UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL PRÉ-TRATAMENTOS COM LUZ EM SEMENTES DE TOMATEIRO PARA INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA AO DÉFICIT HÍDRICO Joel Cabral dos Santos Engenheiro Agrônomo 2016 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL PRÉ-TRATAMENTOS COM LUZ EM SEMENTES DE TOMATEIRO PARA INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA AO DÉFICIT HÍDRICO Joel Cabral dos Santos Orientador: Prof. Dr. Rogério Falleiros Carvalho Co-orientador: Dr. Vinicius Costa Galvão Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Produção Vegetal). 2016 iii Santos, Joel Cabral dos S237 p Pré-tratamentos com luz em sementes de tomateiro para indução de tolerância ao déficit hídrico / Joel Cabral dos Santos. – – Jaboticabal, 2016 xiii, 83 p. : il. ; 29 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientador: Rogério Falleiros Carvalho Coorientador: Vinicius Costa Galvão Banca examinadora: Davi Rodrigo Rossatto, Samira Domingues Carlin Cavallari Bibliografia 1. Embebição. 2. Fotorreceptores. 3. Germinação. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 631.547.1:635.64 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. iv v DADOS CURRICULARES DO AUTOR JOEL CABRAL DOS SANTOS – Filho de Maria do Desterro Santos, nascido em 22 de Setembro de 1987 no município de Zabelê-PB. Em 2007, ingressou no curso técnico em Agroindústria no Colégio Agrícola Vidal de Negreiros na Universidade Federal da Paraíba – UFPB, Campus de Bananeiras. Em 2010, iniciou a graduação em Agronomia na Universidade Federal da Paraíba – UFPB – Areia- PB. Foi bolsista PET (Programa de Educação Tutorial) entre os anos de 2010 à 2014. Entre os anos 2012 à 2014, fez estágio voluntário no PIVIC - CNPq (Programa Voluntário de Iniciação Científica) junto ao Laboratório de Biologia Celular e Cultura de Tecidos Vegetais no qual realizou seu trabalho de conclusão de curso, obtendo o título de Engenheiro Agrônomo e em razão dele, o prêmio Láurea Acadêmica. Em Agosto de 2014, ingressou no programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal), da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Jaboticabal. Durante o período de realização do mesmo, foi bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). vi “Eu sou de uma terra que o povo padece Mas não esmorece e procura vencer. Da terra querida, que a linda cabocla De riso na boca zomba no sofrer Não nego meu sangue, não nego meu nome Olho para a fome, pergunto o que há? Eu sou brasileiro, filho do Nordeste, Sou cabra da Peste, das banda de Cá” Patativa do Assaré vii A minha mãe (Maria do Desterro), aos meus sobrinhos: minha princesa Amanda, Ana Luísa, Ana Beatriz, Gustavo, Fernando e Flávio. Aos irmãos Dejailma, Janiel, Joelma e Deja. A minha companheira Leandra Barrozo DEDICO viii AGRADECIMENTOS A toda minha família, especialmente a minha amada mãe Maria do Desterro (Neném), por todo apoio e incentivo nas minhas escolhas, mesmo sem compreender muitas vezes o que de fato estou a fazer. A minha companheira, Leandra Barrozo, por todo amor, carinho, atenção, paciência, compreensão, apoio e ajuda durante os anos que temos construído juntos, e claro por toda ajuda na construção deste trabalho. Ao professor Dr. Rogério Falleiros Carvalho, por ter me recebido como seu orientado, pela oportunidade, paciência, pelos ensinamentos aqui recebidos e pela construção deste trabalho. A família, Coletivo ATISSAR, Romério, Sandra, Anael, Anaely, Almir, Iago, Raphael, Lucas, Alan (e outros que por este coletivo já passaram) sem vocês, sem a força e sem os ensinamentos deste coletivo não teria eu chegado até aqui. Aos orientadores da graduação Profª. Núbia e Prof. Jacinto, por todos os ensinamentos ao longo da graduação, pelos incentivos para que chegasse ao objetivo alcançado e por todos os conselhos para tomada de decisões. A Edwin Gutieerez e Marina Gavassi por todo o apoio e atenção dado no momento que tanto precisei. Antonio Márcio por toda sua amizade e companheirismo ao longo deste ano. Amizade que quero ter sempre em minha vida. A todos que contribuíram de para este trabalho: Antônio Márcio, Edwin, Leandra, Elienay, Marina Gavassi, Lucas Gaion, Rodrigo, Natália. Aos técnicos do Laboratório de Fisiologia Vegetal, Sônia, por toda ajuda, atenção, cuidado e carinho ao longo deste trabalho. Seu Jamil, por toda ajuda e cuidado com o material de estudo. Aos companheiros do Laboratório de Fisiologia Vegetal e do Grupo de Estudos sobre Estresse abiótico em Plantas Cultivadas: Marina, Lucas, Flávio, Leonardo, Antônio, Rita, Letícia, Priscila, Patricia, Luis (Mancha), Gilmar, Rodrigo pelo apoio nas rotinas do laboratório e em todos os momentos em que eu precisei. Aos amigos pelos bons momentos compartilhados em Jaboticabal: Antonio Márcio, Leonardo Correia, Gabriel Barbosa, Luiz Cláudio (Mancha), Paulo ix Alexandre, Wallace Leite, Cid Campos, Rodolfo Lizcano, José Mauricio, Elienay Ferreira, Leandro Moda, Cláudio Ferreira (Claudão), Prof. Aguinaldo, Rafael Barreto, Gilberto Rostirolla, Edwin Gutierrez, Flor, Ezequias Correia, Cássio Nogueira. A Renato Pereira e prof. Dr. Walter Esfrain por todo apoio e auxílio com as análises estatísticas. Mileny (Mimi/Morena) pela amizade, pelos momentos dedicados a ouvir os meu lamentos. Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal) pela oportunidade concedida. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa concedida. Aos professores da FCAV/UNESP que contribuíram ao longo deste mestrado. A todos aqueles que, direto ou indiretamente, colaboraram para que este trabalho fosse realizado. x SUMÁRIO Página RESUMO GERAL............................................................................................. xii GENERAL ABSTRACT.................................................................................... xiii CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................... 14 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................... 14 2. REFERENCIAL TEÓRICO................................................................... 15 2.1. A espécie e sua importância agroeconômica.................................. 15 2.2. Déficit hídrico na agricultura............................................................. 16 2.3. Germinação de sementes.................................................................. 17 2.4. Condicionamento fisiológico de sementes...................................... 18 2.4. Luz na germinação de sementes....................................................... 22 3. REFERÊNCIAS.................................................................................... 24 CAPÍTULO 2 - Hidrocondicionamento com diferentes qualidades de luz em sementes de tomateiro............................................................................. 38 RESUMO.......................................................................................................... 38 ABSTRACT...................................................................................................... 39 1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 40 2. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 42 2.1. Tratamento com luz e a avaliação da germinação de sementes... 42 2.2. Avaliações da germinação de sementes.......................................... 43 2.3. Crescimento........................................................................................ 44 2.4. Determinação do teor de pigmentos................................................. 45 2.5. Delineamento experimental e análise estatística............................ 