Efeito de extratos, frações e moléculas isoladas de Casearia sylvestris contra biofilme cariogênico de Streptococcus mutans
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Data
2023-02-03
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Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
Este estudo in vitro avaliou o efeito de extratos, frações e moléculas isoladas de Casearia sylvestris (de amostras coletadas em três cidades, contemplando os Biomas Atlântico e Cerrado; variedades sylvestris, lingua e intermediária) no controle do biofilme cariogênico de Streptococcus mutans. Primeiro, foram avaliados os efeitos antimicrobiano (cultura planctônica) e antibiofilme (biofilmes iniciais e pré-formados) contra S. mutans em modelos de exposição prolongada (24 horas) via viabilidade da população bacteriana (unidades formadoras de colônias-UFC/mL). Em segundo lugar, os tratamentos eficazes em biofilmes (iniciais e pré-formados) foram usados para preparar soluções (com e sem fluoreto de sódio e testados quanto ao efeito tópico (breve exposição) em biofilmes de S. mutans cultivados em discos de hidroxiapatita revestidos com saliva. Terceiro, os tratamentos selecionados (com efeito em biofilmes iniciais e pré-formados) foram avaliados através da curva de inibição do crescimento de S. mutans associada à expressão gênica e análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV). A caracterização química das frações foi realizada via cromatografia. Nenhum extrato bruto mostrou atividade antimicrobiana. Nos biofilmes iniciais, as frações de acetato de etila (AcOEt) e etanólica (EtOH) de Brasília (BRA/DF; 250 µg/mL) reduziram em média 8- e 6-logs vs. veículo, respectivamente, e as frações preparadas por extração em fase sólida (EFS-C18) de Presidente Venceslau/SP (Água/EtOH 60:40 e Água/EtOH 40:60; 500 µg/mL), reduziram em média 6- e 8-logs vs. veículo, respectivamente. Entre as moléculas (Flavonoide 4, Caseargrewiina F ou CsF, Casearinas X e J), apenas CsF (125 µg/mL), reduziu a contagem de células viáveis de biofilmes pré-formados (5 logs vs. veículo). No entanto, para efeito tópico, nenhuma solução afetou os componentes do biofilme (população viável, biomassa, componentes da matriz extracelular e organização estrutural). O perfil de sobrevivência durante o ensaio de inibição do crescimento diferiu entre CsF e AcOEt_BRA/DF. Enquanto ambos mataram a bactéria após uma hora, CsF produziu uma recuperação média constante de células sobreviventes ( 3,5 logs) até 24h (ou seja, bacteriostático). No entanto, a fração AcOEt_BRA/DF causou morte celular pronunciada e progressiva sem células recuperadas em 24h (ou seja, bactericida). CsF e AcOEt_BRA/DF causaram danos irreversíveis às células de S. mutans (imagens MEV) e influenciaram a expressão de genes de virulência de S. mutans. AcOEt_BRA/DF reduziu a expressão de eno (0,6 vezes) e induziu nox1 (8 vezes); CsF induziu gtfB ( 5 vezes). As análises cromatográficas indicam que a fração AcOEt de Brasília/DF contém uma casearina ainda não identificada. Assim, um efeito contra biofilmes de S. mutans ocorreu apenas em um modelo de exposição prolongada devido à capacidade bacteriostática e/ou bactericida de uma fração e uma molécula de C. sylvestris.
