UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE BOTUCATU INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS ESTRUTURA E ONTOGÊNESE DE ÓRGÃOS REPRODUTIVOS DE CONNARUS SUBEROSUS PLANCH. (CONNARACEAE) E OXALIS CYTISOIDES ZUCC. (OXALIDACEAE) JOÃO DONIZETE DENARDI BOTUCATU - SP - 2008 - Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Botânica), AC: Morfologia e Diversidade Vegetal. UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE BOTUCATU INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS ESTRUTURA E ONTOGÊNESE DE ÓRGÃOS REPRODUTIVOS DE CONNARUS SUBEROSUS PLANCH. (CONNARACEAE) E OXALIS CYTISOIDES ZUCC. (OXALIDACEAE) JOÃO DONIZETE DENARDI PROFª DRª DENISE MARIA TROMBERT OLIVEIRA ORIENTADORA PROF. DR. ÉLDER ANTÔNIO SOUSA PAIVA CO-ORIENTADOR BOTUCATU - SP - 2008 - Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Botânica), AC: Morfologia e Diversidade Vegetal. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS Denardi, João Donizete. Estrutura e ontogênese de órgãos reprodutivos de Connarus Suberosus Planch. (Connaraceae e Oxalis Cytisoides Zucc. (Oxalidaceae) / João Donizete Denardi. – Botucatu : [s.n.], 2008. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu 2008. Orientador: Denise Maria Trombert Oliveira Co-orientador: Élder Antônio Sousa Paiva Assunto CAPES: 20303009 1. Anatomia vegetal 2. Morfologia vegetal 3. Flores 4. Frutos 5. Se- mentes CDD 581.46 Palavras-chave: Connaraceae; Flor; Oxalidaceae; Pericarpo; Semente; Tricoma glandular ii Dedico à minha família. iii AGRADECIMENTOS À Profª Drª Denise Maria Trombert Oliveira, a quem devoto sincera admiração, agradeço por toda a atenção dedicada a minha formação acadêmica, pelo apoio e incentivo constantes na realização deste trabalho, pela confiança e tratamento acolhedor. Ao Prof. Dr. Élder Antônio Sousa e Paiva e Profª Drª Sheila Zambello de Pinho, pela orientação em temas específicos neste trabalho e pela generosidade com que a fizeram. Aos Professores do curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Botânica), pelas suas contribuições a minha formação acadêmica. Aos taxonomistas Luciano C. Milhomens e Pedro Fiaschi, pela identificação das espécies estudadas neste trabalho. Aos funcionários do Departamento de Botânica, especialmente Clemente José Campos, pelo auxílio nas coletas, e Kleber A. Campos, pela prontidão em me auxiliar nas atividades laboratoriais. Aos funcionários da Biblioteca Marlene e Braz, pela simpatia e empenho em atender às solicitações de artigos via COMUT. Aos meus queridos amigos Juliana Marzinek e Orlando Cavalari de Paula pelo companheirismo e convívio acadêmico tão proveitoso. Aos amigos Shirlayne S. U. de Barros, Daniela D. Pinto e Marco Antônio G. Martins, pela cordialidade com que me receberam em Botucatu e pelo apoio. À Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul (UEMS) por me incluir no Programa de Qualificação Docente. Aos queridos amigos da UEMS: Emília Maria Silva, Francisco C. E. González, Olga T. Matsuno, César Y. Fujihara e Rosemary Mocchi, por todo o apoio que recebi. À CAPES pela concessão de bolsa PICDT. iv SUMÁRIO RESUMO ............................................................................................................................. 1 ABSTRACT ......................................................................................................................... 3 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 8 Connaraceae e Oxalidaceae: relações interfamiliares e classificação ordinal .......................... 8 Família Connaraceae ............................................................................................................. 9 Família Oxalidaceae ............................................................................................................ 12 Considerações sobre as espécies estudadas .......................................................................... 13 Anatomia floral .................................................................................................................... 16 Heterostilia ......................................................................................................................... 19 Morfologia dos frutos .......................................................................................................... 21 Morfologia da semente ........................................................................................................ 21 CAPÍTULO I – Tricomas glandulares em Connarus suberosus (Connaraceae): distribuição, organização estrutural e prováveis funções ........................................................................... 24 Resumo ............................................................................................................................... 26 Introdução ........................................................................................................................... 27 Material e métodos .............................................................................................................. 28 Resultados .......................................................................................................................... 29 Discussão ............................................................................................................................ 31 Literatura citada .................................................................................................................. 34 Ilustrações ........................................................................................................................... 38 CAPÍTULO II – Existem variedades de Connarus suberosus? Evidências morfoanatômicas da heterostilia e dioicia ............................................................................................................ 42 Resumo ............................................................................................................................... 44 Introdução ........................................................................................................................... 44 Material e métodos .............................................................................................................. 46 Resultados .......................................................................................................................... 47 Discussão ............................................................................................................................ 52 Referências ......................................................................................................................... 57 Ilustrações ........................................................................................................................... 59 v CAPÍTULO III – Morfoanatomia e desenvolvimento do pericarpo e da semente de Connarus suberosus Planch. (Connaraceae) ........................................................................................ 67 Introdução ........................................................................................................................... 69 Material e métodos .............................................................................................................. 70 Resultados .......................................................................................................................... 71 Discussão ............................................................................................................................ 78 Literatura citada .................................................................................................................. 84 Ilustrações ........................................................................................................................... 89 CAPÍTULO IV – Morfologia e anatomia floral de Oxalis cytisoides Zucc. (Oxalidaceae) . 102 Resumo ............................................................................................................................. 104 Introdução ......................................................................................................................... 104 Material e métodos ............................................................................................................ 106 Resultados ........................................................................................................................ 106 Discussão .......................................................................................................................... 112 Referências bibliográficas ................................................................................................. 115 Ilustrações ......................................................................................................................... 118 CAPÍTULO V – Morfoanatomia e ontogênese do pericarpo e semente de Oxalis cytisoides Zucc. (Oxalidaceae), com ênfase no peculiar mecanismo de deiscência ............................. 125 Resumo ............................................................................................................................. 127 Introdução ......................................................................................................................... 127 Material e métodos ............................................................................................................ 129 Resultados ........................................................................................................................ 130 Discussão .......................................................................................................................... 134 Referências bibliográficas ................................................................................................. 138 Ilustrações ......................................................................................................................... 140 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 146 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 147 1 DENARDI, J.D. ESTRUTURA E ONTOGÊNESE DE ÓRGÃOS REPRODUTIVOS DE CONNARUS SUBEROSUS PLANCH. (CONNARACEAE) E OXALIS CYTISOIDES ZUCC. (OXALIDACEAE). 2008. 