Dissertação de Mestrado INVESTIGAÇÃO DAS POTENCIALIDADES DE COMPLEXOS PIRAZÓLICOS DE Pd(II) NO DESENVOLVIMENTO DE NOVAS METALO-DROGAS Carolina Valério Barra Araraquara 2010 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE QUÍMICA – Araraquara CAROLINA VALÉRIO BARRA Investigação das potencialidades de complexos pirazólicos de Pd(II) no desenvolvimento de novas metalo-drogas Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da UNESP, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, Área de concentração Química Inorgânica. Orientador: Prof. Dr. Adelino Vieira de Godoy Netto Coorientador: Prof. Dr. Antonio Eduardo Mauro Araraquara 2010 FICHA CATALOGRÁFICA Barra, Carolina Valério B268i Investigação das potencialidades de complexos pirazólicos de Pd(II) no desenvolvimento de novas metalo-drogas / Carolina Valério Barra. – Araraquara : [s.n], 2010 96 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Adelino Vieira de Godoy Netto Coorientador: Antonio Eduardo Mauro 1. Química inorgânica. 2. Atividade biológica. 3. Complexos de Pd(II). I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação CURRICULUM VITAE CURRICULUM VITAE DADOS PESSOAIS Nome: Carolina Valério Barra Data de Nascimento: 01 de maio de 1986 Naturalidade: Juiz de Fora – MG Nacionalidade: Brasileira Filiação: Pai – Helder de Almeida Barra Mãe – Maria Beatriz de Campos Valério Barra Documento de Identidade: MG – 12.890.959 Endereço para Correspondência: Av. Alberto Toloi, 185/43 – Bloco 5 Bairro: Quitandinha – CEP: 14800-105 Araraquara - SP e-mail: krolvb@iq.unesp.br FORMAÇÃO Acadêmica GRADUAÇÃO Bacharel e Licenciada em Química Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Concluído em dezembro de 2007. TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS 01. BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; FREM, R. C. G.; QUILLES, M. B.; CARLOS, I. Z. “Síntese, caracterização e estudo da atividade biológica de complexos de paládio(II) contendo ligantes pirazólicos”. In: 17 Encontro da SBQ – Regional Interior Paulista Waldemar Saffioti, Araraquara-SP, de 18 a 20 de outubro de 2009. 02. BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; FREM, R. C. G.; QUILLES, M. B.; CARLOS, I. Z. “Complexos de paládio(II) contendo o ligante 4- metilpirazol: Síntese, caracterização e avaliação da atividade antitumoral”. In: 17 Encontro da SBQ – Regional Interior Paulista Waldemar Saffioti, Araraquara-SP, de 18 a 20 de outubro de 2009. 03. BARRA, C. V.; CÉSAR, E.T.; COELHO, J. N.; MELO, C. S.; AVELAR, A. P. B.; THOMAZ, A. C.; FRANCO, D. M.; REIS, R. C.; MARCELO, D. B. “Ciência Experimental na Escola: trabalhando com experiências de química na sala de aula”. In: XXII Encontro CURRICULUM VITAE Regional da Sociedade Brasileira de Química, Belo Horizonte-MG, de 6 a 9 de novembro de 2008. 04. BARRA, C. V.; SILVA, H.; ROCHA, F. V.; SIQUEIRA, L. M. S.; LOPES, M. T. P.; FONTES, A. P. S. “Effect of leaving group on cytotoxic activity of long aliphatic chain diamine platinum complexes”. In: I Latin American Meeting on Biological Inorganic Chemistry, Foz do Iguaçu-PR, 31 de agosto a 4 de setembro de 2008. 05. BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; FREM, R. C. G.; ANANIAS, S. R.; STEVANATO, A.; ROCHA, M. C.; CARLOS, I. Z. “Synthesis and antitumour properties of palladium(II) containing N,S-based ligands”. In: I Latin American Meeting on Biological Inorganic Chemistry, Foz do Iguaçu-PR, 31 de agosto a 4 de setembro de 2008. 06. BARRA, C. V.; SHIMURA, B.; ROCHA, F. V.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; FREM, R. C. G.; ANANIAS, S. R.; CARLOS, I. Z. “Palladium(II) pyrazolyl complexes: Synthesis, characterization and biological studies”. In: I Latin American Meeting on Biological Inorganic Chemistry, Foz do Iguaçu-PR, 31 de agosto a 4 de setembro de 2008. 07. BARRA, C. V.; CÉSAR, E.T.; BITTENCOURT, G. C.; COELHO, J. N.; BORGES, M. A. ; REIS, R. C. “Relato dos Projetos de Iniciação Científica Júnior em Química Desenvolvidos no Colégio de Aplicação João XXIII/UFJF”. In: 14º Encontro Nacional de Educação em Química (ENEQ), Curitiba-PR, 21 a 24 de julho de 2008. 08. BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; SILVA, H.; FONTES, A. P. S “Novos complexos de platina(II) contendo ligantes N-alquilados de cadeia longa derivados da etilenodiamina e oxalato”. In: XXXI Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP, 26 a 29 de maio de 2008. 09. BARRA, C. V.; SILVA, H.; ROCHA, F. V.; FONTES, A. P. S.; CÉSAR, E.T.; LOPES, M. T. P. “Estudos "in vitro" de atividade citotóxica de complexos de platina (II) contendo oxalato e derivados da etilenodiamina como ligantes”. In: XXX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP, 31 de maio a 3 de junho de 2007. 10. BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; SILVA, H.; FONTES, A. P. S. “Síntese e caracterização de complexos de platina (II) com ligantes diaminados e carboxilatos”. In: XIII Seminário de Iniciação Científica da UFJF, Juiz de Fora-MG, 3 a 5 de outubro de 2007. 11. BARRA, C. V.; SILVA, H.; ROCHA, F. V.; FONTES, A. P. S.; CÉSAR, E.T.; ALMEIDA, M. V. “Síntese e caracterização de novos complexos de platina (II) contendo oxalato e derivados da etilenodiamina como ligantes”. In: XXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP, 19 a 22 de maio de 2006. CURRICULUM VITAE 12. BARRA, C. V.; FONTES, A. P. S.; SILVA, H.; ALMEIDA, M. V.; CÉSAR, E.T.; ODA, S. C.; COSTA, C. F. “Síntese e caracterização de complexos de platina (IV) com ligantes N-alquilados de cadeia longa derivados da etilenodiamina”. In: XIX Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química, Ouro Preto-MG, 27 a 29 de novembro de 2005. 13. BARRA, C. V.; SILVA, H.; FONTES, A. P. S.; CÉSAR, E.T.; ALMEIDA, M. V. “Síntese e Caracterização de Complexos de Platina (II) com ligantes N-alquilados de cadeia longa derivados da etilenodiamina”. In: XXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas-MG, 30 de maio a 2 de junho de 2005. 14. CÉSAR, E.T.; BARRA, C. V. “Desenvolvimento de Aulas Práticas para o Ensino de Química no Ensino Médio”. In: I Mostra de Iniciação Científica Júnior da UFJF, Juiz de Fora-MG, 20 de outubro de 2004. 15. BARRA, C. V.; CÉSAR, E.T. “Desenvolvimento de Aulas Práticas para o Ensino de Química no Ensino Médio”. In: XI Seminário de Iniciação Científica da UFJF, Juiz de Fora-MG, 23 a 28 de novembro de 2004. PUBLICAÇÕES 01. SILVA, H.; BARRA, C. V.; COSTA, C. F.; ALMEIDA, M. V.; CÉSAR, E.T.; SILVEIRA, J. N.; GARNIER-SUILLEROT, A.; PAULA, F. C. S.; PEREIRA-MAIA, E. C.; FONTES, A. P. S. “Impact of the carbon chain lenght of novel platinum complexes derived from N- alkyl-propanediamines on their cytotoxic activity and cellular uptake”. Journal of Inorganic Biochemistry, v. 102, p. 767-772, 2008. 02. ROCHA, F. V.; BARRA, C. V.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; CARLOS, I. Z.; FREM R. C. G.; ANANIAS, S. R.; QUILLES, M. B.; STEVANATO, A.; ROCHA, M. C. “3,5- dimethyl-1-thiocarbamoylpyrazole and its Pd(II) complexes. Synthesis, spectral studies and antitumor activity”. European Journal of Medicinal Chemistry, aceito. 03. BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; NETTO, A. V. G.; SHIMURA, B.; DA SILVA, D.A.M.; FREM R. C. G.; MAURO, A. E.; CARLOS, I. Z.; ANANIAS, S. R.; QUILLES, M. B. “New palladium(II) complexes with pyrazole ligands: Synthesis, spectral studies and antitumor evaluation”. Em preparação. 04. TREU-FILHO, O.; BARRA, C.V.; ROCHA, F.V.; NETTO, A.V.G; MAURO, A.E; FREM, R.C.G.; PINHEIRO, J.C.; KONDO, R.T. “Experimental and DTF study on the compounds [PdCl2L2] (L = 4-methylpyrazole, 4-iodopyrazole)”. Em preparação. 05. SILVA, H.; BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; ALMEIDA, M. V.; CÉSAR, E.T.; SIQUEIRA, L. M. S.; LOPES, M. T. P.; FONTES, A. P. S. “Synthesis, characterization, and cytotoxic CURRICULUM VITAE activity of novel platinum(II) complexes derived from N-benzylethylenediamine and oxalato”. Chemical Biology & Drug Design, aceito. 06. SILVA, H.; BARRA, C. V.; ROCHA, F. V.; LOPES, M. T. P.; FONTES, A. P. S. “Novel platinum(II) complexes of long chain aliphatic diamine ligands with oxalato as the leaving group. Comparative citotoxic activity relative to chloride precursors”. Journal of the Brazilian Chemical Society, aceito. PRÊMIOS E TÍTULOS Melhor apresentação oral no XIII Seminário de Iniciação Científica da UFJF, com o trabalho “Síntese e caracterização de complexos de platina (II) com ligantes diaminados e carboxilatos”, Juiz de Fora-MG, 3 a 5 de outubro de 2007. ESTÁGIOS, BOLSAS E AUXÍLIOS Estágio docente no Colégio de Aplicação João XXIII ministrando o módulo optativo “Reações em Química Orgânica” de maio a dezembro de 2007. Estágio no Centro de Ciências da UFJF de agosto a dezembro de 2007. Estágio no Laboratório de Química Inorgânica no Nupeq (Núcleo de Pesquisas Químicas) no Departamento de Química da UFJF de agosto de 2004 a agosto de 2005. Bolsa de Mestrado (MS) concedida pelo CNPq de março de 2008 a março de 2010. Bolsa de Iniciação Científica (IC) concedida pelo CNPq de agosto de 2005 a agosto de 2007. Bolsa de Iniciação Científica Júnior (IC) concedida pela UFJF de abril de 2003 a janeiro de 2004. "A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original." Albert Einstein "Ninguém poderá jamais aperfeiçoar-se, se não tiver o mundo como mestre. A experiência se adquire na prática." William Shakespeare "Renda-se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei. Não se preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento." Clarice Lispector DEDICATÓRIA “Um dia a maioria de nós irá se separar. Sentiremos saudades de todas as conversas jogadas fora, das descobertas que fizemos,dos sonhos que tivemos, dos tantos risos e momentos que compartilhamos. Saudades até dos momentos de lágrima, da angústia, das vésperas de finais de semana, de finais de ano, enfim...do companheirismo vivido.” (Vinícius de Moraes) À memória de minhas avós DEDICATÓRIA “Nesses anos todos, sob suas asas Eu enriqueci E tive a luz da vida E os passos pra seguir E como o vento, o tempo passa tão depressa Eu cresci também Eu não sou mais de vocês, agora é a minha vez De ser alguém Vou viajar sem bagagem Deixo o amor, mas levo a coragem Eu vou seguir, de mãos vazias No peito trago a lição Sei que um dia com meus filhos Eu vou abrir meu coração E falar dos meus pais Quando a noite era um mar de pesadelos Vinham me abraçar E num sorriso aberto, Com prazer de amar Fui mimado, amado, nunca vi motivos Pra me preocupar Mas meu dia chegou, Eu tenho a chance de tentar De ser alguém” (Roupa Nova) Ao Fillipe, meu amor e amigo, por me ensinar o verdadeiro significado da palavra companheirismo. Aos meus pais, por apoiarem todas as minhas decisões e me incentivarem sempre a lutar pelos meus sonhos. Amo vocês! “Assim como o oceano, só é belo com o luar Assim como a canção, só tem razão se se cantar Assim como uma nuvem, só acontece se chover Assim como o poeta, só é bem grande se sofrer Assim como viver sem ter amor, não é viver Não há você sem mim E eu não existo sem você!” (Vinícius de Moraes) AGRADECIMENTOS Agradeço... Ao Professor Adelino, pela orientação e pela enorme paciência em atender sempre com um sorriso bem humorado as mil vezes que eu batia em