UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ANA CAROLINE ZANATTA SILVA Abordagem multidisciplinar e multicomponente aplicada à caracterização e desenvolvimento de fitopreparados de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa Araraquara 2021 ANA CAROLINE ZANATTA SILVA Abordagem multidisciplinar e multicomponente aplicada à caracterização e desenvolvimento de fitopreparados de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Co-orientador: Prof. Dr. Daniel Rinaldo Araraquara 2021 Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA S586a Silva, Ana Caroline Zanatta Abordagem multidisciplinar e multicomponente aplicada à caracterização e desenvolvimento de fitopreparados de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa / Ana Caroline Zanatta Silva. – Araraquara : [s.n.], 2021 202 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Wagner Vilegas Coorientador: Daniel Rinaldo 1. Plantas medicinais. 2. Controle de qualidade. 3. Espectrometria de massa. 4. Química verde. 5. Beta-ciclodextrina. I. Título. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: Abordagem multidisciplinar e multicomponente aplicada à caracterização e desenvolvimento de fitopreparados de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa AUTORA: ANA CAROLINE ZANATTA SILVA ORIENTADOR: WAGNER VILEGAS COORIENTADOR: DANIEL RINALDO Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em QUÍMICA, pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. WAGNER VILEGAS (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Biológicas e Ambientais / Instituto de Biociências - UNESP - São Vicente Profa. Dra. CLAUDIA MARIA FURLAN (Participaçao Virtual) Departamento de Botânica / Instituto de Biociências - USP São Paulo Prof. Dr. JOÃO HENRIQUE GHILARDI LAGO (Participaçao Virtual) Centro de Ciências Naturais e Humanas / Universidade Federal do ABC Prof.ª Dr.ª ISABELE RODRIGUES NASCIMENTO (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquímica e Química Orgânica / Instituto de Química - UNESP - Araraquara Prof. Dr. ÁDLEY ANTONINI NEVES DE LIMA (Participaçao Virtual) Departamento de Farmácia / Centro De Ciências da Saúde - UFRN - Natal Araraquara, 17 de setembro de 2021 Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/quimica-2/CNPJ: 48.031.918/0027-63. http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/quimica-2/CNPJ Dados curriculares IDENTIFICAÇÃO Nome: Ana Caroline Zanatta Silva Nome em citações bibliográficas: Silva, A. C. Z.; SILVA, ANA C.Z.; Zanatta, A. C; Zanatta, Ana C.; Zanatta, Ana Caroline; ZANATTA, A. C. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 08/2016 – 08/2021 Doutorado em Química Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, SP, Brasil Título da tese: “Abordagem multidisciplinar e multicomponente aplicada à caracterização e desenvolvimento de fitopreparados de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa” Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Co-orientador: Prof. Dr. Daniel Rinaldo Bolsas: período 08/2016 – 09/2016: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); período 10/2016 – 11/2017: Conselho Nacional de Conhecimento Científico e Tecnológico (CNPq); período 12/2017 – 06/2021: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), No. do processo: 2016/21044-4. 03/2014 – 06/2016 Mestrado em Química Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, SP, Brasil Titulo da dissertação: “Padronização dos extratos polares das partes aéreas de Actinocephalus divaricatus (Körn.) Sano (Eriocaulaceae)”. Orientadora: Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos. Bolsas: período 03/2014 – 05/2014: Conselho Nacional de Conhecimento Científico e Tecnológico (CNPq); período 06/2014 – 06/2016: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), No. do processo: 2014/04593-9. 03/2009 – 12/2013 Dupla Licenciatura em Química Dupla titulação entre a Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, SP, Brasil e Universidade de Coimbra (UC), Coimbra, Portugal Bolsa no exterior: período 09/2010 – 07/2012: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Licenciaturas Internacionais (PLI). Prêmio: 3% dos Melhores Estudantes no ano letivo 2011/2012, Universidade de Coimbra. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 01/2020 – 10/2020 Estágio no exterior University of Strathclyde, Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences (SIPBS), Glasgow, Reino Unido Título do projeto: “Metabolomic study of Brazilian plants used in the treatment of chronic diseases”. Orientadora: Profª. Drª. RuAngelie Edrada-Ebel. Bolsa: FAPESP – Bolsa de Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE), No. do processo: 2019/18673-8. 02/2017 – 07/2017 Estágio de docência Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências - Câmpus do Litoral Paulista, São Vicente, SP, Brasil Curso de Graduação em: Ciências Biológicas – Bacharelado. Nome da Disciplina: Química. Carga Horária Total: 60 horas. Professor Responsável pela Disciplina: Prof. Ari José Scattone Ferreira. 04/2015 – 07/2015 Estágio no exterior Università degli Studi di Salerno (UniSa), Departamento de Farmácia (DIFARMA), Fisciano, Itália Titulo do projeto: “Metabolite fingerprinting of aerial parts of Actinocephalus divaricatus (Koern.) Sano (Eriocaulaceae) by LC-ESI- MS”. Orientadora: Profª. Drª. Sonia Piacente. Bolsista: FAPESP – Bolsa de Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE), No. do processo: 2015/00809-0. 04/2013 – 12/2013 Iniciação científica Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, SP, Brasil Título do projeto: “Estudo dos extratos de Actinocephalus divaricatus (Koern.) Sano (Eriocaulaceae) pelo HPLC-PDA” Orientadora: Profª. Drª. Lourdes Campaner dos Santos. Bolsa: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), No. do processo: 2013/01227-9. 02/2012 – 07/2012 Estágio Laboratorial Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal Título do projeto: “Caracterização estrutural de anti-inflamatórios não- esteróides por espectroscopia de infravermelho”. Título monografia: “Análise estrutural e pesquisa de co-cristais de 1,1’- Bi-2-naftol com compostos de interesse farmacêutico”. Orientador: Prof. Dr. Mário Túlio dos Santos Rosado. 03/2009 – 07/2010 Iniciação científica Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, SP, Brasil Título do projeto: “Uso sustentável da biodiversidade brasileira – prospecção químico-farmacológica em plantas superiores: Pouteria ssp. (Sapotaceae)”. Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas. Bolsa: período 08/2009 – 07/2010: Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica – PIBIC/CNPq. 2007 – 2008 Técnico em Química Escola Municipal Adelino Bordignon, Matão, SP, Brasil Prêmio: Melhor aluno do curso de Técnico em Química em 2007-2008, Conselho Regional de Química - IV Região. Estágio em Instituto de Química - UNESP Araraquara: período 10/2007 – 12/2008: Título do projeto: “Uso sustentável da biodiversidade brasileira – prospecção químico-farmacológica em plantas superiores: Pouteria ssp. (Sapotaceae)”. Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas. ATUAÇÃO PROFISSIONAL 02/2019 – 07/2019 Atividade de docência Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, Brasil Participou do Programa de Aperfeiçoamento e Apoio à Docência no Ensino Superior – PAADES. Curso de Graduação em: Licenciatura em Química. Nome da Disciplina: Química Orgânica II (curso teórico). Carga Horária Total: 60 horas. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos 1. ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; EDRADA-EBEL, R. UHPLC-(ESI)-HRMS and NMR- based metabolomics approach to access the seasonality of Byrsonima intermedia and Serjania marginata from Brazilian Cerrado flora diversity. Frontiers in Chemistry, v. 9, p. 534, 2021. 2. ALMEIDA, A. A.; LIMA, G. D.; EITERER, M.; RODRIGUES, L. A.; DO VALE, J. A.; ZANATTA, A. C.; BRESSAN, G. C.; DE OLIVEIRA, L. L.; LEITE, J. P. A Withanolide-rich Fraction of Athenaea velutina Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest in Melanoma B16F10 Cells. Planta Medica, 2021. 3. DANTAS-MEDEIROS, R.; ZANATTA, A. C.; DE SOUZA, L. B. F. C.; FERNANDES, J. M.; AMORIM-CARMO, B.; TORRES-RÊGO, M.; FERNANDES-PEDROSA, M. F.; VILEGAS, W.; ARAÚJO, T. A. S.; MICHEL, S.; GROUGNET, R.; CHAVES, G. M.; ZUCOLOTTO, S. M. Antifungal and Antibiofilm Activities of B-Type Oligomeric Procyanidins From Commiphora leptophloeos Used Alone or in Combination With Fluconazole Against Candida spp. Frontiers in microbiology, v. 12, p. 613155, 2021. 4. BORGES, M. S.; ZANATTA, A. C.; SOUZA, O. A.; PELISSARI, J. H.; CAMARGO, J. G.; CARNEIRO, R. L.; FUNARI, C. S.; BOLZANI, V. S.; RINALDO, D. A green and sustainable method for monitoring the chemical composition of soybean: an alternative for quality control. Phytochemical Analysis, p. pca.3006, 2020. 5. DANTAS-MEDEIROS, R.; FURTADO, A. A.; ZANATTA, A. C.; TORRES-RÊGO, M.; LOURENÇO, E. M. G.; ALVES, J. S. F.; GALINARI, H. A. O. R.; GUERRA, B. G. C.; VILEGAS, W.; ARAÚJO, A. S.; FERNADES-PEDROSA, M. F; ZUCOLOTTO, S. M. Mass spectrometry characterization of Commiphora leptophloeos leaf extract and preclinical evaluation of toxicity and anti-inflammatory potential effect. Journal of Ethnopharmacology, v. 264, p. 113229, 2021. 6. VALERINO-DÍAZ, A. B.; ZANATTA, A. C.; GAMIOTEA-TURRO, D.; CANDIDO, A. C. B. B.; MAGALHÃES, L. G.; VILEGAS, W.; DOS SANTOS, L. C. An enquiry into antileishmanial activity and quantitative analysis of polyhydroxylated steroidal saponins from Solanum paniculatum L. leaves. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 191, p. 113635, 2020. 7. SALLES, T. H. C.; VOLPE-ZANUTTO, F.; DE OLIVEIRA SOUSA, I. M.; MACHADO, D.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; LANCELLOTTI, M; FOGLIO, M. A.; D’ÁVILA, M. A. Electrospun PCL-based nanofibers Arrabidaea chica Verlot – Pterodon pubescens Benth loaded: synergic effect in fibroblast formation. Biomedical Materials, v. 15, n. 6, p. 065001, 2020. 8. DEL ROSARIO, X. T.; CASAO, L.; PINHEIRO, C. G.; SARANDY, M.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; DIAS NOVAES, R.; GONÇALVES, R.V.; LEITE, J. P. V. Croton urucurana Baillon stem bark ointment accelerates the closure of cutaneous wounds in knockout IL-10 mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 261, p. 113042, 2020. 9. ALMEIDA, A. A.; LIMA, G. D.; SIMÃO, M. V.; MOREIRA, G. A.; SIQUEIRA, R. P.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; MACHADO-NEVES, M.; BRESSAN, G. C.; LEITE, J. P. Screening of plants from the Brazilian Atlantic Forest led to the identification of Athenaea velutina (Solanaceae) as a novel source of antimetastatic agents. International Journal of Experimental Pathology, v. 101, n. 3-4, p. 106-121, 2020. 10. OHARA, R.; PÉRICO, L. L.; RODRIGUES, V. P.; BUENO, G.; ZANATTA, A. C.; DOS SANTOS, L. C.; VILEGAS, W.; CONSTATINO, F. B.; JUSTULIN, L. A.; HIRUMA-LIMA, C. A. Terminalia catappa L. infusion accelerates the healing process of gastric ischemia- reperfusion injury in rats. Journal of ethnopharmacology, v. 256, p. 112793, 2020. 11. DE ALMEIDA, G. V. B.; ARUNACHALAM, K.; BALOGUN, S. O.; PAVAN, E.; ASCÊNCIO, S. D.; SOARES, I. M.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; MACHO, A.; MARTINS, D. T. O. Chemical characterization and evaluation of gastric antiulcer properties of the hydroethanolic extract of the stem bark of Virola elongata (Benth.) Warb. Journal of Ethnopharmacology, v. 231, p. 113-124, 2019. 12. DOS SANTOS, R. D. C.; BONAMIN, F.; PÉRICO, L. L.; RODRIGUES, V. P.; ZANATTA, A. C.; RODRIGUES, C. M.; SANNOMIYA M.; RAMOS, M. A. S.; BONIFÁCIO, B. V.; BAUAB, T. M.; TAMASHIRO, J.; ROCHA, L. R. M.; VILEGAS, W.; HIRUMA-LIMA, C. A. Byrsonima intermedia A. Juss partitions promote gastroprotection against peptic ulcers and improve healing through antioxidant and anti-inflammatory activities. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 111, p. 1112-1123, 2019. 