46 3. RESULTADOS..................................................................................... 46 3.1. Experimento I...................................................................................... 46 3.2. Experimento II..................................................................................... 49 4. DISCUSSÃO......................................................................................... 52 5. CONSIDERAÇÕES.............................................................................. 54 6. REFERÊNCIAS ................................................................................... 54 xi CAPÍTULO 3- Pré-tratamentos com ultravioleta-B em sementes de tomateiro para indução da tolerância ao déficit hídrico............................. 58 RESUMO.......................................................................................................... 58 ABSTRACT...................................................................................................... 59 1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 60 2. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 62 2.1. Tratamento com UV-B e a avaliação da germinação de sementes 62 2.2. Avaliações da germinação de sementes.......................................... 64 2.3. Determinação do teor de pigmentos................................................. 65 2.4. Delineamento experimental e análise estatística............................ 66 3. RESULTADOS..................................................................................... 67 4. DISCUSSÃO......................................................................................... 73 5. CONSIDERAÇÕES.............................................................................. 76 6. REFERÊNCIAS.................................................................................... 76 xii PRÉ-TRATAMENTOS COM LUZ EM SEMENTES DE TOMATEIRO PARA INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA AO DÉFICIT HÍDRICO RESUMO GERAL - O déficit hídrico está entre as principais restrições para o cultivo de espécies de interesse agrícola, pois este fenômeno ocasiona diminuição no crescimento e produtividade das plantas. O condicionamento fisiológico de sementes surge como uma técnica que pode induzir à tolerância das plantas a diversos estresses abióticos. Desta forma objetivou-se com este trabalho pré-tratar sementes de tomateiro com diferentes qualidades de luz para indução da tolerâncias ao déficit hídrico. Para isto foram realizados três experimentos, nos quais sementes de tomateiro foram embebidas em água destilada sob os comprimentos de onda do vermelho, vermelho extremo, verde e azul por 10 ou 20 horas (experimento I e II, respectivamente) decorrido o tempo de embebição as sementes foram colocadas para secar sob os mesmo comprimento de onda durante 48 horas. No experimento III, sementes também foram colocadas para embeber durante 20 horas, após 10 horas de embebição as sementes foram exposta a luz UV-B ou branca por um período de 0, 1, 2, 3 e 4 horas, seguido de privação da luz. Após o período de embebição, foram postas para secar na ausência da luz por 48 horas. Para as análises de germinação e crescimento, sementes foram colocadas para germinar em caixas tipo gerbox contendo 2 folhas de papel de filtro umedecidas com 20 mL de água ou solução com potencial osmótico de -0,1 MPa, induzido com polietilenoglicol. O baixo potencial osmótico da condição estressora reduziu os valores da maioria das variáveis aqui estudadas. O tratamento com luz vermelha durante 20 horas melhorou o TMG e IVG das sementes de tomateiro. O pré tratamento com luz branca e UV-B durante 0, 1, 2, 3 e 4 horas melhoram a porcentagem de germinação, TMG e IVG da sementes de tomateiro sob déficit hídrico. Com isto, chegou-se a conclusão que o pré-tratamento com luz vermelha durante 20 horas, o pré- tratamento com luz branca, UV-B ou hidrocondicionamento de sementes de tomateiro pode induzir a tolerância ao déficit hídrico. Palavras-chave: Embebição, fotorrecptores, germinação. xiii SEED PRIMING WITH LIGHT IN TOMATO SEEDS FOR INDUCTION TO WATER DEFICIT TOLERANCE GENERAL ABSTRACT – The water deficit is among the main constraints for the cultivation of species of agricultural interest, because this phenomenon promotes decreases in the growth and productivity of crops. The physiological conditioning of seeds arises as a technic that can induce the plant tolerance to many abiotic stresses. In this context aimed to evaluate in this work pre-treat tomato seeds with different qualities of light to induce the water deficit tolerances. For that, were realized three experiments which tomato seeds were imbibed in distilled water under wavelengths red, extreme red, green and blue for 10 or 20 hours (experiment I and II, respectively). After imbibition period the seeds were put to dry under the same wavelength during 48 hours. In the experiment III, seeds were put to imbibition during 20 hours also, after 10 hours of imbibition the seeds were exposed to UV-B light or white for a period of 0, 1, 2, 3 and 4 hours, followed by light privation. After the imbibition period, were put to dry in the absence of light for 48 hours. For analysis of germination and growth, the seeds were put to germinate in gerbox recipients containing 2 leaves of filter paper moistened with 20 ml of water or solution with osmotic potential of -0,1 MPa, induced by polyethylene glycol. The low osmotic potential of stress condition decreased the values of most of the analyzed variables in this paper. The treatment with red light during 20 hours improved TMG and IVG of tomato seeds. The pre-treatment with white light and UV-B during 0, 1, 2, 3 and 4 hours improved the germination percentage, TMG and IVG of tomato seeds under water deficit. So, we concluded that pre-treatment with red light during 20 hours, the pre-treatment with white light, UV-B or hydropriming of tomato seeds can induce water deficit tolerance. Keywords: Soaking, photoreceptors, germination. 14 CAPÍTULO 1 – Considerações Gerais 1. INTRODUÇÃO GERAL A germinação e o vigor de sementes são fatores primordiais para que as culturas possam ter elevado desempenho de produção em campo (MOTERLE et al., 2011). Fatores ambientais, tais como temperatura, luz, pH, umidade do solo (RIZZARDI et al., 2009), déficit hídrico, salinidade e solos contaminados por metais pesados podem afetar a germinação das sementes. Em campo as sementes, principalmente as de plantas cultivadas, encontram cada vez mais condições abióticas desfavoráveis que impedem ou diminuem seu potencial de germinação. Desta forma, a escassez de água é uma das principais condições desfavoráveis e, este fenômeno tem se agravado cada vez mais devido às mudanças climáticas. Os potenciais osmóticos muito negativos causados pelo déficit hídrico retardam e reduzem o processo de germinação das sementes (MOTERLE; SCAPIM; LUCCA, 2008), principalmente no início da embebição, uma vez que todas as fases seguintes a absorção de água estarão comprometidas. Sendo assim,::: a água é considerada um fator abiótico preponderante na regulação do crescimento e desenvolvimento de uma planta, e induzir tolerância ao déficit hídrico é de fundamental importância para a manutenção do seu ciclo de vida (SHAO et al., 2008) em regiões áridas e semiáridas. Embora a luz não seja considerada um fator imprescindível para que o processo germinativo se realize em sementes não dormentes, a sua presença pode contribuir para atenuar problemas causados pelo baixo potencial hídrico do solo (MARCOS-FILHO, 2015). Aliado a isto, o condicionamento fisiológico de sementes tem se mostrado uma técnica eficaz e de fácil execução, com a função de conferir às plantas tolerância aos mais diversos estresses abióticos (SUN et al., 2010; BAKHT et al., 2011; GALHAUT et al., 2014), principalmente em hortaliças de grande importância agrícola mundial, como o tomateiro (AMOOAGHAIE; NIKZAD, 2013). 