sua porta para pedir ajuda e conselhos. Muito obrigada pela atenção e incentivo constantes. Ao Professor Mauro, pela coorientação, amizade, confiança e pelas animadas conversas no laboratório. Aos professores Clóvis Augusto Ribeiro e Sergio Roberto de Andrade Leite pelas sugestões no meu exame de qualificação. Às professoras Regina e Vânia, pelas conversas do dia-a-dia e pela divertida companhia em Foz do Iguaçu. Precisamos repetir a dose! Aos professores Luiz Antonio e Stanlei e à funcionária Valéria pelo convívio no Departamento de Química Geral e Inorgânica. À Professora Iracilda Zeppone Carlos e à técnica Marisa Polesi, do laboratório de Imunologia Clínica, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, pela realização dos testes biológicos. À mestranda Marcela Bassi pela ajuda durante os testes, pela paciência e pela disposição em tirar sempre minhas inúmeras dúvidas. À Irene, pelo bom dia sempre alegre e pelos vários espectros de infravermelho. Ao Nivaldo, pela obtenção e ajuda com os espectros de RMN. Às funcionárias da pós-graduação e da biblioteca pela prestatividade e atenção. Aos meus colegas do laboratório de Química de Coordenação e Organometálicos: Alexandre, Alessandra, Cris, Fillipe, Gislaine, Ian, Katinha, Natália, Patrícia, Rodrigo, Sahra, Silmar e Treu pela ajuda e pelas muitas conversas e distração. À Professora Ana Paula (UFJF) pela orientação durante a iniciação científica. À pós- doutoranda Heveline (UFJF) pela ajuda constante, pelos muitos esclarecimentos e pelos ensinamentos de laboratório durante a minha graduação. Ao Professor Eloi (UFJF), o grande responsável por minha escolha profissional, pelos ensinamentos, amizade, confiança e incentivo durante todos esses anos. Você terá sempre meu carinho e admiração. À minha irmã Júlia pela amizade, carinho e pelas conversas no MSN, que me ajudaram a matar um pouco a saudade da família. Te amo muito, irmã!!! A toda a minha família, que sempre torceu por mim e me apoiou em todos os momentos. Em especial às minhas primas Flávia e Márcia, pelos e-mails que sempre tornavam meus dias mais alegres e por me deixarem participar de momentos tão especiais de suas vidas. AGRADECIMENTOS À minha nova família, Suely, Luiz, Rapha, Léo e vó Zenir, pelo carinho desde sempre. Às minhas amigas de infância, Clarice, Camila e Natália, de graduação, Arturene e Karen e de pós-graduação, Patrícia e Sahra, que de perto ou de longe estão sempre presentes em minha vida, me ouvindo, me dando conselhos, carinho e me fazendo dar muitas, muitas risadas! Muito obrigada meninas!!! Ao CNPq pela bolsa concedida. A Deus, por ter colocado todas essas pessoas maravilhosas em minha vida e ter me guiado até aqui. RESUMO RESUMO A quimioterapia é uma das principais formas de combate ao câncer. Sendo assim, muitas pesquisas vêm sendo feitas com o objetivo de desenvolver compostos que solucionem, ou minimizem, os problemas decorrentes deste tipo de tratamento, como os efeitos colaterais e a resistência que as células desenvolvem aos medicamentos. Os pirazóis e seus complexos são conhecidos por possuírem atividade antitumoral, antiinflamatória, antibacteriana e antipirética. Tendo em vista estas propriedades, ligantes pirazólicos foram utilizados na síntese de complexos de paládio(II) com a finalidade de obter compostos com atividade antitumoral. A escolha deste metal foi baseada na similaridade entre sua química de coordenação e a da platina(II), cujos complexos, como a cisplatina e a carboplatina, são amplamente utilizados como agentes antitumorais. Neste contexto, o presente trabalho descreve a síntese, caracterização e avaliação da atividade antitumoral de duas séries de compostos paládio(II) de fórmula geral [PdX2(HdmIPz)2] {HdmIPz = 3,5-dimetil-4-iodopirazol; X = Cl (1), Br (2), I (3), SCN (4)} e [PdX2(HmPz)2] {HmPz =4-metilpirazol; X = Cl (5), Br (6), I (7), SCN (8)}. Os compostos foram caracterizados por análise elementar, espectroscopia vibracional na região do infravermelho, ressonância magnética nuclear de 1H e 13C{1H}, termogravimetria e análise térmica diferencial. Os complexos sintetizados e os ligantes livres foram submetidos a testes de atividade citotóxica frente a células tumorais murinas. A cisplatina foi usada como droga padrão, sendo submetida às mesmas condições. A citotoxicidade dos compostos 1-4 também foi avaliada frente a macrófagos peritoneais de camundongos. Palavras-chave: complexos de paládio(II), pirazóis, espectroscopias vibracional e RMN, atividade biológica. ABSTRACT ABSTRACT Chemotherapy is one of the main methods of treating cancer. Thus, much research has been undertaken with the aim of developing compounds that can solve or minimize the problems caused by this type of treatment, as the side effects and cell resistance. Pyrazoles and their complexes are known to possess antitumor, anti-inflammatory, antiamoebic, antibacterial, antipyretic activities. Considering these properties, pyrazole ligands were used in the synthesis of palladium(II) complexes with the aim to obtain compounds displaying antitumor activity. The choice for using this metal was based on the similarity of its coordination chemistry to that of platinum(II) whose compounds, such as cisplatin and carboplatin, are widely used as antitumor agents. In this context, this work describes the synthesis, characterization and investigation of the antitumor activity of two series of palladium(II) complexes of general formulae [PdX2(HdmIPz)2] {HdmIPz = 3,5-dimethyl-4-iodopyrazole; X = Cl (1), Br (2), I (3), SCN (4)} e [PdX2(HmPz)2] {HmPz =4-methylpyrazole; X = Cl (5), Br (6), I (7), SCN (8)}. The compounds were characterized by elemental analysis, infrared vibrational spectroscopy, 1H and 13C{1H} nuclear magnetic resonance, thermogravimetry and differential thermal analysis. The complexes and the free ligands were tested for cytotoxic activity against murine tumor cells. Cisplatin was used as standard drug, being subject to the same conditions. The cytotoxicity of compounds 1-4 was also evaluated towards peritoneal macrophages of mice. Key-words: palladium(II) complexes, pyrazoles, IR and NMR spectroscopy, biological activity. LISTA DE FIGURAS LISTA DE FIGURAS Figura 1. Complexo de paládio(I) onde ocorre ligação metal-metal ...................................... 24 Figura 2. Cisplatina (a), Carboplatina (b) e Oxaloplatina (c) .................................................. 26 Figura 3. Ligações de hidrogênio entre os pares de bases nitrogenadas ............................... 28 Figura 4. Fórmula estrutural do complexo [(benzil)Pd{bis(tiossemicarbazonato)}] ............... 30 Figura 5. Ligantes derivados de bases de Schiff: asme (a) e asbz (b) ..................................... 30 Figura 6. Fórmulas estruturais dos compostos de fórmula trans-[PdCl2L2] (L = 3- hidroxipiridina, 2-hidroxipiridina e 4- hidroxipiridina) ............................................. 31 Figura 7. Fórmulas estruturais dos complexos [PdCl2(dmnp)2] e [Pd2Cl4(dmnp)2] ................. 31 Figura 8. Fórmulas estruturais dos complexos de paládio(II) com o ligante 1-metilcitosina .. 32 Figura 9. Fórmulas estruturais dos complexos trans- [PdCl2(L)(piridina)] (1a) e trans- [PdCl2(L)2] (1b) ................................................................................................... 33 Figura 10. Família dos 1,2-azóis ............................................................................................ 34 Figura 11. Modos de coordenação dos ligantes pirazólicos. ................................................. 35 Figura 12. Estruturas moleculares dos compostos trans-[Co(NCS)2(HPz)4] (a) e [Pd2(- dppz)2(Hida)2] (b) ................................................................................................. 35 Figura 13. Estruturas moleculares dos compostos [Zr(2-dmpz)2Cl2(1-dmpz)2] (a) e [Os(5-3,5-tBupz)(5-pmCp)] (b). .......................................................................... 36 Figura 14. Fórmula estrutural do complexo [Pt2(-Pz)(-OH)(NH3)4](NO3)2. ........................ 37 Figura 15. Possíveis fórmulas estruturais para o composto [{Au(mpz)Cl2}2] .......................... 37 Figura 16. Fórmulas estruturais dos compostos análogos à cisplatina testados .................... 38 Figura 17. Estruturas moleculares dos complexos [PdL2+ (a) e *PdL’2] (b), L = 3-oxo-5-fenil-1H- pirazol-2(3H)-carbotioamida e L’ = 4-etil-5-metil-3-oxo-1H-pirazol-2(3H)- carbotioamida ...................................................................................................... 39 Figura 18. Fórmula estrutural dos complexos de Pd(II), Pt(II) e Cu(II) com ligante pirazólico 39 Figura 19. Fórmula estrutural do composto [PdCl2(L2)2] (L2 = 5-(2-hidróxifenil)-1,3-dimetil-4- metóxicarbonil-1-H-pirazol................................................................................... 40 Figura 20. Espectros vibracionais na região de 4000-400 cm-1 do IV para o ligante livre HdmIPz e os complexos 1-4 .................................................................................. 53 Figura 21. Modos de coordenação mais comuns do íon tiocianato (NCS-) ............................ 55 Figura 22. Espectro de RMN de 1H do ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol ............................... 56 LISTA DE FIGURAS Figura 23. Espectros de RMN de 1H para os compostos 1-4 .................................................. 57 Figura 24. Esquema de numeração adotado para a análise dos espectros de RMN de HdmIPz e complexos 1-4 ................................................................................................... 58 Figura 25. Espectro de RMN de 13C do ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol............................... 59 Figura 26. Espectros de RMN de 13C para os complexos 1-4 ................................................. 60 Figura 27. Curvas TG/DTA do composto [PdCl2(HdmIPz)2] (1) ............................................... 62 Figura 28. Curvas TG/DTA do composto [PdBr2(HdmIPz)2] (2) .............................................. 63 Figura 29. Curvas TG/DTA do composto [PdI2(HdmIPz)2] (3) ................................................. 64 Figura 30. Curvas TG/DTA do composto [Pd(SCN)2(HdmIPz)2] (4) ......................................... 65 Figura 31. Difratograma de raios-X, método do pó, do resíduo final da termodecomposição do complexo 1 ..................................................................................................... 66 Figura 32. Estruturas propostas para os compostos [PdCl2(HdmIPz)2] (1), [PdBr2(HdmIPz)2] (2), [PdI2(HdmIPz)2] (3), [Pd(SCN)2(HdmIPz)2] (4) .................................................. 67 Figura 33. Espectros vibracionais na região de 4000-400 cm-1 do IV para o ligante livre HmPz e os complexos 5-8............................................................................................... 68 Figura 34. Ligações de hidrogênio intermoleculares presentes nos pirazóis ......................... 69 Figura 35. Espectro de RMN de 1H do ligante 4-metilpirazol ................................................. 71 Figura 36. Espectros de RMN de 1H para os compostos 5-8 .................................................. 