13. BENTO, C.C.; TANGERINA, M. M. P.; ZANATTA, A. C.; SARTORI, Â. L. B.; FRANCO, D. M.; HIRUMA-LIMA, C. A.; VILEGAS, W.; DE ALMEIDA, L. F. R.; SANNOMIYA M. Chemical constituents and allelopathic activity of Machaerium eriocarpum Benth. Natural product research, p. 1-5, 2018. 14. VALERINO-DÍAZ, A. B.; GAMIOTEA-TURRO, D.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; GOMES MARTINS, C. H.; DE SOUZA SILVA, T.; RASTRELLI, L.; SANTOS, L. C. New polyhydroxylated steroidal saponins from Solanum paniculatum L. leaf alcohol tincture with antibacterial activity against oral pathogens. Journal of Agricultural and Food chemistry, v. 66, n. 33, p. 8703-8713, 2018. 15. SOARES, A. M. S.; OLIVEIRA, J. T. A.; ROCHA, C. Q.; FERREIRA, A. T. S.; PERALES, J.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; SILVA, C. R.; COSTA-JÚNIOR, L. M. Myracrodruon urundeuva seed exudates proteome and anthelmintic activity against Haemonchus contortus. PLoS ONE, v. 13, n. 17, p. 1-12, 2018. 16. ZANATTA, A. C.; MARI, A.; MASULLO, M.; CARLOS, I. Z.; VILEGAS, W. PIACENTE, S.; SANTOS, L. C. Chemical metabolome assay by high-resolution Orbitrap mass spectrometry and assessment of associated antitumoral activity of Actinocephalus divaricatus. Rapid Communications in Mass Spectrometry, v. 32, n. 3, p. 241-250, 2018. 17. COSTA, D. L. M. G.; RINALDO, D.; VARANDA, E. A.; SOUSA, J. F.; NASSER, A. L. M.; SILVA, A. C. Z.; BALDOQUI, D. C.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C. Flavonoid detection in hydroethanolic extract of Pouteria torta (Sapotaceae) leaves by HPLC-DAD and the determination of its mutagenic activity. Journal of Medicinal Food, v. 17, n. 10, p. 1103-12, 2014. Apresentação de trabalho e/ou palestra • Apresentação de trabalho (comunicação oral) 1. ZANATTA, A. C. Molecular Networking as a Tool in Plant Extract Analysis. In: Universidad de la Habana, Havana, Cuba, 2019 (Palestra). 2. SILVA, A. C. Estudo fitoquímico do extrato metanólico das folhas e avaliação da atividade antioxidante das partes aéreas de Actinocephalus divaricatus (Eriocaulaceae). In: 54º Congresso Brasileiro de Química, Natal - RN, 2014. • Apresentação de trabalho (pôster) 1. ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; EDRADA-EBEL, R. UHPLC-DAD-(ESI)-HRMS and NMR-based metabolomics approach to access the seasonality of Terminalia catappa L. from Brazilian biodiversity. In: 16th Annual Conference of the Metabolomics Society, Metabolomics 2020 Online, Online, 2020. 2. ZANATTA, A. C.; VIEIRA, N. C.; VILEGAS, W. Molecular networking based-analysis and assessment of total flavonoid content of Byrsonima intermedia. In: XXVIII Congress of the Italo-Latinamerican of Ethnomedicine (SILAE), Havana, Cuba, 2019. 3. COSTA, G. M.; LAVEZZO, G. A.; ZANATTA, A. C.; DOS SANTOS, L. C.; VILEGAS, W. Evaluation of the effect of the solvent on the determination of punicalagin in T. catappa leaves using mixtures design. In: 7th Brazilian Conference on Natural Product e XXXIII RESEM, Rio de Janeiro, Brasil, 2019. 4. LAVEZZO, G. A.; COSTA, G. M.; ZANATTA, A. C.; DOS SANTOS, L. C.; VILEGAS, W. Development of green method extraction of leaves of Serjania marginata Casar. using mixture design. In: 7th Brazilian Conference on Natural Product e XXXIII RESEM, Rio de Janeiro, Brasil, 2019. 5. ZANATTA, A. C.; RUSSO, H. M.; MEDEIROS, R. D.; RINALDO, D.; VILEGAS, W. Perfil químico e screening de atividades biológicas para os extratos de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa. In: XII Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVII Simpósio Latino Americano de Farmacobotânica, Petrópolis, Brazil, 2019. 6. BASTOS, R. G.; SALLES, B. C. C.; OLIVEIRA, C. M.; MICHELONI, A. L. C.; SILVA, P. H. C.; SOBRAL, M. E. G.; ROCHA, C. Q.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W.; PAULA, F. B. A.; SILVA, G. A.; SILVA, M. A. Extrato de Eugenia sonderiana (Myrtaceae): Fitoquímica e efeitos sobre o estresse oxidativo in vivo em ratos Wistar diabéticos. In: XII Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVII Simpósio Latino Americano de Farmacobotânica, Petrópolis, Brasil, 2019. 7. BORGES, M. S.; ZANATTA, A. C.; CARNEIRO, R. L.; FUNARI, C. S.; RINALDO, D. Novo método de análise de soja por HPLC: uma alternativa de baixo custo e baixo impacto ambiental. In: XII Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVII Simpósio Latino Americano de Farmacobotânica, Petrópolis, Brasil, 2019. 7. BRITTO, I. O.; PINHEIRO, C. G.; ALMEIDA, A. A; GONÇALVES, R. G.; SOUZA, M. M. S.; VILEGAS, W.; ZANATTA, A. C; ALVARENGA, A. P.; LEITE, J. P. V. Caracterização química por LC/MS e atividade antioxidante in vivo de extratos etanólicos de casca e látex de Croton urucurana Baillon. In: XII Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVII Simpósio Latino Americano de Farmacobotânica, Petrópolis, Brazil, 2019. 5. SILVA, M. A.; SILVA, G. A.; PAULA, F. B. A.; BASTOS, R. G.; SALLES, B. C. C.; OLIVEIRA, C. M; SANTOS, L. L.; BINI, I. F.; CASTALDINI, L. P.; SILVA, L. C. D.; VILELA, A. A.; SILVA, G. M.; SOBRAL, M. E. G.; ROCHA, C. Q.; ZANATTA, A. C.; VILEGAS, W. Estudo de Eugenia florida (Myrtaceae) sobre os parâmetros bioquímicos em ratos diabéticos crônicos. In: XII Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVII Simpósio Latino Americano de Farmacobotânica, Petrópolis, Brazil, 2019. 7. ZANATTA, A. C.; BORGES, M. S.; RINALDO, D.; VILEGAS, W. HPLC-PDA green chromatographic method for the standardization of Serjania marginata extracts. In: XXVII Congress of the Italo-Latinamerican of Ethnomedicine (SILAE), Milazzo, Itália, 2018. 8. FIGUEIREDO, B.; ZANATTA, A. C.; PRATA, L. N.; VILEGAS, W. Perfil químico do extrato das folhas de Serjania marginata. In: XXV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, São Paulo, Brazil, 2018. 9. SANNOMYIA, M.; TINO, R. A.; TANGERINA, M. M. P.; SILVA, A. C. Z.; SARTORI, A. L. B.; SANTOS, L. C.; ALMEIDA, L. F. R.; VILEGAS, W. Chemical and alellopatic effects of Machaerium extracts. In: 46th World Chemistry Congress, 40ª Reunião Anual da Socieda Brasileira de Química and IUPAC 49th Genereal Assembly, São Paulo, Brazil, 2017. 10. SILVA, A. C. Z.; SANTOS, L. C. Quantificação de flavonoides das partes aéreas de Actinocephalus divaricatus por HPLC-PAD. In: XI Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVI Simpósio Latino Americano de Farmacobotânica, Curitiba, Brazil, 2017. 11. MARCONDES, T. H.; TURRO, D. G.; SILVA, A. C. Z.; SANTOS, L. C. Avaliação do potencial antirradicalar e determinação do teor de flavonoides totais das frações acetato de etila e n-butanol das folhas de Jatropha aethiopica (Euphorbiaceae) coletadas em Havana, Cuba. In: VI Congresso Farmacêutico da Unesp e II Jornada de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, 2016, Araraquara. Suplemento 1-QM-Química. Araraquara: Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2016. v.37. 12. SOUZA, T. P.; SILVA, A. C. Z.; SANTOS, L. C. Estudo fitoquímico, determinação do teor de fenóis e flavonoides totais e avaliação do potencial antirradicalar da fração acetato de etila das folhas de Actinocephalus divaricatus (Eriocaulaceae) In: VI Congresso Farmacêutico da Unesp e II Jornada de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, 2016, Araraquara. Suplemento 1-QM-Química. Araraquara: Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2016. v.37. 13. AMORIM, M. R.; BOTERO, W. B.; SILVA, A. C. Z.; ARAUJO, A. R.; CARLOS, I. Z.; SANTOS, L. C. Cytotoxic activities of endophytic fungi extracts from Paepalanthus planifolius: A Brazilian evergreen. In: 9th Joint Natural Products Conference, Copenhagen, Denmark, 2016. 14. SILVA, A. C. Z.; SANTOS, L. C. Metabolite profiling of the aerial parts of Actinocephalus divaricatus (Koern.) Sano (Eriocaulaceae) by LC-ESI-MS. In: 5th Natural Products and the XXX Meeting on Micromolecular, Evolution, Brazilian Conference on Systematic and Ecology (RESEM), Atibaia, Brazil, 2015. 15. WYREPKOWSKI, C. C.; SINHORIN, A. P.; SILVA, A. C. Z.; COSTA, D. L. G.; SANTOS, L. C. Avaliação da atividade antiradicalar, fenóis e flavonoides totais das cascas do caule de Caesalpinia férrea. In: 54º Congresso Brasileiro de Química, Natal, Brazil, 2014. 16. COSTA, D. L. G.; RINALDO, D.; NASSER, A. L. M.; SILVA, A. C. Z.; BALDOQUI, D. C.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C. Quantification of flavonoids from the leaves of Pouteria torta (Sapotaceae) by HPLC-PAD. In: 4th Natural Products and the XXX Meeting on Micromolecular, Evolution, Brazilian Conference on Systematic and Ecology (RESEM), Natal, Brazil, 2013. 17. SILVA, A. C. Z.; LIMA NETO, J. S.; COSTA, D. L. G.; SANO, P. T.; SANTOS, L. C. Scale up from analytical HPLC to preparative MPLC for the separation of flavonoid from Actinocephalus divaricatus leaves. In: 4th Natural Products and the XXX Meeting on Micromolecular, Evolution, Brazilian Conference on Systematic and Ecology (RESEM), Natal, Brazil, 2013. 18. SILVA, A. C. Z.; LIMA NETO, J. S.; SANTOS, L. C. Scale-up de HPLC analítico para MPLC preparativo para a separação de flavonoide das folhas de Actinocephalus divaricatus (Eriocaulaceae). In: XXV CIC - Congresso de Iniciação Científica da UNESP e I Fórum Internacional de Iniciação Científica da UNESP, Barra Bonita, Brazil, 2013. 19. SILVA, A. C. Z.; RODRIGUES, C. M.; VILEGAS, W. Isolamento e identificação de flavonoides de espécies do gênero Byrsonima (Malpighiaceae) por HPLC-PAD. In: 57ª Jornada Farmacêutica da Unesp, Araraquara, Brazil, 2010. 20. NASSER, A. L. M.; SILVA, A. C. Z.; TOZZO, J. G.; SANTOS, R. C.; HIRUMA-LIMA, C. A.; Tamashiro, J. Y.; Vilegas, W. Phenolic compounds obtained by HSCCC from Pouteria torta leaves and their antioxidant activity In: 7th International Congress of Phamaceutical Sciences (CIFARP 2009), Ribeirão Preto, Brazil, 2009. 21. SILVA, A. C. Z.; VILEGAS, W.; RODRIGUES, C. M. Predição estrutural de flavonóides baseada em dados de HPLC-PAD. In: 17º Encontro Regional da SBQ - Regional IPWS, Araraquara, Brazil, 2009. 22. SILVA, A. C. Z.; BORGES, M. S.; NASSER, A. L. M.; VILEGAS, W. Isolamento e identificação de flavonóides em Pouteria torta. In: XXI Congresso de Iniciação Científica, São José do Rio Preto, Brazil, 2009. 23. SILVA, A. C. Z.; VILEGAS, W.; NASSER, A. L. M.; SILVA, M. A. Estudo fitoquímico de Pouteria torta utilizando cromatografia em contra correntede alta velocidade. In: XXXVIII Semana da Química, Araraquara, Brazil, 2008. PARTICIPAÇÃO EM BANCAS Curso de aperfeiçoamento/especialização 1. SILVA, A. C. Z., AMARAL, F. P., SEVERI, J. A. Participação em banca de Émerson Gálio. Análise de Tintas, (Técnico em Química) E.M. Adelino Bordignon, Matão – SP, 2009. 2. SILVA, A. C. Z., AMARAL, F. P., SEVERI, J. A. Participação em banca de Genildo Sirineu Tomé. Extração de metabólitos, (Técnico em Química) E.M. Adelino Bordignon, Matão – SP, 2009. 3. SILVA, A. C. Z., AMARAL, F. P., SEVERI, J. A. Participação em banca de Matheus dos Santos Alves. Tintas Emulsionadas, (Técnico em Química) E.M. Adelino Bordignon, Matão – SP, 2009. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS 1. 16th Annual Conference of the Metabolomics Society – Metabolomics 2020 Online, Online, 27 a 29 de outubro de 2020. (Conferência) 2. VII Workshop Etnofarmacologia: Desafios fundamentais, Cuiabá-MT, Brasil, 18 a 29 de novembro de 2019. Curso “Utilização da Plataforma Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)”, proferido pelo Dr. Andres Mauricio Caraballo Rodriguez (University of California San Diego), carga horária 32 horas. (Workshop; Curso de curta duração) 3. XXVIII Congreso Internacional de la Sociedad Italo-Latinoamericana de Etnomedicina, Havana, Cuba, 16 a 20 de setembro de 2019. (Congresso) 4. 12° Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e 17° Simpósio Latinoamericano de Farmacobotânica, Petrópolis-RJ, Brasil, 07 a 10 de maio de 2019. (Simpósio) 5. Workshop Bioenergia e Quimiometria, Araraquara-SP, Brasil, 18 a 20 de fevereiro de 2019. Disciplina “Calibração multivariada de segunda ordem”, proferida pelo Prof. Dr. Alejandro Olivieri (Universidad Nacional de Rosario), carga horária 30 horas. (Workshop; Curso de curta duração) 6. 