155 P. TESE (DOUTORADO) – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, BOTUCATU. RESUMO - Considerando que Connaraceae e Oxalidaceae constituem um clado de Oxalidales bem representado na flora brasileira e pouco estudado relativamente à estrutura de órgãos reprodutivos, este trabalho aborda a morfoanatomia e a ontogênese de flores, frutos e sementes de Connarus suberosus (Connaraceae) e Oxalis cytisoides (Oxalidaceae), a fim de avaliar a existência de padrões estruturais comuns a essas espécies. O processamento das amostras para microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão e de varredura seguiu as técnicas usuais. Verificou-se que, estruturalmente, C. suberosus possui heterostilia dimórfica, caracterizada pelas formas brevi- e longistila, as quais se mostraram funcionalmente masculina e feminina, respectivamente. Alguns caracteres morfológicos peculiares a cada forma floral, provavelmente estão associados à evolução da dioicia, como dimensões de sépalas e pétalas e distribuição de tricomas glandulares. Nesta análise, provou- se que esses caracteres, aliados às diferenças de tamanho dos verticilos de estames das formas florais, foram utilizados equivocadamente na delimitação de C. suberosus var. fulvus e C. suberosus var. suberosus, que correspondem às formas brevistila e longistila, respectivamente. Independentemente da forma floral, houve variação no número de sépalas, pétalas e estames e tendência à restrição do tecido nectarífero aos setores antepétalos do tubo estaminal. A vascularização carpelar mostrou-se derivada em relação ao padrão descrito para Connaraceae, devido à formação de um complexo ovular mediante união parcial de traços ovulares àqueles derivados de feixes alas. O desenvolvimento do pericarpo e da semente, que pode ocorrer apomiticamente, não é concomitante, visto que a diferenciação seminal inicia-se após a expansão do pericarpo, quando este alcança comprimento e largura finais. Ao término da diferenciação seminal, ocorre a maturação pericárpica, caracterizada pela expansão radial das células do mesocarpo externo que, provavelmente, causa a deiscência do folículo. A semente madura é arilada, hemítropa e vascularizada por um complexo rafeal e outro pré- rafeal; o tégmen é parcialmente absorvido. Diferentemente de outras Connaraceae, a endotesta e o exotégmen são multiplicativos; o mesotégmen mostra-se esclerificado. O endosperma, que é núcleo-celular, persiste como estrato irregularmente multisseriado, adnato ao tegumento. Como parte do indumento de C. suberosus, relatou-se a ocorrência de tricomas glandulares, que consistem de pedúnculo multicelular, unisseriado, e de uma porção glandular multicelular que, na fase secretora, apresenta acúmulo de compostos pécticos, amido e gotas lipídicas, as quais ocupam grande parte do volume celular. No citoplasma das células secretoras, predominam mitocôndrias, plastídios e dictiossomos. Na fase secretora, observa-se hidrólise do amido presente nos plastídios, redução na densidade do estroma plastidial e fusão de plastídios com vacúolos. A ocorrência desses tricomas glandulares nas superfícies expostas de órgãos em desenvolvimento, associada à natureza química dos produtos de secreção e reserva, sugere que estas estruturas possam atuar como corpos de alimentação. Oxalis cytisoides apresenta tristilia e morfologia floral típica de Oxalidaceae, destacando-se que as pétalas expandem-se apenas após a diferenciação dos demais verticilos, sendo livres na base e no ápice, conatas em pequena extensão. O retarde no desenvolvimento da corola sugere que a obdiplostemonia é primária. Anatomicamente, o que mais se destaca é similaridade entre o mesofilo de sépalas e carpelos, ambos preenchidos, em grande parte, por volumosas células aqüíferas. O pericarpo de O. cytisoides passa por pequenas alterações durante o desenvolvimento, mantendo estrutura geral similar à parede ovariana, com exocarpo e 2 endocarpo unisseriados e mesocarpo com dois estratos, o externo composto por parênquima aqüífero, que mantém a turgescência do fruto até próximo da deiscência, e o interno, que é clorofiliano. As sementes desenvolvem ambos os tegumentos, com espessa cutícula na exotesta, mesotesta multiplicativa que acumula amido até próximo da maturidade, endotesta cristalífera e exotégmen unisseriado, composto por células paliçádicas espessadas. São sementes albuminosas, com amplo endosperma formado de modo núcleo-celular. Ocorre deiscência loculicida no fruto, a partir da desidratação do mesocarpo externo, que contrai o pericarpo; tricomas endocárpicos lignificados alavancam as sementes, lançando-as balisticamente; como a testa se rompe na camada cristalífera, as sementes são dispersadas revestidas pelo exotégmen e resíduos da endotesta. As espécies estudadas compartilham vários caracteres e tendências morfológicas, os quais incluem ocorrência e função de tricomas glandulares em partes florais; restrição de áreas nectaríferas aos setores antepétalos; desenvolvimento assimétrico dos frutos, os quais apresentam estômatos exo- e endocárpicos e tricomas internos; desenvolvimento núcleo-celular do endosperma; entre outros. Palavras-chave – Connaraceae, Oxalidaceae, flor, pericarpo, semente, tricoma glandular 3 DENARDI, J.D. STRUCTURE AND ONTOGENY OF THE REPRODUTIVE ORGANS OF CONNARUS SUBEROSUS PLANCH. (CONNARACEAE) AND OXALIS CYTISOIDES ZUCC. (OXALIDACEAE). 2008. 155P. DR THESIS – BIOSCIENCES INSTITUTE, UNESP – SÃO PAULO STATE UNIVERSITY, BOTUCATU. ABSTRACT – Connaraceae and Oxalidaceae constitute a clade of Oxalidales that is well represented within the Brazilian flora although relatively poorly studied in terms of the structure of their reproductive organs. The present work examined the morphology, anatomy and ontogeny of the flowers, fruits, and seeds of Connarus suberosus (Connaraceae) and Oxalis cytisoides (Oxalidaceae) in order to evaluate the existence of structural patterns common to both species. Preparation of plant samples for viewing under light and electron microscopy followed established techniques. Connarus suberosus demonstrated dimorphic heterostyly, characterized by the brevi- and longistylous morphs, which were observed to be functionally masculine and feminine respectively. Some of the peculiar morphological characteristics of each floral form are probably associated with the evolution of dioecy, such as the dimensions of the sepals and petals and the distribution of the glandular trichomes. The present analysis indicated that these characters, allied to differences in the sizes of the verticils of the two floral forms, had been equivocally used in delimiting C. suberosus var. fulvus and C. suberosus var. suberosus, which correspond to thrum and pin morphs respectively. Independent of the floral form, variation in the numbers of sepals, petals, and stamens were observed, as well as a tendency for the nectary tissues to be restricted to the epipetalous sectors of the staminal tube. Carpel vasculature was observed to be derived in relation to the pattern described for Connaraceae due to the formation of an ovular complex resulting from the partial union of ovular traces derived from wing bundles. The development of the pericarps and seeds, which can occur in an apomixic manner, is not concomitant; the seed differentiation initiates after the expansion of the pericarp when this organ attains its final length and width. The pericarp matures when seminal differentiation ends, and is characterized by radial expansion of the outer mesocarp cells, which provokes the dehiscence of the follicles. The mature seed is arillate, hemianatropous, and is vascularized by a raphal bundle complex as well as a pre-raphal bundle complex; the tegmen is partially absorbed. Different from other Connaraceae, the endotesta and exotegmen are multiplicative; the mesotegmen is sclerified. The endosperm, which is nuclear-cellular, persists as an irregular multiseriate layer adnate to the seed coat. Glandular trichomes make up part of the indument of C. suberosus, these having uniseriate multicellular peduncles with multicellular glandular portions that accumulate pectic compounds, starch, and lipidic drops, which take up a large portion of the cellular volume in their secretory phase. Mitochondria, plastids, and dictiosomes predominate in the cytoplasm of the secretory cells. Hydrolysis of the starch present in the plastids was observed in the secretory phase, as well as a reduction in the density of the plastid stroma and the fusion of plastids with vacuoles. The occurrence of glandular trichomes on the exposed surfaces of the developing organs in association with the chemical nature of the secretion and reserve products, suggests that these structures act as food bodies. Oxalis cytisoides demonstrates the tristyly and floral morphology typical of the Oxalidaceae, especially in terms of its petals, that expand only after the differentiation of the other verticils, are free at the base and at the apex, and connate only for short extensions. The slow development of the corolla suggests that the obdiplostemony is primary. The anatomical factor that most stands out is the similarity between the mesophyll of the sepals and carpels, 4 both of which are mostly filled by large water-storing cells. The pericarp of O. cytisoides undergoes only small alterations during development, maintaining the general structure similar to the ovarian wall. The exocarp and endocarp are uniseriate, and the mesocarp has two layers – an outer layer composed of watery parenchyma, which maintains the fruit turgid until near dehiscence, and an inner photosynthetic layer. The seeds develop both integuments, with a thick exotesta cuticle, a multiplicative mesotesta that accumulates starch almost to maturity, and a crystalliferous endotesta and uniseriate exotegmen composed of thick palisade cells. The seeds are albuminous, with ample endosperm formed in a nuclear- cellular mode. Loculicidal dehiscence occurs in the fruit by dehydration of the outer mesocarp, contracting the pericarp; lignified endocarp trichomes propel the seeds outwards at high speeds. As the testa is torn along the crystalliferous layer the seeds are covered by the exotegmen and vestiges of the endotesta after dispersal. The species studied have various characteristics and morphological tendencies which include: the occurrence and functioning of glandular trichomes on floral parts; restriction of nectary areas to the epipetalous sectors; asymmetric development of the fruits, which have stomata on the exo- and endocarp and internal trichomes; the development of a nuclear-cellular endosperm; among others. Key words – Connaraceae, Oxalidaceae, flower, pericarp, seeds, glandular trichomes 5 INTRODUÇÃO Estudos recentes sobre sistemática de angiospermas promoveram um reagrupamento de taxa superiores, com base em análises cladísticas de seqüências de DNA, em particular dos genes 18S rDNA, rbcL e atpB (Chase et al., 1993; Savolainen et al., 2000; Soltis et al., 2000). Desta forma, uma nova classificação para as famílias de angiospermas foi proposta pelo “Angiosperm Phylogeny Group” (APG, 1998; 2003). Uma associação inesperada de famílias resultou na circunscrição da ordem Oxalidales, a qual, de acordo com APG (2003), constitui-se das famílias Brunelliaceae, Cephalotaceae, Connaraceae, Cunoniaceae, Elaeocarpaceae (incluindo Tremandraceae) e Oxalidaceae. Em classificações tradicionais (por exemplo: Cronquist, 1981; Takhtajan, 1997; Thorne, 2000), essas famílias estavam alocadas em diversas ordens, nem todas relacionadas estritamente ou inclusas em uma mesma subclasse. Na classificação de Cronquist (1981), constavam na subclasse Rosidae as seguintes ordens e respectivas famílias: Rosales (Brunelliaceae, Cephalotaceae, Connaraceae e Cunoniaceae), Geraniales (Oxalidaceae) e Polygalales (Tremandraceae). Elaeocarpaceae, em contraste, estava na subclasse Dilleniidae (ordem Malvales). Na classificação de Takhtajan (1997), embora colocadas nas mesmas subclasses, o número de ordens para essas famílias aumentou. Em Rosidae, consistiam de Cunoniales (Brunelliaceae e Cunoniaceae), Cephalotales (Cephalotaceae), Connarales (Connaraceae), Oxalidales (Oxalidaceae) e Vochysiales (Tremandraceae). Elaeocarpaceae foi mantida em Dilleniidae, mas acomodada em sua própria ordem, Elaeocarpales. Na classificação de Thorne (2000), considerou-se em Rosidae apenas Brunelliaceae, Cephalotaceae e Cunoniaceae, as quais foram agrupadas na ordem Cunoniales. As famílias restantes foram distribuídas em Dilleniidae: Violales (Elaeocarpaceae), Rutales (Connaraceae) e Geraniales (Oxalidaceae e Tremandraceae). Zhang e Simmons (2006) sugeriram a inclusão de Huaceae em Oxalidales, tendo em vista que, em suas análises, esses taxa figuram como grupos irmãos com suporte moderado (valores jacknife superiores a 80%). Em estudos anteriores (Nandi, Chase e Endress, 1998; Savolainen et al., 2000; Soltis et al., 2000), não se obteve suporte suficiente para se realizar a classificação ordinal dessa família. De acordo com Stevens (2007), Connaraceae e Oxalidaceae são grupos irmãos, assim como Brunelliaceae e Cephalotaceae, e Tremandraceae está embebida em 6 Elaeocarpaceae. No entanto, com exceção do par Connaraceae/Oxalidaceae, as relações entre as demais famílias (Brunelliaceae, Cephalotaceae, Cunoniaceae, Elaeocarpaceae incluindo Tremandraceae) apresentam-se variáveis, devido à resolução conferida pelos dados até agora considerados na análise filogenética (Davies et al., 2004; Savolainen et al., 2000; Soltis et al., 2005; Zhang e Simmons, 2006). A interpretação da estrutura floral (Matthews e Endress, 2002, 2006), por outro lado, corroborou as relações mencionadas por Stevens (2007). No sistema APG II (APG, 2003), Oxalidales, Malpighiales e Celastrales constituem um grande subclado de eurosídeas I, cujas relações permanecem não resolvidas. Stevens (2007) reconheceu como sinapomorfia para essas ordens a ocorrência de exotégmen fibroso. Matthews e Endress (2005) descreveram, com base na morfoanatomia floral, caracteres que evidenciam a associação entre Celastrales e Malpighiales, bem como as potenciais sinapomorfias e tendências apomórficas entre Oxalidales, Malpighiales e Celastrales. Matthews e Endress (2002) relacionaram diversos caracteres de Oxalidales menos comumente encontrados em outras ordens de rosídeas e consideraram que, pelo menos parte desses, poderiam representar sinapomorfias para Oxalidales ou, talvez, para eurosídeas I sensu APG (1998). Stevens (2007) reconheceu como sinapomorfia para eurosídeas I o endosperma escasso. Para Oxalidales, o autor mencionou os seguintes caracteres: ocorrência de células de mucilagem, micrópila formada por ambos os tegumentos, estigma secretor, tegumento do óvulo multiplicativo, endotesta cristalífera e paliçádica, e exotégmen fibroso ou traqueoidal. Tendo em vista que: 1) na flora brasileira, a ordem Oxalidales sensu APG (2003) e Stevens (2007) está representada pelas famílias Connaraceae, Cunoniaceae, Elaeocarpaceae e Oxalidaceae (Souza e Lorenzi, 2005); 2) há uma maior afinidade filogenética entre Connaraceae e Oxalidaceae, conforme evidenciam as análises baseadas em dados moleculares; e 3) os trabalhos relativos à morfoanatomia de órgãos reprodutivos dessas duas famílias são escassos, ao contrário da situação levantada principalmente para Cunoniaceae (Bensel e Palser, 1975; Dickison, 1975a, 1975b, 1984; Doweld, 1998; Godley 1983; Govil e Saxena, 1976; Kennedy e Prakash, 1981; Lopez Naranjo e Huber, 1971; Moody e Hufford, 2000; Webb e Simpson, 1991); considerou-se oportuna a realização de um estudo sobre a estrutura e a ontogênese de órgãos reprodutivos de Connaraceae e Oxalidaceae. As espécies escolhidas para o presente estudo foram Connarus suberosus Planch. (Connaraceae) e Oxalis cytisoides Zucc. (Oxalidaceae), em função de sua ocorrência 7 na região de Botucatu, Estado de São Paulo. No processo de seleção, consideraram-se também os seguintes aspectos: - Em 170 levantamentos florísticos rápidos da flora lenhosa de cerrado lato sensu, realizados nos Estados da Bahia, Ceará, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Piauí, Rondônia e Tocantins, Ratter, Bridgewater e Ribeiro (2001) avaliaram, entre 587 taxa inventariados (463 identificados até o nível de espécie), C. suberosus (Connaraceae) como uma das espécies mais freqüentes, ocorrendo em 75% dos levantamentos. - Oxalis cytisoides inclui-se no subgênero Thamnoxys, cujas espécies evoluíram principalmente nos campos e cerrados do Brasil (Lourteig, 1994) e para as quais não foram empreendidas abordagens anatômicas envolvendo órgãos reprodutivos. O objetivo principal deste estudo foi realizar uma análise morfoanatômica dos órgãos reprodutivos de C. suberosus e O. cytisoides, a fim de avaliar a existência de padrões estruturais comuns a essas espécies. Os objetivos específicos consistiram em: - Descrever a anatomia e a vascularização floral, a estrutura e ontogênese de frutos e sementes nas referidas famílias, bem como analisar a variabilidade estrutural desses órgãos. - Comparar os resultados obtidos àqueles disponíveis na literatura para as demais famílias de Oxalidales e grupos filogeneticamente relacionados de acordo com o sistema APG II. - Verificar a existência de caracteres estruturais de ocorrência comum às plantas dos ambientes de origem das espécies selecionadas. 8 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Connaraceae e Oxalidaceae: relações interfamiliares e classificação ordinal Várias interpretações taxonômicas foram apresentadas a respeito das afinidades de Connaraceae com outras famílias. Hutchinson (1969) classificou Connaraceae em Dilleniales por considerá-la derivada do mesmo estoque ancestral de Dilleniaceae, com a qual compartilha gineceu apocárpico e sementes ariladas. No entanto, Dickison (1971, 1972, 1973a, 1973b, 1979) não encontrou evidências na morfologia de órgãos reprodutivos ou vegetativos para o estabelecimento dessa associação. Dickison (1972) concluiu que os caracteres estruturais do lenho indicam uma posição avançada de Connaraceae dentro de Rosales ou uma relação mais estreita com Sapindales, conforme propôs Heimsch (1942) em um estudo anatômico do lenho de Gruinales e Terebinthales. Cronquist (1968) incluiu Connaraceae em Sapindales devido, principalmente, à anatomia avançada do lenho e à presença de arilo e órgãos secretores comuns a Sapindaceae. Contudo, esse autor ressaltou as similaridades entre Connaraceae e Rosales. A relação de Connaraceae com Leguminosae e Rosaceae foi indicada em diversos estudos, dentre os quais se destacam aqueles conduzidos por Dickison (1971, 1972, 1973a, 1973b) a respeito da vascularização carpelar, anatomia nodal, morfoanatomia foliar e anatomia do lenho de Connaraceae. Cronquist (1981), subsidiado pelos trabalhos realizados por Dickison, optou por classificar Connaraceae em Rosales, em função de suas folhas exestipuladas, gineceu freqüentemente apocárpico e frutos usualmente do tipo folículo, que a distinguiria de Fabales; porém destacou que essa família encontra-se em uma “área nebulosa” que provê a conexão entre Rosales, Fabales e Sapindales. Posteriormente, trabalhos envolvendo filogenia de Leguminosae revelaram que essa família possui o mesmo padrão de espessamento endotecial de Connaraceae, Rosaceae, Sapindaceae e Chrysobalanaceae (Manning e Stirton, 1994) e o mesmo arranjo de ceras epicuticulares observado em Connaraceae (Ditsch, Patha e Barthlott, 1995). Corner (1976), em seus estudos sobre as sementes das dicotiledôneas, sugeriu uma aliança entre Connaraceae e as demais famílias que apresentam exotégmen fibroso, especialmente Meliaceae. Segundo o autor, não há evidências de afinidades entre Connaraceae, Rosaceae e Leguminosae, quando se considera a estrutura das sementes e o sistema de vascularização dos carpelos. 9 A inclusão de Connaraceae em qualquer uma das ordens citadas anteriormente, leva à incompatibilidade de parte de seus caracteres com aquela posição. Assim, Takhtajan (1969, 1997) criou a ordem Connarales para abranger, exclusivamente, essa família. Segundo Forero (1983), alguns autores clássicos como Endlicher, Planchon, Bentham e Hooker relacionaram Connaraceae com Oxalidaceae. Entretanto, na maioria das classificações tradicionais, incluiu-se Oxalidaceae em Geraniales (Cronquist, 1981, 1988; Thorne, 1992, 2000). Dahlgren (1989), por outro lado, acomodou essa família em Linales, enquanto Takhtajan (1997) preferiu tratá-la em uma ordem própria: Oxalidales. Behnke (1982) considerou possível a associação citada no início desse parágrafo, ao verificar que Connaraceae (Connarus) e alguns membros de Oxalidaceae (Averrhoa, Oxalis) apresentam plastídios de elementos crivados do tipo P, sendo que Connarus e Averrhoa compartilham a mesma forma (Pcs’). Recentemente, Connaraceae e Oxalidaceae aparecem como famílias- irmãs nas análises filogenéticas realizadas por Hufford e Dickison (1992), a partir de dados morfológicos e químicos, bem como em estudos filogenéticos baseados em seqüências gênicas (Davies et al., 2004; Savolainen et al., 2000; Soltis et al., 2000, 2005; Zhang e Simmons, 2006) ou na combinação de dados moleculares e morfológicos (Nandi, Chase e Endress, 1998). Dessa forma, essas famílias são classificadas atualmente na ordem Oxalidales (APG, 1998, 2003). De acordo com Stevens (2007), os seguintes caracteres são comuns a Connaraceae e Oxalidaceae: plantas com construção simpodial; presença da benzoquinona rapanona, destituídas de ácido elágico; raízes diarcas; lenho com raios unisseriados; plastídios de tubo crivado com cristalóides protéicos; drusas ausentes; plaquetas de cera epicuticular arranjadas como rosetas; folhas imparipinadas ou trifolioladas ou unifolioladas (condição menos comum), folíolos articulados, margens inteiras, nervuras secundárias pinadas a palmadas, sem estípulas; corola unida pós-genitalmente próximo à base, com pêlos glandulares unisseriados; nectário extra-estaminal; dois verticilos de estames de diferentes comprimentos, os quais portam pêlos glandulares unisseriados; heterostilia di ou trimórfica; fruto com cálice persistente e exotesta mais ou menos carnosa. Família Connaraceae Connaraceae consta de espécies arbóreas, arbustivas ou lianas com ampla distribuição nas regiões tropicais. No Neotrópico, é encontrada desde o México e Cuba até o Estado de Santa Catarina, no sul do Brasil. Ocorre desde o nível do mar até 1.000 metros de altitude, em florestas ombrófilas e ripárias, nos cerrados e na vegetação sobre restinga. No 10 Brasil, que é considerado o centro de diversificação da família na região Neotropical, ocorrem 64 espécies, classificadas nos gêneros Bernardinia (1), Connarus (29), Pseudoconnarus (3) e Rourea (31). No Estado de São Paulo, a família está representada por Bernardinia, Connarus e Rourea, abrangendo oito espécies e três variedades (Forero, 1983; Forero e Costa, 2002). Os estudos taxonômicos sobre Connaraceae, como aqueles conduzidos por Schellenberg (1938), Leenhouts (1958) e Breteler (1989), compilados no Quadro 1, revelaram divergências consideráveis na delimitação dos taxa em níveis infrafamiliares. Os tratamentos realizados por Leenhouts (1958) e Breteler (1989) caracterizam-se por uma substancial redução dos números de gêneros e espécies em relação àqueles reconhecidos por Schellenberg (1938). Leenhouts revisou o trabalho de Schellenberg (1938), quando preparava sua contribuição para “Flora Malesiana”. Nessa