71 Figura 37. Esquema de numeração adotado para a análise dos espectros de RMN de HmPz e complexos 5-8 ...................................................................................................... 72 Figura 38. Espectro de RMN de 13C do ligante 4-metilpirazol ................................................ 73 Figura 39. Espectros de RMN de 13C para os complexos 5-8 ................................................. 74 Figura 40. Tautomerismo característico de pirazóis .............................................................. 75 Figura 41. Curvas TG/DTA do composto [PdCl2(HmPz)2] (5) .................................................. 76 Figura 42. Curvas TG/DTA do composto [PdBr2(HmPz)2] (6) ................................................. 77 Figura 43. Curvas TG/DTA do composto [PdI2(HmPz)2] (7) .................................................... 78 Figura 44. Curvas TG/DTA do composto [Pd(SCN)2(HmPz)2] (8) ............................................ 79 Figura 45. Estruturas propostas para os compostos [PdCl2(HmPz)2] (5), [PdBr2(HmPz)2] (6), [PdI2(HmPz)2] (7), [Pd(SCN)2(HmPz)2] (8) .............................................................. 81 LISTA DE TABELAS LISTA DE TABELAS Tabela 1. Estados de oxidação do paládio ............................................................................ 23 Tabela 2. Valores de IC50 (µM) do composto [Pd(4-O-Acrid)(L)] e da cisplatina em linhagens celulares tumorais de ovário ................................................................................ 32 Tabela 3. Valores de IC50 (µM) para o complexo pirazólico e cisplatina em diferentes linhagens celulares tumorais ................................................................................ 38 Tabela 4. Procedência de solventes e reagentes .................................................................. 42 Tabela 5. Dados obtidos por espectroscopia no IV do ligante livre HdmIPz e dos complexos 1- 4 e suas respectivas atribuições. .......................................................................... 54 Tabela 6. Intervalos aproximados dos modos normais de vibração (cm-1) para os diferentes tipos de coordenação do tiocianato. .................................................................... 56 Tabela 7. Dados de RMN de 1H para o ligante livre HdmIPz e os complexos 1-4 ................... 57 Tabela 8. Dados de RMN de 13C para o ligante HdmIPz e os compostos 1-4 ......................... 61 Tabela 9. Dados de análise térmica para os compostos 1-4. ................................................. 66 Tabela 10. Dados obtidos por espectroscopia no IV do ligante livre HmPz e dos complexos 5- 8 e suas respectivas atribuições ........................................................................... 69 Tabela 11. Dados de RMN de 1H para o ligante livre HmPz e os complexos 5-8 .................... 72 Tabela 12. Dados de RMN de 13C para o ligante HmPz e os compostos 5-8 .......................... 73 Tabela 13. Dados de análise térmica para os compostos 5-8. ............................................... 80 Tabela 14. Valores de IC50 obtidos frente às linhagens LM3 e LP07 ...................................... 82 Tabela 15. Valores de IC50 para os compostos 1-4, HdmIPz e cisplatina para macrófagos com 24 horas de exposição. ........................................................................................ 84 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS dec. – decomposição diars – 1,2-bis(dimetilarsênio)benzeno dmso – dimetilsulfóxido dmso-d6 – dimetilsulfóxido deuterado DNA – Ácido desoxirribonucléico HdmIPz – 3,5-dimetil-4-iodopirazol HmPz – 4-metilpirazol hpp – ânion do 1,3,4,6,7,8-hexahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidina HPz – pirazol IC50 – Concentração inibitória de 50% da viabilidade celular LM3 – Linhagem tumoral de adenocarcionama mamário LP07 – Linhagem tumoral de adenocarcionama pulmonar MEM – (Modified Eagle Médium): meio essencial mínimo (mistura de sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento celular) PBS – Tampão salino fosfato PPh3 – Trifenilfosfina PMe3 – Trimetilfosfina RPMI – Meio de cultura RPMI (mistura de sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento celular) SUMÁRIO SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 22 1.1 A Química de Coordenação do Paládio ................................................................... 23 1.2 Aplicações biológicas de complexos de paládio(II) .................................................. 25 1.2.1 Mecanismo de ação de compostos de paládio e platina .............................. 27 1.2.2 Complexos de paládio(II) com atividade antitumoral ................................... 29 1.3 A Química de Coordenação dos Pirazóis ................................................................. 34 1.4 Aplicações biológicas de complexos pirazólicos ...................................................... 36 1.5 Complexos pirazólicos de paládio(II) ....................................................................... 39 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 41 3 PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 42 3.1 Procedência dos solventes e reagentes .................................................................. 42 3.2 Metodologias de síntese ........................................................................................ 42 3.2.1 Metodologia para preparação dos complexos contendo o ligante HdmIPz .. 43 3.2.2 Metodologia para preparação dos complexos contendo o ligante HmPz ..... 43 3.3 Preparação dos compostos..................................................................................... 44 3.3.1 Síntese do ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol (HdmIPz) ................................. 44 3.3.2 Síntese do precursor [PdCl2(CH3CN)2]........................................................... 44 3.3.3 Síntese dos compostos inéditos utilizando o ligante HdmIPz........................ 44 3.3.4 Síntese dos compostos inéditos utilizando o ligante HmPz........................... 46 3.4 Testes biológicos para determinação da atividade antitumoral .............................. 48 3.4.1 Preparo das soluções .................................................................................. 48 3.4.2 Testes biológicos com macrófagos .............................................................. 49 3.4.3 Testes biológicos com células tumorais ....................................................... 51 3.5 Métodos Instrumentais .......................................................................................... 51 3.5.1 Medidas de temperatura de fusão ou decomposição .................................. 51 3.5.2 Espectroscopia da absorção na região do infravermelho (IV) ...................... 52 3.5.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) ........................... 52 3.5.4 Análise elementar de C, H, N ....................................................................... 52 3.5.5 Termogravimetria ....................................................................................... 52 SUMÁRIO 3.5.6 Difração de raios-X – Método do pó ................................................................ 52 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................. 53 4.1 Compostos contendo o ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol (HdmIPz) ........................ 53 4.1.1 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho ............................... 53 4.1.2 Espectroscopia de RMN de 1H ..................................................................... 56 4.1.3 Espectroscopia de RMN de 13C{1H} .............................................................. 59 4.1.4 Análise Termogravimétrica ......................................................................... 61 4.1.5 Proposição Estrutural .................................................................................. 67 4.2 Compostos contendo o ligante 4-metilpirazol (HmPz) ............................................ 68 4.2.1 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho ............................... 68 4.2.2 Espectroscopia de RMN de 1H ..................................................................... 70 4.2.3 Espectroscopia de RMN de 13C{1H} .............................................................. 73 4.2.4 Análise Termogravimétrica ......................................................................... 75 4.2.5 Proposição Estrutural .................................................................................. 80 4.3 Atividade Biológica ................................................................................................. 81 4.3.1 Atividade frente a células tumorais ............................................................. 81 4.3.2 Atividade frente a macrófagos .................................................................... 83 5 CONCLUSÕES................................................................................................................... 86 6 PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................................................................. 87 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 88 22 CAPÍTULO 1 Introdução 1 INTRODUÇÃO Muitos metais têm um papel importante nos sistemas vivos, uma vez que se ligam e interagem com moléculas biológicas tais como proteínas e o DNA, e apresentam afinidade por moléculas cruciais para a vida, como a de oxigênio, O2, ou a de óxido nítrico, NO. Sendo assim, a evolução natural incorporou os metais às funções essenciais à vida. Ainda que a elucidação dos mecanismos de ação dos metais no organismo seja relativamente recente, seu uso em Medicina vem sendo praticado há aproximadamente 5000 anos. De fato, os egípcios usavam cobre para esterilizar a água 3000 anos antes de Cristo, e o ouro era empregado na fabricação de medicamentos na Arábia e na China há 3500 anos, mais em razão da natureza preciosa do metal do que de suas propriedades medicinais, pois se acreditava que um metal nobre deveria trazer benefícios ao organismo. Medicamentos contendo ferro eram usados no Egito 1500 anos antes de Cristo e já no século dezesseis o médico suíço Theophrastus Paracelsus (1493-1541) desenvolvia e usava medicamentos à base de mercúrio. No entanto, somente nos últimos cem anos as propriedades medicinais de compostos inorgânicos começaram a ser investigadas de forma racional, com o emprego de compostos de ouro no tratamento da tuberculose, dos antimoniais para o tratamento de leishmaniose e de compostos à base de arsênio para o tratamento da sífilis1. Um dos maiores avanços na Química Inorgânica Medicinal foi a descoberta da atividade antitumoral do composto cis-[PtCl2(NH3)2], a cisplatina, por Rosenberg2,3 no final dos anos 60. Atualmente, a droga é usada em vários tipos de neoplasias como câncer de pulmão, cabeça, esôfago, linfomas, melanoma, osteossarcoma, de mama e cérvix, sobretudo em associação com outras drogas em vários esquemas terapêuticos4-6. Desde então, houve um grande interesse por complexos metálicos como possíveis agentes terapêuticos, e iniciou-se uma nova era de busca por compostos metálicos com propriedades farmacológicas. O interesse nas aplicações da Química Inorgânica em Medicina continua a crescer, com a procura por novos alvos e novas oportunidades de intervenção da Química de Coordenação na Química Medicinal1. 