vertebrado modelo, para avaliar se a metilação m6A poderia estar influenciando na ocorrência de arm switching nesta espécie. Para isso, confrontamos o perfil global de expressão dos braços 5p e 3p dos miRNAs pela análise de uma ampla coleção de dados de RNA-seq de períodos iniciais do desenvolvimento embrionário e diversos tecidos adultos de zebrafish obtidos da literatura. Adicionalmente, aplicamos a técnica de sequenciamento de metilações m6A (m6A-seq) no transcriptoma para identificar potencial correlação entre os picos de metilação presentes nos miRNAs e os eventos de arm switching identificados. Este conjunto de análises nos conduziu à inédita identificação de 14 eventos de arm switching em zebrafish. Pelo estudo detalhado destes casos e sua comparação aos eventos descritos em outras espécies verificamos que eventos de arm switching estão majoritariamente associados ao desenvolvimento ontogenético dos vertebrados. Adicionalmente, nossas análises sugerem que a expressão diferencial de isoformas de miRNAs (isomiRs) pode ser um importante modulador na prevalência dos braços. Também demonstramos, via análises de predição de alvos e enriquecimento funcional, que os eventos de arm switching de fato potencializam a regulação exercida pelos miRNAs, ao aumentarem o número de genes alvos, redes regulatórias e funções biológicas aos quais estão associados. No entanto, surpreendentemente, a análise criteriosa dos dados de m6A-seq nos forneceu indícios de que os pri-miRNAs de zebrafish não são efetivamente metilados, ainda que contenham sítios de metilação m6A em suas sequências. A discrepância entre os resultados obtidos neste trabalho e aqueles reportados em humanos e, mais recentemente, em Arabidopsis thaliana, sugerem que pressões seletivas atuantes na biogênese dos miRNAs poderiam estar ocorrendo em diferentes estágios nestas espécies. Ainda, considerando dados recentes da literatura sobre a interação entre a proteína efetora de metilações m6A e moléculas de RNA, conjecturamos que a estrutura secundária dos pri-miRNAs pode ser um fator permissivo desta modulação. Nesse contexto, concluímos que o arm switching é um fenômeno conservado e que está majoritariamente associado ao desenvolvimento ontogenético dos organismos. Também não encontramos evidências de que a metilação m6A interfira na prevalência dos braços de miRNAs em zebrafish, dada sua ausência aparente nos transcritos de pri-miRNAs desta espécie. Os resultados obtidos neste estudo trazem novas contribuições para a compreensão de mecanismos regulatórios inerentes à atividade funcional de miRNAs. Adicionalmente, fornecem subsídios para pesquisas futuras interessadas em explorar os mecanismos moleculares subjacentes às diferentes taxas de metilação e sua interferência na função e dinâmica evolutiva dos miRNAs nos metazoários.
Efeito dos esteroides sexuais no sistema Kisspeptinas e na diferenciação gonadal de Centropomus undecimalis.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-08-31) Ricci, Juliana Morena Bonita; Nóbrega, Rafael Henrique [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O robalo-flecha (Centropomus undecimalis) é um peixe hermafrodita protândrico de grande importância econômica. Um dos principais entraves na sua produção consiste na obtenção de matrizes fêmeas em cativeiro. Como alternativa, realiza-se captura de fêmeas selvagens ou induz a inversão sexual utilizando esteroides sexuais. No entanto, pouco se sabe sobre as informações genéticas relacionadas à reprodução e diferenciação sexual nesta espécie. Diante deste cenário, neste estudo procuramos entender o efeito dos esteroides sexuais no eixo reprodutivo durante a diferenciação gonadal. Para isto, analisamos a expressão da kisspeptina encefálica, a morfologia gonadal e os perfis transcriptômicos (RNA-seq) das gônadas pós-tratamento com esteroides. Para tanto, 450 animais indiferenciados foram divididos em 3 grupos os quais receberam dieta basal (controle), suplementada com 17α-metiltestosterona (MT) ou suplementada com 17β-estradiol (E2) por 45 dias. Os encéfalos e as gônadas dos animais foram coletados logo após o tratamento hormonal e em intervalos de 4 meses durante o período de 1 ano. Os resultados da expressão gênica dos encéfalos mostraram que os grupos tratados com MT e E2 apresentaram aumento