15 Diante do exposto, objetivou-se com este trabalho induzir a tolerância ao déficit hídrico em sementes de tomateiro (Solanum lycopersicum L) por meio de pré- tratamento das sementes com luz. 2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1. A espécie e sua importância agroeconômica O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) possui sua origem na América do Sul, tendo centros de distribuição na Bolívia, Chile, Equador e Peru (CURRENCE, 1963). O tomateiro é uma hortaliça pertencente à família das Solanaceas e possui grande importância econômica mundial. Anualmente são produzidas mais de 159 milhões de toneladas dessa hortaliça em todo o mundo, sendo que os maiores produtores mundiais de tomate são: China, Estados Unidos, Índia, Turquia, Egito, Itália, Irã, Brasil, Espanha e México, respectivamente, produzindo cerca de 76% da produção mundial desta cultura (FAOSTAT, 2013). O Brasil ocupa o oitavo lugar em relação à produção mundial de tomate, produzindo em média mais de 4,4 milhões de toneladas por ano. Os três principais estados produtores são Goiás, Minas Gerais e São Paulo (IBGE, 2015). Das cultivares existentes no Brasil, a maioria é proveniente de materiais europeus e dos Estados Unidos, inclusive as cultivares tradicionais, apesar de materiais selvagens serem encontrados esporadicamente (CARELLI et al., 2006). Sob o ponto de vista econômico, o tomate é utilizado pelas indústrias de alimentos como matéria-prima para a produção de produtos derivados tais como molhos (LENUCCI, et al., 2006). Considerando seu conteúdo nutricional, o tomate contêm níveis elevados de glicose, frutose e sacarose (GARVEY; HEWITT, 1991; MIRON; SCHAFFER, 1991). Além disso, sua composição química possui também carotenoides: β - caroteno, um precursor da vitamina A, e, principalmente, o licopeno; são ainda encontradas vitaminas, a exemplo do ácido ascórbico e tocoferóis, fenóis: flavonóides e derivados 16 do ácido hidroxicinâmicos (BORGUINI; TORRES, 2009; CLINTON, 1998; KOTKOV; HEJTMNKOV; LACHMANI 2009 ; KOTKOV et al , 2011; MOCO et al., 2006 ; VALLVERDÚ - QUERALT et al., 2011) . Muitos benefícios à saúde podem ser relacionados ao tomate, principalmente a prevenção ou combate ao desenvolvimento de doenças crônico-degenerativas (LEONARDI et al., 2000). Foi verificado em pesquisas epidemiológicas que o consumo de tomate está associado com um risco reduzido de câncer e doenças cardiovasculares (CLINTON, 1998; GIOVANNUCCI et al, 2002), sendo esse efeito atribuído aos seus componentes bioativos com propriedades antioxidantes (BORGUINI; TORRES, 2009). 2.2. Déficit hídrico na agricultura O déficit hídrico é caracterizado quando a quantidade de água perdida pelo vegetal é maior que sua absorção e, seus efeitos na planta dependem da intensidade e do período de exposição à restrição hídrica (COSTA et al., 2008), pois afetam diretamente o crescimento e o desenvolvimento vegetal, implicando a redução de produtividade (BRAY, 2004), além de prejudicar processos vitais (GOLLDACK et al., 2014). Dentre as diversas respostas dos vegetais ao déficit hídrico, existem aquelas negativas, como a produção de espécies reativas de oxigênio, as quais são produzidas por um desequilíbrio metabólico (NOCTOR et al., 2002). No entanto, ocorre também o aumento da produção de substâncias antioxidantes, ácido ascórbico, glutationa, carotenos, açúcares-álcool (manitol), aminoácidos (prolina), proteínas (chaperonas, LEA - late embryogenesis abundant) e aminas (glicina betaína e poliaminas), substâncias que auxiliam na adaptação da planta a esta condição de estresse (YORDANOV, 2000, SEKI et al., 2007). Como as principais mudanças apresentadas por plantas submetidas ao estresse hídrico podemos citar o fechamento dos estômatos, diminuição na condutância estomática e das perdas de água por transpiração, e consequentemente diminuição da fotossíntese 17 (XOCONOSTLE-CAZARES et al., 2010), alteração na permeabilidade da cutícula, redução de turgor, enrolamento das folhas, redução da área foliar, menor crescimento da parte aérea, maior crescimento do sistema radicular e abscisão floral (XOCONOSTLE-CAZARES et al., 2010; BASTOS et al., 2011; VARSHNEY et al., 2011), Na fase de sementes, a restrição hídrica pode ser prejudicial, pois a germinação é um processo biológico que é totalmente dependente de um fornecimento adequado de água para que o desenvolvimento do embrião seja retomado (BECKERT et al., 2000). Tanto a germinação quanto o desenvolvimento inicial de plântulas são fases muito sensíveis ao déficit hídrico, e como consequência, pode ocorrer redução da porcentagem de germinação, desuniformidade do estande, resultando, assim, na diminuição do desempenho da cultura (DEMIR et al., 2006). Além disto, dependendo da intensidade e do período da restrição hídrica, a germinação poderá ser retardada, ou mesmo não ocorrer (MORAES; MENEZES, 2003; SILVA et al., 2006) A água é fundamental para a atividade metabólica do processo da germinação, pois interfere na atividade enzimática, na solubilização e transporte de fotoassimilados, atuando como reagente na digestão das reservas da semente (MARCOS FILHO, 2005; BRADFORD, 1995). Desta forma, alterações no potencial hídrico externo afetará as propriedades hidráulicas do tegumento da semente, pois quanto mais baixo for esse potencial, menor será a quantidade de água no tegumento e sua absorção pelas sementes e, consequentemente o início da atividade enzimática, o desenvolvimento meristemático e a emergência da radícula serão retardadas (HADAS, 1976). 2.3. Germinação de sementes A germinação é o processo de retomada do crescimento e desenvolvimento do eixo embrionário, interrompido nas sementes ortodoxas por ocasião da maturidade fisiológica, manifestando sua capacidade para originar uma plântula 18 normal em condições favoráveis (MARCOS FILHO, 2015), a qual pode ser influenciada por fatores intrínsecos, como longevidade e viabilidade e extrínsecos, a água, temperatura e oxigênio (CARVALHO; NAKAGAWA, 2012). A água tem importância fundamental na ativação de diferentes processos metabólicos que resultam na germinação das sementes (ÁVILA et al., 2007), e para que a semente germine ela precisa ser hidratada, assim, esta absorção de água pelas sementes segue um padrão que compreende três fases distintas: na primeira fase de água é rapidamente absorvida, devido a diferenças de potencial hídrico entre substrato e sementes; na sequência, a segunda fase é caracterizada por uma redução na taxa de absorção de água, que é o resultado do equilíbrio entre os dois potenciais; e, finalmente, na terceira fase, devido à ativação metabólica e bioprodução de substâncias osmoticamente ativos por a semente, a água volta a ser absorvida rapidamente (BEWLEY; BLACK, 1994). Portanto, a germinação é um processo biológico que é dependente de um fornecimento adequado de água para que o desenvolvimento do embrião seja retomado (BECKERT et al., 2000). 