23 CAPÍTULO 1 Introdução 1.1 A Química de Coordenação do Paládio O paládio é o mais abundante elemento de um grupo de metais conhecidos como “metais nobres”, composto por rutênio, ródio, paládio, ósmio, irídio e platina. Eles são assim denominados, pois não são muito reativos e são redutores mais fracos que o hidrogênio7. Eles são frequentemente encontrados em baixas concentrações nos minérios dos metais mais comuns. Em consequência disto, são normalmente obtidos como subprodutos, durante o processamento destes minérios e a purificação do metal que está sendo produzido8. Em geral, estes metais ocorrem juntos, devido à grande semelhança de suas propriedades químicas7. Uma das características mais notáveis do paládio é sua capacidade de absorver H2 gasoso, mais que qualquer outro metal. Quando Pd é aquecido ao rubro e esfriado na presença de H2, ele pode absorver um volume desse gás 935 vezes maior que seu próprio volume. Outros gases, inclusive He, não são absorvidos e esse processo é utilizado para purificar H2 9. Diferentemente do que seria esperado, o paládio apresenta configuração 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s0. Mesmo com os subníveis d completos, ele se comporta como um elemento de transição típico, pois no Pd(II), que é seu estado de oxidação mais comum, a configuração é d8, isto é, o nível d está parcialmente preenchido [9]. Apesar da química do paládio ser constituída, em sua maior parte, por compostos de Pd(II), o elemento pode assumir outros estados de oxidação, como (0), (I), (III) e (IV), como mostra a Tabela 110. Tabela 1. Estados de oxidação do paládio Estado de oxidação Número de coordenação Geometria Exemplos Pd0, d10 3 Trigonal Plana [Pd(PPh3)3] 4 Tetraédrica [Pd(PF3)4] PdI, d9 4 Quadrado-planar [Pd2(PMe3)6]2+ PdII, d8 4 Quadrado-planar [Pd(NH3)4]Cl2, [Pd(CN)4]2- 5 Bipirâmide trigonal [PdCl(diars)2]+ 6 Octaédrica [PdI2(diars)2] PdIII, d7 6 Octaédrica [Pd2Cl2(hpp)4] PdIV, d6 6 Octaédrica [PdCl6]2- 24 CAPÍTULO 1 Introdução Compostos de paládio no estado de valência zero, em geral, são estabilizados por ligantes fosfínicos. Assim, o complexo carbonílico simples [Pd0(CO)4] não é conhecido, porém o complexo [Pd0(CO)(PPh3)3] é estável9. Complexos de paládio(I) são, na maioria, dímeros onde ocorre ligação metal-metal, como no [Pd2Cl4(CO)2]2- (Figura 1)10. Cl Pd Cl C C Pd Cl Cl O O 2- Figura 1. Complexo de paládio(I) onde ocorre ligação metal-metal O estado de oxidação (+II) é o mais importante para o paládio. São conhecidos óxidos, haletos, nitratos, sulfatos e diversos complexos de Pd(II). O íon [Pd(H2O)4]2+ é formado em solução aquosa e é diamagnético9. O emparelhamento de todos os elétrons indica uma estrutura quadrado-planar, que ocorre quase invariavelmente em complexos de Pd(II), com exceção de complexos com ligantes volumosos, onde podem ocorrer distorções. Apesar da maioria dos complexos de Pd(II) apresentar número de coordenação quatro, complexos que possuem cinco átomos ligados ao metal e geometria de bipirâmide trigonal são conhecidos, como o complexo [PdCl(pp3)] (pp3 = tris(2-(difenilfosfino)-etil)fosfina)11. Compostos de Pd(III) são muito raros, com poucos casos descritos na literatura. Em geral, esses compostos apresentam, na realidade, valência mista, como o composto Pd2+[PdIVF6]2-, contendo Pd(II) e Pd(IV)9. Com exceção do composto [Pd(NO3)2(OH)2], formado na dissolução de Pd em ácido nítrico concentrado, os complexos de Pd(IV) são octaédricos do tipo [PdX6]2-, onde X = F, Cl ou Br. São compostos bastante reativos, que são decompostos por água quente10. De acordo com a classificação de Pearson, o íon Pd(II) é um ácido mole e por essa razão forma ligações mais fortes com bases moles, como I-, SCN- e CN-. As principais diferenças entre ácidos e bases moles e duros são tamanho e polarizabilidade, assim os moles são maiores e mais polarizáveis, enquanto os duros são pequenos e não muito polarizáveis8. Apesar do Pd(II) possuir baixa afinidade com o oxigênio, muitas exceções são 25 CAPÍTULO 1 Introdução conhecidas, como o acetato de paládio(II), que destaca-se por sua importância como precursor em várias sínteses e na participação de reações orgânicas catalisadas por Pd10. Os complexos de paládio(II) são extensivamente investigados há décadas e apresentam diversas aplicações como em catálise homogênea12, automontagem de supramoléculas13, na área tecnológica como materiais líquido-cristalinos14, na área médica como agentes antitumorais15, entre outras. Estes compostos também apresentam uma grande reatividade frente a ligantes orgânicos e inorgânicos originando, assim, espécies com uma rica variedade estrutural. 1.2 Aplicações biológicas de complexos de paládio(II) Câncer é o nome dado a um conjunto de doenças caracterizadas pelo crescimento desordenado de células em alguma parte do corpo16. Estas células dividem-se muito rapidamente, formando os tumores ou neoplasias malignas. Em alguns casos, pode ocorrer o processo de metástase, ou seja, a disseminação das células anormais do tumor para outras partes do corpo além do local original em que elas apareceram. Os diferentes tipos de câncer correspondem aos vários tipos de células do corpo. Assim, existem diversos tipos de câncer de pele pois a pele é formada por vários tipos de células. As estatísticas do câncer são preocupantes. Em 2005, ele representou 13% das mortes no mundo. Os cânceres de pulmão, estômago, fígado, cólon e mama foram os principais responsáveis17. No Brasil, o câncer deixou para trás todas as causas de morte, a não ser os problemas cardiovasculares, basicamente ataques do coração e derrames, que, desde a década de 1960, lideram as estatísticas de óbitos. Um em cada oito óbitos é provocado por tumores malignos16. As estimativas para o ano de 2010 apontam que ocorrerão 489.270 novos casos de câncer no país17. O câncer pode ter causas internas e externas ao organismo, sendo que 80 a 90% dos casos são associados a fatores ambientais, como tabagismo, hábitos alimentares, alcoolismo, hábitos sexuais, medicamentos e radiação solar17. Os fatores podem ainda se relacionar, aumentando a probabilidade de transformações malignas nas células normais. O tratamento pode ser feito através de cirurgia, radioterapia e quimioterapia, sendo que, em muitos casos, é necessário combinar essas modalidades. O objetivo da quimioterapia é erradicar todas as células malignas sem afetar as células normais, no entanto, as diferenças bioquímicas e morfológicas entre essas células são mínimas. Assim, a 26 CAPÍTULO 1 Introdução maioria dos quimioterápicos atua de forma não-específica, atingindo ambos os tipos de células. Essa é a causa dos vários efeitos colaterais, como náuseas e perda de cabelo, associados ao tratamento com quimioterapia18. Além disso, a rápida resistência que as células cancerosas desenvolvem ao medicamento é outro problema enfrentado no uso desta terapia. Soma-se ainda o fato de que alguns complexos contendo metais de transição, principalmente os de platina, são muito tóxicos ao organismo, sendo alguns deles tão fatais quanto o próprio câncer. Inicialmente, compostos contendo metais eram estudados apenas por seu potencial carcinogênico e não por qualquer propriedade anticancerígena que pudessem apresentar 19. Esse cenário começou a mudar no fim da década de 60, no século XX, quando foi descoberta a atividade do complexo cis-diamindicloroplatina(II) (cisplatina) (Figura 2a)2,3. Apesar de ser usada no tratamento de diversas neoplasias4-6, existem vários obstáculos para o tratamento com essa droga, que incluem: o surgimento de resistência celular, a baixa solubilidade em água, o reduzido espectro de atividade e graves efeitos colaterais, que surgem, principalmente, devido ao seu acúmulo no organismo em função da complexação da cisplatina com proteínas e peptídeos20. Figura 2. Cisplatina (a), Carboplatina (b) e Oxaloplatina (c) Além da cisplatina, outras drogas a base de platina são usadas no tratamento do câncer, como a carboplatina (Figura 2b) e a oxaloplatina (Figura 2c). A carboplatina, [diamino(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platina(II)], apesar de não atuar em células resistentes à cisplatina, apresenta menor nefrotoxicidade e vem sendo usada em todo o mundo desde 1989, quando foi aprovada para uso contra o câncer de ovário21,22. A oxaloplatina, cis-[1,2-diaminocicloexanooxalatoplatina(II)], demonstra atividade antitumoral contra células resistentes à cisplatina23-25. As novas pesquisas têm buscado solucionar os problemas enfrentados no tratamento à base de quimioterapia através da produção de compostos que apresentem melhor (a) (b) (c) 27 CAPÍTULO 1 Introdução espectro de atividade antitumoral, menor resistência celular e menos efeitos colaterais19. Apesar do uso de paládio na medicina ser limitado, tendo como única aplicação o isótopo radioativo 103Pd no tratamento de câncer de próstata26, complexos de paládio(II) vêm apresentando propriedades antitumorais muito promissoras27. A escolha do íon paládio(II) como centro metálico é baseada em três fatores: i) compostos de paládio são, em geral, mais solúveis que os de platina, o que facilitaria as interações no meio biológico; ii) o paládio é mais barato que a platina, o que diminuiria os custos finais do fármaco; iii) por causa da contração lantanídica, os raios iônicos de Pd(II) e Pt(II) possuem valores muito próximos, o que se reflete na similaridade entre a química de coordenação de seus compostos28-30. 1.2.1 Mecanismo de ação de compostos de paládio e platina Apesar de uma vasta literatura sobre as interações entre complexos metálicos e o DNA, a natureza destas ligações, bem como suas geometrias, ainda é assunto de debate29. Em geral, como os complexos possuem um centro metálico carregado positivamente, eles podem ligar-se a biomoléculas negativamente carregadas, o que faz com que proteínas e ácidos nucléicos sejam excelentes alvos para essas drogas31. Sabe-se que a cisplatina manifesta sua atividade antitumoral através de interação covalente com o DNA. Ao ligar-se ao DNA, o complexo de platina causa lesões que alteram a estrutura conformacional do mesmo, interferindo nas suas funções de replicação e transcrição e finalmente causando a morte celular32-34. A molécula do DNA é formada por duas fitas, cada uma delas composta por uma seqüência de nucleotídeos, que por sua vez é constituído por três diferentes tipos de moléculas: um açúcar (a 2’-desoxi-D-ribose), um grupo fosfato e uma base nitrogenada. As bases nitrogenadas podem ser púricas [guanina (G) e adenina (A)] ou pirimídicas [citosina (C) e timina (T)]. A proximidade entre as bases nitrogenadas de cada fita possibilita a formação de ligações de hidrogênio (G-C e A-T) que mantêm a estrutura de dupla hélice do DNA (Figura 3). 