obra, Leenhouts (1958) referiu-se a seis gêneros e 36 espécies de Connaraceae para a Malásia, em contraste aos nove gêneros com 142 espécies reportados, anteriormente, por Schellenberg (1938) para a Ásia e áreas adjacentes. Um resultado similar foi obtido na revisão das espécies africanas (Breteler, 1989): uma redução de 154 espécies em 16 gêneros, segundo Schellenberg (1938), para 49 espécies em 10 gêneros. No entanto, o tratamento empreendido para espécies americanas não levou à diminuição do número de taxa. De acordo com Schellenberg (1938), cinco gêneros com 89 espécies ocorrem na América, enquanto que Forero (1983) registrou 101 espécies alocadas nos mesmos gêneros. Desta forma, a América exibe, atualmente, a maior diversidade de espécies. Na opinião de Breteler (1989), esse resultado provavelmente reflete um conceito diferente de espécie. Em seu estudo, Leenhouts (1958) reconheceu 16 gêneros para Connaraceae e não aceitou a subdivisão da família, proposta por Schellenberg (1938), principalmente por considerar a delimitação de tribos, com base na posição da inflorescência, insustentável na prática. Breteler (1989) encontrou apoio em análises filogenética e de similaridade total para o estabelecimento de quatro tribos: Connareae, Jollydoreae, Manoteae e Cnestideae. Essas classificações (filogenética e por similaridade total) basearam-se nos gêneros e em seus caracteres diferenciais. Segundo o autor, Connaraceae abrange 12 gêneros e cerca de 110 a 200 espécies, dependendo do conceito de espécie adotado. Forero (1983) fez uma síntese dos usos de espécies de Connaraceae, os quais se relacionam, principalmente, à medicina popular e a efeitos tóxicos sobre animais. Estudos fitoquímicos recentes comprovaram os benefícios terapêuticos e, algumas vezes, a toxicidade de sustâncias ativas e extratos obtidos de diversas partes de plantas dessa família. Por exemplo, Otshudi et al. (2000) relataram atividades antidesentérica e bactericida para extratos 11 Quadro 1 – Comparação de tratamentos taxonômicos infrafamiliares de Connaraceae SCHELLENBERG (1938) LEENHOUTS (1958) BRETELER (1989) Subfam. I. JOLLYDOROIDEAE 1. Cnestis Juss. Tribo 1. Jollydoreae 1. Jollydora Pierre 2. Agelaea Soland. ex. Planch. (inclui Agelaea e Castanola sensu Schellenberg, 1. Jollydora Pierre Subfam. II. CONNAROIDEAE 1938) Tribo 2. Manoteae Tribo 1. Cnestideae Subgênero Troostwykia 2. Manotes Soland. 2. Cnestis Juss. Subgênero Agelaea Tribo 3. Connareae Tribo 2. Agelaeeae 3. Roureopsis Planch. (inclui 3. Burttia Bak. F. Exell. 3. Manotes Soland. Roureopsis e Taeniochlaena sensu 4. Connarus L. 4. Hemandradenia Stapf Schellenberg, 1938) 5. Ellipanthus Hook. f. (inclui 5. Agelaea Soland. 4. Rourea Aubl. (inclui Rourea, Ellipanthus, Pseudoellipanthus, sensu Tribo 3. Byrsocarpeae Byrsocarpus, Jaundea, Santaloides, Schellenberg, 1938) 6. Pseudoconnarus Raldlk. Santaloidella, sensu Schellenberg, 1938) 6. Hemandradenia Stapf 7. Burttia Bak. F. Exell. 5. Ellipanthus Hook. f. (inclui 7. Vismianthus Mildbr. 8. Vismianthus Mildbr. Ellipanthus, Pseudoellipanthus, Tribo 4. Cnestideae 9. Bernardinia Planch. Hemandradenia sensu Schellenberg, 1938) 8. Agelaea Soland. ex. Planch. (inclui 10. Spiropetalum Gilg. 6. Connarus L. Agelaea e Castanola sensu Schellenberg, 11. Roureopsis Planch. 7. Cnestidium Planch. 1938) 12. Paxia Gilg. 8. Schellenbergia Parkinson Secção Troostwykia 13. Santaloidella Schellenb. 9. Paxia Gilg. Secção Agelaea 14. Santaloides (L.) O. Ktze. 10. Spiropetalum Gilg. 9. Cnestis Juss. Subgênero Dalbergioidea 11. Bernardinia Planch. 10. Cnestidium Planch. Subgênero Afrosantaloides 12. Vismianthus Mildbr. 11. Pseudoconnarus Raldlk. Subgênero Mimosoidea 13. Burttia Bak. F. Exell. 12. Rourea Aubl. (inclui Rourea, 15. Byrsocarpus Schum. et Thonn. 14. Pseudoconnarus Raldlk. Bernardinia, Byrsocarpus, Jaundea, Subgênero Eubyrsocarpus 15. Manotes Soland. Paxia, Roureopsis, Santaloidella, Subgênero Pseudojaundea 16. Jollydora Pierre Spiropetalum, Santaloides, Taeniochlaena, 16. Jaundea Gilg. sensu Schellenberg, 1938) Tribo 4. Castanoleae Secção Bernardinia 17. Taeniochlaena Hook. f. Secção Byrsocarpus 18. Castanola Llanos Secção Rourea 19. Schellenbergia Parkinson Secção Roureopsis 20. Ellipanthus Hook. f. Secção Santaloides 21. Pseudoellipanthus Schellenb. Tribo 5. Connareae 22. Cnestidium Planch. 23. Rourea Aubl. 24. Connarus L. Subgênero Connarellus Subgênero Neoconnarus Subgênero Euconnarus 12 de raízes de Roureopsis obliquifoliolata; Kuwabara et al. (2003) estudaram uma substância (“tricin”) com potente efeito anti-histamínico, extraída de folhas de Agelaea pentagyna; Jiménez et al. (2001) constataram que extratos de folhas e ramos de Connarus lambertii apresentam uma forte ação sobre a atividade cardiovascular de animais experimentais, causando-lhes a morte, bem como são efetivos na inibição da enzima glucose-6-fosfatase, que catalisa a reação final da neoglicogênese e glicogenólise. Taveira et al. (1988) investigaram os efeitos de extratos da casca de Connarus fulvus (= Connarus suberosus) em camundongos, uma vez que essa planta é consumida em chás e garrafadas devido a uma suposta ação sobre as funções cardíacas. Os resultados obtidos não confirmaram esta atividade, mas indicaram ações analgésica, anticonvulsivante e anticurarizante, além da toxicidade desses extratos. Apesar dos indícios sobre o potencial farmacológico de muitas espécies de Connaraceae (Forero, 1983; Jongkind, 1989), poucos estudos (Aiyar et al., 1964; Jeannoda et al., 1985; Kuwabara et al., 2003; Le et al., 2005) trataram da identificação das substâncias responsáveis por seus efeitos terapêuticos. Família Oxalidaceae Oxalidaceae é constituída por cinco gêneros e cerca de 800 espécies; Oxalis é o maior gênero com aproximadamente 700 espécies (Stevens, 2007). São, em geral, ervas bulbosas, raramente arbustos ou árvores, com distribuição tropical e subtropical. No Brasil, ocorrem dois gêneros (Biophytum e Oxalis) com cerca de 150 espécies (Souza e Lorenzi, 2005). No Estado de São Paulo, está representada apenas por Oxalis, no entanto Averrhoa carambola é muito cultivada em função dos frutos comestíveis (Fiaschi e Conceição, 2005). Economicamente, Oxalis destaca-se por incluir espécies invasoras de culturas (Lorenzi, 2000), espécies ornamentais (Ingram, 1958, 1959), e pela “oca” (Oxalis tuberosa), cujos tubérculos comestíveis são cultivados na região andina (Alvarez, 1960; Trognitz e Hermann, 2001). Várias espécies são mencionadas em estudos etnobotânicos (Albuquerque e Andrade, 2002; Guarim Neto e Morais, 2003; Rodrigues e Carvalho, 2001), mas há poucos ensaios laboratoriais voltados à comprovação de suas propriedades farmacológicas. Em um desses, Egly et al. (2003) isolaram, a partir de O. erythrorhiza, compostos que se mostraram ativos contra Trypanossoma cruzi, Leishmania amazonensis e L. donovani. O gênero Oxalis consiste de quatro subgêneros: Oxalis, Thamnoxys, Monoxalis e Trifidus. O subgênero Oxalis caracteriza-se pelo hábito herbáceo e por suas folhas trifolioladas digitadas, enquanto os representantes de Thamnoxys são arbustivos ou 13 subarbustivos e apresentam folhas trifolioladas pinadas. Os demais subgêneros abrangem apenas duas espécies cada um (Lourteig, 1994, 2000). Estudos taxonômicos a respeito do gênero Oxalis foram conduzidos por vários autores. Knuth (1930), por exemplo, dedicou-se à descrição e à determinação de espécies africanas e sulamericanas, considerando 37 seções, numerosas subsecções e séries. Denton (1973) realizou uma monografia sobre as espécies da seção Ionoxalis da América do Norte. Lourteig (1975, 1979) revisou as seções Thamnoxys e Corniculatae, respectivamente, no âmbito das espécies extra-austroamericanas. Em publicações subseqüentes, a autora apresentou a descrição do subgênero Trifidus (Lourteig, 1995) e os resultados de tratamentos taxonômicos efetuados para os subgêneros Thamnoxys (Lourteig, 1994), Monoxalis, Oxalis e Trifidus (Lourteig, 2000). Considerações sobre as espécies estudadas Connarus suberosus é uma espécie que se desenvolve em áreas de cerrado, sendo encontrada nos seguintes estados: Pará, Maranhão, Piauí, Bahia, Goiás (incluindo o Distrito Federal), Mato Grosso, Minas Gerais e São Paulo. Forero e Costa (2002) caracterizaram-na como árvore de pequeno porte, 1,5-7(-12)m; casca espessa, suberosa; ramos tortuosos, os jovens densamente ferrugíneo-tomentosos. Folhas 5-9(-13) folioladas, folíolos elípticos, ovais ou suborbiculares, coriáceos, face adaxial tomentosa quando jovem, passando a glabrescente ou glabra, face abaxial tomentosa quando jovem passando a glabra, exceto na nervura central. Inflorescência paniculada (Fig. 1), terminal ou axilar, densamente ferrugíneo-tomentosa; sépalas com pontos glandulosos inconspícuos, tomentosa externamente, glabra internamente; pétalas com pontos glandulosos presentes ou ausentes, margem com ou sem tricomas glandulosos; estames unidos na base, com ou sem tricomas glandulosos; estilete tomentoso, geralmente com tricomas glandulosos; ovário tomentoso. Fruto estipitado (Fig. 2), densamente ferrugíneo-tomentoso quando jovem, mais tarde irregularmente pubérulo externamente, esparsamente pubescente internamente. Forero (1983), revisando Connaraceae neotropicais, concluiu que era impossível manter Connarus suberosus e C. fulvus como entidades separadas. Desta forma, procedeu à nova combinação, reconhecendo para C. suberosus as variedades suberosus e fulvus. Para a identificação das mesmas, propôs a seguinte chave: - sépalas 3,5 mm; pétalas 4x1,5 mm; pontos glandulosos ausentes ou inconspícuos; estames maiores 2,5 mm, menores 1,5 mm, sem tricomas glandulosos nos filetes, tricomas glandulosos presentes no ápice do conectivo e no estilete ............ C. suberosus var. suberosus 14 - sépalas 2,6 mm; pétalas 5-5,5x2 mm, pontos glandulosos conspícuos; estames maiores 4 mm, menores 3 mm, com tricomas glandulosos nos filetes, tricomas glandulosos ausentes no ápice do conectivo e no estilete ......................................................... C. suberosus var. fulvus Embora mencione a existência de estados intermediários em caracteres como pilosidade dos filetes, ocorrência de pontos glandulosos nas pétalas, forma e pubescência dos folíolos, entre outros, Forero (1983) considerou possível distinguir certas tendências que justificariam a referida classificação. Milhomens e Proença (2002), mediante a análise de 42 exsicatas, das quais 17 foram selecionadas a partir da monografia de Forero (1983), concluíram que não há correlação entre os caracteres diagnósticos estabelecidos por este autor e as respectivas variedades de C. suberosus, uma vez que esses mostraram um gradiente de estados ou não diferiram expressivamente entre as variedades. Resultados similares foram obtidos quando se construíram gráficos de dispersão, utilizando-se outros caracteres que se apresentavam variáveis entre exsicatas escolhidas ao acaso. Verificou-se, contudo, que realmente existem as tendências morfológicas citadas por Forero (1983). Segundo Milhomens e Proença (2002), em se tratando de densidade e persistência de pilosidade, essas tendências estariam relacionadas à variação fenotípica ou genotípica, mas sem caracterizar a especialização de linhagens. Parte da variação encontrada no tamanho das peças florais foi atribuída a diferentes níveis de sexualidade das flores, visto que 50% das flores dissecadas apresentavam androceu normal e pistilos reduzidos (sem óvulos e com estilete curto a ausente). Desta forma, os autores recomendam que a variedade fulvus seja sinonimizada à variedade típica. Em sua contribuição para “Flora fanerogâmica do Estado de São Paulo”, Forero e Costa (2002) mantiveram a distinção entre C. suberosus var. suberosus e C. suberosus var. fulvus; entretanto, não relacionaram a presença ou ausência de tricomas glandulosos no estilete ou no ápice do conectivo como parte dos caracteres para sua identificação. A outra espécie selecionada para esse estudo, Oxalis cytisoides (Fig. 3), ocorre em campos e locais úmidos até 950 m de altitude, desde o Ceará até o Rio Grande do Sul e na Argentina. Segundo Fiaschi e Conceição (2005), essa espécie consiste de subarbustos eretos, com até 1m, folhas espiraladas, trifolioladas pinadas; subopostas ou com entrenós até 6 cm; pecíolo canaliculado, piloso; peciólulos pilosos. Os folíolos são glabros a esparsamente pubescentes na face adaxial e densamente pubescentes na abaxial; lâmina terminal estreitamente ovada a lanceolada ou rombo-ovada, ápice agudo a atenuado, base aguda; lâminas laterais oblongas a ovadas, simétricas a levemente assimétricas, ápice agudo a obtuso, 15 16 base aguda a arredondada. Inflorescências maiores que a folhagem, consistindo de cimeiras dicasiais. Sépalas pubescentes; corola rosa, filetes maiores apendiculados e pilosos, menores glabros; estiletes pilosos. Cápsulas elipsóides a globosas, glabras; carpelos glabros e lóculos trisseminados. Lourteig (1994), porém, mencionou a ocorrência de pilosidade em ambas as superfícies da cápsula e duas a três sementes por lóculo. Oxalis cytisoides assemelha-se muito a O. barrelieri, sendo as duas espécies reconhecidas com base em pequenas diferenças no formato e pilosidade dos folíolos (Fiaschi e Conceição, 2005). Anatomia floral As flores de Connaraceae são bissexuadas, actinomorfas, heterostilas; cálice pentâmero na maioria das espécies, sépalas livres ou conatas, geralmente pubescentes; corola também pentâmera, pétalas livres ou conatas acima da base, usualmente glabras, pontos glandulosos podem ocorrer nas pétalas de Connarus, Manotes e Vismianthus; dez estames unidos a partir da base em um tubo de extensão variável, os estames antessépalos são maiores que os demais; os filetes têm algum tipo de indumento em Connarus, Ellipanthus, Hemandradenia e Manotes; gineceu formado por um ou cinco carpelos livres, biovulados, parcial ou totalmente pubescentes na maioria das espécies (Forero, 1983; Jongkind, 1989). De acordo com Matthews e Endress (2002), a anatomia floral de Connaraceae é pouco conhecida; no entanto, em seu trabalho, produziram uma relação de caracteres estruturais potencialmente úteis na determinação das afinidades interfamiliares dentro de Oxalidales, não se apresentando descrições detalhadas da anatomia das peças florais, à exceção da vascularização. Os autores consideraram que Connaraceae e Oxalidaceae compartilham alguns caracteres que são únicos para Oxalidales, sendo alguns deles raros em eudicotiledôneas. Essas sinapomorfias florais estão entre aquelas citadas por Stevens (2007). Matthews e Endress (2002) notaram, ainda, similaridades entre os sistemas de vascularização floral de Connaraceae e Brunelliaceae. Segundo Dickison (1971), o padrão vascular prevalecente em carpelos de Connaraceae assemelha-se àquele descrito para algumas espécies de Rosaceae (Sterling, 1953, 1969), Leguminosae (Rao, Sirdeshmukh e Sadar, 1958), Brunelliaceae e Cunoniaceae (Eyde, 1970), consistindo de cinco feixes principais. Desses, um é o feixe dorsal, dois são feixes ovulares e os outros dois são feixes alas. Os feixes ovulares vascularizam os óvulos, enquanto alas e dorsal continuam através do estilete. Em 17 Connarus culionensis var. culionensis e C. punctatus os traços ovulares fundem-se no ginóforo, de modo que apenas um cordão ovular estende-se a partir da base do carpelo. Em Cnestidium guianense, Agelaea borneensis e nas espécies de Cnestis estudadas, os carpelos são vascularizados por um feixe dorsal e dois ventrais. No entanto, em Agelaea sp, os traços ventrais dividem-se na base do lóculo, originando feixes alas e ovulares. Sterling (1953, 1963, 1964a, 1964b, 1964c, 1965a, 1965b, 1965c, 1966a, 1966b, 1966c, 1969), por meio de uma série de estudos de morfologia comparada do carpelo em Rosaceae, concluiu que o padrão vascular ancestral caracteriza-se por feixes alas e ovulares livres. Padrões mais avançados derivaram da fusão entre feixes alas e ovulares, em extensões variáveis, para formar os feixes ventrais, sendo esta geralmente relacionada ao fechamento do carpelo. Rao, Sirdeshmukh e Sadar (1958), em um trabalho extenso sobre a anatomia floral de Leguminosae, examinaram várias espécies cuja vascularização carpelar consiste de cinco traços principais ou é derivada desta condição; porém, não apresentaram uma interpretação sobre a filogenia do carpelo nessa família. Corner (1976) considerou a similaridade na vascularização carpelar de Connaraceae, Rosaceae e Leguminosae como um “exemplo de convergência por meio de simplificação neotênica”. Eyde (1970), ao discutir as relações filogenéticas de Brunelliaceae, tomou as semelhanças observadas na vascularização dos carpelos de Brunellia (Brunelliaceae) e Acsmithia densiflora (Cunoniaceae) como um dos parâmetros que unem as duas famílias. No entanto, Dickison (1975b) verificou que somente os carpelos de Acsmithia e Spiraeanthemum recebem cinco traços vasculares, enquanto que, nos demais gêneros de Cunoniaceae, a vascularização carpelar principal é derivada de três traços. Ao contrário de Rosaceae e Connaraceae, não há estádios intermediários entre esses padrões vasculares. Essa e outras disparidades anatômicas levaram o referido autor a sugerir a remoção de Acsmithia e Spiraeanthemum de Cunoniaceae. Em Oxalidaceae, as flores são bissexuadas, radiais, usualmente heterostilas; com cinco sépalas livres; cinco pétalas distintas ou muito levemente conatas, geralmente convolutas; freqüentemente dez estames; filetes conatos basalmente, sendo os externos mais curtos que os internos; grãos de pólen geralmente tricolpados ou tricolporados; usualmente cinco carpelos conatos; ovário súpero, mais ou menos lobado, com placentação axial; geralmente cinco estiletes distintos; estigmas freqüentemente capitatos ou punctiformes; em 18 geral, vários óvulos por lóculo; néctar produzido pela base dos filetes ou por glândulas que se alternam com as pétalas (Judd et al., 1999). Estelita-Teixeira (1984) investigou a morfologia floral de Oxalis latifolia, O. oxyptera e O. corymbosa. Sauer (1933) destacou que a anatomia do carpelo em Oxalidaceae é similar àquela das sépalas. Matthews e Endress (2002) consideraram que o mesofilo das sépalas das Oxalidaceae, constituído por células especialmente grandes, representa uma autapomorfia para Oxalidales. Estudos sobre a vascularização floral de Oxalidaceae conduzidos por Al- Nowaihi e Khalifa (1971), Narayana (1966), Kumar (1976) e Estelita-Teixeira (1980a) evidenciaram uma tendência à redução dos feixes carpelares dorsais. Em algumas famílias, como Meliaceae (Nair, 1963) e Malpighiaceae (Lorenzo, 1981), ocorre um processo evolutivo similar. Segundo Estelita-Teixeira (1980a), em Oxalis latifolia, O. oxyptera e O. corymbosa, observa-se a fusão de traços marginais de carpelos adjacentes, assim como de traços ventrais. Nos espécimes de Oxalis examinados por Al-Nowaihi e Khalifa (1971), Narayana (1966) e Kumar (1976), esses traços vasculares mostram-se conatos desde sua origem. Tendo em vista que os feixes ventrais apresentam orientação invertida em relação ao eixo floral, logo acima da base do ovário, Estelita-Teixeira (1980a) concluiu que há uma tendência à substituição da placentação parietal (Narayana, 1966; Kumar, 1976) pela axial. A emissão de traços estaminais antepétalos em um nível inferior àquele de traços de estames antessépalos foi considerada uma confirmação anatômica da obdiplostemonia em Oxalidaceae (Al-Nowaihi e Khalifa, 1971; Narayana, 1966; Kumar, 1976; Estelita-Teixeira, 1980a). No entanto, Al-Nowaihi e Khalifa (1971) mencionam que, em O. cernua, o androceu obdiplostêmone somente é reconhecido do ponto de vista morfológico, pois os traços estaminais separam-se do cilindro central no mesmo nível. Ronse Decraene e Smets (1995) relataram que, em taxa obdiplostêmones, os traços de estames antepétalos divergem em um nível inferior, equivalente ou superior àquele dos traços antessépalos; portanto, não há uma correlação entre vascularização e obdiplostemonia. O androceu obdiplostêmone representa uma interrupção da seqüência usual de alternância dos verticilos florais, devido à posição oposta às pétalas do verticilo externo de estames. Eames (1977) agrupou em três teorias as diversas interpretações sobre a obdiplostemonia, as quais explicam a sua origem pela adição de um novo verticilo de estames (teoria da intercalação), pela perda de um verticilo externo de estames (teoria da redução) ou pelo deslocamento ontogenético (teoria do deslocamento). 19 Recentemente, vários estudos sobre a ontogenia floral de taxa obdiplostêmones revelaram que os estames surgem na seqüência centrípeta usual. Desta forma, a obdiplostemonia foi interpretada como um fenômeno secundário causado pelo crescimento diferencial e deslocamento dos primórdios de estames. Esses resultados corroboram a teoria do deslocamento, proposta originalmente por Čelakovský em 1875 (Ronse Decraene e Smets, 1995; Weberling, 1992). A partir da observação de casos de obdiplostemonia que não se ajustam às premissas de um deslocamento, Ronse Decraene e Smets (1995) propuseram a distinção entre três vias de desenvolvimento da obdiplostemonia: “obdiplostemonia primária” (os estames antepétalos surgem antes dos estames antessépalos e não há deslocamento secundário), “obdiplostemonia secundária” (as partes florais iniciam-se na seqüência acrópeta normal, mas os primórdios de estames antepétalos são deslocados para uma posição externa àquela dos estames antessépalos durante a ontogenia) e “obdiplostemonia centrífuga” (os primórdios de estames antepétalos surgem após os primórdios antessépalos e constituem o verticilo externo). Em termos evolutivos, admite-se que a obdiplostemonia é uma condição intermediária na transição entre a diplostemonia e a haplostemonia ou, menos freqüentemente, na transição entre diplostemonia e obhaplostemonia (Ronse Decraene e Smets, 1995, 1997). Heterostilia Matthews e Endress (2002) citaram a ocorrência de heterostilia dimórfica e trimórfica em Connaraceae e Oxalidaceae e ressaltaram que o compartilhamento de heterostilia trimórfica é especialmente significante, visto que é conhecida para poucas famílias de angiospermas. Contudo, Vuilleumier (1967), Ganders (1979) e Barrett (2002) consideraram que a heterostilia originou-se claramente em diversas ocasiões, especialmente em famílias com um grau intermediário de avanço evolutivo, as quais não formam um grupo estritamente relacionado. Os relatos sobre heterostilia abrangem cerca de vinte e oito famílias de angiospermas. A maioria