2.4. Condicionamento fisiológico de sementes O condicionamento fisiológico ou pré-tratamento de sementes é uma técnica que permite a reidratação (água ou soluções) controlada da semente para promover os processos metabólicos normalmente ativados durante a fase inicial de germinação (metabolismo pré-germinativo), mas impedindo a protrusão da radícula. Com isso, o condicionamento deve ser interrompido antes da perda da tolerância à dessecação (BEWLEY et al., 2013; PAPARELLA et al., 2015). O uso desta técnica tem demostrado resultados práticos de grande importância agronômica como o aumento da taxa de germinação, velocidade de germinação e emergência das plântulas, bem como sua uniformidade. Tais fatores podem resultar no melhor estabelecimento da cultura sob condições estressantes e, com isso, alcançar altos níveis de rendimento (McDONALD, 2000; BASRA et al 2005; BEWLEY et al., 2013; PAPARELLA et al., 2015). Entretanto, os efeitos benéficos do condicionamento 19 podem ser mais evidentes em condições desfavoráveis do que em condições favoráveis (PARERA; CANTLIFFE 1994). O condicionamento de sementes baseia-se na relação entre a embebição e o potencial hídrico (ψ). Quando o ψ do meio de embebição é diminuído ou a quantidade total de água fornecida para as sementes é limitada ou cessada, a conclusão da emergência da radícula é impedida (BEWLEY et al., 2013; MARCOS FILHO, 2015). Entretanto, boa parte do metabolismo germinativo que ocorre durante a fase II da germinação continuam, incluindo síntese “de novo” de ácidos nucleicos e proteínas, produção de ATP, acumulação de esteróis e fosfolipídios, ativação da reparação do DNA, degradação de mRNA armazenados, transcrição e tradução de novas proteínas e os mecanismos antioxidantes. Contudo, mantendo-se também a tolerância a dessecação, permitindo que as sementes sejam desidratadas após o condicionamento. Na sequência, fornecida a quantidade de água adequada, as sementes condicionadas irão absorver rapidamente, encurtando a duração da fase II da germinação, movendo-se de forma relativamente rápida da hidratação para emergência da radícula e crescimento (BEWLEY et al., 2013; PAPARELLA et al., 2015). O pré-tratamento de sementes têm sido usualmente utilizado para tratar sementes de: hortaliças, entre elas cenoura (Daucus carota L.), alho-poró e cebola (Allium Genus L.) (DEARMAN et al., 1987), salsão (Apium graveolens L.), alface (Lactuca sativa L.), chicória (Cichorium endivia L.), pimenta (Capsicum) e tomate (Solanum lycopersicum L.) (PARERA; CANTLIFFE 1994; DI GIROLAMO; BARBANTI 2012); cereais, entre eles arroz (Oryza sativa L. )(BASRA et al., 2005) trigo (Triticum aestivum L.) (FAROOQ et al, 2013) e milho (Zea mays L.) (ABRAHA; IOHANNES 2013); na indústria de sementes de flores, em variedades de Petunia hybrida L. (DI GIROLAMO; BARBANTI 2012; MOMIN 2013) e plantas medicinais como, Rosmarinus officinalis L. e Salvia splendens L., (DI GIROLAMO; BARBANTI 2012). O sucesso do condicionamento fisiológico é fortemente correlacionado com a espécie e fisiologia da planta, lote e vigor das sementes, bem como o método de condicionamento aplicado (PARERA; CANTLIFFE 1994). Entre os diversos métodos de condicionamento, verifica-se o hidrocondicionamento, no qual as sementes são 20 imersas ou postas em recipientes com camadas de papel filtros saturados com água destilada esterilizada mantida em temperatura adequada por um período predeterminado (KAYA et al., 2006; ABRO et al., 2009; SOLEIMANZADEH, 2013). Na tentativa de melhorar a eficiência da germinação, o processo de embebição controlada realizada com quantidades definidas de água foi substituída por tratamentos com soluções salinas e, subsequentemente, com a utilização de polietilenoglicol de elevado peso molecular (PEG) (HEYDECKER et al., 1973). Hoje são conhecidos vários produtos e métodos para o pré-tratamento de sementes (JISHA et al, 2013, PAPARELLA et al, 2015): No osmocondicionamento, as sementes são embebidas em soluções aeradas com baixos potenciais osmóticos, fazendo com que ocorra uma restrição na taxa de embebição (PARERA; CANTLIFFE, 1999). Para tanto, vários produtos químicos são utilizados para criar o baixo potencial osmótico como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) (RAHIMI, 2013; GALHAUT et al., 2014), NaCl (BAKHT et al., 2011), manitol (TOSELLI; CASENAVE, 2014), KNO3 (SINGH et al., 2014), KCl (FAROOQ et al., 2006; ELOUAER; HANNACHI, 2012), CaCl2 (AFZAL et al., 2008; REHMAN et al., 2011), ascorbato (AFZAL et al., 2008; JAFAR et al., 2012). Pode-se ainda citar o pré-tratamento com nutrientes, o qual surge como uma nova proposta, onde as sementes são embebidas em soluções com nutrientes essenciais como N, P, e K (AL-MUDARIS; JUTZI 1999), Cu e Zn (CuSO4, ZnSO4) (PROM-U-THAI et al., 2012, BEGUM et al., 2014) e outros micronutrientes (FAROOQ et al. ,2012). Além deste, utiliza-se também o pré-tratamento químico, em que vários são os produtos utilizados. Por exemplo, tem-se o ácido ascórbico (FAROOQ et al., 2013;) butenolide (DEMIR et al., 2012), selênio (NAWAZ et al., 2012), KH2PO4, etanol (AFZAL et al., 2013), poliaminas (putrescina) (KHAN et al., 2012), colina (SALAMA et al., 2011), quitosana (MAHDAVI; RAHIMI, 2013). Outra técnica existente é o pré-tratamento hormonal, no qual reguladores de crescimento e hormônios vegetais são utilizados para se obter um melhor desempenho em condições de estresse abiótico. Este método consiste na imersão das sementes em soluções contendo reguladores ou hormônios vegetais, como giberelinas (GA3) (GHOBADI et al., 2012; HEYDARIYAN et al., 2014), brassinolídeo 21 (ZHANG et al., 2007), etileno (CARVALHO et al, 2011), ácido salicílico (REHMAN et al., 2011; SHARAFIZAD et al., 2013) entre outros. As espécies reativas de oxigênio (ROS) também vem sendo usadas para o pré-tratamento em plântulas e sementes de algumas culturas, a exemplo do precursor do radical hidroxil, o H2O2 (BARBA-ESPÍN et al., 2009; SANTHY et al., 2014) e a tioureia (PATADE et al., 2012). Isso se deve ao fato de que as ROS são fundamentais à regulação do processo de crescimento e desenvolvimento, e também da tolerância ao estresse, tornando o estado redox um fator de extrema importância durante o pré-tratamento (JISHA et al., 2013). As plantas modificam o seu estado redox em respostas a todos estímulos externos, com extensões que levam em conta a origem, dose e tempo de exposição (MILLER et al., 2009). Assim, supõe-se que mantendo-se o estado redox, os danos promovido por estresse podem ser mitigados (MITTLER, 2002). O pré-tratamento matriz sólida, também denominado de condicionamento matricial sólido, condicionamento mátrico ou meio semi-sólido, é um processo alternativo às soluções líquidas, consiste na mistura de sementes em material sólido em proporções definidas, onde as propriedades físicas e químicas do material são utilizadas para diminuir a absorção de água pelas sementes (TAYLOR et al., 1988; COPELAND; McDONALD, 1995; JISHA et al., 2013). Vários são os materiais utilizados no pré-tratamento de sementes com matriz sólida. São exemplos desta modalidade de pré-tratamento, vermiculita em camadas, argila expandida calcinada, Agro-lig, carvão betuminoso macio, gel de polipropionato sódico, silicato de cálcio sintético, pó de serragem, carvão vegetal e cinza vulcânicas (KUBIK et al.,1988; KHAN; PATASZNIK, 1992, LORENZO, 1991) pó de “algalita” (QUEIROGA et al., 2011). Alguns fungicidas também podem ser aplicados nas sementes, diluídos ou dissolvidos nas soluções de pré-tratamento, por exemplo, soluções de PEG (ALI et al., 2001; ZHAO et al., 2003). Fungicidas que promovem a tolerância ao estresse abiótico tem sido propostos, promovendo efeitos positivos como, por exemplo, o aumento da germinação in vitro em sementes de girassol devido à aplicação de estrobilurina (JISHA et al., 2013). O pré-tratamento biológico, por sua vez, consiste