27th Congress of the Italo-Latinamerican Asian & African Society Of Ethnomedicine (SILAE), Milazzo, Sicília, Itália, 09 a 13 de setembro de 2018. (Congresso) 7. XI Simpósio Brasileiro de Farmacognosia e XVI Simpósio Latino-americano de Farmacobotânica, Curitiba-PR, Brasil, 09 a 11 de agosto de 2017. (Simpósio) 8. 5th Natural Products and the XXX Meeting on Micromolecular, Evolution, Brazilian Conference on Systematic and Ecology (RESEM), Atibaia-SP, Brasil, 26 a 29 de outubro de 2015. (Congresso) 9. 54º Congresso Brasileiro de Química, Natal-RN, Brasil, 03 a 07 de novembro de 2014. (Congresso) 10. 4th Natural Products and the XXX Meeting on Micromolecular, Evolution, Brazilian Conference on Systematic and Ecology (RESEM), Natal-RN, Brasil, 28 a 31 de outubro de 2013. (Congresso) 11. XXV CIC - Congresso de Iniciação Científica da UNESP e I Fórum Internacional de Iniciação Científica da UNESP, Barra Bonita-SP, Brasil, 10 a 12 de novembro de 2013. (Congresso) 12. X Evento de Educação em Química - A Química como Ferramenta Interdisciplinar, Araraquara-SP, Brasil, 29 a 31 de agosto de 2012. (Outra) 13. 3rd Portuguese Young Chemists Meeting, Porto, Portugal, 09 a 11 de maio de 2012. (Encontro) 14. III Congresso de Investigação Criminal - Novas Perspectivas e Desafios, Figueira da Foz, Portugal, 29 e 30 de março de 2012. (Congresso) 15. 57ª Jornada Farmacêutica da Unesp, Araraquara-SP, Brasil, 21 a 27 de agosto de 2010. (Outra) 16. XV Encontro Nacional de Ensino de Química, Brasília-DF, Brasil, 21 a 24 de julho de 2010. (Encontro) 17. XXI Congresso de Iniciação Científica, São José do Rio Preto-SP, 03 a 07 de novembro de 2009. (Congresso) 18. 17º Encontro Regional da SBQ - Regional IPWS, Araraquara-SP, Brasil, 18 a 20 de outubro de 2009. (Encontro) 19. XXXIX Semana da Química, Araraquara-SP, Brasil, 18 a 23 de outubro de 2009. (Outra) 20. VII Evento de Educação em Química - Materiais Didáticos: Suas Aplicações, Araraquara-SP, Brasil, 27 a 30 de agosto de 2009. (Outra) 21. XXXVIII Semana da Química, Araraquara-SP, Brasil, 05 a 10 de outubro de 2008. (Outra) 22. VI Simpósio e VI Reunião de Avaliação do Programa Biota/Fapesp, Araraquara-SP, Brasil, 08 a 12 de julho de 2008. (Simpósio) ORGANIZAÇÃO DE EVENTO 1. SILVA, A. C. Z. et al. VIII Evento de Educação em Química - Os Instrumentos de Avaliação no Ensino de Química, Araraquara – SP, 2010. 2. SILVA, A. C. Z. et al. XXXIX Semana da Química, Araraquara – SP, 2009. SUPERVISÃO CIENTÍFICA Iniciação científica Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, SP, Brasil Título do projeto: Estudo das frações polares de Actinocephalus divaricatus (Koern.) Sano (Eriocaulaceae) por HPLC-PDA. Aluna: Thais Pezza (Graduanda em Bacharel em Química, Instituto de Química - UNESP Araraquara). Bolsista: PIBIC/CNPq Pró-reitoria; período: agosto/2015 a dezembro/2016. Título do projeto: Desenvolvimento tecnológico do extrato vegetal das folhas de Serjania marginata Casar. (Sapindaceae) Aluna: Gabriela Aparecida Lavezzo (Graduanda em Licenciatura em Química, Instituto de Química - UNESP Araraquara). Bolsista: Não bolsista; período: janeiro/2019 a dezembro/2019. Título do projeto: Estudo fitoquímico do extrato hidroalcóolico das folhas de Serjania marginata Aluna: Gisla Maria Costa (Graduanda em Licenciatura em Química, Instituto de Química - UNESP Araraquara). Bolsista: Não bolsista; período: janeiro/2019 a dezembro/2019. Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, São Vicente, SP, Brasil Título do projeto: Serjania marginata: isolamento de substâncias marcadoras e desenvolvimento de um fitopreparado Aluna: Luciana Nogueira Prata (Graduanda em Biomedicina, Universidade Paulista – UNIP Santos). Bolsista: PIBIC/CNPq; período: agosto/2017 a janeiro/2018. Aluna: Bruna Figueiredo Daniel (Graduanda em Biomedicina, Universidade Paulista – UNIP Santos). Bolsista: PIBIC/CNPq, período: janeiro/2018 a agosto/2018. Dedico este trabalho a todas aquelas pessoas que me apoiaram e encorajaram durante todo o meu caminho até aqui, em especial a meus pais, família, amigos e aos professores Wagner e Lourdes. Agradecimentos À UNESP e ao Instituto de Química (UNESP Araraquara) e ao Instituto de Biociências (UNESP São Vicente) pela oportunidade de realizar o meu Doutorado. Ao meu orientador Prof. Dr. Wagner Vilegas, pela oportunidade, confiança e ensinamentos durante todos esses anos. Muito obrigada por me inspirar e me mostrar a beleza dos produtos naturais! Ao meu co-orientador Prof. Dr. Daniel Rinaldo por toda a ajuda e ensinamento durante a realização deste trabalho. À minha orientadora de coração Profa. Dra. Lourdes Campaner dos Santos pela amizade, confiança, por acreditar sempre em mim e por me incentivar sempre. Ao Jardim Botânico Municipal de Bauru pela autorização concedida para a realização das coletas de Byrsonima intermedia e à Dra. Viviane Camila de Oliveira por todo auxílio e identificação botânica. À Maiara Borges por ter me ajudado nas coletas no Jardim Botânico e nas análises de quimiometria e à Natália Vieira por toda a ajuda nas análises de espectrometria de massas; agradeço a vocês principalmente pela amizade e por todo apoio e incentivo em todos os momentos. À Silvia Heredia Vieira por toda ajuda nas coletas da espécie Serjania marginata e a Profa. Dra. Maria José do Carmo pela identificação botânica. À Carol Costa por ter me ajudado nas coletas na orla de Santos, por toda troca de conhecimento, por ter me ensinado tanto sobre a Biologia e principalmente por todo seu apoio, incentivo e sua incrível amizade. À Camila Cunha pela sua amizade e por ter sido extremamente solicita sempre que precisei. Aos meus amigos do grupo de pesquisa do Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais – LBPN (UNESP São Vicente). Agradeço em especial ao Douglas e ao Marcelo pelo acolhimento, pela colaboração, pela amizade, pelas risadas e pelas trocas de conhecimento. À pesquisadora Cris Hardoim pela amizade, conselhos, convivência e colaboração. Às meninas Bruna, Gabriela, Gisla e Luciana pelo trabalho de iniciação científica. Aos amigos do Departamento de Orgânica (UNESP Araraquara) pela amizade e convivência, em especial ao Weslei, Alexander, Daylin, Tony, Maria, Isabela, Tiago, Rafael, Marcus e Helena pelo companheirismo e ajuda. Ao meu grande amigo Renato Dantas, pela constante colaboração e por sempre me ajudar em todos os momentos. Ao grupo da University of Strathclyde, Dana, Flore, Ignacio, Katharina e Saif pela amizade, acolhida e convivência. À Profa. Dra. RuAngelie Edrada-Ebel pela oportunidade, por ter me recebido em seu grupo de uma maneira tão acolhedora e pela sua gentileza em compartilhar seus conhecimentos. Aos amigos, professores e funcionários do Departamento de Química Orgânica, em especial ao Professor Ian Castro-Gamboa por ter me recebido tão gentilmente em seu grupo de pesquisa. Ao Dr. Nivaldo Boralle, pela amizade e pelas análises de RMN. Às funcionárias da biblioteca e da pós-graduação pela dedicação, competência e por serem sempre tão prestativas. Aos funcionários do Instituto de Química da UNESP de Araraquara e do Instituto de Biociências da UNESP de São Vicente que contribuíram direta ou indiretamente com esse trabalho. Em especial à Zilá (UNESP São Vicente) pela sua amizade, caronas e por ter sempre me socorrido nas prestações de contas. Ao Prof. Dr. Adley Lima e ao aluno de Doutorado Renato Dantas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN Natal) pela colaboração no desenvolvimento da pré-formulação dos extratos com as ciclodextrinas. Ao Prof. Dr. Flavio Junior Caires (Faculdade de Ciências – UNESP Bauru) e ao aluno Bruno Ekawa (Instituto de Química – UNESP Araraquara) pela colaboração nas análises de caracterização dos sistemas complexos. À CAPES e ao CNPq através dos financiamentos de pesquisa. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelas bolsas concedidas no país, processo nº 2016/21044-4 e no exterior (BEPE) processo nº 2019/18673-8. “Não tenha medo de pensar diferente dos outros, tenha medo de pensar igual e descobrir que todos estão errados!” (Eça de Queiroz) RESUMO Este trabalho descreve o estudo dos extratos das plantas medicinais Byrsonima intermedia A. Juss. (Malpighiaceae), Serjania marginata Casar. (Sapindaceae) e Terminalia catappa L. (Combretaceae) a fim de permitir o desenvolvimento e caracterização de fitopreparações que possam ser utilizadas no tratamento de doenças crônicas. Para isso, foi fundamental aprofundar o conhecimento da composição química, avaliar a sazonalidade, aperfeiçoar os métodos analíticos para o controle de qualidade da matéria-prima vegetal e desenvolver complexos de inclusão para a incorporação dos extratos. No estudo da sazonalidade, os extratos foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HLPC) acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-ESI-MS/MS). As amostras foram coletadas bimestralmente durante os períodos do verão, outono, inverno e primavera. Os dados de HPLC-MS/MS foram analisados na plataforma GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking), que permitiu a anotação de 39 substâncias nos extratos de B. intermedia, 38 substâncias nos extratos de S. marginata e 42 substâncias nos extratos de T. catappa. Os agrupamentos das amostras nas redes moleculares mostraram que os fatores sazonais desempenharam um papel importante na produção de metabólitos em cada espécie vegetal, sendo as condições de temperatura, seca e radiação solar os principais fatores que afetaram a variabilidade das substâncias em cada espécie. O conteúdo de flavonoides totais, capacidade antioxidante e antiglicante também foram determinados para ajudar a estudar a variabilidade química sazonal dessas espécies. A fim de contribuir para a sustentabilidade ambiental, para a padronização do extrato de S. marginata foi desenvolvido um método cromatográfico verde por HPLC-PDA utilizando apenas etanol e água como solventes, seguindo um planejamento fatorial fracionário na triagem das variáveis e aplicando a matriz de Doehlert foi utilizada no procedimento de otimização. O método verde desenvolvido foi comparado com o método da literatura, e o desempenho cromatográfico e o impacto ambiental de ambos foram avaliados por meio de métricas, como GCFR (Green Chromatographic Fingerprinting Response), HPLC-EAT (EAT - Environmental Assesment Tool) e AGREE (Analytical GREEnness metric). O método foi validado através da avaliação dos parâmetros de seletividade, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão e robustez. A padronização do extrato foi realizada pela quantificação do ácido protocatecuico e derivados de (+)- catequina, (-)-epicatequina e apigenina. O método desenvolvido foi preciso e robusto e combinado com os princípios que regem a Química Verde foi considerado ambientalmente amigável. Finalmente, para conferir melhorias nas propriedades químicas e biológicas dos ingredientes ativos dos extratos, investigamos a complexação de cada um deles com β-cyclodextrina por mistura física e malaxagem. A caracterização dessas amostras por espectroscopia na região do infravermelho, análise térmica, difração de raios X, microscopia eletrônica de varredura e ressonância magnética nuclear, permitiu propor a complexação parcial dos metabólitos dos extratos na cavidade da β-cyclodextrina. Assim, este estudo traz novas informações sobre o potencial dos extratos de B. intermedia, S. marginata e T. catappa contribuindo para aperfeiçoar o controle químico de qualidade do material vegetal, para aumentar seu potencial de aplicação como um futuro fitoterápico e colaborando para a implementação de marchas analíticas ambientalmente mais amigáveis. Palavras-chave: Byrsonima intermedia; Serjania marginata; Terminalia catappa; metabolômica; química verde; complexos de inclusão. ABSTRACT This work describes the study of the extracts of the medicinal plants Byrsonima intermedia A. Juss. (Malpighiaceae), Serjania marginata Casar. (Sapindaceae) and Terminalia catappa L. (Combretaceae) in order to allow the