28 CAPÍTULO 1 Introdução N N N N N 1 H H 2 6 8 5 5 2 6 9 4 4 3 3 7 1 N N O O H CH3 H H Adenina Timina 3 4 57 9 5 2 2 6 6 4 3 8 1 1N N N N O N H H H N N H O HN H H Guanina Citosina Figura 3. Ligações de hidrogênio entre os pares de bases nitrogenadas A cisplatina interage com o DNA através da formação de adutos intrafita (quando as duas ligações ocorrem na mesma fita do DNA) ou interfitas (quando cada ligação é feita em uma fita do DNA)35-36. Alguns complexos de paládio(II) com ligantes N,S, como as tiossemicarbazonas, mostraram-se ativos frente a células tumorais resistentes à cisplatina. Investigações a respeito do mecanismo de ação sugerem que esses compostos se liguem ao DNA através de coordenação interfitas, ao contrário da cisplatina, que interage predominantemente com duas guaninas na mesma fita, ou seja, através de coordenação intrafita. Acredita-se que seria esta a razão pela qual os complexos de tiossemicarbazonas se mostram ativos nas células resistentes37. Gao et al. estudaram a interação do complexo [PdCl2(bipy)+ (bipy = 2,2’ bipiridina) com o DNA38. Diferentemente da cisplatina, que se liga preferencialmente ao nitrogênio N7 da base guanina, seguido por N7-adenina, N1-adenina e N3-citosina39, a interação do complexo com a base adenina deu-se através dos átomos de nitrogênio N3 e N9. Além disso, o complexo estudado revelou forte ação de intercalação com o DNA. Outro trabalho recente estudou complexos de Pd(II) e Pt(II) do tipo [M(Bu-dtc)(bipy)]NO3 (M = Pd(II) ou Pt(II), Bu-dtc = butilditiocarbamato) e mostrou que o composto de paládio(II) interagiu mais fortemente com o DNA que o complexo análogo com platina40. Também foi mostrado que os compostos induzem diferentes mudanças conformacionais no DNA. O composto de paládio(II) conseguiu desnaturar o DNA em concentrações baixas, o que indica que caso ele possa ser usado como um antitumoral, baixas doses serão necessárias. Um estudo feito com compostos ciclopaladados mostrou que eles são capazes de induzir apoptose41. A apoptose é um tipo de “morte programada” que ocorre de forma ordenada e é usada para manter o equilíbrio interno dos organismos multicelulares. Ela 29 CAPÍTULO 1 Introdução ocorre quando a célula não consegue reparar o DNA modificado. Neste caso, os compostos induziram mudanças no DNA que não foram reparadas pela célula e levaram à apoptose. Diversos outros trabalhos29,30,42 indicam que os complexos de paládio(II), assim como os de platina, interagem com o DNA. A diferença nas atividades antitumorais apresentadas por eles parece estar no tipo de mudança causada no DNA. 1.2.2 Complexos de paládio(II) com atividade antitumoral Os primeiros ensaios citotóxicos com complexos de paládio(II) não foram muito promissores, pois mostraram que estes eram bem menos ativos em relação aos compostos de Pt(II). Muitos autores sugeriram que os avanços nesta área seriam limitados, provavelmente, em função de parâmetros cinéticos, uma vez que complexos de Pd(II) reagem ≈ 105 vezes mais rapidamente que seus análogos de Pt(II)43. Assim, a baixa atividade antitumoral de parte dos complexos de Pd(II) foi atribuída aos rápidos processos de hidrólise que conduzem à dissociação dos grupos abandonadores em solução e, consequentemente, à formação de espécies muito reativas incapazes de atingir seus alvos farmacológicos29. Nos últimos anos, no entanto, o interesse no uso medicinal de complexos de Pd(II) foi renovado com a publicação de vários trabalhos científicos que relataram propriedades antitumorais muito promissoras desta classe de compostos44. Complexos de paládio (II) e platina (II) derivados de tiossemicarbazonas se mostraram ativos em células tumorais resistentes à cisplatina, como os complexos de fenilacetaldeído tiossemicarbazona (HL) do tipo [MCl2(HL)]37, os quais são citotóxicos frente a uma variedade de linhagens tumorais, com um bom índice terapêutico, e valores de concentrações inibitórias (IC50) muito menores para células resistentes à cisplatina do que para células normais. Um outro estudo relatou a síntese de complexos de paládio(II) com ligantes N,S doadores derivados da tiossemicarbazona45. Foram realizados testes in vitro com duas linhagens celulares tumorais humanas, HL-60 (leucemia promielocítica) e U-937 (linfoma histiocítico). Em geral, os compostos apresentaram atividade próxima ou melhor que a da cisplatina, sendo que o complexo [Pd(L2)(PPh3)] (H2L2 = 2-hidroxiacetofenona tiossemicarbazona) se mostrou bem mais citotóxico que a cisplatina nas duas linhagens testadas. 30 CAPÍTULO 1 Introdução Outros derivados de tiossemicarbazidas também apresentaram ótimos resultados. O composto [(benzil)Pd{bis(tiossemicarbazonato)}] (Figura 4) apresentou valores de IC50 similares aos da cisplatina e notável atividade em linhagens celulares tumorais resistentes à droga42. Figura 4. Fórmula estrutural do complexo [(benzil)Pd{bis(tiossemicarbazonato)}] Vários trabalhos têm relatado estudos envolvendo a comparação da atividade citotóxica de complexos análogos com diversos metais. Os compostos de fórmula [Pd(asme)2] e [Pd(asbz)2] com ligantes derivados de bases de Schiff (Figura 5) apresentaram atividade frente a duas linhagens celulares tumorais, enquanto os compostos de platina foram inativos46. (a) (b) Figura 5. Ligantes derivados de bases de Schiff: asme (a) e asbz (b) Outro estudo comparativo foi realizado por Friebolin et al., onde foi avaliada a atividade antitumoral de complexos contendo ligantes derivados do bis(O- alquilditiocarbonato) com diferentes metais. Foram estudados complexos de paládio(II), platina(II), ouro(I), níquel(II), cobre(II), ródio(II) e bismuto(II). Os menores valores de IC50 foram obtidos para os complexos de paládio, chegando a ser, inclusive, bem inferiores aos da cisplatina47. 31 CAPÍTULO 1 Introdução Complexos com ligantes heterocíclicos N doadores também vêm se mostrando bastante promissores. Compostos de fórmula geral trans-[PdCl2L2] (L = 3-hidroxipiridina, 2- hidroxipiridina e 4-hidroxipiridina) (Figura 6) foram testados frente às linhagens celulares tumorais de ovário: A2780, A2780cisR, A2780ZD0473R 48. Os compostos são menos ativos que a cisplatina, com exceção do composto com L = 2-hidroxipiridina; porém foram mais ativos nas células resistentes. Figura 6. Fórmulas estruturais dos compostos de fórmula trans-[PdCl2L2] (L = 3-hidroxipiridina, 2-hidroxipiridina e 4- hidroxipiridina) A investigação da atividade antitumoral do complexo mononuclear [PdCl2(dmnp)2] e do dinuclear [Pd2Cl4(dmnp)2] (dmnp = 2,6-dimetil-4-nitro-piridina) (Figura 7) foi realizada in vitro com quatro linhagens tumorais humanas: SW707 (adenocarcinoma de reto), T47D (câncer de mama), HCV29T (câncer de bexiga) e A549 (carcinoma pulmonar)49. O composto mononuclear apresentou elevada atividade citotóxica em quase todas as linhagens comparada à cisplatina, enquanto o ligante livre e o complexo dinuclear tiveram atividade moderada. Figura 7. Fórmulas estruturais dos complexos [PdCl2(dmnp)2] e [Pd2Cl4(dmnp)2] D. Pucci et al. mostraram a atividade citotóxica do complexo ciclopaladado [Pd(4-O-Acrid)(L)], com os ligantes quelantes fenilpiridina (L) e 4-hidroxiacridina 32 CAPÍTULO 1 Introdução (4-O-Acrid)50. Os testes foram feitos em três tipos de células tumorais humanas de ovário e foi usada a cisplatina como droga padrão. Os valores de IC50 para a cisplatina e para o composto encontram-se na Tabela 2. O complexo de paládio foi bem mais tóxico que a cisplatina em todas as linhagens estudadas. Tabela 2. Valores de IC50 (µM) do composto [Pd(4-O-Acrid)(L)] e da cisplatina em linhagens celulares tumorais de ovário IC50 (µM) Composto A2780 OVCAR 5 OVCAR 8 Cisplatina 15,9 ± 1,5 10,4 ± 3,5 38,9 ± 13,3 [Pd(4-O-Acrid)(L)] 3,8 ± 1,9 5,6 ± 1,2 4,7 ± 1,1 Novos complexos organometálicos de paládio(II) (Figura 8) foram sintetizados utilizando como ligante a 1-metilcitosina (Mecyt), sendo que nos compostos a-d estão presentes ligantes N,N doadores, derivados de pirazol (a,b), piridina (c) e etilenodiamina (d)51. O estudo da citotoxicidade dos compostos foi feito com células tumorais de leucemia (HL-60) e revelou que praticamente todos foram mais ativos que a cisplatina num período de incubação de 24 h. Além disso, os complexos foram capazes de induzir a apoptose. Figura 8. Fórmulas estruturais dos complexos de paládio(II) com o ligante 1-metilcitosina Ray et al. estudaram a atividade antitumoral de dois novos complexos organometálicos de paládio(II) (Figura 9) frente às linhagens de câncer cervical (HeLa), a R = H c d b R = CH3 e L´ = PPh3 g h f L´ = t-BuCN 33 CAPÍTULO 1 Introdução câncer de mama (MCF-7) e adenocarcinoma de colo (HCT 116) obtendo excelentes resultados52. O composto 1b se apresentou mais ativo que a cisplatina nos três casos. Os valores de IC50 da cisplatina para HeLa, MCF-7 e HCT 116 foram 8, 15 e 16 M, respectivamente enquanto que os valores correspondentes para o composto 1b foram 4, 1 e 0,8 M. Figura 9. Fórmulas estruturais dos complexos trans- [PdCl2(L)(piridina)] (1a) e trans- [PdCl2(L)2] (1b) Diferentemente dos complexos de platina(II), cuja atividade, em geral, se manifesta em compostos de geometria cis19, complexos de paládio(II) na geometria trans também se mostram bastante promissores. O composto trans-[PdCl2(L)(dmso)] (L = 7-metóxi-1-metil- 9H-pirido[3,4-b]indol) apresentou atividade superior a da cisplatina frente às linhagens leucêmicas P388, L1210 e K56253. Os complexos de paládio(II) têm enorme potencial como agente anticancerígeno, pois podem aliar alta atividade e baixa toxicidade comparados aos análogos de platina(II)40. A elevada cinética do processo de hidrólise sofrido pelos complexos levando à rápida substituição dos ligantes lábeis, indicada, inicialmente, como a causa para a baixa atividade destes compostos, pode ser suprimida a partir do planejamento de complexos termodinamicamente estáveis e cineticamente inertes37. 34 CAPÍTULO 1 Introdução 1.3 A Química de Coordenação dos Pirazóis Azóis são heterocíclicos aromáticos contendo um átomo de nitrogênio e mais um outro heteroátomo dispostos na posição-1,2 de um anel de cinco membros. Os pirazóis pertencem à família dos 1,2-azóis, juntamente com os isotiazóis e isoxazóis54 (Figura 7). H N N 5 4 3 21 1 2 3 4 5 S N 1 2 3 4 5 O N pirazol isotiazol isoxazol Figura 10. Família dos 1,2-azóis Os pirazóis são ligantes -doadores que podem interagir de diferentes modos com metais e ocupam uma posição similar à amônia e piridina na série espectroquímica55. A presença de dois átomos de nitrogênio quimicamente diferentes dispostos na posição 1,2 do anel de cinco membros confere aos pirazóis uma grande versatilidade quanto aos seus modos de coordenação56. Assim, os pirazóis, sem substituintes coordenantes, são capazes de atuar como: a) Ligantes neutros monodentados: a coordenação ocorre via átomo de nitrogênio piridínico do pirazol neutro (Figura 11a). b) Ligantes aniônicos monodentados: quando a coordenação se dá por apenas um átomo de nitrogênio do pirazol aniônico (pirazolato) (Figura 11b). c) Ligantes aniônicos exobidentados: quando os dois átomos de nitrogênio do grupo pirazolato ligam-se a centros metálicos diferentes (Figura 11c). d) Ligantes aniônicos endobidentados: ocorre quando os dois átomos de nitrogênio do grupo pirazolato ligam-se simultaneamente ao mesmo centro metálico (Figura 11d). e) Ligantes pentahapto (5): ocorre quando todos os átomos do anel pirazolato interagem com o centro metálico, de modo similar ao ânion ciclopentadienilo no modo pentahapto (Figura 11e). 