na aplicação de microrganismos e tem melhorado o desempenho das culturas, com 22 ênfase para aqueles que se estabelecem nas raízes das plantas como rizobactérias promotoras de crescimento (PGPR) (MIRSHEKARI et al., 2012) e Tricodherma (RAHMAM et al., 2015). Finalmente, é evidente que as técnicas de pré-tratamento têm se mostrado muito úteis para aumentar a tolerância de sementes e plântulas à condições estressoras. Entretanto, a adoção de outras técnicas como àquelas representadas por ondas eletromagnéticas de diferentes comprimentos carecem de mais atenção, pois alguns resultados de pesquisas mostraram-se promissores na indução de tolerância a estresses abióticos como, por exemplo, em sementes de alface tratadas com radiação UV-C a qual induziu tolerância ao estresse salino (OUHIBI et al., 2014). Estudos, técnicas e ferramentas como o uso de tecnologia de imagem digital (DIT), biologia molecular, proteômica e biologia de sistemas têm sido utilizados, para uma melhor compreensão das mudanças ocorridas durante o condicionamento fisiológico de sementes, com a finalidade de melhoraria dos métodos de condicionamento (PAPARELLA et al., 2015). 2.5. Luz na germinação de sementes A luz é um importante fator ambiental que modula a germinação em um grande número de espécies. Ela é coordenada através da composição espectral, fluência de fótons, temperatura, disponibilidade de água, além do estado fisiológico das sementes, os quais podem promover ou inibir a germinação (MIGUEL et al., 2000; SHICHIJO et al., 2001, DONOHUE et al., 2008). Em sementes embebidas, estes parâmetros sinalizam à semente se as condições são ou não adequadas para germinação (BENECH-ARNOLD et al., 2000). A resposta das sementes à luz, assim como para os demais fatores, apresenta-se de forma distinta entre as espécies e dependentes de uma série de fotorreceptores, tais como os fitocromos, os quais são as moléculas mais exploradas e caracterizadas nos processos fotomorfogenéticos (NAGY et al., 2001), que se 23 encontram em todas as plantas superiores e em cianobactérias. O fitocromo é o sensor fisiológico da luz nas sementes e existe duas formas interconversíveis, uma forma chamada Fv, que é considerada fisiologicamente inativa, com pico de absorção na região do vermelho (660 nm) e outra denominada Fve, cujo pico de absorção encontra-se na faixa do vermelho extremo (730 nm), sendo considerada a forma ativa do fitocromo. Apesar da Fv absorver pouco no comprimento de onda azul, esta absorção permite a conversão de Fv em Fve. A reversão de Fve a Fv ocorre pela absorção do comprimento de onda vermelho-extremo podendo, também, a reversão de Fve a Fv ocorrer no escuro. Esta interconversão permite a mudança de estrutura bioquímica, o que permite ou não, a resposta fotomorfogenética (BORGES; RENA, 1993). A ação da luz na região do vermelho e vermelho extremo sobre o fitocromo promove a alteração da sua forma isomérica permitindo o balanço entre a forma ativa (Fve) e inativa (Fv), respectivamente. Quando a taxa Fve/Fv é elevada, ocorre maior estímulo à germinação, sendo que em taxas menores, ocorre maior estímulo ao estado dormente das sementes (SMITH, 1982; VÁZQUEZ-YANES; OROZCO- SEGOVIA, 1993; BEWLEY; BLACK, 1994; VIVIAN et al., 2008). Os criptocromos e as fototropinas são os receptores da luz azul e ultravioleta A (UV-A) (AHMAD; CASHMORE, 1993). Pouco é conhecido sobre a ação dos criptocromos em sementes, pois ainda não há estudos demonstrando especificamente a presença da proteína criptocromo em tecidos de sementes (GOGGIN; STEADMAM, 2012). Um experimento realizado por Hennig et al., (2002), mostrou que, sob luz azul, a germinação de um mutante de Arabidopsis deficientes nos fitocromos tipo A e E foi reduzida, sugerindo que a luz azul em sementes pode ser mediada por fitocromos. No entanto, a germinação foi reduzida a penas 50% no mutante individual e no duplo mutante em 75%. Portanto, é provável que a germinação de sementes de Arabidopsis sob luz azul seja também mediada por criptocromos, em conjunto com os fitocromos A e E (GOGGIN; STEADMAM, 2012). Em outro estudo que evidenciou o efeito positivo da exposição de sementes desidratadas de cenoura, agrião e rabanete a altas intensidades de luz verde (526 e 532 nm) houve aumento de biomassa nas plantas, mesmo não afetando a germinação das sementes (SOMMER; FRANKE, 2006). Apesar dos resultados 24 acima reportados, não existem evidências de que estas respostas sejam mediadas por criptocromos (GOGGIN; STEADMAM, 2012), porque a reposta deste fotorreceptor ao comprimento de luz verde é dependente de uma irradiação anterior ou simultânea de luz azul (BANERJEE et al., 2007). Até então não é conhecido um receptor para luz verde, bem como a razão para o efeito do aumento da biomassa mesmo depois de algum tempo após as sementes secas serem expostas a tal luz. Sendo assim, sugere-se que exista um receptor específico para luz verde, antagonista para os receptores de luz vermelha e azul, mediando estas respostas em sementes, bem como em tecidos vegetativos (GOGGIN; STEADMAM, 2012). Os diversos comprimentos de ondas influenciam algumas espécies de forma diferente. A exemplo disso, a luz azul que estimula a germinação de Acacia catechu (AGRAWAL; PRAKASH, 1978) e Amaranthus spp (SINGHAL et al., 1983) mas que inibe a de Amaranthus caudatus (NOWAK et al., 1996); o mesmo ocorre para a luz verde, a qual estimula Aeschynomene indica e Tephrosia purpurea (CHAGHTAI et al., 1983), Solidago spp, (WALCK et al, 2000), Atriplex sagittata (MANDAK: PYSEK, 2001) e Compositae (LUNA et al, 2004) e inibe a germinação de Chondrilla juncea (LUNA et al., 2004), bem como a luz azul e vermelho-extremo resulta em inibição de Solanum tuberosum (LISTOWSKI; RYKACZEWSKA, 1975); Citrullus lanatus (THANOS; MITRAKOS, 1992). Em sementes de Cyrtopodium glutiniferum, a germinação é mais rápida sob luz branca ou azul, mas alcançou um percentual final mais elevado sob a luz verde (VOGEL; MACEDO, 2011). 3. REFERÊNCIAS ABRAHA, B.; YOHANNES, G. The role of seed priming in improving seedling growth of maize (Zea mays L.) under salt stress at field conditions. 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O condicionamento fisiológico de sementes surge como uma alternativa promissora para indução de tolerância aos estresses abióticos. Aliado a isto, o fato de que a luz é fator limitante ou parte fundamental na indução da germinação de sementes e crescimento em muitas espécies, não seria surpresa pensar que o hidrocondicionamento associado a luz poderia induzir tolerância ao déficit hídrico. Desta forma, objetivou-se pré-tratar sementes de tomateiro com luz para indução da tolerância ao déficit hídrico. Para isto, foram realizados dois experimentos, nos quais sementes de tomateiro foram embebidas em água destilada e expostas a comprimentos de onda do vermelho, vermelho extremo, verde e azul por 10 ou 20 horas (experimento I e II, respectivamente). Além disso, para ambos experimentos, sementes permaneceram no escuro ou não foram tratadas. Para as análises de germinação e crescimento, sementes foram colocadas para germinar em caixas tipo gerbox contendo 2 folhas de papel de filtro umedecidas com 20 mL de água ou solução com potencial osmótico de -0,1 MPa, induzido com polietilenoglicol. Durante 120 horas foram realizadas as contagens de germinação a cada 12 horas e, a partir delas, foram analisadas a porcentagem de germinação (PGM), tempo médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG). Além disso, após 10 dias do início dos experimentos, foram avaliados: crescimento da parte aérea e