delas apresenta heterostilia dimórfica (distilia), enquanto que a heterostilia trimórfica (tristilia) é mais rara, sendo conhecida apenas em seis famílias (Barrett et al., 2000). As espécies portadoras de distilia caracterizam-se pela existência de plantas brevistilas e longistilas em suas populações, enquanto aquelas com tristilia têm populações constituídas por plantas brevistilas, medistilas (ou mesostilas) e longistilas. Em ambos os casos, há uma correspondência recíproca entre as posições de anteras e estigmas das formas 20 florais. No entanto, os padrões morfológicos que distinguem as formas florais podem incluir outros polimorfismos. Em Biophytum sensitivum (Mayura Devi, 1966), Oxalis tuberosa (Gibbs, 1976) e O. squamata (Marco e Arroyo, 1998), os grãos de pólen maiores são produzidos pelos estames longos, o pólen de tamanho intermediário pelos estames médios e os grãos menores pelos estames curtos. Entretanto, esse trimorfismo é pouco característico em Oxalis alpina (Weller, 1976). Em várias espécies tristilas, os estames médios e curtos não diferem entre si quanto à produção de pólen e os verticilos longos produzem quantidades consideravelmente menores; tais relações foram descritas para O. squamata (Marco e Arroyo, 1998). Em O. alpina, Weller (1976) verificou que os estames curtos produzem mais pólen que os médios e estes produzem mais que os longos. Os estigmas das formas florais podem diferir na forma, tamanho ou, mais comumente, no tamanho das papilas estigmáticas. Em Oxalis tuberosa, os estigmas das três formas florais distinguem-se quanto a estes três parâmetros (Gibbs, 1976). Marco e Arroyo (1998) registraram diferenças no comprimento de cálice e corola e pubescência estilar de O. squamata, as quais representam polimorfismos pouco comuns em plantas heterostilas. Ao conjunto de caracteres morfológicos que distinguem as formas florais, associa-se um sistema de auto-incompatibilidade dialélico que previne fertilizações após autopolinizações ou polinizações entre anteras e estigmas situados em níveis diferentes (polinizações ilegítimas). Desta forma, o estabelecimento de sementes decorre, em geral, de polinizações entre formas com anteras e estigmas em níveis equivalentes (polinizações legítimas) (Ganders, 1979). Em espécies distilas, com dois verticilos de estames em cada forma floral, geralmente não há nenhuma diferenciação funcional entre eles (Ornduff, 1972). Apenas autopolinizações e polinizações entre flores da mesma forma floral são ilegítimas em populações com essa característica (Weller, 1976). A reação de auto-incompatibilidade, no entanto, varia em diferentes taxa (Ganders, 1979). Em Oxalidaceae, as relações de incompatibilidade foram estudadas em Biophytum sensitivum (Mayura Devi, 1964), Sarcotheca celebica (Lack e Kevan, 1987), Oxalis suksdorfii (Ornduff, 1964), O. priceae (Mulcahy, 1964), O. alpina (Weller, 1976, 1981, 1986) e O. squamata (Marco e Arroyo. 1998). Em Oxalis seção Corniculatae (Ornduff, 1972), particularmente, quase toda estratégia evolutiva leva à ruptura da incompatibilidade 21 trimórfica e, em alguns casos, ao desenvolvimento da distilia, semi-homostilia e quase- homostilia. Em Connaraceae, as relações de incompatibilidade foram estudadas somente em Byrsocarpus coccineus (Baker, 1962), apesar da diversidade de tipos de heterostilia descritos por Lemmens (1989). Segundo este autor, a heterostilia em Connaraceae parece seguir duas tendências filogenéticas a partir da tristilia: uma delas leva as espécies com cinco carpelos à homostilia; a outra, atuando nas Connaraceae com gineceu unicarpelar, resulta na dioicia. Em ambas as vias, a distilia representa um estádio intermediário. Morfologia dos frutos Os frutos de Connaraceae desenvolvem-se de gineceu unicarpelar ou apocárpico. Neste último caso, geralmente apenas um frutíolo é produzido. O pericarpo é seco ou mais ou menos carnoso, deiscente pela sutura ventral ou indeiscente em Jollydora e Hemandradenia (Jongkind, 1989). Externamente, os frutos são pubescentes a glabros. Em Cnestis e em muitas espécies de Connarus, o endocarpo é piloso. Neste último gênero, os tricomas podem ser glandulares, não-glandulares ou de ambos os tipos (Dickison, 1971; Corner, 1976; Forero, 1983; Jongkind, 1989; Forero e Costa, 2002). Segundo Jongkind (1989), em todas as espécies de Connarus, o desenvolvimento da semente é incipiente até a completa expansão do folículo. Um padrão similar de desenvolvimento foi observado em Leguminosae (Oliveira e Beltrati, 1993). Informações sobre a anatomia dos frutos de Connaraceae restringem-se a algumas observações realizadas por Corner (1976), por ocasião do estudo das sementes de espécies dessa família. Em Oxalidaceae, a estrutura do pericarpo de várias espécies de Oxalis foi descrita por Sauer (1933) e Estelita-Teixeira (1980b). O fruto de Oxalis é uma cápsula rimosa, a qual se caracteriza pela deiscência loculicida, sem a formação de valvas (Barroso et al., 1999). Sua superfície pode ser glabra ou pilosa e várias espécies desenvolvem tricomas endocárpicos (Lourteig, 1975, 1994, 2000; Fiaschi e Conceição, 2005). A anatomia do fruto de Averrhoa, classificado como um campomanesoídeo (Barroso et al., 1999) foi analisada por Dave, Patel e Rupera (1975), Kumar (1975) e Rao e Kothagoda (1984). Morfologia da semente As sementes de Connaraceae derivam de óvulos hemítropos (Corner, 1976; Jongkind, 1989; Matthews e Endress, 2002), anátropos (Jongkind, 1989) ou quase ortótropos 22 (Matthews e Endress, 2002), bitegumentados e crassinucelados (Corner, 1976). Há dois óvulos colaterais por carpelo, mas na maioria das espécies somente um deles desenvolve-se em semente (Jongkind, 1989). Uma característica comum a todas as Connaraceae é a suculência, pelos menos parcial, do tegumento (Jongkind, 1989). Esse tecido carnoso usualmente se desenvolve da rafe-calaza, estendendo-se como uma margem livre sobre parte da testa. Corner (1976) referiu-se a ele como um complexo arilo-sarcotesta calazal, considerando a base dessa excrescência de natureza sarcotestal e a sua porção livre, um arilo. Jongkind (1989) preferiu empregar o termo sarcotesta por entender que esse tecido é contínuo e derivado da testa. Esses pontos de vista refletem a controvérsia existente sobre a terminologia aplicada a apêndices carnosos de sementes, a qual foi revisada por Corner (1976), Kapil, Bor e Bouman (1980), entre outros. Em alguns gêneros, como Jollydora, Hemandradenia e Manotes, quase toda a testa torna-se carnosa. Segundo Corner (1976), a semente de Connaraceae é uma das mais distintas entre dicotiledôneas. Suas principais características são a forma pré-rafeal, a qual se caracteriza por um grande distanciamento entre a micrópila e o hilo, a testa preta com paliçada exotestal firme mas não lignificada, o exotégmen fibroso, a presença de feixe vascular pré-rafeal, o arilo calazal, o embrião grande e o aroma semelhante ao de feijão exalado por tecidos triturados. O autor examinou a anatomia das sementes de dez espécies de Connaraceae, sendo este estudo a única referência sobre o assunto. Jongkind (1989) destacou que a estrutura da semente com relação ao endosperma e cotilédones é muito variável. Em Manotes e algumas espécies de Cnestis, os cotilédones achatados, finos e pequenos estão envoltos por endosperma abundante, enquanto que as sementes exalbuminosas de Agelaea, Connarus, Jollydora e Rourea apresentam cotilédones plano-convexos. Combinações intermediárias ocorrem em Burttia, Pseudoconnarus e algumas espécies de Cnestis, que possuem cotilédones achatados, um tanto carnosos, embebidos em endosperma abundante, e em Cnestidium, Ellipanthus, Hemandradenia e Vismianthus com cotilédones plano-convexos e endosperma escasso. De acordo com Corner (1976), as reservas das sementes de Cnestis palala e Connarus grandis consistem de óleos. Forero (1983) mencionou o acúmulo de taninos e óleos (Rourea) e proteínas e outras secreções características (Connarus) em sementes exalbuminosas. Na semente de Pseudoconnarus, o endosperma abundante continha óleos. Em Cnestidium, o endosperma, com espessura de duas camadas de células, e os cotilédones armazenaram amido. 23 As sementes das Oxalidaceae desenvolvem-se de óvulos anátropos, bitegumentados e tenuinucelados (Corner, 1976). A testa mucilaginosa é freqüentemente confundida com um arilo (Stevens, 2007). Em vários gêneros, podem ocorrer ruminações nos tegumentos que podem atingir o endosperma (Corner, 1976; Boesewinkel, 1985). Em Oxalis e Averrhoa, as ruminações da semente são produzidas pela atividade mitótica de grupos de células da mesotesta; em Biophytum, são derivadas, exclusivamente, da expansão radial das células desse tecido (Boesewinkel, 1985; Werker, 1997). Em Biophytum e Oxalis, ocorre um mecanismo incomum de dispersão das sementes, que envolve a ruptura brusca da testa e a ejeção da parte interna. A separação do tegumento externo é atribuída ao estiramento circunferencial da espessa membrana cuticular, durante o desenvolvimento da semente, e à turgescência elevada do parênquima mesotestal, resultante da degradação enzimática de amido pouco antes da maturação da semente. A tensão gerada por esses processos causa o rompimento das paredes das células com cristais, que constituem a endotesta, e a liberação balística da semente, revestida pelo tégmen e, parcialmente, pela endotesta (Corner, 1976; Werker, 1997). Com exceção de Biophytum, os demais gêneros de Oxalidaceae apresentam exotégmen fibroso. Corner (1976) sugeriu que Oxalidaceae relaciona-se filogeneticamente a outras famílias portadoras desse caráter, entre as quais Connaraceae. O endosperma é formado por divisões nucleares livres, mas algumas espécies possuem sementes exalbuminosas (Corner, 1976). Salter (1952) mencionou que várias espécies de Oxalis da África do Sul não apresentam endosperma na semente madura. Barroso et al. (1999) classificaram o embrião de Oxalis como espatulado. Corner (1976) e Boesewinkel (1985) relataram que as reservas da semente consistem de óleos. Jones e Earle (1966) quantificaram o conteúdo de amido, óleos e proteínas das sementes de Oxalis europaea. Como resultado obteve-se 0; 47,6 e 21,9% dessas substâncias, respectivamente. 24 CAPÍTULO I1 1 Trabalho elaborado segundo as normas da Revista de Biologia Tropical 25 Tricomas glandulares em Connarus suberosus (Connaraceae): distribuição, organização estrutural e prováveis funções2 JOÃO DONIZETE DENARDI3, DENISE MARIA TROMBERT OLIVEIRA4 e ELDER ANTONIO SOUSA PAIVA4,5 Título resumido: Tricomas glandulares em Connarus suberosus 2. Parte da tese de doutorado do primeiro autor, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Botânica), Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu. 3. Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Unidade Universitária de Coxim, Rua Pereira Gomes, 355, Vila Santa Maria, 79.400-000, Coxim, MS, Brasil. 4. Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Avenida Antonio Carlos, 6627, Pampulha, Caixa Postal 486, 31.270-901, Belo Horizonte, MG, Brasil. 