development and characterization of phytopreparations that can be used in the treatment of chronic diseases. For this, it was fundamental to deepen the knowledge of the chemical composition, to evaluate the seasonality, to improve the analytical methods for the quality control of the vegetal raw material and to develop inclusion complexes for the incorporation of the extracts. In the seasonality study, the extracts were analyzed by high-performance liquid chromatography (HLPC) coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The samples were collected bimonthly during the summer, autumn, winter and spring periods. The HPLC-MS/MS data were analyzed in the GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) platform, which allowed the annotation of 39 compounds in B. intermedia extracts, 38 compounds in S. marginata extracts and 42 compounds in T. catappa extracts. The clustering of the samples in the molecular networks showed that seasonal factors played an important role in the production of metabolites in each plant species, with temperature, drought and solar radiation conditions being the main factors that affected the variability of substances in each species. The content of total flavonoids, antioxidant and antiglycant capacity were also determined to help study the seasonal chemical variability of these species. In order to contribute to environmental sustainability, for the standardization of S. marginata extract, a green chromatographic method by HPLC-PDA was developed using only ethanol and water as solvents, following a fractional factorial planning in the screening of variables and applying Doehlert matrix was used in the optimization procedure. The developed green method was compared with the literature method, and the chromatographic performance and environmental impact of both were evaluated using metrics, such as GCFR (Green Chromatographic Fingerprinting Response), HPLC-EAT (EAT - Environmental Assesment Tool) and AGREE (Analytical GREEnness metric). The method was validated through the evaluation of the parameters of selectivity, linearity, detection and quantification limits, precision and robustness. The standardization of the extract was performed by quantification of protocatechuic acid and (+)-catechin, (-)- epicatechin and apigenin derivatives. The developed method was accurate and robust and combined with the principles of Green Chemistry was found to be environmentally friendly. Finally, to confer improvements in the chemical and biological properties of the active ingredients of the extracts, we investigated the complexation of each of them with β-cyclodextrin by physical mixing and malaxation. The characterization of these samples by spectroscopy in the infrared region, thermal analysis, X-ray diffraction, scanning electron microscopy and nuclear magnetic resonance, allowed to propose the partial complexation of the metabolites of the extracts in the cavity of β-cyclodextrin. Thus, this study brings new information about the potential of the extracts of B. intermedia, S. marginata and T. catappa contributing to improve the chemical quality control of the vegetal material, to increase its potential of application as a future phytomedicine and collaborating to the implementation of more environmentally friendly analytical marches. Key words: Byrsonima intermedia; Serjania marginata; Terminalia catappa; metabolomics, green chemistry; inclusion complexes. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Detalhes das espécies de estudo: (A) Byrsonima intermedia; (B) Serjania marginata; (C) Terminalia catappa ............................................................................................................................... 29 Figura 2 - Exemplos de alguns metabólitos encontrados nas espécies Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa ........................................................................................................... 31 Figura 3 - Estrutura química da β-ciclodextrina (BCD) (A) e forma de cone truncado da BCD (B) .... 39 Figura 4 - Cromatogramas do pico base por HPLC-ESI-MS no modo positivo para os extratos de Byrsonima intermedia ........................................................................................................................... 62 Figura 5 - Cromatogramas do pico base por LC-ESI-MS no modo positivo para os extratos de Serjania marginata .............................................................................................................................................. 63 Figura 6 - Cromatogramas do pico base por LC-ESI-MS no modo positivo para os extratos de Terminalia catappa ............................................................................................................................... 63 Figura 7 - Mapa das redes moleculares geradas pelo GNPS para os extratos de Byrsonima intermedia ............................................................................................................................................................... 65 Figura 8 - Representação de parte do cluster para os flavonoides glicosilados em Byrsonima intermedia e espectros de massas MS/MS ............................................................................................ 67 Figura 9 - Representação dos clusters para os flavonoides glicosilados com substituição do grupo galoil em Byrsonima intermedia e espectros de massas MS/MS .......................................................... 68 Figura 10 - Representação dos clusters para as proantocianidinas e os derivados galato em Byrsonima intermedia e espectros de massas MS/MS ............................................................................................ 70 Figura 11 - Representação dos clusters para os ésteres de galato do ácido quínico em Byrsonima intermedia e espectros de massas MS/MS ............................................................................................ 72 Figura 12 - Representação de parte do cluster para os ésteres do ácido galoil e coumaroil em Byrsonima intermedia e espectros de massas MS/MS .......................................................................... 73 Figura 13 - Mapa das redes moleculares geradas pelo GNPS para os extratos de Serjania marginata 77 Figura 14 - Representação do cluster para flavonoides glicosilados em Serjania marginata. (A) flavonas di-C-glicosiladas; (B) flavonóis e flavonas contendo pelo menos um açúcar hexose e (C) flavonóis e flavonas contendo pelo menos um açúcar deoxihexose ..................................................... 78 Figura 15 - Espectros de massas MS/MS representativos do cluster dos flavonoides glicosilados em Serjania marginata. (A) flavonoides di-C-glicosilados (fragmentação cruzada do glicosídeo e eliminação de água); (B) flavonoides contendo pelo menos um açúcar hexose (perdas de 162 Da) e (C) flavonoides contendo pelo menos um açúcar deoxihexose (perdas de 146 Da) ................................... 79 Figura 16 - Mecanismo de fragmentação de perda de molécula de água em flavonoides C-glicosilados e representação do equilíbrio ceto-enólico ............................................................................................ 80 Figura 17 - Ampliação dos espectros de segunda ordem na região de m/z 200-400 para os íons precursores de flavonoides C,O-diglicosilados ..................................................................................... 81 Figura 18 - Representação do cluster para as proantocianidinas em Serjania marginata e espectros de massas MS/MS ...................................................................................................................................... 83 Figura 19 - Representação do cluster para as saponinas em Serjania marginata e espectros de massas MS/MS .................................................................................................................................................. 85 Figura 20 - Mapa das redes moleculares geradas pelo GNPS para os extratos de Terminalia catappa 89 Figura 21 - Representação de parte do cluster para os galotaninos e elagitaninos em Terminalia catappa e espectros de massas MS/MS ................................................................................................. 92 Figura 22 - Representação do cluster para flavonas C-glicosiladas em Terminalia catappa e espectros de massas MS/MS. (A) apigenina-8-C-hexose (B) apigenina-6-C-hexose (C) luteolina-8-C-hexose (D) luteolina-6-C-hexose ............................................................................................................................. 94 Figura 23 - Representação do cluster para flavonas C-glicosiladas e O-galoil flavonas em Terminalia catappa e espectros de massas MS/MS ................................................................................................. 95 Figura 24 - Curva para o padrão quercetina ........................................................................................ 104 Figura 25 - Teores de flavonoides expressos em mg g-1 de quercetina nos extratos de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa ....................................................................... 105 Figura 26 - Capacidade antioxidante (ensaios DPPH˙, ABTS˙+, ROO˙) dos extratos de (A) Byrsonima intermedia, (B) Serjania marginata e (C) Terminalia catappa .......................................................... 107 Figura 27 - Porcentagem de inibição dos extratos de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa na formação de produtos avançados de glicação (AGEs) ................................... 110 Figura 28 - Gráfico de Pareto dos principais efeitos obtidos para o planejamento fracionário (2V 7-2) para (A) número de bandas e (B) GCFR ............................................................................................. 115 Figura 29 - Valores preditos versus valores observados para as respostas (a) e (b) ............................ 119 Figura 30 - Superfície de resposta para o modelo otimizado que representa o número de picos (n) (A) e GCFR (B) em função da vazão (mL min-1), % final de EtOH e tempo de análise (min) .................... 120 Figura 31 - Perfis para os valores previstos e de desejabilidade para as respostas número de bandas cromatográficas (a) e GCFR (b) considerando: (A) o valor D ótimo e (B) os níveis de ajuste especificados pelo usuário para a % final de EtOH (X5) ..................................................................... 123 Figura 32 - Perfil cromatográfico por HPLC-PDA utilizando o método otimizado verde na análise do extrato etanólico 70% das folhas de Serjania marginata. (A) Cromatograma em λ = 270 nm. (B) Espectro de absorção UV: banda 1, ácido fenólico; bandas 2 a 10, derivados de catequina/epicatequina; bandas 11 e 13, derivados de flavonois; bandas 12, 14, 15 a 23, derivados de flavonas; bandas 24 a 28, não identificado .......................................................................................... 125 Figura 33 - Perfil cromatográfico por HPLC-PDA do extrato etanólico 70% das folhas de Serjania marginata. (A) Cromatograma em λ = 270 nm, de acordo com o método de referência desenvolvido por VIEIRA (2014). (B) Espectro de absorção UV: picos 1 a 9, derivados de catequina/epicatequina; 10, derivados de flavonas; estão abaixo do limite de detecção ........................................................... 126 Figura 34 - Gráfico pictograma gráfico da análise pela métrica AGREE para o (A) método verde otimizado e para o (B) método da literatura ........................................................................................ 128 Figura 35 - Espectros no infravermelho para: (A) extrato hidroetanólico das folhas de Byrsonima intermedia (BIEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (BIEH-MF) e MAL (BIEH-MAL); (B) extrato hidroetanólico das folhas de Serjania marginata (SMEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (SMEH-MF) e MAL (SMEH-MAL); (C) extrato etanólico das folhas de Terminalia catappa (TCEE), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (TCEE- MF) e MAL (TCEE-MAL) ................................................................................................................. 