raiz; biomassa seca de parte aérea e raiz; teores de clorofilas totais, carotenóides e antocianinas. O baixo potencial osmótico da condição estressora reduziu a maioria das variáveis aqui estudadas, porém apenas o tratamento com luz vermelha durante 20 horas melhorou o TMG e IVG das sementes de tomateiro. Com isto, chegamos a conclusão de que o pré-tratamento com luz V durante 20 horas pode induzir nas sementes de tomateiro tolerância ao déficit hídrico. Palavras-chave: Fitocromos, condicionamento fisiológico, Solanum lycopersicum L. 39 CHAPTER 2 – Hydropriming with different qualities of light on tomato seeds ABSTRACT – The scarcity of water resources can compromise the food security due to the fact that water deficit affects crop productivity. The physiological conditioning of seeds arises as a promising alternative to induce tolerances to abiotic stresses. Allied to this, the fact that the light is a limiting factor or fundamental part in the induction of seed germination and growth in many species, it would not be surprising to think that hydropriming associated to the light could induce tolerance to water stress. So, aimed to pre-treat tomato seeds with light for induction to water deficit tolerance. For this, two experiments were carried out in which tomato seeds were imbibed in distilled water under the wavelengths of red, extreme red, green and blue for 10 or 20 hours (experiment I and II, respectively). In addition, for both experiments, seeds were kept in the dark or were not treated. For analysis of germination and growing, seeds were put to germinate in gerbox containing 2 leaves of filter paper moistened with 20 ml of water or solution with osmotic potential -0.1 MPa, induced with polyethylene glycol. During 120 hours were realized the germination counts every 12 hours and from them were analyzed the PGM, TGM and IVG. In addition, after 10 days the beginning of experiments, were evaluated: shoot and root growth, dry matter of shoot and root, total chlorophyll levels, carotenoids and anthocyanin. The low osmotic potential of stressed condition decreases most of the analyzed variables in this paper, however only treatment with red light during 20 hours improved the TMG and IVG of tomato seeds. So, we conclude that pre-treating tomato seeds with V light during 20 hours can induce them to water deficit tolerance. Keywords: Phytochromes, Physiological conditioning, Solanum lycopersicum L. 40 1. INTRODUÇÃO A escassez de recursos hídricos tem se agravado em função de mudanças climáticas, e entre as consequências, está o comprometimento da segurança alimentar (SOMERVILLE; BRISCOE, 2001), já que o déficit hídrico afeta o crescimento, desenvolvimento e a produtividade das culturas em diversas zonas climáticas, principalmente nas de clima árido e semiárido (KNAPP et al., .2001; FISCHLIN et al., 2007). Estes fatos estão aliados diretamente ao déficit hídrico por afetar a morfologia, fisiologia e até características moleculares e fotoquímicas das plantas (LISAR, et al., 2012), a exemplo da redução do turgor que implica diretamente na redução da área foliar e da taxa de crescimento da planta (DUQUE et al., 2013). Em virtude disto, os avanços da agricultura moderna tem buscado além de aumentar a produtividade das culturas sem aumentar a área plantada, reduzir as perdas pré e pós-colheita ocasionadas por agentes abióticos (GUST et al. 2010). Sendo assim, aumentar a qualidade das sementes tornou-se uma prioridade necessária para enfrentar a atual demanda por altos padrões do mercado agrícola (PAPARELLA et al., 2015). O conhecimento em diferentes níveis dos processos germinativos, através de ferramentas como a proteômica (TAN et al 2013; GALLAND et al., 2014), têm proporcionado mecanismos que visam alterar e melhorar o desempenho das sementes na agricultura (BEWLEY et al., 2013). Nos últimos anos, o pré-tratamento de sementes passou a existir como uma estratégia promissora para enfrentar o estresse abiótico, sem afetar o potencial produtivo das culturas (VAN HULTEN et al., 2006). Este método consiste na indução das fases iniciais da germinação, fazendo com que se inicie uma série de processos, morfológicos (crescimento do eixo embrionário) e bioquímicos (síntese de enzimas), sem permitir que ocorra a protrusão da radícula, 0ocasionando na indução a tolerância a estresses abióticos como o déficit hídrico (PAPARELLA et al., 2015). Os pré-tratamentos/condicionamentos fisiológicos de sementes incluem hidrocondicionamento, osmocondicionamento, pré-tratamento químico, pré- tratamento hormonal, pré-tratamento biológico, entre outros (JISHA et al., 2013). http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030442381530371X#bib0185 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030442381530371X#bib0095 41 Embora o pré-tratamento melhore a taxa e a uniformidade de emergência e de crescimento, principalmente em condições de estresse (PARERA; CANTLIFFE, 1991), a eficácia dos diferentes agentes de pré-tratamento variam de acordo com o tipo de estresse (salino, déficit hídrico, etc.) e com a espécies (IQBAL; ASHRAF, 2005). Além disso, não é surpresa pensar que pré-tratamentos em sementes com luz também possam induzir modificações moleculares e bioquímicas que resultem na indução de plantas tolerantes a estresses. De fato, a luz é fator limitante ou parte fundamental na indução da germinação em muitas espécies. Considerando os comprimentos de ondas da luz, os mais conhecidos sistemas biológicos que controlam a germinação envolvem a percepção do vermelho (V) ou vermelho extremo (VE) pelos fitocromos. A alta relação V/VE pode induzir a germinação de sementes por meio da forma ativa do fitocromo (FVe), enquanto a baixa relação V/VE pode reprimir a germinação por meio da forma inativa (FV) (VIDAVER, 1980). Adicionalmente, os criptocromos e as fototropinas são os receptores da luz azul e ultravioleta A (UV-A) (AHMAD; CASHMORE, 1993), com tudo, pouco se conhece sobre a ação de criptocromos em sementes (GOGGIN; STEADMAM, 2012). Entretanto, existem evidências de que a germinação de Arabidospsis seja mediada por criptocromos em conjunto com fitocromos (HENNIG et al., 2002, GOGGIN; STEADMAM, 2012). Um fotorreceptor para luz verde ainda é desconhecido, porém sementes de algumas espécies que foram expostas a luz verde tem apresentado respostas, como aumento e diminuição de biomassa e aumento de polifenóis na parte aérea em mudas de orquídeas (ISLAM et al., 1999, SOMMER; FRANKE, 2006, KHATTAK et al., 2007). Desta forma objetivou-se com este trabalho testar a hipótese de que pré- tratamento com diferentes qualidades de luz em sementes de tomateiro (Solanum lycopersicum L.) pode induzir tolerância ao déficit hídrico. 