5. Autor para correspondência: epaiva@icb.ufmg.br 26 Resumo Connarus suberosus Planch., Connaraceae típica de cerrado, apresenta inflorescências e ramos vegetativos jovens densamente revestidos por tricomas dendróides. Como parte do indumento desta espécie, relata-se, neste estudo, a ocorrência de tricomas glandulares (TGs), os quais foram analisados quanto à localização, origem e estrutura, por meio de técnicas usuais de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. Os TGs ocorrem na face abaxial de folíolos, bractéolas e sépalas, assim como na superfície de pecíolos, ráquis foliares, caules, eixos de inflorescências e frutos, durante os estádios juvenis destes órgãos. Os TGs consistem de pedúnculo multicelular, unisseriado, cujas células se mostram fenólicas, e de uma porção glandular multicelular que, na fase secretora, apresenta acúmulo de compostos pécticos, amido e gotas lipídicas. O acúmulo de óleo na forma de gotas dispersas no citosol é expressivo, ocupando grande parte do volume celular. As células secretoras possuem paredes delgadas, citoplasma denso e núcleo volumoso com nucléolo evidente. No citoplasma destas células predominam mitocôndrias, plastídios e dictiossomos. Na fase secretora, observa-se hidrólise do amido presente nos plastídios, redução na densidade do estroma plastidial e fusão de plastídios com vacúolos. Observam-se, ainda, indícios da conversão de plastídios em vacúolos. Testes histoquímicos indicam presença de secreção de natureza péctica, tanto no citosol quanto no espaço subcuticular, entretanto, em pequenas quantidades. Nos estádios finais de atividade dos TGs, os quais são caducos, observou-se escurecimento protoplasmático em algumas células secretoras, o que sugere a ocorrência de morte celular programada. Em C. suberosus, a ocorrência de TGs nas superfícies expostas de órgãos em desenvolvimento, associada à natureza química dos produtos de secreção e reserva, sugere que estas estruturas possam atuar como corpos de alimentação. Estudos ecológicos são necessários para esclarecer o papel destes tricomas nestas supostas interações. Palavras-chave: Cerrado, Connaraceae, corpos de alimentação, secreção, tricoma glandular, ultra-estrutura celular 27 Introdução Os tricomas, projeções de natureza exclusivamente epidérmica, apresentam uma enorme diversidade morfológica tendo, assim, grande valor taxonômico (ver Solereder, 1908). Segundo Werker (2000), os estudos de ontogênese são importantes para a correta denominação destas estruturas, sobretudo pela similaridade morfológica observada entre tricomas e emergências. Diversos autores separam os tricomas em dois grandes grupos: glandulares e não glandulares. Para os tricomas não glandulares ou tectores, a distinção entre diferentes tipos é feita, sobretudo, com base em caracteres morfológicos. Para os tricomas glandulares, a classificação leva em consideração, dentre outros aspectos, a composição química da secreção, seu modo de produção, a posição do tricoma no corpo vegetal e aspectos estruturais e funcionais (Werker 2000). Tricomas glandulares estão envolvidos na síntese de diversos compostos, tais como óleos, açúcares, sais, enzimas digestivas e outros, desempenhando importantes papéis na interação planta-ambiente (Fahn 1979). Os tricomas, tanto na forma isolada quanto em agrupamentos, podem constituir estruturas secretoras diversas, como nectários, elaióforos e glândulas de sal (Fahn 1979). Outras estruturas envolvidas nas interações planta-ambiente, tais como coléteres (Renobales et al. 2001, Paiva e Machado 2006a) e corpos de alimentação ou similares (Rickson e Risch 1984) são, em algumas espécies, caracterizados como tricomas. Estruturas secretoras podem ocupar várias posições nas diferentes partes do corpo do vegetal e podem ocorrer em todos os seus órgãos, em alguns destes ou, então, se restringir a apenas um órgão (Solereder 1908). Por vezes, diferentes estruturas secretoras estão presentes em diferentes partes de uma mesma planta (Fahn 1979, Metcalfe e Chalk 1979) e são de grande valor taxonômico, como ocorre com os tricomas glandulares (Solereder 1908). No Brasil, considerado o centro de diversificação de Connaraceae nos Neotrópicos, há cerca de 64 espécies da família, sendo 30 pertencentes a Connarus (Forero 1983, Forero e Costa 2002). Segundo Ratter et al. (2001), Connarus suberosus Planch. é uma das espécies mais freqüentes da flora lenhosa de cerrado senso lato, ocorrendo em 75% dos levantamentos florísticos que os autores realizaram em dez estados brasileiros. Forero (1983) relatou que C. suberosus apresenta caracteres comumente encontrados em plantas de cerrado, como a casca espessa e suberosa, ramos tortuosos e pilosidade densa. De acordo com o autor, ramos vegetativos jovens, inflorescências e frutos em estádios iniciais de desenvolvimento mostram indumento ferrugíneo-tomentoso, denso, e tricomas glandulares que podem estar presentes em pétalas, estames e estilete. 28 No presente estudo, são descritos a localização, desenvolvimento, estrutura e aspectos ultra-estruturais e histoquímicos dos tricomas glandulares em C. suberosus, buscando dados que possam auxiliar na compreensão da função destas estruturas. Material e métodos Coleta de material para estudos morfológicos As coletas foram realizadas em indivíduos adultos de Connarus suberosus Planch. ocorrentes na região de Botucatu, São Paulo (22º 53’ 11,4”S, 48º 26’ 07,8”W), em diferentes fases fenológicas. Foram coletados ápices vegetativos e reprodutivos, folhas e frutos em diferentes etapas de desenvolvimento, botões florais e flores em antese. As amostras foram estudadas ao microscópio estereoscópico para caracterização dos padrões de distribuição e ocorrência. Microscopia de luz Para ontogênese e caracterização anatômica, foram coletadas amostras de ápices caulinares e folhas em diferentes fases de desenvolvimento. O material foi fixado em solução de Karnovsky (Karnovsky 1965) por 24 horas, transferido para álcool etílico 70% (Jensen 1962), desidratado em série etílica (Johansen 1940) e submetido a pré-infiltração e infiltração em metacrilato (Leica®), segundo métodos usuais. Cortes transversais e longitudinais (5 μm) foram obtidos em micrótomo rotativo, montados em lâmina e corados com azul de toluidina 0,05% pH 4,7 (O’Brien et al. 1964). Testes histoquímicos Foram utilizados material fixado e a fresco. Para a caracterização histoquímica, foram empregados os seguintes testes, com os respectivos controles: Sudan black B para lipídios em geral (Pearse 1980); lugol para identificação de amido (Johansen 1940); solução aquosa de vermelho de rutênio a 0,02% para detecção de substâncias pécticas (Jensen 1962). Microscopia eletrônica de transmissão Amostras foram fixadas em mistura de Karnovsky (Karnovsky 1965) por 24 horas, pós-fixadas em tetróxido de ósmio (1%, tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2) e processadas segundo métodos usuais (Roland 1978). As secções ultra-finas foram contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinadas em microscópio de transmissão Philips CM 100 a 60 KV. 29 Microscopia eletrônica de varredura Amostras foram fixadas em glutaraldeído 2,5% (tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2), desidratadas em série etílica, submetidas à desidratação em ponto crítico com CO2 e metalizadas com camada de 10nm de ouro (Robards 1978). As amostras foram examinadas em microscópio eletrônico de varredura Quanta 200 (Fei Company), sendo as imagens obtidas digitalmente. Resultados Distribuição e ontogênese As folhas de Connarus suberosus são compostas e, quando jovens, apresentam folíolos conduplicados. Os tricomas glandulares (TGs) ocorrem na face abaxial de folíolos, bractéolas e sépalas, assim como na superfície de caules, eixos de inflorescências e frutos, durante os estádios juvenis destes órgãos. Folhas jovens apresentam numerosos TGs na face abaxial de folíolos, especialmente na região ao longo da nervura mediana; essas estruturas secretoras também ocorrem, embora em menor número, na superfície do pecíolo e da ráquis, principalmente na face abaxial. Em caules jovens e eixos de inflorescências, a presença de TGs parece ser ocasional. Freqüentemente, os TGs encontram-se ocultos em meio a tricomas dendróides (fig. 1A-C), que conferem ao indumento o aspecto ferrugíneo-tomentoso. O desenvolvimento do tricoma glandular inicia-se com a expansão distal de uma célula epidérmica, produzindo uma saliência globosa na superfície do órgão. Como resultado da divisão periclinal da célula inicial, delimita-se a célula basal do TG e uma célula apical (fig. 2A). A célula basal, de formato afunilado, completa seu processo de diferenciação nesta fase. Da divisão periclinal da célula apical, forma-se, no sentido proximal, a célula inicial do pedúnculo, mantendo-se no ápice a inicial da porção secretora (fig. 2B). Da célula inicial do pedúnculo formam-se, por sucessivas divisões periclinais, o pedúnculo multicelular e unisseriado (fig. 2C). Neste estádio, a célula inicial da porção secretora permanece em interfase, reiniciando as divisões após a formação de pedúnculo. Desta célula, por divisões em planos diversos, resulta uma porção apical, secretora, multicelular (fig. 2D-F). Aspectos estruturais e histoquímicos As células do pedúnculo são curtas, de formato cilíndrico (fig. 2D-F); a parede anticlinal é cuticulada e impregnada por substâncias de natureza lipídica. Nos TGs maduros, as células do pedúnculo são vacuoladas, ficando o restante do citoplasma restrito a uma estreita faixa comprimida junto à parede celular. Não há, nestas células, acúmulo de 30 compostos de reserva e o vacúolo encerra grande quantidade de compostos de natureza fenólica. As células secretoras estão dispostas de modo compacto e apresentam paredes delgadas, citoplasma denso e núcleo volumoso com nucléolo evidente (fig. 2E-F). Durante a fase secretora, observou-se, no citoplasma destas células, a presença de compostos pécticos, amido e gotas lipídicas. Nas etapas finais de desenvolvimento dos TGs, observou-se aumento do vacuoma e escurecimento protoplasmático de algumas células secretoras, o qual evolui para as células vizinhas, culminando no encerramento da atividade secretora e na morte dos TGs, os quais são caducos. O acúmulo de óleo nas células secretoras é expressivo em TGs maduros, ocorrendo na forma de gotas dispersas no citosol e ocupando grande parte do volume celular. Testes histoquímicos indicam presença de secreção de natureza péctica, tanto no citosol quanto no espaço subcuticular, entretanto, em pequenas quantidades. Nas observações em campo e laboratório, não foram encontrados sinais de extravasamento da secreção. Ultra-estrutura e secreção As células secretoras apresentam-se justapostas, com citoplasma denso, núcleo volumoso e nucléolo conspícuo (fig. 3A-B). No citoplasma de células secretoras ativas, observam-se mitocôndrias, dictiossomos, plastídios e ribossomos, tanto livres quanto associados a segmentos de retículo endoplasmático. As mitocôndrias possuem cristas bem desenvolvidas e, algumas vezes, encontram-se justapostas a plastídios (fig. 3C-D). O retículo endoplasmático aparece em estreita associação com os plastídios e, também, localizado muito próximo à membrana plasmática (fig. 3C). Os plastídios, de formas variadas, apresentam sistema de membranas inconspícuo, estroma elétron-lucente e grãos de amido. Nos TGs maduros há evidências de hidrólise do amido, quando o estroma torna-se mais elétron-denso e