35 CAPÍTULO 1 Introdução 12 3 4 5 N N H M N N M - N N M M - (a) (b) (c) N N M - (d) (e) N N - M Figura 11. Modos de coordenação dos ligantes pirazólicos. O modo de coordenação neutro monodentado é exemplificado, entre outros, pelo trabalho de Takahashi et al.57 no qual foi descrito a obtenção e caracterização estrutural do complexo trans-[Co(NCS)2(HPz)4] (Figura 12a). O comportamento exobidentado do grupo pirazolato é observado no complexo [Pd2(-dppz)2(Hida)2] (dppz = 3,5-difenilpirazolato, Hida = iminodiacetato58 (Figura 12b). O trabalho de Sanz et al.59, no qual foi relatado a determinação da estrutura molecular do complexo [Zr(2-dmpz)2Cl2(1-dmpz)2] (Hdmpz = 3,5-dimetilpirazol) (Figura 13a), é um exemplo da coordenação pirazólica no modo endobidentado. Por outro lado, é rara a coordenação de ânions pirazolatos no modo pentahapto (5), semelhante ao ciclopentadienilo. Arachchige et al.60 descreveram a obtenção e determinação estrutural da espécie [Os(5-3,5-tBupz)(5-pmCp)] (3,5-tBupz = 3,5-di-t-butilpirazolato, pmCp = pentametilciclopentadienil) (Figura 13b). (a) (b) Figura 12. Estruturas moleculares dos compostos trans-[Co(NCS)2(HPz)4] (a) e [Pd2(-dppz)2(Hida)2] (b) 36 CAPÍTULO 1 Introdução (a) (b) Figura 13. Estruturas moleculares dos compostos [Zr(2-dmpz)2Cl2(1-dmpz)2] (a) e [Os(5-3,5-tBupz)(5-pmCp)] (b). 1.4 Aplicações biológicas de complexos pirazólicos Os compostos pirazólicos atraem grande atenção em função de sua potencial aplicação como catalisadores61, cristais-líquidos62, reagentes complexantes para determinação analítica63, entre outras64,65. Na Química Medicinal, destacam-se suas potenciais atividades biológicas. Compostos de fórmula geral [Au(L)(PPh3)] (L = pirazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol) demonstraram atividade antimicrobiana seletiva e efetiva contra duas bactérias Gram- positivas, B. subtilis, S. aureus, e atividade modesta contra a levedura C. albicans66. Sakai et al.67 verificaram que o complexo cis-[PtCl2(HPz)2] apresentou modesta atividade antitumoral frente às linhagens de células humanas cancerosas colo-retais (DLD-1, HCT15 e HT29) e gástricas (AGS). Komeda et al.68 compararam a citotoxicidade de alguns complexos azólicos de Pt(II) com a cisplatina frente às linhagens de células humanas cancerosas MCF7 e EVSA-T (câncer de bexiga), WIDR (câncer de cólon), IGROV (câncer de ovário), M19 (melanoma), A498 (câncer renal) e H226 (câncer de células pulmonares). Dentre os compostos estudados, destaca-se o complexo catiônico [Pt2(-Pz)(-OH)(NH3)4](NO3)2 (Figura 14) que foi 39 vezes 37 CAPÍTULO 1 Introdução mais efetivo que a cisplatina frente à linhagem MCF7 e 37 vezes mais citotóxico do que a cisplatina frente à M19. Figura 14. Fórmula estrutural do complexo [Pt2(-Pz)(-OH)(NH3)4](NO3)2. Os compostos pirazólicos [{Au(pz)Cl2}2] e [{Au(mpz)Cl2}2] (Figura 15), onde Hpz = pirazol e Hmpz = 3-metilpirazol, tiveram suas atividades antitumorais testadas em linhagens tumorais humana e murina69. Os dois complexos se revelaram mais ativos que a cisplatina em ambas as linhagens. Isômero trans Isômero cis Figura 15. Possíveis fórmulas estruturais para o composto [{Au(mpz)Cl2}2] E. Ciesielska et al. descreveram a síntese e o estudo da atividade citotóxica de quatro complexos análogos à cisplatina contendo pirazóis como ligantes não-abandonadores (Figura 16)70. Os compostos foram testados em uma linhagem de leucemia murina (L1210) e as drogas de referência utilizadas foram cisplatina e carboplatina. Apesar de apresentarem menor atividade que a cisplatina, todos os compostos foram mais citotóxicos que a carboplatina. 38 CAPÍTULO 1 Introdução Figura 16. Fórmulas estruturais dos compostos análogos à cisplatina testados O complexo aniônico dinuclear de platina(IV) [(PtMe3)2(-I)(-pz)2]-, que contém o ânion pirazolato, foi testado frente às seguintes linhagens tumorais: câncer de tireóide (8505C), tumores de cabeça e pescoço (A253 e FaDu), câncer cervical (A431), câncer de pulmão (A549), câncer de ovário (A2780) e carcinoma de colo (DLD-1, HCT-8 e HT-29), sendo as linhagens 8505C e DLD-1 com baixa sensibilidade à cisplatina (Tabela 3)71. O complexo foi mais ativo que a cisplatina nas linhagens pouco sensíveis à droga e apresentou valores de IC50 próximos aos da cisplatina frente às outras células. Tabela 3. Valores de IC50 (µM) para o complexo pirazólico e cisplatina em diferentes linhagens celulares tumorais IC50 (µM) Composto 8505C A253 A431 A549 A2780 DLD-1 FaDu HCT-8 HT-29 Cisplatina 5 0,8 0,65 1,5 0,55 5 1,2 1,5 0,6 [(PtMe3)2(-I)(-pz)2]- 1,96 1,13 0,95 2,30 1,49 2,51 2,32 3,76 2,18 39 CAPÍTULO 1 Introdução 1.5 Complexos pirazólicos de paládio(II) Em um trabalho recente foram descritas a síntese e a avaliação da atividade citotóxica de complexos de paládio(II) contendo ligantes derivados do pirazol72 (Figura 17). Os compostos foram testados frente às linhagens celulares de carcinoma ovariano humano A2780 (sensível à cisplatina) e A2780cisR (resistente à cisplatina). A atividade antitumoral observada nos compostos foi similar ou maior que a da cisplatina, sendo que um dos compostos apresentou atividade equiparada a da cisplatina em células do tipo A2780, porém foi aproximadamente 16 vezes mais potente que a droga de referência nas células da linhagem resistente. (a) (b) Figura 17. Estruturas moleculares dos complexos [PdL2] (a) e [PdL’2] (b), L = 3-oxo-5-fenil-1H-pirazol-2(3H)- carbotioamida e L’ = 4-etil-5-metil-3-oxo-1H-pirazol-2(3H)-carbotioamida Compostos de Pd(II), Pt(II) e Cu(II) (Figura 18) com o mesmo ligante pirazólico tiveram suas citotoxicidades estudadas73. Apesar de ter se mostrado o menos ativo entre os três, o complexo de paládio apresentou IC50 = 135,6 ± 27,5 µM na linhagem WM-115 (melanoma humano), enquanto o valor para a carboplatina foi de 422,2 ± 50,2 µM. Figura 18. Fórmula estrutural dos complexos de Pd(II), Pt(II) e Cu(II) com ligante pirazólico 40 CAPÍTULO 1 Introdução Budzisz et al.74 testaram a citotoxicidade de complexos de fórmula geral [MCl2L2] {M = Pd(II), Pt(II); L = 5-(2-hidróxifenil)-1,3-dimetil-4-(dimetóxi)fosfonil-1H-pirazol (L1); 5-(2- hidróxifenil)-1,3-dimetil-4-metóxicarbonil-1H-pirazol (L2)} (Figura 19) frente às linhagens de células leucêmicas HL-60 e NALM-6. Dentre os complexos testados, a maior citotoxicidade foi observada para o [PdCl2(L2)2], embora seja menos citotóxico que a cisplatina e a carboplatina. Figura 19. Fórmula estrutural do composto [PdCl2(L2)2] (L2 = 5-(2-hidróxifenil)-1,3-dimetil-4- metóxicarbonil-1H-pirazol) Os principais objetivos no desenvolvimento de novos quimioterápicos consistem em obter compostos que atuem nas células resistentes à cisplatina, que possuam maior espectro de atividade e provoquem menos efeitos colaterais nos pacientes. Com base no exposto anteriormente, fica clara tanto a potencialidade biológica dos compostos de paládio(II) quanto dos complexos com ligantes derivados de pirazóis. Assim, neste trabalho foram preparados complexos de paládio(II) com os ligantes pirazólicos 3,5-dimetil-4- iodopirazol e 4-metilpirazol e os ânions Cl-, Br-, I- e SCN-. Os compostos foram testados frente a células tumorais e frente a macrófagos peritoneais. 41 CAPÍTULO 2 Objetivos 2 OBJETIVOS O presente trabalho tem como objetivos: i)Síntese e caracterização espectroscópica de novos compostos de Pd(II) de fórmula geral [PdX2(HdmIPz)2] e [PdX2(HmPz)2], onde HdmIPz = 3,5-dimetil-4-iodopirazol, HmPz = 4-metilpirazol e X = Cl-, Br-, I-, SCN-. ii)Caracterização térmica dos compostos preparados. iii)Avaliação da atividade antitumoral dos complexos. 42 CAPÍTULO 3 Parte Experimental 3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Procedência dos solventes e reagentes Os reagentes (p.a.) foram utilizados nas sínteses sem purificação prévia. Os solventes (p.a.) empregados nas reações foram tratados com peneira molecular para remoção de excesso de água e armazenados em frascos de vidro escuro. A Tabela 4 apresenta a procedência de solventes e reagentes empregados neste trabalho. Tabela 4. Procedência de solventes e reagentes Reagentes Procedência Solventes Procedência Cloreto de paládio Vetec Acetonitrila Mallinckrodt Chemicals 3,5-dimetilpirazol Aldrich Metanol Merck 4-metilpirazol Agros Organics Clorofórmio Merck Iodo Carlo Erba Dimetilsulfóxido deuterado Tedia Carbonato de sódio Fisher Brometo de potássio Merck Iodeto de potássio Merck Tiocianato de sódio Riedel-de Haen 3.2 Metodologias de síntese Na síntese dos complexos foram empregados os ligantes 3,5-dimetil-4-iodopirazol (HdmIPz) e 4-metilpirazol (HmPz). N N H H3C I CH3 N N H H CH3 H 3,5-dimetil-4-iodopirazol 4-metilpirazol HdmIPz HmPz 43 CAPÍTULO 3 Parte Experimental 3.2.1 Metodologia para preparação dos complexos contendo o ligante HdmIPz O cloro-complexo 1 foi preparado em metanol, à temperatura ambiente, segundo a equação a seguir. N N H H3C I CH3 Cl Pd Cl N N H CH3 I H3C [PdCl2(CH3CN)2] + 2 N N H H3C I CH3 1 Esquema 1. Síntese do composto 1 Os compostos 2-4 foram obtidos a partir da reação entre o complexo precursor [PdCl2(CH3CN)2], o 3,5-dimetil-4-iodopirazol (HdmIPz) e os respectivos ligantes aniônicos (Br-, I-, SCN-), segundo a equação a seguir. N N H H3C I CH3 X Pd X N N H CH3 I H3C [PdCl2(CH3CN)2] + 2 N N H H3C I CH3 + 2 X- X = Br (2), I (3), SCN (4) Esquema 2. Síntese dos compostos 2-4 3.2.2 Metodologia para preparação dos complexos contendo o ligante HmPz O complexo 5 foi preparado a partir da reação entre o complexo precursor [PdCl2(CH3CN)2] e o ligante pirazólico, em metanol, à temperatura ambiente, segundo a equação a seguir. N N H H3C Cl Pd Cl N N H CH3 [PdCl2(CH3CN)2] + 2 N N H CH3 5 Esquema 3. Síntese do composto 5 Os compostos 6, 7 e 8 foram obtidos in situ a partir de reações de substituição do CH3CN e do Cl- da esfera de coordenação do [PdCl2(CH3CN)2] pelo 4-metilpirazol (HmPz) e pelos ligantes aniônicos Br-, I- e SCN-, respectivamente, segundo a equação a seguir. 44 CAPÍTULO 3 Parte Experimental N N H H3C X Pd X N N H CH3 [PdCl2(CH3CN)2] + 2 N N H CH3 + 2 X- X = Br (6), I (7), SCN (8) Esquema 4. Síntese dos compostos 6-8 3.3 Preparação dos compostos 3.3.1 Síntese do ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol (HdmIPz) O ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol foi sintetizado de maneira análoga ao método empregado na obtenção do 4-iodopirazol75. Foi feita a dissolução do 3,5-dimetilpirazol (7,03 g, 73 mmol) e do Na2CO3 anidro (4.10 g, 39 mmol) em 60 mL de água quente. Sobre esta mistura adicionou-se uma solução de I2 (18,64 g, 73 mmol) e KI (26,00 g, 157 mmol) em 70 mL de H2O. A seguir, acrescentou-se mais um volume de 70 mL de H2O ao meio reacional antes de submetê-lo a um refluxo durante 30 min. a 100 C. Filtrou-se a mistura a quente e a solução avermelhada obtida foi resfriada a 0 C. O sólido formado foi separado da solução por filtração, lavado com água gelada e seco sob vácuo. Rendimento: 80 %. 3.3.2 Síntese do precursor [PdCl2(CH3CN)2] Em um erlenmeyer de 200 mL de capacidade contendo 40 mL de acetonitrila a 80 C foram adicionados lentamente 2,00 g (11,3 mmol) de cloreto de paládio anidro (PdCl2). A reação ficou sob intensa agitação magnética. Um precipitado amarelo foi formado após 30 min. de reação. O sólido foi isolado a partir de uma filtração simples e lavado com éter de petróleo. Rendimento: 75 %. Análise Elementar: obtido (calculado) %C = 18,05 (18,52); %N = 10,40 (10,80); %H = 2,49 (2,34). 