42 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Tratamento com luz e a avaliação da germinação de sementes Sementes de tomateiro da cultivar Moneymaker (MM) foram colocadas em bandejas de plástico pretas (uma para cada tratamento) contendo folhas de papel de filtro umedecidas com 120 mL de água destilada por um período total de 10 horas (experimento I) ou 20 horas (experimento II). As sementes foram submetidas a luz, simulada através dos diferentes comprimentos de ondas do espectro de ação: azul (400 - 485 nm), verde (500 - 565), vermelho (600 - 680 nm), vermelho extremo (680 - 720 nm). Além disso, as sementes permaneceram embebidas no escuro ou não receberam tratamento algum (NT). Decorridas 10 e 20 horas de embebição, as sementes foram colocadas para secar em bandejas plásticas contendo folhas de papel filtro por um período de 48 horas sob seus respectivos tratamentos (diferentes comprimentos de luz) (Figura 1). Para obtenção dos comprimentos de ondas, as bandejas foram cobertas com uma placa de acrílico com espessura 4 mm nas cores: azul, vermelha, azul+vermelho (vermelho extremo), entretanto, para a cor verde, a bandeja foi coberta com duas folhas de papel celofane verde, e para o escuro utilizou-se uma lona plástica preta. Utilizou-se luz branca com lâmpadas fluorescentes (60 μmol m² s-²), como fonte de luz para as cores azul, verde e vermelho e, lâmpada incandescente de 60 W para o vermelho extremo. As sementes ficaram a uma distância de 35 cm da fonte de luz, sob temperatura média de 25ºC. Para análise de germinação, as sementes foram desinfetadas com solução de hipoclorito de sódio a 5% por 10 minutos. Posteriormente, lavadas três vezes com água destilada, onde 50 sementes (quatro repetições por tratamento) foram colocadas para germinar em caixas plásticas transparentes (11x11x3,5) contendo duas folhas de papel de filtro. As sementes foram colocadas para germinar na presença de 20 ml de água destilada ou 20 mL de solução com potencial osmótico 43 de - 0,1 MPa, o qual foi obtido com 78,49 g L-1 de polietilenoglicol (PEG 6.000) (VILLELA et al., 1992). Para análise da germinação, foi utilizado fotoperíodo de 12 horas com iluminação fornecida por luz branca (60 μmol m² s-²), sob temperatura média de 25ºC. Figura 1. Esquema do pré-tratamento com luz em sementes de tomateiro durante 10 e 20 horas de embebição. Ao final desse período, as sementes foram postas para secar durante 48 h. É importante comentar que sementes permaneceram no escuro ou não foram pré-tratadas. E1= Experimento 1; E2= Experimento 2. 2.2. Avaliações da germinação de sementes Durante 120 horas, foi avaliada, em intervalos de 12 horas, a porcentagem de sementes germinadas. Para isso, foi considerada as sementes que emitiram a raiz primária (2 mm). Além disso, foi obtido o Índice de velocidade de germinação (IVG), o qual foi calculado de acordo com a fórmula proposta por Maguire (1962). 44 IVG= G1 N1 + G2 N 2 +…+ Gn N n , onde: IVG = índice de velocidade de germinação. G1, G2, Gn = número de plântulas computadas na primeira, na segunda ..... e última contagens. N1, N2, Nn = número de dias da semeadura à primeira, à segunda......e à ultima contagens. O tempo (horas) médio de germinação (TMG), proposto por Labouriau (1983) como segue a fórmula abaixo. TMG= / Ni Ti onde: Ni TMG = tempo médio de germinação (dias). Ni = número de sementes germinadas no intervalo entre cada contagem. Ti = tempo decorrido entre o início da germinação e a i-ésima contagem. 2.3. Crescimento Após 10 dias do início da germinação, foram selecionadas aleatoriamente 10 plântulas de cada repetição para as análises de crescimento. O comprimento das raízes e do hipocótilo foi realizado com um paquímetro digital. Posteriormente, as raízes e os hipocótilos das plântulas foram postos para secar por 48 horas a 40ºC em estufa de circulação de ar forçada para a obtenção da matéria seca. As plântulas foram pesadas em grupos de 10, as quais foram consideradas como repetição. As medidas de massa foram realizadas utilizando uma balança analítica modelo AA 200 (Denver Instrument Company) com precisão de 0,0001g. 45 2.4. Determinação do teor de pigmentos A partir dos cotilédones, foram retirados 25 mg de amostras por repetição (com amostras em duplicata) e estas foram colocadas em tubos eppendorfe acrescidos de1,5 ml de acetona P.A. A seguir, em condições de penumbra, os tubos foram envolvidos com papel alumínio e permaneceram por 48 horas sob agitação a 60 rpm a 4 ºC. Após a agitação, a solução de extração contendo os pigmentos foi utilizada para leituras nos seguintes comprimento de onda: Clorofila a em 662 nm (A662); Clorofila b em 645 nm (A645) e Carotenoides (caroteno [c]+ xantofilas [x]) em 470 nm (A470). Para o cálculo da concentração de clorofilas (Chl) e carotenóides (Car) foram utilizadas as seguintes fórmulas, segundo Lichtenthaler (1987): C a = 11,24 [𝐴661,6]− 2,04 [𝐴644,8] C b = 20,13 A644,8 − 4,19 𝐴661,6 C a + b = 7,05 𝐴661,6 + 18,09 A644,8 Cc + x = (1000 [A470 ] − 1,90 [Ca] − 63,14 [Cb])/214 onde: C a = Clorofila a C b = Clorofila b C a + b= Clorofila a + b Cc + x= Caroteno + xantofilas A = Absorbância O conteúdo de clorofilas totais (Chla+b) e carotenoides foi expresso em μg do pigmento por grama de massa fresca (μg.g-1). Para obtenção do teor de antocianinas hipocótilos foram segmentados e, a partir deles, pesados 45 mg. O material obtido foi colocado em tubos Eppendorf (2 mL) com o acréscimo de 0,48 ml de metanol acidificado (1% de HCl, v/v). Posteriormente, as amostras permaneceram sob agitação a 60 rpm por 48 horas no escuro a 4 ºC. Após este período, foram adicionados 0,36 mL de água destilada e 0,96 mL de clorofórmio. As amostras foram levadas para centrifugação por 15 46 minutos a 5.000 rpm, e o sobrenadante contendo antocianinas foi coletado para leitura da absorbância a 535 nm (A535) (PETERS et al.,1989). Para o cálculo da concentração de antocianina foi utilizada a fórmula proposta por CARVALHO et al., 2010: Ant. = 𝐴535 /45 O Conteúdo de antocianina foi expresso em μg do pigmento por grama de massa fresca (μg g-1). 2.5. Delineamento experimental e análise estatística Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 6x2 (tratamentos de luz x condições de germinação e crescimento, água e PEG). Cada tratamento foi composto por 4 repetições de 50 sementes cada (totalizando 200 sementes por tratamento). Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância pelo teste F, tendo as médias comparadas pelo teste de Tukey (p>0,05). Sendo realizada uma análise para cada experimento. Os resultado foram apresentados e discutidos em função das respostas das variáveis estudas principalmente na condição de déficit hídrico, ressaltando que os tratamentos na condição de água foram tidos como controle em relação a condição (água x PEG). 3. RESULTADOS 3.1. Experimento I 47 O pré-tratamento das sementes com luz durante 10 horas não foi suficiente para promover o incremento na germinação das sementes sob o déficit hídrico, quando comparadas a porcentagem de germinação dos pré-tratamentos de luz com o não tratado (Nt) (Tabela 1). Sementes que foram embebidas e expostas a luz verde (Vd) resultaram em uma maior porcentagem de germinação. Entretanto, esta porcentagem se diferencia apenas do tratamento com vermelho (V) e vermelho extremo (Ve). As semente pré-tratadas com Ve apresentaram porcentagem de germinação (PGM) inferior, com uma redução de 16% em comparação com Nt. Resultados semelhantes aos anteriores foram observados para o tempo médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) (Tabela 1), pois os pré-tratamentos com 10 horas de embebição e exposição a luz não foram suficientes para melhorar o TMG e o IVG em relação ao Nt em condição estressora. Entretanto, o tratamento com luz Ve apresentou o maior TMG e menor IVG comparado aos demais tratamentos. Tabela 1. Porcentagem de germinação (PGM), tempo (h) médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) em sementes de tomateiro postas para germinar em água (H2O) ou solução de polietilenoglicol (PEG; - 0,1 MPa) e pré-tratadas com luz durante 10 horas. Para os tratamentos com luz, foram considerados os seguintes comprimentos de onda: Vermelho (V); Vermelho extremo (Ve); Verde (Vd); Azul (A), bem como sementes permaneceram no escuro (E) ou não foram pré-tratadas (Nt). Tratamentos PGM TMG IVG H2O PEG H2O PEG H2O PEG Nt 98a 89ab* 72bc 97b* 0,70abc 0,47a* E 100a 91ab* 70c 94b* 0,74a 0,49a* V 100a 86b* 69c 97b* 0,74a 