141 Figura 36 - Curvas TG-DSC simultâneas para: (A) amostras de Byrsonima intermedia; (B) amostras de Serjania marginata e (C) amostras de Terminalia catappa. (I) extrato, (II) β-ciclodextrina e os complexos obtidos por (III) MF e (IV) MAL ...................................................................................... 143 Figura 37 - Difratogramas de raios X para: (A) extrato hidroetanólico das folhas de Byrsonima intermedia (BIEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (BIEH-MF) e MAL (BIEH-MAL); (B) extrato hidroetanólico das folhas de Serjania marginata (SMEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (SMEH-MF) e MAL (SMEH-MAL); (C) extrato etanólico das folhas de Termianlia catappa (TCEE), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (TCEE- MF) e MAL (TCEE-MAL) ................................................................................................................. 145 Figura 38 - Eletromicrografias das superfícies extrato hidroetanólico das folhas de Byrsonima intermedia (BIEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos entre BIEH e BCD. (A) BIEH (200x); (B) BIEH (1000x); (C) BCD (200x); (D) BCD (1000x); (E) complexo BCD-BIEH por MF (200x); (F) complexo BCD-BIEH por MF (1000x); (G) complexo BCD-BIEH por MAL (200x); (H) complexo BCD-BIEH por MAL (1000x) ............................................................................................................ 147 Figura 39 - Eletromicrografias das superfícies extrato hidroetanólico das folhas de Serjania marginata (SMEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos entre SMEH e BCD. (A) SMEH (200x); (B) SMEH (1000x); (C) BCD (200x); (D) BCD (1000x); (E) complexo BCD-SMEH por MF (200x); (F) complexo BCD-SMEH por MF (1000x); (G) complexo BCD-SMEH por MAL (200x); (H) complexo BCD-SMEH por MAL (1000x) .......................................................................................................... 148 Figura 40 - Eletromicrografias das superfícies extrato etanólico das folhas de Terminalia catappa (TCEE), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos entre TCEE e BCD. (A) TCEE (200x); (B) TCEE (1000x); (C) BCD (200x); (D) BCD (1000x); (E) complexo BCD-TCEE por MF (200x); (F) complexo BCD-TCEE por MF (1000x); (G) complexo BCD-TCEE por MAL (200x); (H) complexo BCD-TCEE por MAL (1000x) ................................................................................................................................ 149 Figura 41 - Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 14,1 T) do extrato hidroetanólico das folhas de Byrsonima intermedia (BIEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (BIEH-MF) e MAL (BIEH-MAL) ............................................................................................................................. 151 Figura 42 - Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 14,1 T) do extrato hidroetanólico das folhas de Serjania marginata (SMEH), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (SMEH-MF) e MAL (SMEH-MAL) ..................................................................................................................................... 152 Figura 43 - Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 14,1 T) do extrato etanólico das folhas de Terminalia catappa (TCEE), β-ciclodextrina (BCD) e os complexos obtidos por MF (TCEE-MF) e MAL (TCEE- MAL) ................................................................................................................................................... 153 Figura 44 - Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 14,1 T) com expansão na região de  5,85-8,00 para o extrato hidroetanólico das folhas de Byrsonima intermedia (BIEH) e os complexos obtidos por MF (BIEH-MF) e MAL (BIEH-MAL) ...................................................................................................... 156 Figura 45 – Estruturas das substâncias fenólicas identificadas no extrato hidroetanólico de Byrsonima intermedia. (A) derivados de quercetina; (B) derivados de catequina; (C) derivados do ácido gálico (ésteres galato)..................................................................................................................................... 157 Figura 46 - Representação do possível mecanismo de interação para a inclusão de derivados de quercetina glicosilados presentes nos extratos de Byrsonima intermedia na cavidade da BCD ......... 158 Figura 47 - Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 14,1 T) com expansão na região de H 6,00 a H 9,00 para o extrato hidroetanólico das folhas de Serjania marginata (SMEH) e os complexos de obtidos por MF (SMEH -MF) e MAL (SMEH -MAL) .......................................................................................... 160 Figura 48 - Espectro de 1H-RMN (DMSO-d6, 14,1 T) com expansão na região de H 6,00 a H 8,50 para o extrato hidroetanólico das folhas de Terminalia catappa (TCEE) e os complexos obtidos por MF (TCEE-MF) e MAL (TCEE-MAL) .............................................................................................. 161 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição química e atividade biológica das folhas das espécies Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa ............................................................................................ 32 Tabela 2 - Período de coleta das espécies vegetais estudadas ............................................................... 44 Tabela 3 - Fatores e níveis investigados no planejamento fracionário .................................................. 51 Tabela 4 - Parâmetros analíticos e variações para a avaliação da robustez do método otimizado ........ 56 Tabela 5 - Combinação fatorial dos parâmetros analíticos para avaliação da robustez do método otimizado pelo teste de Youden ............................................................................................................ 56 Tabela 6 - Proposta de identificação dos principais metabólitos dos extratos de Byrsonima intermedia, através da combinação das redes moleculares - GNPS e espectrometria de massas ............................. 74 Tabela 7 - Proposta de identificação dos principais metabólitos dos extratos de Serjania marginata, através da combinação das redes moleculares - GNPS e espectrometria de massas ............................. 86 Tabela 8 - Proposta de identificação dos principais metabólitos do extrato etanólico de Terminalia catappa, através da combinação das redes moleculares - GNPS e espectrometria de massas .............. 96 Tabela 9 - Características climáticas para Bauru-SP no ano de 2017: temperatura média, radiação solar, umidade do ar e precipitação ....................................................................................................... 99 Tabela 10 - Características climáticas para Dourados-MS no ano de 2017: temperatura média, radiação solar, umidade do ar e precipitação ..................................................................................................... 100 Tabela 11 - Características climáticas para Santos-SP no ano de 2017: temperatura média, radiação solar, umidade do ar e precipitação ..................................................................................................... 100 Tabela 12 - Teores de flavonoides expressos em mg g-1 de quercetina nos extratos de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa ....................................................................... 104 Tabela 13 - Capacidade antioxidante (ensaios DPPH˙, ABTS˙+, ROO˙) dos extratos de Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa e dos padrões quercetina e ácido gálico ........ 106 Tabela 14 - Planejamento fatorial fracionário com 2 níveis e 5 fatores (2V 7-2) e as respostas obtidas para cada análise.................................................................................................................................. 113 Tabela 15 - Variáveis e as respostas obtidas para cada análise de acordo com o modelo Doehlert .... 117 Tabela 16 - Análise de variância (ANOVA) para o modelo representando a resposta número de bandas cromatográficas (a) de acordo com o planejamento Doehlert ............................................................. 118 Tabela 17 - Análise de variância (ANOVA) para o modelo representando a resposta GCFR de acordo com o planejamento Doehlert ............................................................................................................. 118 Tabela 18 - Critérios avaliados e classificação para o método verde otimizado e o método da literatura pelo software AGREE ......................................................................................................................... 129 Tabela 19 - Valores de escores obtidos nas métricas verdes para a avaliação dos impactos dos procedimentos analíticos ..................................................................................................................... 130 Tabela 20 - Curvas de calibração, faixa linear, dados LD e LQ, para os padrões de referência determinados por HPLC-PDA ............................................................................................................ 131 Tabela 21 - Análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão linear para os padrões de referência ............................................................................................................................................. 132 Tabela 22 - Resultados de robustez do método para tempo de retenção (tr) e área de pico (A) .......... 133 Tabela 23 - Teores para o ácido protocatecuico e derivados de catequina, epicatequina e apigenina no extrato hidroetanólico das folhas de S. marginata .............................................................................. 135 Tabela 24 - Percentuais de retenção no tamis para determinação da granulometria dos pós vegetais 138 Tabela 25 - Quantidade obtida dos extratos preparados das espécies vegetais ................................... 138 Tabela 26 - Deslocamentos químicos dos 1H da β-ciclodextrina (BCD) e a diferença nos complexos para Byrsonima intermedia obtidos por MF (BIEH-MF) e MAL (BIEH-MAL) ................................ 154 Tabela 27 - Deslocamentos químicos dos 1H da β-ciclodextrina (BCD) e a diferença nos complexos para Serjania marginata obtidos por MF (SMEH-MF) e MAL (SMEH-MAL) ................................. 154 Tabela 28 - Deslocamentos químicos dos 1H da β-ciclodextrina (BCD) e a diferença nos complexos para Terminalia catappa obtidos por MF (TCEE-MF) e MAL (TCEE-MAL) .................................. 155 Tabela 29 - Deslocamentos químicos dos 1H aromáticos dos metabólitos de interesse no extrato hidrotetanólico de Byrsonima intermedia (BIEH) e a diferença nos complexos obtidos por MF (BIEH- MF) e MAL (BIEH-MAL) .................................................................................................................. 157 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS AGREE Analytical GREEnness metric (Métrica de Analítica Verde) BCD β-ciclodextrina d.i. Diâmetro interno EAT Environmental Assesment Tool (Ferramenta de avaliação ambiental) EROs Espécies reativas de oxigênio ESI Electrospray ionization (Ionização por electrospray) EtOH Etanol GAC Green Analytical Chemistry GCFR Green Chromatographic Fingerprinting Response (Resposta de Impressão Digital Cromatográfica Verde) GNPS Global Natural Products Social Molecular Networking kJ/m2 Quilojoule por metro quadrado (intensidade de radiação, quantidade de energia radiante por unidade de área) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) HPLC-PDA High Performance Liquid Chromatography - Photodiode Array Detector (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada com Detector de Arranjo de Fotodiodos) MAL Malaxagem m/z Relação massa carga MeOH Metanol MF Mistura física MS Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas) MS/MS Tandem mass spectrometry Ppm Partes por milhão RMN Ressonância Magnética Nuclear rpm Rotações por minuto ® Marca registrada SPE Solid Fase Extraction (Extração em fase sólida) tR Tempo de retenção UV Ultravioleta SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 27 1.1 As espécies vegetais de estudo ........................................................................................... 