3.3.3 Síntese dos compostos inéditos utilizando o ligante HdmIPz Preparação do [PdCl2(HdmIPz)2] (1) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,086 g 45 CAPÍTULO 3 Parte Experimental (0,39 mmol) de 3,5-dimetil-4-iodopirazol em 1 mL de metanol. Durante a adição do ligante, formou-se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. Houve formação de um precipitado amarelo claro após o final da adição do heterociclo. A agitação magnética foi mantida durante 1 h e o sólido obtido foi isolado a partir de uma filtração simples e lavado com metanol. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 68 %. P. f. (C) = 252 (dec). Análise Elementar: obtido (calculado para C10H14N4Cl2I2Pd) %C = 19,73 (19,33); %H = 2,19 (2,27); %N = 9,13 (9,02). Preparação do [PdBr2(HdmIPz)2] (2) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,086 g (0,39 mmol) de 3,5-dimetil-4-iodopirazol em 1 mL de metanol. Durante a adição do ligante, formou-se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. Houve formação de um precipitado amarelo claro após o final da adição do heterociclo. A agitação magnética foi mantida durante 30 min. Em seguida, adicionou-se ao meio reacional 0,046 g (0,39 mmol) de brometo de potássio dissolvidos em 1 mL de água, conduzindo à formação de um precipitado amarelo intenso. A reação ficou sob agitação por mais 1 h. O sólido obtido foi isolado a partir de uma filtração simples e lavado com metanol. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 63 %. P. f. (C) = 242 (dec.). Análise Elementar: obtido (calculado para C10H14N4Br2I2Pd) %C = 17,05 (16,91); %H = 2,05 (1,99); %N = 7,99 (7,89). Preparação do [PdI2(HdmIPz)2] (3) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,086 g (0,39 mmol) de 3,5-dimetil-4-iodopirazol em 1 mL de metanol. Durante a adição do ligante, formou-se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. Houve formação de um precipitado amarelo claro após o final da adição do heterociclo. A agitação magnética foi mantida durante 30 min. Em seguida, adicionou-se ao meio reacional 0,064 g (0,39 mmol) de iodeto de potássio dissolvidos em 1 mL de água, conduzindo à formação de um precipitado verde escuro. A reação ficou sob agitação por mais 1 h. O sólido obtido foi isolado a partir de 46 CAPÍTULO 3 Parte Experimental uma filtração simples e lavado com metanol. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 87 %. P. f. (C) = 214 (dec.). Análise Elementar: obtido (calculado para C10H14N4I3Pd) %C = 14,89 (14,93); %H = 1,85 (1,75); %N = 7,04 (6,97). Preparação do [Pd(SCN)2(HdmIPz)2] (4) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,086 g (0,39 mmol) de 3,5-dimetil-4-iodopirazol em 1 mL de metanol. Durante a adição do ligante, formou-se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. Houve formação de um precipitado amarelo claro após o final da adição do heterociclo. A agitação magnética foi mantida durante 30 min. Em seguida, adicionou-se ao meio reacional 0,031 g (0,39 mmol) de tiocianato de sódio dissolvidos em 1 mL de água, conduzindo à formação de um precipitado laranja. A reação ficou sob agitação por mais 1 h. O sólido obtido foi isolado a partir de uma filtração simples e lavado com metanol. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 60 %. P. f. (C) = 212 (dec). Análise Elementar: obtido (calculado para C12 H14N6I2S2Pd) %C = 21,42 (21,62); %H = 2,27 (2,12); %N = 12,24 (12,61). 3.3.4 Síntese dos compostos inéditos utilizando o ligante HmPz Preparação do [PdCl2(HmPz)2] (5) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,032 g (0,39 mmol) de 4-metilpirazol em 1 mL de metanol. Após o fim da adição do ligante, formou- se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. A agitação magnética foi mantida durante 1 h. Após vários dias, formou-se um sólido laranja de aspecto cristalino. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 51 %. P. f. (C) = 248 (dec.). Análise Elementar: obtido (calculado para C8H12N4Cl2Pd) %C = 28,09 (28,13); %H = 3,51 (3,54); %N = 16,29 (16,40). 47 CAPÍTULO 3 Parte Experimental Preparação do [PdBr2(HmPz)2] (6) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,032 g (0,39 mmol) de 4-metilpirazol em 1 mL de metanol. Após o fim da adição do ligante, formou- se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. A agitação magnética foi mantida durante 30 min. Em seguida, adicionou-se ao meio reacional 0,046 g (0,39 mmol) de brometo de potássio dissolvidos em 1 mL de água, conduzindo à formação de uma solução laranja. A reação ficou sob agitação por mais 1 h. Após vários dias, formou-se um sólido laranja de aspecto cristalino. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 54 %. P. f. (C) = 206. Análise Elementar: obtido (calculado para C8H12N4Br2Pd) %C = 24,01 (22,32); %H = 2,95 (2,81); %N = 13,58 (13,02). Preparação do [PdI2(HmPz)2] (7) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,032 g (0,39 mmol) de 4-metilpirazol em 1 mL de metanol. Após o fim da adição do ligante, formou- se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. A agitação magnética foi mantida durante 30 min. Em seguida, adicionou-se ao meio reacional 0,064 g (0,39 mmol) de iodeto de potássio dissolvidos em 1 mL de água, conduzindo à formação de uma solução vermelho intenso. A reação ficou sob agitação por mais 1 h. Após vários dias, formou-se um sólido marrom de aspecto cristalino. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 42 %. P. f. (C) = 200 (dec). Análise Elementar: obtido (calculado para C8H12N4I2Pd) %C = 19,16 (18,32); %H = 2,20 (2,31); %N = 10,97 (10,68). Preparação do [Pd(SCN)2(HmPz)2] (8) Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 0,050 g (0,19 mmol) de [PdCl2(CH3CN)2] suspenso em 5 mL de metanol foi gotejada uma solução contendo 0,032 g (0,39 mmol) de 4-metilpirazol em 1 mL de metanol. Após o fim da adição do ligante, formou- se uma solução límpida e de coloração mais clara que a inicial. A agitação magnética foi 48 CAPÍTULO 3 Parte Experimental mantida durante 30 min. Em seguida, adicionou-se ao meio reacional 0,031 g (0,39 mmol) de tiocianato de sódio dissolvidos em 1 mL de água, conduzindo à formação de uma solução laranja escuro. A reação ficou sob agitação por mais 1 h. Após vários dias, formou-se um sólido laranja de aspecto cristalino. O composto é bastante solúvel em dmso. Rendimento: 50 %. P. f. (C) = 160. Análise Elementar: obtido (calculado para C10H12N6S2Pd) %C = 28,85 (31,05); %H = 2,78 (3,13); %N = 19,86 (21,73). 3.4 Testes biológicos para determinação da atividade antitumoral Os experimentos biológicos foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - UNESP, em colaboração com a Profa. Dra. Iracilda Z. Carlos, a Profa. Dra. Sandra R. Ananias e a mestranda Marcela Bassi. Foi avaliado o índice de citotoxicidade dos complexos 1-8 frente às células tumorais LM3 e LP07. Os compostos 1-4 também foram testados frente a macrófagos peritoneais murinos Swiss. 3.4.1 Preparo das soluções Todas as soluções foram preparadas momentos antes da aplicação das amostras nos ensaios biológicos, em concentração máxima de dmso de 4% v/v diluídas em meio de cultura RPMI para os testes com macrófagos e MEM para os testes com células tumorais. As diluições foram realizadas a partir da solução-mãe empregando-se pipetas automáticas com capacidade variando de 1000 L a 100 L e de 100 L a 0,5 L e ponteiras descartáveis apropriadas para cada pipeta. Preparo da solução-mãe dos ligantes 3,5-dimetil-4-iodopirazol e 4-metilpirazol Um volume de 5000 L da solução-mãe dos ligantes foi obtido dissolvendo-se 50 mol de composto em 50 L de dmso e posterior diluição com 4950 L de meio de cultura RPMI para os testes com macrófagos e MEM para os testes com células tumorais. Foram empregadas concentrações de 250-150 mol L-1 para determinação da viabilidade celular frente a culturas de macrófagos e de 700-100 mol L-1 para os testes com células tumorais. 49 CAPÍTULO 3 Parte Experimental Preparo da solução-mãe dos complexos 1-8 Um volume de 5000 L da solução-mãe dos complexos foi obtido dissolvendo-se 5 mol de composto em 50 L de dmso e posterior diluição com 4950 L de meio de cultura RPMI para os testes com macrófagos e MEM para os testes com células tumorais. Foram empregadas concentrações de 100-10 mol L-1 para determinação da viabilidade celular frente a culturas de macrófagos e de 140-20 mol L-1 para os testes com células tumorais. Preparo da solução-mãe de cisplatina Um volume de 5000 L da solução-mãe de cisplatina foi obtido dissolvendo-se 1500 L da solução de cisplatina em 3500 L de meio de cultura RPMI para os testes com macrófagos e MEM para os testes com células tumorais. Foram empregadas concentrações de 60-15 mol L-1 para determinação da viabilidade celular frente a culturas de macrófagos e de 40-5 mol L-1 para os testes com células tumorais. 3.4.2 Testes biológicos com macrófagos Animais Foram utilizados camundongos não isogênicos Swiss machos de 6 semanas, pesando entre 18 e 25 g, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – campus de Araraquara. Os animais foram mantidos em gaiolas de policarbonato, com água e ração Purina® ad libitum em local climatizado (Temperatura = 23  2º C, Umidade relativa do ar = 56  2%), com controle de claro e escuro a cada período de 12 h. Obtenção de macrófagos do exsudato peritoneal Os procedimentos foram seguidos conforme descrito na literatura, com pequenas modificações76. Os animais foram previamente inoculados intraperitonealmente com 3,0 mL de tioglicolato de sódio a 3%. Após decorridos 3 a 4 dias de estímulo, eles foram sacrificados em atmosfera de CO2. Logo em seguida expôs-se o peritônio abrindo-se a pele do animal, no qual inoculou-se 5,0 mL de solução salina tamponada de fosfato estéril com pH 7,2 e fez-se leve massagem manual no peritônio. As células foram colhidas do peritônio com a mesma seringa e dispensadas em tubo cônico estéril para o preparo da suspensão celular. Esta suspensão foi centrifugada de 3 a 4 vezes a 2000 rpm durante 5 min., separando assim, as 50 CAPÍTULO 3 Parte Experimental células do exsudato peritoneal. As células foram ressuspensas em meio de cultura RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino, 1 U mL-1 de estreptomicina, 1 U mL-1 de penicilina e 5.10-2 mol L-1 de -mercaptoetanol, sendo então assim designado como RPMI Completo (RPMI-1640-C). Em seguida, as células foram contadas em câmara hemocitométrica tipo Neubauer, empregando corante vital líquido de Lázarus, sendo ajustado à concentração de 5 x 106 células mL-1 em meio de RPMI Completo para os testes de viabilidade celular. Determinação da viabilidade celular Da suspensão de macrófagos peritoneais em meio RPMI, ajustados a uma concentração de 5x106 células mL-1, foram adicionados 100 L em cada poço de placas para cultivo de tecidos de 96 poços (Corning). Sobre essas células, foram adicionados em triplicata, 100 L das soluções dos compostos HdmIPz, 1-4 e cisplatina nas diferentes concentrações, em mol L-1, a serem testadas e 100 L de RPMI completo como controle de células. A incubação das placas foi feita durante 24 h em estufa a 37 C, com tensão constante de 7,5% de CO2. Após esse período os sobrenadantes das culturas foram descartados e 100 L de uma solução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5- difeniltetrazólio (MTT) diluído em tampão PBS a 5 mg mL-1 e posteriormente em meio RPMI- 1640-C na proporção 1:5, foram adicionados em cada poço da placa, que foi incubada por 3 h (37 C, 7,5 % de CO2). O sal de tetrazólio, nessas condições, é metabolizado pelas proteinases mitocondriais das células vivas formando cristais de formazana. Após a incubação foi adicionado 100 L de isopropanol para solubilizar os cristais. A leitura da absorbância foi realizada no fotocolorímetro multicanal UV-Vis Multiscan Ascent (Labsystems) a 540 nm com filtro de referência a 620 nm. Os valores correspondentes à concentração que reduz em 50% a viabilidade celular (IC50) dos compostos foram quantificados através da regressão linear de uma curva dose- resposta (Concentração da Amostra x Viabilidade Celular), realizada com 95% de confiabilidade. A equação da reta do tipo, Y= A + BX origina os valores de IC50, na qual Y = Absorbância; X = Concentração. 