This in vitro study evaluated the effect of extracts, fractions, and isolated molecules of Casearia sylvestris (of samples collected in different cities, contemplating the Atlantic and Cerrado Biomes; sylvestris, lingua, and intermediate varieties) to control the cariogenic biofilm of Streptococcus mutans. First, the antimicrobial (planktonic culture) and antibiofilm (initial and pre-formed biofilms) effects against S. mutans in prolonged exposure (24 hours) models via bacterial population viability (colony-forming unitsCFU/mL) were assessed. Next, the effective treatments in biofilms (initial and pre-formed) were used to prepare solutions (with and without fluoride) and tested for the topical effect (brief exposure) in S. mutans biofilms grown on saliva-coated hydroxyapatite discs. Lastly, selected treatments were evaluated through the S. mutans growth inhibition curve associated with gene expression and scanning electron microscopy (SEM) analyses. The chemical characterization of the fractions was performed via chromatography. No crude extracts showed antimicrobial activity. In early biofilms, the ethyl acetate (AcOEt) and ethanolic (EtOH) fractions from Brasília (BRA/DF; 250 µg/mL) reduced 8- and 6-logs vs. vehicle, respectively, and the fractions prepared by solid phase extraction (SPE-C18) from Presidente Venceslau/SP (Water/EtOH 60:40 and Water/EtOH 40:60; 500 µg/mL), reduced 6- and 8-logs vs. vehicle, respectively. Among the isolated molecules (Flavonoid 4, Caseargrewiin FCsF, Casearins X and J), only CsF (125 µg/mL) reduced the viable cell counts of pre-formed biofilms (5 logs vs. vehicle). However, none of the solutions presented a topical effect on biofilm components (viable population, biomass, extracellular matrix components, and structural organization). The survival profile during the growth inhibition assay differed between CsF and AcOEt_BRA/DF. While both killed the bacterium after one hour, CsF yielded a constant mean recovery of surviving cells (3.5 logs) until 24h (i.e., bacteriostatic). But AcOEt_BRA/DF caused pronounced and progressive cell death without cells recovered at 24h (i.e., bactericidal). CsF and AcOEt_BRA/DF caused irreversible damage to S. mutans cells (SEM images) and influenced the expression of S. mutans virulence genes. AcOEt_BRA/DF reduced the expression of eno (0.6-fold) and induced nox1 (8-fold); CsF induced gtfB (5-fold). Chromatographic analyzes indicate that the AcOEt fraction from Brasília/DF contains an unidentified casearin. Thus, an effect against S. mutans biofilms occurred only in a prolonged exposure model due to the bacteriostatic and/or bactericidal capacity of a fraction and a molecule from C. sylvestris.
This in vitro study evaluated the effect of extracts, fractions, and isolated molecules of Casearia sylvestris (of samples collected in different cities, contemplating the Atlantic and Cerrado Biomes; sylvestris, lingua, and intermediate varieties) to control the cariogenic biofilm of Streptococcus mutans. First, the antimicrobial (planktonic culture) and antibiofilm (initial and pre-formed biofilms) effects against S. mutans in prolonged exposure (24 hours) models via bacterial population viability (colony-forming unitsCFU/mL) were assessed. Next, the effective treatments in biofilms (initial and pre-formed) were used to prepare solutions (with and without fluoride) and tested for the topical effect (brief exposure) in S. mutans biofilms grown on saliva-coated hydroxyapatite discs. Lastly, selected treatments were evaluated through the S. mutans growth inhibition curve associated with gene expression and scanning electron microscopy (SEM) analyses. The chemical characterization of the fractions was performed via chromatography. No crude extracts showed antimicrobial activity. In early biofilms, the ethyl acetate (AcOEt) and ethanolic (EtOH) fractions from Brasília (BRA/DF; 250 µg/mL) reduced 8- and 6-logs vs. vehicle, respectively, and the fractions prepared by solid phase extraction (SPE-C18) from Presidente Venceslau/SP (Water/EtOH 60:40 and Water/EtOH 40:60; 500 µg/mL), reduced 6- and 8-logs vs. vehicle, respectively. Among the isolated molecules (Flavonoid 4, Caseargrewiin FCsF, Casearins X and J), only CsF (125 µg/mL) reduced the viable cell counts of pre-formed biofilms (5 logs vs. vehicle). However, none of the solutions presented a topical effect on biofilm components (viable population, biomass, extracellular matrix components, and structural organization). The survival profile during the growth inhibition assay differed between CsF and AcOEt_BRA/DF. While both killed the bacterium after one hour, CsF yielded a constant mean recovery of surviving cells (3.5 logs) until 24h (i.e., bacteriostatic). But AcOEt_BRA/DF caused pronounced and progressive cell death without cells recovered at 24h (i.e., bactericidal). CsF and AcOEt_BRA/DF caused irreversible damage to S. mutans cells (SEM images) and influenced the expression of S. mutans virulence genes. AcOEt_BRA/DF reduced the expression of eno (0.6-fold) and induced nox1 (8-fold); CsF induced gtfB (5-fold). Chromatographic analyzes indicate that the AcOEt fraction from Brasília/DF contains an unidentified casearin. Thus, an effect against S. mutans biofilms occurred only in a prolonged exposure model due to the bacteriostatic and/or bactericidal capacity of a fraction and a molecule from C. sylvestris.
Descrição
Palavras-chave
Casearia, Biofilmes, Streptococcus mutans, Matriz Extracelular, Durapatita