28 1.2 Padronização de extratos vegetais ...................................................................................... 32 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 40 3 PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................ 41 3.1 Materiais, reagentes e soluções .......................................................................................... 41 3.2 Instrumentação e procedimentos gerais .............................................................................. 41 3.3 Metodologia ........................................................................................................................ 44 3.3.1 PARTE A: Estudo sazonal das espécies vegetais ............................................................ 44 3.3.1.1 Coletas do material vegetal ........................................................................................... 44 3.3.1.2 Preparação dos extratos vegetais ................................................................................... 45 3.3.1.3 Dados meteorológicos ................................................................................................... 45 3.3.1.4 Análises LC-MS e MS/MS ............................................................................................ 45 3.3.1.5 Processamento dos dados e construção das redes moleculares (molecular networking) ................................................................................................................................................... 46 3.3.1.6 Determinação do teor de flavonoides totais .................................................................. 47 3.3.1.7 Avaliação da capacidade antioxidante........................................................................... 47 3.3.1.8 Avaliação da atividade antiglicante ............................................................................... 49 3.3.2 PARTE B: Caracterização qualitativa e quantitativa do extrato de S. marginata usando princípios da Química Verde .................................................................................................... 49 3.3.2.1 Obtenção e preparo da amostra ..................................................................................... 50 3.3.2.2 Análises por HPLC-PDA .............................................................................................. 50 3.3.2.3 Triagem e otimização do método cromatográfico verde ............................................... 51 3.3.2.4 Métrica para o método cromatográfico verde ............................................................... 54 3.3.2.5 Validação do método cromatográfico verde .................................................................. 54 3.3.2.6 Análises por UFLC-ESI-IT-MS e MS/MS .................................................................... 57 3.3.3 PARTE C: Desenvolvimento de complexos com ciclodextrina ...................................... 57 3.3.3.1 Determinação da granulometria dos pós vegetais ......................................................... 57 3.3.3.2 Preparação dos extratos ................................................................................................. 58 3.3.3.3 Preparação dos sistemas complexos .............................................................................. 58 3.3.3.4 Análises de caracterização dos extratos vegetais e complexos sólidos ......................... 59 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................................... 61 4.1 PARTE A: Estudo sazonal das espécies vegetais ............................................................... 61 4.1.1 Anotação do perfil de metabólitos por espectrometria de massas ................................... 61 4.1.1.1 Análise da rede molecular para B. intermedia ............................................................... 64 4.1.1.2 Análise da rede molecular para S. marginata ................................................................ 76 4.1.1.3 Análise da rede molecular para T. catappa ................................................................... 88 4.1.2 Avaliação da composição química e sazonalidade com base na análise das redes moleculares ............................................................................................................................... 98 4.1.3 Determinação do teor de flavonoides totais .................................................................. 103 4.1.4 Avaliação das atividades antioxidantes ......................................................................... 105 4.1.5 Avaliação da atividade antiglicante ............................................................................... 109 4.2 PARTE B: Caracterização qualitativa e quantitativa do extrato de S. marginata usando princípios da Química Verde .................................................................................................. 111 4.2.1 Triagem das variáveis .................................................................................................... 111 4.2.2 Otimização do método cromatográfico ......................................................................... 116 4.2.3 Função desejabilidade .................................................................................................... 120 4.2.4 Avaliação do desempenho e do impacto ambiental do método desenvolvido .............. 126 4.2.5 Validação do método otimizado .................................................................................... 131 4.2.6 Aplicação do método otimizado na análise qualitativa e quantitativa de S. marginata . 134 4.3 PARTE C: Desenvolvimento de pré-formulações com ciclodextrina .............................. 136 4.3.1 Determinação granulométrica dos pós vegetais e rendimento de extração ................... 137 4.3.2 Caracterização dos extratos vegetais e complexos sólidos ............................................ 138 4.3.2.1 Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) ...................... 139 4.3.2.2 Termogravimetria simultânea e calorimetria de varredura diferencial (TG-DSC) ..... 142 4.3.2.3 Difração de Raio X (DRX) .......................................................................................... 144 4.3.2.4 Microscopia de varredura eletrônica (MEV) ............................................................... 146 4.3.2.5 Análise 1H-RMN ......................................................................................................... 150 5 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 162 27 1 INTRODUÇÃO Os produtos naturais derivados do metabolismo secundário vegetal têm desempenhado um papel essencialmente importante no tratamento de doenças e enfermidades ao longo da história de vida dos seres humanos. Por milênios, as plantas medicinais têm sido uma fonte valiosa de agentes terapêuticos, e os progressos na terapêutica moderna tem estimulado o uso de produtos naturais em todo o mundo (CRAGG; NEWMAN, 2013; KATZ; BALTZ, 2016). A diversidade de estruturas moleculares e a capacidade de a natureza fornecer moléculas de complexidades estruturais dificilmente imaginadas ou elaboradas por síntese é o resultado de vias biossintéticas diferentes que estão envolvidas na produção dos metabólitos secundários de uma planta, e o que também leva esses metabolitos a exibir vasta gama de atividades biológicas (BERNARDINI et al., 2018; HARVEY; EDRADA-EBEL; QUINN, 2015). A produção de metabólitos secundários por plantas é caracterizada pela individualidade da espécie vegetal e é considerada uma resposta adaptativa essencialmente relevante em termos de lidar com estímulos ambientais e/ou externos aos quais as plantas estão expostas (GHORBANPOUR; VARMA, 2017). Além disso, esses metabólitos desempenham um papel fundamental na regulação do crescimento, desenvolvimento e defesa das plantas, bem como na mediação das interações planta-ambiente, incluindo a proteção contra várias condições de mudança ambiental estressantes e desafiadoras (ERB; KLIEBENSTEIN, 2020; ISAH, 2019; PANDEY; SENTHIL-KUMAR, 2019; RAI; SAITO; YAMAZAKI, 2017). Nas últimas décadas, tem havido um interesse científico cada vez maior em obter um entendimento abrangente a respeito das mudanças no metabolismo secundário vegetal, e um número considerável de estudos tem sido conduzido com o objetivo de investigar os efeitos das mudanças nos fatores ambientais (por exemplo, temperatura, mudança climática, precipitação, seca, salinidade, radiação UV, luz e umidade) e sazonalidade (de acordo com as estações do ano) na biossíntese e acúmulo de metabólitos especializados em plantas medicinais (BERINI et al., 2018; SAMPAIO; EDRADA-EBEL; DA COSTA, 2016; YANG et al., 2018). Devido a vários fatores, o teor de metabólitos secundários pode variar qualitativa e/ou quantitativamente nas espécies de plantas. Como muitos desses metabólitos são princípios ativos, essa variação pode eventualmente alterar a resposta terapêutica da planta medicinal quando aplicada para fins farmacológicos específicos. Em vista disso, estudar os efeitos de fatores que podem determinar ou modificar a concentração dessas substâncias nas plantas, tais como condições de cultivo e/ou coleta, estação e hora do dia, é extremamente importante caso se pretenda obter produtos de boa qualidade à base de plantas com concentrações desejáveis de 28 princípios ativos (KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012; LIEBELT; JORDAN; DOHERTY, 2019). 1.1 As espécies vegetais de estudo Dentro do contexto do trabalho realizado pelo grupo nos últimos anos em pesquisas desenvolvidas nos projetos temáticos do programa Biota/FAPESP: (I) “Uso sustentável da biodiversidade brasileira: Prospecção químico-farmacológica de plantas superiores” e (II) “Extratos padronizados para o tratamento de doenças crônicas”, foi possível selecionar algumas espécies para a continuidade dos estudos com vistas à obtenção de fitopreparados padronizados, de forma a complementar as opções de tratamento a partir de plantas medicinais, para além daquelas disponibilizadas pelo Sistema Único de Saúde (SUS). As espécies foram selecionadas segundo os critérios preconizados pelo Ministério da Saúde: ampla distribuição geográfica, disponibilidade atual, facilidade de cultivo, produtividade e identificação botânica, baixa toxicidade, baixa incidência de efeitos colaterais, caracterização química qualititativa e quantitativa e propriedades terapêuticas cientificamente avaliadas (BRASIL, 2006b). Assim para o desenvolvimento desse trabalho, foram selecionadas as espécies Byrsonima intermedia A.Juss. (Malpighiaceae), Serjania marginata Casar. (Sapindaceae) e Terminalia catappa L. (Combretaceae) (Figura 1) que apresentam características etnofarmacológicas similares e se mostraram promissoras para aplicação futura de fitoterapia para o tratamento de doenças inflamatórias. Os extratos alcóolicos obtidos das folhas de cada uma dessas espécies demonstraram potencial efeito gastroprotetor (ARRUDA et al., 2009; DOS SANTOS et al., 2019; OHARA et al., 2020; PÉRICO et al., 2015; PINHEIRO SILVA et al., 2015), anti-inflamatório (MOREIRA et al., 2011; SALINAS-SÁNCHEZ et al., 2017), antioxidante (CHYAU; KO; MAU, 2006; GUILHON-SIMPLICIO et al., 2017; HEREDIA-VIEIRA et al., 2015), analgésico (DI STASI et al., 1988; HAÏDARA et al., 2020; VERDAM et al., 2017) e ausência de toxicidade nos modelos agudos avaliados (DOS SANTOS et al., 2019; MININEL et al., 2014; PÉRICO et al., 2015; SANTOS et al., 2012). 