floculado (fig. 3C). A ocorrência de fusões de plastídios com vacúolos foi observada em células secretoras (fig. 3E). Observam-se indícios de ruptura da membrana interna dos plastídios, associada à redução da densidade do estroma e hidrólise dos grãos de amido. Os vacúolos, de tamanho similar ao dos plastídios, apresentam conteúdo amorfo que se assemelha ao estroma plastidial (fig. 3C). Os dictiossomos constituem-se de quatro a sete cisternas, cujas porções periféricas liberam vesículas pequenas, pouco densas, que se dispersam na matriz citoplasmática. Outros aspectos ultra-estruturais que se destacam referem-se à presença de corpos lipídicos no 31 citoplasma, ao vacuoma pouco volumoso, ao espaço periplasmático bem desenvolvido e ao desprendimento de trechos da cutícula, originando pequenos espaços subcuticulares (fig. 3B). Ainda nas células secretoras, observa-se a presença de corpos vesiculares e indícios de secreção no espaço periplasmático. Em muitos TGs, ao final do estágio secretor, as células exibem citoplasma denso e escuro, aumento da quantidade de retículo endoplasmático rugoso e dictiossomos ativos (fig. 3F-G). Nestas células os vacúolos apresentam inclusões membranares. Discussão Em Connarus suberosus, o indumento denso formado pelos tricomas dendróides parece constituir uma vantagem adaptativa, exercendo proteção contra a dessecação, função normalmente atribuída a este tipo de indumento (Fahn e Cutler 1992). Para órgãos em desenvolvimento, ainda não fotossintetizantes, o transporte de água pelo xilema não é eficiente (Nobel et al. 1994), o que os torna particularmente vulneráveis à dessecação. No caso de C. suberosus, esta vulnerabilidade é ainda mais relevante, uma vez que a espécie é típica de ambientes de cerrado, onde o clima é sazonal, com períodos de baixa umidade relativa, temperatura elevada e alta luminosidade (Franco 2002), o que parece favorecer a seleção de defesas estruturais contra a dessecação. Estudos prévios sobre Connaraceae demonstraram a ocorrência de tricomas glandulares (TGs) em Pseudoconnarus (Schellenberg 1938), Connarus, Rourea (Forero 1983, Jongkind 1989), Manotes (Dickison 1973, Jongkind 1989), Cnestis e Jollydora (Jongkind 1989). Apesar destes relatos, pouco se sabe a respeito da organização estrutural destes tricomas, sendo que aspectos ultra-estruturais, a biologia da secreção, composição química da secreção e possíveis envolvimentos em interações planta-ambiente são absolutamente desconhecidos. A presença de compostos de natureza lipídica na parede anticlinal das células do pedúnculo, como observado nos TGs de C. suberosus, é característica de tricomas envolvidos em processos secretores (ver Fahn 1979); além de atuar impedindo o refluxo de secreção, indica que os precursores da secreção não chegam até as células secretoras pela rota apoplástica. Considerando-se os aspectos estruturais e histoquímicos das células do pedúnculo e a hidrólise do amido observada nas células secretoras, é possível inferir que o amido constitui uma fonte de energia para a secreção, tal como observado em outras estruturas 32 secretoras, onde o amido é a forma predominante de reserva energética (Fahn 1979, Paiva & Machado 2008). A grande quantidade de mitocôndrias, como se observou no TG de C. suberosus, é uma característica marcante de células secretoras (Fahn 1988), estando relacionada a atividade metabólica intensa (Horner e Lersten 1968, Mohan e Inamdar 1986). Segundo Paiva e Machado (2008), a justaposição de mitocôndrias e amiloplastos pode evidenciar o requerimento de energia durante a hidrólise do amido. Na espécie aqui estudada, este processo parece fornecer precursores para a síntese de polissacarídeos, que ocorre nos dictiossomos (Andreeva et al. 1998). As vesículas que se desprendem dessas organelas, possivelmente, realizam o transporte dos produtos de secreção até a membrana plasmática; no entanto, os espaços periplasmático e subcuticular não apresentaram acúmulo desses materiais. A observação da fusão de plastídios com vacúolos, verificada nas células secretoras dos TGs, e a similaridade entre o conteúdo vacuolar e o estroma plastidial, sugere a ocorrência de conversão de plastídios em vacúolos, como reportado para outros tipos de células secretoras (Paiva e Machado 2008). Pode-se inferir que este processo culmina na ampliação do vacuoma, outro fato marcante em diversos tipos de células secretoras (Fahn 1979). Deve-se ressaltar que esta conversão de plastídios é observada nos estágios finais de atividade celular e parece constituir-se num dos primeiros sinais de morte celular programada (MCP) que verificamos ocorrer nestas células. Também o escurecimento protoplasmático, observado em algumas células secretoras dos TGs, parece constituir evidência de MCP, conforme descreveram Mohan e Inamdar (1986), Zer e Fahn (1992) e Paiva e Machado (2006a). A morte celular observada nas células secretoras do TG não pode ser interpretada como apoptose, uma vez que características marcantes deste processo tais como vesiculações na carioteca e presença de corpos apoptóticos não foram observadas. Por outro lado, segundo Greenberg (1996), muitas das características da apoptose estão ausentes nas células vegetais que sofrem MCP. A co-existência de células em diferentes estádios de morte celular com células íntegras e de aspecto saudável reduz as possibilidades destas observações serem decorrentes de artefatos de técnica ou problemas de fixação e demonstra ser um processo normal no desenvolvimento destes TGs. A ocorrência de MCP em tricomas foi reportada por Paiva e Machado (2006a) em coléteres de Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae). Os folíolos jovens de C. suberosus, ainda não expandidos, apresentam limbo conduplicado, deixando apenas a face abaxial exposta, o que parece explicar o padrão de distribuição de tricomas glandulares. Similarmente, bractéolas e sépalas, que constituem o 33 invólucro protetor de botões florais em diferentes estádios da ontogênese, apresentam a face abaxial exposta. Assim, a localização dos TGs nesta espécie parece corroborar a interpretação da função de proteção de órgãos em desenvolvimento (Mueller 1985, Thomas 1991), visto que ocorrem em superfícies expostas ao ambiente, as quais são revestidas também por tricomas tectores dendróides. Algumas das funções atribuídas a tricomas tectores e glandulares relacionam-se à regulação da temperatura, ao aumento da reflexão luminosa e à redução da transpiração (Wagner et al. 2004). O fato destes TGs ocorrerem apenas na fase juvenil dos órgãos, os tornam similares a coléteres, de acordo com os conceitos adotados por Thomas (1991). Segundo Thomas (1991), o termo coléter é empregado para designar estruturas secretoras de origem mista, ou seja, formadas com a participação tanto da protoderme quanto do meristema fundamental. Renobales et al. (2001) consideraram que os tricomas de Gentiana podem ser interpretados funcionalmente como coléteres, pois embora se desenvolvam exclusivamente da camada dérmica, sua secreção é mucilaginosa. Há, na literatura, relatos da ocorrência de coléteres de origem exclusivamente protodérmica (Renobales et al. 2001, Paiva e Machado 2006a). Os TGs presentes nos órgãos aéreos de C. suberosus, embora mostrem grande similaridade estrutural com coléteres e apresentem compostos pécticos e lipídicos comumente reportados nestas estruturas secretoras (Mohan e Inamdar 1986, Thomas e Dave 1989, Appezzato-da-Glória e Estelita 2000, Klein et al. 2004), não reúnem todos os atributos para serem considerados com tal, uma vez que não foi observado o extravasamento de secreção. A liberação, pelo coléter, de secreção péctica ou resinosa é fundamental para que ocorra a proteção contra dessecação e a lubrificação de órgãos em desenvolvimento. Fica, ainda, a possibilidade de se tratar de estrutura com perda de função ou, do ponto de vista oposto, de estrutura com processo evolutivo em curso; tendo por base esses aspectos, os TGs de C. suberosus poderiam ser considerados coléteres não funcionais. Estudos adicionais e prospecção de estruturas similares em Connaraceae são importantes para ajudar a elucidar estas hipóteses. Em C. suberosus, a ocorrência dos TGs restrita à fase juvenil dos órgãos, associada à quantidade e natureza química dos compostos de reserva, constitui evidência de que estas estruturas atuam na proteção dos órgãos em desenvolvimento, função atribuída a corpos de alimentação em diversas espécies vegetais (O’Dowd 1980). A presença de reserva predominantemente lipídica é reportada para corpos de alimentação (O’Dowd 1980), embora 34 outros compostos ricos em energia ou proteína sejam oferecidos nestas estruturas (O’Dowd 1982). A quantidade de óleo acumulado nos TGs de C. suberosus faz destas estruturas recursos alimentares interessantes. Assim, é possível que estes TGs atuem como mediadores de interações entre a planta e formigas, as quais exercem proteção contra herbivoria, como observado em diversas espécies vegetais portadoras de corpos de alimentação (Rickson 1980, Heil et al. 1998). Sabe-se que corpos de alimentação atuam na manutenção de relação mutualística entre planta e formigas, as quais beneficiam a planta por oferecerem proteção contra herbívoros (O’Dowd 1980, 1982). A restrição temporal de oferta dos TGs de C. suberosus, os quais são limitados à fase juvenil dos órgãos, é característica de outras estruturas envolvidas em interações com formigas que oferecem proteção, como em nectários extraflorais (Paiva e Machado 2006b), além de corpos de alimentação. No caso dos nectários extraflorais, os órgãos jovens são protegidos por formigas nos estágios de maior vulnerabilidade à herbivoria, quando as defesas químicas e estruturais ainda não estão plenamente desenvolvidas (Paiva e Machado 2006b). Diante destas considerações, observações em campo e estudos das interações planta-ambiente, bem como a análise química dos compostos de reserva são imprescindíveis para elucidar o possível envolvimento dos TGs, presentes em C. suberosus, como recompensa alimentar. Agradecimentos – A Luciano C. Milhomens, por realizar a identificação da espécie, e à FAPESP (Programa BIOTA, proc. no 00/12469-3), pelo apoio financeiro. João D. Denardi agradece à CAPES pela concessão da bolsa PICDT e D.M.T. Oliveira ao CNPq, pela bolsa de produtividade em pesquisa. Literatura citada Andreeva, A.V., M.A. Kutuzov, D.E. Evans & C.R. Hawes. 1998. The structure and function of Golgi apparatus: a hundred years of questions. Journal of Experimental Botany 49: 1281-1291. Appezzato-da-Gloria, B. & M.E.M. Estelita. 2000. Development, structure and distribution of colleters in Mandevilla illustris and M. velutina (Apocynaceae). Revista Brasileira de Botânica 23:113-120. 35 Dickison, W.C. 1973. Anatomical studies in the Connaraceae. III. Leaf anatomy. Journal of the Elisha Mitchell Scientific Society 88: 120-136. Fahn, A. 1979. Secretory Tissues in Plants. Academic Press, New York, 302 p. Fahn, A. 1988. Secretory tissues in vascular plants. New Phytologist 108: 229-257. Fahn, A. & D.F. Cutler. 1992. Xerophytes. Gebrüder Borntraeger, Berlin. 176 p. Forero, E. 1983. Connaraceae. Flora Neotropica Monograph 36: 1-208. Forero, E. & C.B. 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