51 CAPÍTULO 3 Parte Experimental 3.4.3 Testes biológicos com células tumorais Linhagens celulares As linhagens tumorais foram cedidas pela Dra. Elisa Bal de Kier Joffé, do Instituto de Oncologia Angel H. Roffo – Buenos Aires – Argentina. Foram utilizadas as linhagens celulares tumorais murinas de mama (LM3) e de pulmão (LP07). O cultivo celular foi mantido em meio MEM (Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 4 g mL-1 de gentamicina, em estufa a 37 C, com atmosfera úmida e tensão constante de 7,5% de CO2. O número de células foi determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco), utilizando corante azul de Tripan, a 0,04% em PBS, e ajustado a uma concentração de 5x104 células mL-1 em meio MEM. Determinação da viabilidade celular Foram adicionados 200 L das células tumorais ajustadas em cada poço de placas de 96 poços. Após 24 h de incubação, período necessário para as células aderirem à placa, foram colocados 200 L dos compostos investigados em cada poço. Após incubação por mais 24 h, as células foram expostas ao MTT por 3 h. Depois, o conteúdo da placa foi novamente vertido e 100 L de álcool isopropílico (Mallinckrodt) foram adicionados a cada orifício para solubilizar os cristais de formazana formados. A leitura da absorbância foi realizada em fotocolorímetro UV/Visível (Multiskan Ascent, Labsystems), em comprimento de onda de 540 nm e filtro de referência 620 nm. Os valores correspondentes à concentração que reduz em 50% a viabilidade celular (IC50) dos compostos foram quantificados através da regressão linear de uma curva dose- resposta (Concentração da Amostra x Viabilidade Celular), realizada com 95% de confiabilidade. A equação da reta do tipo, Y= A + BX origina os valores de IC50, na qual Y = Absorbância; X = Concentração. 3.5 Métodos Instrumentais 3.5.1 Medidas de temperatura de fusão ou decomposição Os intervalos de temperatura de fusão foram medidos utilizando-se um aparelho MICROQUÍMICA modelo MQAPF - 302. 52 CAPÍTULO 3 Parte Experimental 3.5.2 Espectroscopia da absorção na região do infravermelho (IV) Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados no espectrofotômetro NICOLET modelo SX-FT Impact 400, na região de 4000 – 400 cm-1, resolução de 4 cm-1, utilizando pastilha de KBr. 3.5.3 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C{1H} foram registrados no Espectrômetro multinuclear VARIAN, modelo INOVA 500, operando a 500 MHz para hidrogênio. Utilizou-se dmso-d6 para dissolução das amostras. 3.5.4 Análise elementar de C, H, N Os teores de carbono, hidrogênio e nitrogênio foram determinados no analisador automático Perkin Elmer modelo 240, pertencente à Central Analítica do Instituto de Química da USP, São Paulo-SP (IQ-USP). 3.5.5 Termogravimetria As curvas TG e DTA foram obtidas no equipamento SDTQ 600, fabricado pela TA Instruments. Cada amostra foi disposta em cadinho de α-alumina, o qual foi submetido a um aquecimento desde a temperatura ambiente até 900 C, com taxa aquecimento de 20 C.min-1, sob atmosfera de ar sintético e fluxo de 50 mL.min-1. 3.5.6 Difração de raios-X – Método do pó Os difratogramas de raios X foram registrados no Difratômetro Siemens, modelo D- 5000, que operou utilizando radiação de CuKα (λ= 1,544 Å). A amostra é exposta à radição sob ângulos 5  2  70. 53 CAPÍTULO 4 Resultados e Discussão 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Compostos contendo o ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol (HdmIPz) 4.1.1 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho A Figura 20 representa os espectros no IV do ligante HdmIPz e dos complexos obtidos. As freqüências vibracionais presentes nos espectros no IV dos compostos foram atribuídas e encontram-se listadas na Tabela 5. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 % T ra n sm itâ n ci a R e la tiv a Número de onda (cm -1 ) Figura 20. Espectros vibracionais na região de 4000-400 cm-1 do IV para o ligante livre HdmIPz e os complexos 1-4. HdmIPz 1 2 3 4      NH NH NH NH NH asSCN sSCN anel anel anel anel anel 54 CAPÍTULO 4 Resultados e Discussão Tabela 5. Dados obtidos por espectroscopia no IV do ligante livre HdmIPz e dos complexos 1-4 e suas respectivas atribuições. Composto Atribuição HdmIPz 1 2 3 4 3170-3000 F 3180-3090 F 3190-3090 F 3230-3100 F 3160-3080 F NH 2960-2800 F 2970-2840 f 2970-2840 f 2970-2830 f 2960-2850 F CH3 - - - - 2121 F asSCN 1575 m 1560 m 1558 m 1558 m 1571 m  (“respiração do anel”) 1463 m 1473 f 1473 f 1469 f 1477 f anel + NH 1413 m 1415 m 1413 m 1413 m 1413 m asCH3 - 1379 om 1379 om 1371 om 1373 om anel + NH 1303 m 1288 m 1290 f 1282 f 1298 m NH 1164 f 1201 f 1201 mf 1195 f 1199 f anel + NH 1076 m, 1033 F 1091 m, 1016 f 1091 m, 1010 f 1087 m, 1004 f 1093 m, 1010 f anel - - - - 761 m sSCN 865 f 659 m 655 m 655 f 624 f NH 763 m 590 m 574 m 563 m 599 f anel + NH as=estiramento assimétrico, s=estiramento simétrico, =”respiração do anel”, =deformação no plano, as=deformação angular assimétrica no plano, = deformação fora do plano. Intensidades: F = forte, mF = média- forte, m = média, mf = média-fraca, f = fraca, om = ombro. A espectroscopia vibracional na região do infravermelho é de fundamental importância na determinação do modo de coordenação dos pirazóis. Alguns modos vibracionais são relevantes para se determinar de qual maneira o pirazol se coordena ao átomo metálico, principalmente os modos NH e “respiração do anel” ()77-79. A presença da banda NH no espectro indica a coordenação do ligante no modo neutro, visto que quando o ligante se coordena de modo aniônico, essa banda não está presente no espectro. A “banda respiração do anel” () também auxilia no diagnóstico dos modos de coordenação dos pirazóis. Estudos mostraram que esta banda, observada na região de 1596-1533 cm-1 no caso dos pirazóis livres, desloca-se para 1572-1512 cm-1 quando o pirazol se coordena de modo monodentado. Quando o ligante atua no modo exobidentado ela se desloca para frequências ainda mais baixas (1520-1490 cm-1) e ocorre também o desaparecimento da banda NH80. Os dados de espectroscopia vibracional na região do infravermelho obtidos para os compostos sugerem a coordenação monodentada do 3,5-dimetil-4-iodopirazol no caso dos complexos 1, 2 e 3. Observa-se a banda na região de 3200 cm-1, atribuída ao modo NH, e 55 CAPÍTULO 4 Resultados e Discussão além disso, pode notar-se o deslocamento da banda  (“respiração do anel”) de 1575 cm-1 (HdmIPz) para 1560 (1) e 1558 cm-1 (2 e 3). No caso do complexo 4, observa-se que em seu espectro no IV, as bandas associadas ao ligante HdmIPz não sofreram alterações muito significativas. Dessa forma, de acordo com os dados de espectroscopia no IV, o heterociclo não teria se coordenado ao Pd(II). Entretanto, foi possível evidenciar a coordenação com a técnica de ressonância magnética nuclear, como será visto posteriormente. Os dados de espectroscopia no IV, no entanto, forneceram informações valiosas a respeito do modo de coordenação do grupo tiocianato. Modos de coordenação do íon tiocianato O íon tiocianato possui vários modos de coordenação. Ele pode coordenar-se a um único metal (coordenação terminal) ou a dois ou mais centros metálicos (coordenação em ponte). Se os dois centros metálicos forem unidos por um único e mesmo átomo do íon, observa-se a coordenação μ-1,1 ou end-on. Caso os dois metais sejam conectados pelos átomos presentes em cada extremidade do íon, tem-se a coordenação μ-1,3 ou end-to-end (Figura 21). M NNN terminal NNN M M -1,1 NNN MM -1,3 NNN MM M -1,1,3 NNN M M M -1,1,1 AZIDA (NNN-) TIOCIANATO (NCS-) SCN M M -1,1-S NCS M M -1,1-N M SCN S-terminal M NCS N-terminal SCN MM -1,3 SCN MM M -1,1,3 CIANATO (NCO-) NCO M M -1,1-N M NCO N-terminal O-terminal M OCN OCN M M -1,1-O Figura 21. Modos de coordenação mais comuns do íon tiocianato (NCS-) Os principais modos vibracionais no espectro no IV do íon NCS- são: estiramento assimétrico as(SCN), estiramento simétrico s(SCN) e deformação δNCS *81,82]. A presença das bandas as(SCN) e s(SCN) na região de 2060-2090 cm-1 e 830-854 cm-1, respectivamente, indica que o íon se liga ao metal pelo átomo de nitrogênio. Caso as bandas encontrem-se em 2100-2120 cm-1 (as(SCN)) e 696-711 cm-1 (s(SCN)), a coordenação ocorre pelo átomo de enxofre. Atuando como ponte, a banda as(SCN) desloca-se para regiões acima de 2130 cm-1, enquanto que a s(SCN) é pouco afetada neste modo de coordenação. Estas informações estão resumidas na Tabela 6. 56 CAPÍTULO 4 Resultados e Discussão Tabela 6. Intervalos aproximados dos modos normais de vibração (cm-1) para os diferentes tipos de coordenação do tiocianato. Coordenação as(SCN) s(SCN) NCS NCS- 2053 746 486-471 M-NCS 2090-2060 854-830 485-475 M-SCN 2120-2100 711-696 470-430 M-NCS-M 2165-2130 800-750 470-440 Assim, a presença de uma absorção intensa no IV em 2121 cm-1 (asSCN) e uma banda de média intensidade em 761 cm-1 (sSCN), como no complexo 4, é um forte indicativo da coordenação do íon tiocianato no modo terminal via átomo de S. 4.1.2 Espectroscopia de RMN de 1H Os espectros de RMN de 1H do ligante HdmIPz e dos complexos 1-4 estão representados pelas Figuras 22 e 23, respectivamente. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H estão contidos na Tabela 7. Todos os espectros foram obtidos usando dmso-d6 como solvente. PPM 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1 2 .5 9 6 3 2 .0 9 8 1 Figura 22. Espectro de RMN de 1H do ligante 3,5-dimetil-4-iodopirazol NH Água do dmso-d6 dmso-d6 CH3 57 CAPÍTULO 4 Resultados e Discussão PPM 13.0 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 1 3. 86 74 2. 61 28 2. 25 08 PPM 13.5 12.5 11.5 10.5 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1 3. 86 72 2. 61 28 2. 25 18 PPM 13.5 12.5 11.5 10.5 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1 3. 77 71 2. 52 86 2. 26 70 PPM 13.5 12.5 11.5 10.5 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1 4. 17 68 2. 60 72 2. 27 30 Figura 23. Espectros de RMN de 1H para os compostos 1-4 Tabela 7. Dados de RMN de 1H para o ligante livre HdmIPz e os complexos 1-4 Atribuições Composto HdmIPz 1 2 3 4 3-CH3 2,09 2,61 2,61 2,53 2,61 5-CH3 2,09 2,25 2,25 2,27 2,27 NH 12,60 13,87 13,87 13,78 14,18 1 2 3 4 PPM 13.0 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 58 CAPÍTULO 4 Resultados e Discussão A análise dos espectros será