29 Figura 1 - Detalhes das espécies de estudo: (A) Byrsonima intermedia; (B) Serjania marginata; (C) Terminalia catappa Fonte: Foto (A): Maiara Stefanini Borges Caires; Foto (B): Silvia Cristina Heredia Vieira; Foto (C): Carolina Mendes Costa. (A) Jardim Botânico de Bauru-SP; (B) Fazenda Santa Madalena, Dourados-MS; (C) Orla de Santos-SP. A espécie B. intermedia (Figura 1A) é popularmente conhecida como murici-do- cerrado, cajuzinho do cerrado ou murici-mirim. Esse nome, murici, que significa pequena árvore em língua tupi guarani, foi dado à espécie pelos povos indígenas. Ela é nativa do Cerrado brasileiro, e como o nome indica, tem características semelhantes a arbustos e geralmente atinge uma altura máxima de 1,60 m. A população local do cerrado usa a casca e as folhas de B. intermedia como infusões, as quais são relatadas como tendo propriedades anti-sépticas, antimicrobianas, anti-hemorrágicas, cicatrizantes e anti-inflamatórias (NOGUEIRA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2007). A espécie S. marginata (Figura 1B) é uma planta trepadeira popularmente conhecida como cipó-uva, cipó-timbó ou barbasco, cujas folhas são utilizadas na medicina popular na forma de infusão ou suco para o tratamento de dores de estômago (ARRUDA et al., 2009). Essa espécie é considerada nativa do Brasil, Paraguai, Bolívia e Argentina. No Brasil, está presente em florestas decíduas, campos inundáveis e na região de Chaquenha no Mato Grosso do Sul, bem como em 18 fragmentos florestais no noroeste do Estado de São Paulo e na densa floresta do Estado de Pernambuco (MOREIRA et al., 2013; RODAL; NASCIMENTO, 2002; SPRENGEL-LIMA; REZENDE, 2013). Seu cultivo agronômico demonstrou que o rendimento e a composição química do extrato das espécies cultivadas foram similares aos das espécies nativas, comprovando que a planta pode ser cultivada ex situ (TABALDI et al., 2012; VIEIRA, 2014). Além disso, o cultivo reduz o uso contínuo de plantas nativas, preservando assim seu habitat natural, assim como é um fator relevante que permite a padronização dos rendimentos para obter um produto de qualidade uniforme e consistente (CANTER; THOMAS; ERNST, 2005; KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012). A B C 30 A espécie T. catappa (Figura 1C) pode ser encontrada em todas as regiões do Brasil, e especialmente na região sudeste do país devido ao clima quente nessa área, que é adequado para o desenvolvimento e crescimento da planta. As espécies do gênero Terminalia são predominantes tanto nas regiões tropicais como subtropicais do Brasil, e mais particularmente nas áreas costeiras, onde são conhecidas por sua extensa sombra ao longo da orla das praias do país. Ela é muito conhecida entre a população brasileira, que frequentemente atribui a ela diversos nomes, incluindo amendoeira-da-praia, cuca e chapéu de sol (THOMSON; EVANS, 2006). Além disso, as espécies do gênero Terminalia são amplamente utilizadas na medicina ayurvédica para tratar dores abdominais e nas costas, tosse e resfriados, conjuntivite, diarreia e disenteria, inflamação e úlceras (COCK, 2015). Estudos fitoquímicos anteriores que analisaram os extratos de folhas das espécies vegetais acima mencionadas mostraram que B. intermedia tem como principais constituintes ácidos fenólicos, proantocianidinas oligoméricas e flavonoides glicosilados derivados de quercetina (FRAIGE et al., 2018; MANNOCHIO-RUSSO et al., 2020; PEREIRA; BOREL; SILVA, 2015; RODRIGUES, 2007; SANNOMIYA et al., 2007; ZANATTA; VILEGAS; EDRADA-EBEL, 2021). S. marginata contém flavonoides C-glicosilados derivados de apigenina, proantocianidinas oligoméricas e saponinas (HEREDIA-VIEIRA et al., 2015; VIEIRA, 2014; ZANATTA; VILEGAS; EDRADA-EBEL, 2021). T. catappa apresenta principalmente ácidos fenólicos, flavonoides e taninos hidrolisáveis (CHANG et al., 2019; LIN; HSU, 1999; LIN et al., 2000; MANDLOI et al., 2013; MININEL, 2015; MININEL et al., 2014; VENKATALAKSHMI P; VADIVEL V; BRINDHA P, 2016). A Figura 2 e a Tabela 1 apresentam um panorama do estudo químico e biológico realizado com as espécies B. intermedia, S. marginata e T. catappa. 31 Figura 2 - Exemplos de alguns metabólitos encontrados nas espécies Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa Fonte: próprio autor. 32 Tabela 1 - Composição química e atividade biológica das folhas das espécies Byrsonima intermedia, Serjania marginata e Terminalia catappa Espécie Composição química Atividade biológica Referências B. intermedia 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 anti-inflamatória, antiulcerogênica e anti- colite; antimutagênica ESPANHA et al., 2014; FRAIGE et al., 2018; MANNOCHIO- RUSSO et al., 2020; MOREIRA et al., 2011; PEREIRA; BOREL; SILVA, 2015; RINALDO et al., 2010; RODRIGUES, 2007; SANNOMIYA et al., 2007; ZANATTA; VILEGAS; EDRADA-EBEL, 2021 S. marginata 1, 5, 12, 15, 17, 26, 27 ação protetora da mucosa gástrica e anti-inflamatória; efeito antimutagênico seletivo HEREDIA-VIEIRA et al., 2015; PÉRICO et al., 2015; SERPELONI et al., 2021; VIEIRA, 2014; ZANATTA; VILEGAS; EDRADA-EBEL, 2021 T. catappa 2, 3, 4, 16, 20, 21, 22, 23, 24, 25 anti-inflamatória e anti- úlceras gástricas, com simultânea ação sobre H. pylori CHANG et al., 2019; COCK, 2015; LIN; HSU, 1999; LIN et al., 2000; MANDLOI et al., 2013; MININEL, 2015; MININEL et al., 2014; OHARA et al., 2020; PINHEIRO SILVA et al., 2015; VENKATALAKSHMI; VADIVEL; BRINDHA, 2016 Fonte: próprio autor. 1.2 Padronização de extratos vegetais O crescimento da fitoterapia nos últimos anos tem sido significativo, fazendo com que uma grande parte da população mundial utilize a medicina tradicional à base de plantas para tratar uma grande variedade de doenças. Isso decorre da crescente perda de credibilidade na medicina comum em relação aos efeitos adversos, da falta de acesso a medicamentos sintéticos e da baixa disponibilidade dos medicamentos distribuídos pela rede de saúde pública (BRASIL, 2019). O mercado fitoterápico no Brasil e no mundo é muito promissor, e apenas a indústria farmacêutica movimenta bilhões de dólares anualmente. Atualmente, encontram-se no mercado mundial centenas de produtos à base de plantas medicinais que cobrem várias categorias terapêuticas e que são descritos em diferentes farmacopeias e monografias, tais como: o ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) que é usado como antiinflamatório, antioxidante, antibacteriano, antiviral e antifúngico (EMA, 2014a, 2014b; Formulário de Fitoterápicos, 2021; WHO, 2002); 33 hipericum (Hypericum perforatum L.) como antidepressivo (EMA, 2009; WHO, 2002); valeriana (Valeriana officinalis L.) como sedativo e no tratamento de distúrbios do sono (EMA, 2016; Formulário de Fitoterápicos, 2021; WHO, 1999); kava-kava (Piper methysticum G. Forst) e passiflora ou flor da paixão (Passiflora incarnata L.) como tratamento natural para casos de instabilidade nervosa, insônia e ansiedade (EMA, 2014c; Formulário de Fitoterápicos, 2021; WHO, 2002, 2007); ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.) como anti-inflamatório e antioxidante e para tratar distúrbios do sistema nervoso central, como a doença de Alzheimer e déficits cognitivos (EMA, 2015; WHO, 1999); e o chá verde [Camellia sinensis (L.) Kuntze] como anti-inflamatório, anticancerígeno, antimicrobiano e hipolipidêmico (EMA, 2013a, 2013b). No comércio brasileiro também é possível encontrar muitos produtos à base de plantas nativas, como o guaraná (Paullinia cupana Kunth) que é usado para a fadiga, como estimulante e antidepressivo suave; a espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek) como antidiséptico, antiácido e protetor da mucosa gástrica; a erva baleeira (Cordia verbenaceae DC.) como anti-inflamatório; o barbatimão (Stryphnodendron adstringens Mart. Coville) como anti-séptico, anti-inflamatório, cicatrizante e antifúngico; o guaco (Mikania glomerata Spreng.) como expectorante, e muitas outras espécies medicinais (BRASIL, 2014a; Formulário de Fitoterápicos, 2021). No entanto, dada a ampla tradição de uso de plantas medicinais para o tratamento de diversas enfermidades, difundiu-se a crença de que os medicamentos fitoterápicos, por serem considerados como uma “medicina verde”, são totalmente inofensivos e não tóxicos, levando a um consumo inadequado por grande parte da população. Isso pode resultar em potenciais riscos à saúde, os quais são ainda agravados pela dificuldade de acesso e até mesmo pela falta de informações confiáveis sobre possíveis efeitos tóxicos. No Brasil, grande parte das espécies vegetais utilizadas pela população não possui ação farmacológica comprovada, composição química definida e nem mesmo estudos toxicológicos realizados. Isso é devido à falta de pesquisa e desenvolvimento, além da falta de investimentos na área de controle da qualidade, eficácia e segurança de produtos padronizados (DUTRA et al., 2016). Desse modo, o Ministério da Saúde deu início a ações para implementar políticas públicas destinadas a introduzir o uso de plantas medicinais e fitoterápicos à Fitoterapia no SUS, conhecida como “Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS”; assim como fomentado o desenvolvimento do setor ao longo de todo o processo produtivo. Essa política tem como diretrizes fundamentais promover a integração dos setores público e privado (universidades, centros de pesquisa e organizações não governamentais); incentivar o uso de 34 plantas medicinais e medicamentos caseiros; apoiar as boas práticas no cultivo e manuseio de plantas medicinais, bem como no manuseio e produção de medicamentos fitoterápicos; incentivar o uso sustentável da biodiversidade brasileira com a preservação e valorização dos benefícios decorrentes do conhecimento tradicional e do patrimônio genético associados; e, acima de tudo, garantir que a aquisição de plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos seja realizada de forma segura, eficaz e de qualidade (BRASIL, 2006a, 2016). As definições empregadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (RDC n° 26/2014) (BRASIL, 2014b) para fitoterápicos consideram duas categorias: o Medicamento Fitoterápico (MF) que é obtido com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade; e o Produto Tradicional Fitoterápico (PTF) que é obtido com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais cuja segurança e efetividade sejam baseadas em dados de uso seguro e efetivo publicados na literatura técnico- científica e que seja concebido para ser utilizado sem a vigilância de um médico para fins de diagnóstico, de prescrição ou de monitorização. Adicionalmente, o PTF não pode se referir a doenças, distúrbios, condições ou ações consideradas graves, não pode conter matérias-primas em concentração de risco tóxico conhecido e não deve ser administrado pelas vias injetável e oftálmica. Tanto para MF quanto para PTF, fica clara a necessidade de se garantir a eficácia (avaliação farmacológica) e a segurança (avaliação toxicológica). Além disso, é fundamental o conhecimento da composição química (perfil cromatográfico), a determinação do marcador (qualidade), a avaliação da sazonalidade e o desenvolvimento de métodos analíticos quantitativos validados para o controle de qualidade da matéria prima vegetal (a própria planta ou derivados vegetais, tais como os extratos) e dos produtos acabados (MF e PTF). O conjunto de ensaios de qualidade envolve ainda a identificação botânica, os estudos de estabilidade e a conformidade com as normas para bulas e rótulos, entre outros (BRASIL, 2014b). A padronização dos extratos vegetais é uma das etapas primordiais no desenvolvimento de um novo fitoterápico e requer muito cuidado e cumprimento rigoroso das diretrizes adequadas sugeridas por agências como a Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos para Medicamentos de Uso Humano (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use - ICH) (ICH, 2005) e a ANVISA (BRASIL, 2017). Esse procedimento é essencial para analisar fatores que afetam significativamente