nos níveis de RNAm de kiss1 em relação ao controle. Os transcritos primários do receptor kissr2 não variaram entre os tratamentos. Quanto à morfologia, o grupo tratado com MT apresentou gônada mais desenvolvida e com características morfológicas de testículo. O grupo E2 também apresentou gônada mais desenvolvida, porém com características morfológicas de ovário. Para análise do RNA-seq foi adotada a estratégia de novo. A montagem do transcriptoma gerou 45579 transcritos com uma taxa de completude 85,6% e de mapeamento de 67%. Foram identificados genes diferencialmente expressos (GDEs) entre os tratamentos, dentre eles alguns relacionados a diferenciação sexual, incluindo os genes pró-testículo (nr5a2, tbx1 dmrt3, ptch3, ptch2, shh, etc) no grupo MT, e no grupo E2 os GDEs pró-ovário (cyp19a1, foxl2, irx5, wnt4a, rspo1, fst, etc). Nossos resultados até o presente momento sugerem que os neurônios kiss1 são sensíveis a ação dos esteroides sexuais. O tratamento com MT estimulou o desenvolvimento testicular, por outro lado o E2 parece ter invertido o destino da diferenciação sexual das gônadas, resultando em um ovário no início do desenvolvimento. Por fim, o transcriptoma de novo das gônadas gerado aqui resultou em um recurso genômico valioso para a triagem de vias e genes potenciais envolvidos na diferenciação sexual de C. undecimalis.
Construção de um denso mapa genético e associação genômica para peso corporal e sexo em Piaractus mesopotamicus
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-11-29) Mendes, Natália Jade [UNESP]; Foresti, Fausto [UNESP]; Hashimoto, Teruo Hashimoto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Estudos genéticos com foco no aprimoramento de espécies de peixes Neotropicais são raros e, nesse sentido, uma espécie alvo é o pacu (Piaractus mesopotamicus), uma vez que é considerada uma das espécies de peixe de grande interesse econômico, com grande produção e valor comercial para a piscicultura brasileira. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver ferramentas genéticas e genômicas através da genotipagem dos marcadores genéticos do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) para desenvolvimento de um mapa de ligação para esta espécie e, dessa maneira identificar regiões correlacionadas com características de peso corporal e sexo. Inicialmente foram formadas 14 famílias, sendo os indivíduos marcados com pit-tags e alocados em 3 tanques distintos. Os indivíduos foram pesados e tiveram o sexo identificado; no entanto, apenas 3 famílias foram genotipadas (família1, família2 e família3). Na etapa seguinte, foi realizada a extração do DNA e a elaboração de uma biblioteca genômica para cada família através da metodologia Restriction-Site Associated DNA-Sequencing (RADseq). As bibliotecas foram sequenciadas na plataforma Hiseq 4000 Illumina, resultando em uma média de 35.697.700 de sequências brutas de cada família. Um total de 11.240 marcadores SNP foram prospectados e filtrados, sendo que destes 6.437 foram utilizados na construção do primeiro mapa genético da espécie, que possui 2.814,92cM com intervalo médio de 0.44. Esses mesmos marcadores também foram utilizados para desenvolver o primeiro GWAS (Estudo de Associação Ampla do Genoma) prospectado com indivíduos genotipados e não genotipados, totalizando 399 amostras. A análise do GWAS foi realizada por meio da abordagem ssGBLUP e explicou 3,21% para o peso corporal e 2,89% para o sexo. A partir da identificação dos loci foi realizado o Blast e a busca pelos genes candidatos, sendo identificados genes para o peso corporal envolvidos com fatores de crescimento, regulação e metabolismo do osso, codificação do colágeno, proliferação e crescimento celular. Do mesmo modo foi verificado que os genes candidatos para identificação sexual estavam relacionados à espermatogênese, diferenciação sexual, células germinativas e expressão do hormônio anti-Mülleriano (AMH) em células de Sertoli. Considera-se que as ferramentas genéticas e genômicas desenvolvidas neste trabalho poderão auxiliar em investigações sobre a evolução da espécie, organização do genôma, identificação de QTLs (loci de característica quantitativa) e em programas de melhoramento genético para o pacu e espécies aparentadas.

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