a composição química e a eficácia da fitoterapia, tais como variações entre espécies ou 35 variedades, adulteração, mudanças ambientais durante o crescimento e coleta, tratamento pós- coleta, método de extração, e preparação de amostras, entre outros (SALEM et al., 2020; YULIANA et al., 2011). Para isso, tal padronização deve ser realizada com base no teor de uma substância marcadora presente no extrato, indicando que se a mesma estiver presente em quantidade apropriada também os demais componentes estarão igualmente representados (BRASIL, 2017; DAVID; NASCIMENTO; DAVID, 2004). Nesse contexto, a determinação das substâncias marcadoras em extratos de espécies torna-se imprescindível. A RDC nº 26/2014 define marcador como uma substância ou classe de substâncias químicas presentes na matéria-prima vegetal com correlação com o efeito terapêutico (marcador ativo) ou não (marcador analítico) (BRASIL, 2014b). Por outro lado, a abordagem multicomponente na investigação de plantas medicinais é apreciada por diferentes agências reguladoras internacionais, especialmente pela US Food and Drug Administration (FDA) (FDA et al., 2016), pela Agência Europeia de Medicamentos (European Medicines Agency - EMA) (EMA, 2018) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (WHO, 1991, 2017), que sugerem que em vez de um marcador, o perfil químico qualitativo (identificação de seus componentes) e quantitativo (teor dos principais componentes da mistura) de uma planta pode ser mais apropriado para estabelecer o controle de qualidade químico dos preparados herbais, garantindo segurança e eficácia, assim como a padronização da consistência e reprodutibilidade dos princípios ativos e/ou marcadores químicos das espécies vegetais (KUNLE; EGHAREVBA; AHMADU, 2012; ORY et al., 2019). A realização de uma análise rápida, precisa e de alta qualidade dos constituintes químicos de uma matriz vegetal complexa é indispensável no sentido de que ela permite caracterizar os marcadores ativos na matriz e também facilita a compreensão da relação entre a composição química e a possível eficácia, toxicidade e o alvo terapêutico do produto à base de plantas (WOLFENDER et al., 2019). Um grande obstáculo para estabelecer uma estrutura confiável de controle de qualidade química de um extrato vegetal é que as plantas têm composição extremamente complexa com grande número de substâncias, das quais ainda há conhecimento muito limitado. A diversidade química das substâncias presentes nas plantas medicinais está diretamente associada à alta variabilidade das propriedades físico-químicas intrínsecas dos produtos naturais, e isto torna a separação, detecção e identificação dos substratos naturais das plantas tecnicamente desafiadora (DUNN et al., 2011; WOLFENDER et al., 2015). Avanços significativos nas técnicas analíticas juntamente com novas ferramentas de bioinformática e análises estatísticas multivariadas contribuíram significativamente para o 36 avanço dos estudos químicos de amostras complexas. Abordagens metabolômicas que empregam técnicas de última geração, como a espectrometria de massas de alta resolução (High Resolution Mass Spectrometry - HRMS) e a espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN) unidimensional e bidimensional, são formas rápidas e eficientes de maximizar os resultados da análise de impressões digitais de metabólitos de um grande número de conjuntos de dados (HAN et al., 2018; HOURIET et al., 2020; KELLOGG et al., 2017; SUT et al., 2019). No desenvolvimento e otimização do método cromatográfico a ser utilizado nas análises quantitativas, o estabelecimento das condições apropriadas (tipo de fase estacionária, composição de fase móvel, pH, temperatura da coluna, volume de injeção, entre outras) é fundamental para se obter uma resposta ótima na separação e detecção de um maior número de componentes (FEKETE et al., 2018). Para esse fim, os métodos de otimização multivariada podem ser considerados uma estratégia racional mais apropriada do que a tradicional abordagem “um fator de cada vez” (one-factor-at-time - OFAT) ou também conhecido como tentativa-e-erro. No método OFAT, os parâmetros são alterados um de cada vez, mantendo sempre os outros em níveis constantes. Dessa forma, não são consideradas quaisquer possíveis interações de fatores que influenciam a resposta final (BEZERRA et al., 2019; MONTGOMERY, 2019). A abordagem multivariada aplicada ao desenvolvimento de métodos analíticos oferece numerosas vantagens sobre os métodos tradicionais, como o uso de planejamento experimental (Design of Experiments - DoE) e de Metodologias de Superfície de Resposta (MSE), que promovem a otimização simultânea de respostas múltiplas com um número reduzido de experimentos, permitindo assim aos pesquisadores identificar interações entre fatores e desenvolver modelos de resposta que podem prever os parâmetros analíticos ideais dentro de faixas aceitáveis estabelecidas (BEZERRA et al., 2008, 2019; FERREIRA et al., 2018; SOUZA et al., 2021). Além disso, com essa abordagem muitas vezes o tempo experimental é minimizado, o consumo de solventes utilizados e a geração de resíduos durante a análise são reduzidos, o que também reduz os custos de desenvolvimento do método analítico. O planejamento experimental Doehlert é facilmente aplicado para otimizar variáveis, pois envolve número reduzido de experimento e é considerado mais eficiente na otimização das variáveis. Os níveis determinados pelo modelo Doehlert são atribuídos de acordo com a importância do efeito de cada variável, resultando na atribuição de mais níveis às variáveis com maior efeito sobre a resposta experimental. Tudo isso o torna mais vantajoso em relação aos planejamentos denominados Composto Central e Box-Behnken (ARAUJO; JANAGAP, 2012; FERREIRA et al., 2004; MONTGOMERY, 2019). 37 Outro ponto a considerar é que a maioria dos estudos químicos que utilizam técnicas cromatográficas utilizam solventes orgânicos tóxicos e voláteis como fase móvel, tais como acetonitrila e metanol, gerando grandes quantidades de resíduos de solventes não amigáveis, bem como proporcionam riscos à saúde do analista, e exigem tratamentos dispendiosos para evitar maior contaminação do meio ambiente (PACHECO-FERNÁNDEZ; PINO, 2019). Um dos principais objetivos dos estudos com plantas medicinais é fornecer alternativas naturais (de baixo custo e sustentáveis) para o tratamento de doenças. Nessa direção, percebe- se uma contradição: estudos visando alternativas naturais utilizam solventes/reagentes tóxicos que prejudicam os seres humanos e o meio ambiente. Essa contradição levou ao desenvolvimento de novas estratégias para estudos químicos, com a busca de alternativas que minimizem a produção de resíduos, chamada “química verde” (ANASTAS, 1999; ANASTAS; ZIMMERMAN, 2019). Uma maneira de implementar a química verde durante as análises é realizar todo o processo de acordo com seus princípios, abordando aspectos fundamentais, como a redução do uso de reagentes e energia, bem como a eliminação de resíduos, riscos e perigos, além do uso de solventes verdes (GAŁUSZKA; MIGASZEWSKI; NAMIEŚNIK, 2013). A substituição dos solventes nocivos, utilizados nas análises cromatográficas, por solventes mais verdes, como o etanol, tem sido uma boa estratégia devido à sua toxicidade relativamente baixa, fácil geração a partir de biomassa e biodegradabilidade (FUNARI et al., 2014a; OLIVES; GONZÁLEZ-RUIZ; MARTÍN, 2017). Atualmente, o número de estudos específicos sobre a aplicação da cromatografia verde na análise de extratos vegetais bioativos é muito menor do que o número total de estudos fitoquímicos publicados e a aplicação desse conceito nas indústrias fitoterápicas é inexistente. Alguns estudos têm demonstrado com sucesso o desenvolvimento de métodos de HPLC altamente robustos e ecologicamente corretos utilizando etanol como solvente orgânico na impressão digital de plantas e outras matrizes naturais complexas (BORGES et al., 2021; FUNARI et al., 2016; PELISSARI et al., 2021; SOUZA et al., 2018, 2021). Esses trabalhos demonstraram tanto boas seletividades e separação satisfatória cromatográfica satisfatória, quanto "verde" para o método de HPLC. O uso de métricas pode ser uma abordagem muito adequada que pode fornecer critérios quantitativos para o desempenho analítico, bem como na determinação da natureza "verde" dos procedimentos analíticos realizados (TOBISZEWSKI, 2016). Como exemplo, a métrica HPLC- EAT (EAT - Environmental Assesment Tool) (GABER et al., 2011) é usada principalmente para medir o impacto ambiental com base nas características dos solventes empregados como 38 fase móvel nas análises cromatográficas. Outra métrica que também pode ser usada para medir o impacto ambiental de um procedimento analítico é a Métrica de Analítica Verde - AGREE (AGREE - Analytical GREEnness metric approach and software) que é uma ferramenta para avaliar os riscos ambientais e ocupacionais de um procedimento analítico com base nos 12 princípios da Química Analítica Verde (GAC, Green Analytical Chemistry) (GAŁUSZKA; MIGASZEWSKI; NAMIEŚNIK, 2013; PENA-PEREIRA; WOJNOWSKI; TOBISZEWSKI, 2020). Um outro fator que coopera para otimizar a atividade e/ou a aplicação dos extratos é a tecnologia farmacêutica. A escolha do sistema de liberação mais apropriada para um fitomedicamento deve considerar a eficácia e a segurança do componente ativo e garantir sua qualidade. Portanto, sistemas de liberação devem incluir algumas propriedades fundamentais, tais como: facilitar a aplicação do medicamento, através da via de administração mais apropriada; contornar problemas de estabilidade; e orientar a entrega dos componentes ativos, seja em termos do local de absorção mais apropriado, seja em termos do perfil de liberação (DE TORRE et al., 2020). Nesse contexto, as ciclodextrinas têm sido consideradas como uma alternativa adequada para o uso como sistemas poliméricos de liberação, cujo principal objetivo é prevenir a oxidação, prolongar a estabilidade térmica/propriedades bioativas e melhorar a solubilidade das substâncias presentes no extrato vegetal, o que possivelmente resulta em sua maior biodisponibilidade (JASKI et al., 2019; SUNG; KIM, 2020). As unidades de açúcar nas ciclodextrinas formam macrociclos quirais, truncados em forma de cone, conhecidos por suas cavidades hidrofóbicas e por seu exterior hidrofílico (Figura 3). Seus complexos de inclusão fazem com que as moléculas de interesse fiquem temporariamente presas dentro da cavidade hospedeira, dando origem a modificações benéficas, tais como protegem a molécula contra eventuais interações com a microbiota intestinal e o aumentam a permeabilidade através dos tecidos da mucosa (DEL VALLE, 2004). Dentre os vários tipos, a β-ciclodextrina (BCD) (Figura 3) é a mais indicada para o transporte de fármacos devido ao tamanho de sua cavidade, eficiência de complexação, fácil disponibilidade e custo relativamente baixo (SUNG; KIM, 2020). Algumas das principais propriedades da BCD referem-se à sua baixa absorção pelo trato intestinal, enquanto não sofrem qualquer metabolismo no organismo (DEL VALLE, 2004). 39 Figura 3 - Estrutura química da β-ciclodextrina (BCD) (A) e forma de cone truncado da BCD (B) (A) (B) Fonte: adaptado de UPADHYAY, S. K.; KUMAR, G. NMR and molecular modelling studies on the interaction of fluconazole with β-cyclodextrin. Chemistry Central Journal, v. 3, n. 1, p. 9, 2009. 40 2 OBJETIVOS Aplicar procedimentos de metabolômica, de Química Verde e de tecnologia farmacêutica para aprofundar o estudo da composição química dos extratos vegetais de B. intermedia, S. marginata e T. catappa de modo a viabilizar o desenvolvimento e caracterização de fitopreparados destinados ao tratamento de doenças crônicas. • Objetivos específicos: - Avaliar a variabilidade sazonal da composição química de cada uma das espécies utilizando abordagens de metabolômica; - Desenvolver métodos de química verde para a preparação dos extratos e para a análise dos fitopreparados de S. marginata; - Desenvolver e caracterizar