0,45a* Ve 98a 73c* 79a 102a* 0,64c 0,36b* Vd 99a 96a 71bc 99ab* 0,73ab 0,49a* A 98a 91ab* 76ab 97ab* 0,67bc 0,47a* Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Médias com asterisco (*) indicam diferença entre as médias na condição de estresse (PEG) e condição controle (H2O), dentro de cada variável. O comprimento de parte aérea (CPA) das plântulas do Nt e do pré-tratamento com luz azul, juntamente com o comprimento de raiz (CR) do Nt, E, Ve, e Vd foram reduzidos na condição de estresse, quando comparados com a condição controle 48 (Tabela 2). Entretanto, na condição estressora não houve diferença do CPA e CR entre as médias dos tratamentos. O mesmo fato pode ser verificado para matéria seca de parte aérea (MSPA) e raiz (MSR), ou seja, os pré-tratamentos com luz não proporcionaram diferença no acúmulo de matéria seca das plântulas com relação ao Nt (Tabela 2). Tabela 2. Comprimento (cm) de parte aérea (CPA), comprimento (cm) de raiz (CR), biomassa (g) seca de parte aérea (MSPA), biomassa (g) seca de raiz (MSR) de plântulas de tomateiro advindas de sementes postas para germinar em água (H2O) ou solução de polietilenoglicol (PEG; - 0,1 MPa) e pré-tratadas com luz durante 10 horas. Para os tratamentos com luz, foram considerados os seguintes comprimentos de onda: Vermelho (V); Vermelho extremo (Ve); Verde (Vd); Azul (A), bem como sementes permaneceram no escuro (E) ou não foram pré-tratadas (Nt). Tratramentos CPA CR MSPA MSR H2O PEG H2O PEG H2O PEG H2O PEG Nt 3,31a 1,77a* 8,07a 5,35a* 0,0129a 0,0118ab 0,0053a 0,0049a E 2,41b 2,15a 9,46a 6,30a* 0,0126a 0,0132ab 0,0060a 0,0049a* V 2,51ab 2,19a 7,44a 6,18a 0,0134a 0,0109b* 0,0053a 0,0044a* Ve 2,64ab 2,17a 8,79a 6,34a* 0,0129a 0,0124ab 0,0049ab 0,0047a Vd 2,59ab 2,16a 8,08a 5,98a* 0,0123a 0,0127ab 0,0049ab 0,0045a A 2,90ab 2,03a* 7,49a 6,05a 0,0135a 0,0139a 0,0039b 0,0048a* Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Médias com asterisco (*) indicam diferença entre as médias na condição de estresse (PEG) e condição controle (H2O), dentro de cada variável. Os teores de clorofila total foram reduzidos na condição de estresse comparada com a condição de água, exceto para a o tratamento V (Tabela 3). Contudo, não houve diferença nos teores de clorofila total dos tratamentos, mesmo quando comparados ao Nt. Os teores de carotenoides não diferiram entre os tratamentos e as condições hídricas (Tabela 3). Para antocianina também não foram encontradas diferenças entre os tratamentos e as condições, exceto as plântulas cuja as sementes foram anteriormente tratadas com luz V, a qual apresentou diminuição no teor de antocianina na condição de estresse comparada com a condição de água (Tabela 3). 49 Tabela 3. Teores (µg/mg de cotilédone) de clorofila totais (CLR Totais), carotenoides (µg/mg de cotilédone) (CAR) e antocianinas(µg/mg de cotilédone) (ANT) de hipocótilo) em plântulas de tomateiro advindas de sementes postas para germinar em água (H2O) ou solução de polietilenoglicol (PEG; - 0,1 MPa) e pré-tratadas com luz durante 10 horas. Para os tratamentos com luz, foram considerados os seguintes comprimentos de onda: Vermelho (V); Vermelho extremo (Ve); Verde (Vd); Azul (A), bem como sementes permaneceram no escuro (E) ou não foram pré-tratadas (Nt). Tratramentos CLR Totais CAR ANT H2O PEG H2O PEG H2O PEG NT 0,40432a 0,32579a* 0,11666a 0,10273a 0,00547a 0,00601a E 0,35909a 0,29668a* 0,10823a 0,09105a 0,00521a 0,00516a V 0,39055a 0,34600a 0,09431a 0,10594a 0,00683a 0,00493a* Ve 0,37964a 0,29953a* 0,10810a 0,09948a 0,00479a 0,00578a Vd 0,42259a 0,32704a* 0,11880a 0,10466a 0,00688a 0,00606a A 0,43492a 0,33807a* 0,12015a 0,10467a 0,00548a 0,00674a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Médias com asterisco (*) indicam diferença entre as médias na condição de estresse (PEG) e condição controle (H2O), dentro de cada variável. 3.2. Experimento II O potencial osmótico de -0,1 MPa reduziu a germinação das sementes de tomateiro não tratadas (14%). Bem como as pré-tratadas com luz Ve (17%), Vd (36%) e A (22%) durante 20 horas, comparada com a condição de água (Tabela 4). O pré-tratamento com luz vermelha proporcionou a maior porcentagem de germinação sob condição de estresse, contudo não diferencia-se do Nt e do escuro (E). O pré-tratamento com luz Vd ocasionou em uma menor porcentagem de germinação na condição de estresse, uma redução de 34%, quando comparado com o pré-tratamento de luz V. Pode-se observar que o TMG na condição de estresse foi superior em relação às sementes germinadas em água, independente da luz aplicada, até mesmo as sementes que não receberam tratamento; fato inverso pode ser verificado para o IVG, onde nas mesmas condições ocorreu uma redução (Tabela 4). O pré- tratamento com luz V melhorou o TMG e o IVG das sementes na condição 50 estressora comparado como o Nt. O pré-tratamento com luz Vd, A, Ve e Nt apresentaram os maiores TMG e menores IVG respectivamente (Tabela 4). Tabela 4. Porcentagem de germinação (PGM), tempo (h) médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) em sementes de tomateiro postas para germinar em água (H2O) ou solução de polietilenoglicol (PEG; - 0,1 MPa) e pré-tratadas com luz durante 20 horas. Para os tratamentos com luz, foram considerados os seguintes comprimentos de onda: Vermelho (V); Vermelho extremo (Ve); Verde (Vd); Azul (A), bem como sementes permaneceram no escuro (E) ou não foram pré-tratadas (Nt). Tratramentos PGM TMG IVG H2O PEG H2O PEG H2O PEG Nt 92a 78ab* 68ab 90ab* 0,71ab 0,45bc* E 91a 85ab 56b 77bc* 0,87a 0,59ab* V 94a 92a 64ab 76c* 0,83a 0,66a* Ve 93a 76b* 67ab 88abc* 0,73ab 0,45bc* Vd 91a 58c* 75a 92a* 0,64ab 0,34c* A 93a 71bc* 72a 91ab* 0,69b 0,41c* Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Médias com asterisco (*) indicam diferença entre as médias na condição de estresse (PEG) e condição controle (H2O), dentro de cada variável. Os pré-tratamentos com Ve, Vd e A apresentaram os menores CPA na condição estressora. Contudo, os tratamentos com V e E não se diferenciaram do Nt (Tabela 5). O CPA das plântulas da condição estressora do Nt, Ve, Vd e A foi reduzido em relação a condição de água. Na condição de baixo potencial osmótico, verifica-se para CR não haver diferença entre o Nt e as demais condições de luz. Enquanto é caracterizado um aumento no CR do Nt, E, V e Ve ao se considerar a condição de água. Constata-se também não haver diferença entre as médias da MSPA e MSR dos pré-tratamentos comparadas ao Nt. 51 Tabela 5. Comprimento (cm) de parte aérea (CPA), comprimento (cm) de raiz (CR), biomassa (g) seca de parte aérea (MSPA), biomassa (g) seca de raiz (MSR) de plântulas de tomateiro advindas de sementes postas para germinar em água (H2O) ou solução de polietilenoglicol (PEG; - 0,1 MPa) e pré-tratadas com luz durante 20 horas. Para os tratamentos com luz, foram considerados os seguintes comprimentos de onda: Vermelho (V); Vermelho extremo (Ve); Verde (Vd); Azul (A), bem como sementes permaneceram no escuro (E) ou não foram pré-tratadas (Nt). Tratamentos CPA CR MSPA MSR H2O PEG H2O PEG H2O PEG H2O PEG Nt 3,17a 2,57a* 7,69ab 9,29a* 0,0116a 0,0116a 0,0054a 0,0061a E 2,66b 2,64a 7,74ab 9,62a* 0,0110a 0,0112a 0,0049a 0,0068a* V 2,62b 2,63a 6,52bc 9,61a* 0,0114a 0,0122a 0,0054a 0,0070a* Ve 3,04a 2,18b* 5,79c 8,48a* 0,0124a 0,0111a 0,0050a 0,0063a* Vd 2,53b 2,23b* 8,73a 8,92a 0,0130a 0,0123a 0,0061a 0,0061a A 2,50b 2,08b* 8,42a 9,28a 0,0121a 0,0111a 0,0057a 0,0062a Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Médias com asterisco (*) indicam diferença entre as médias na condição de estresse (PEG) e condição controle (H2O), dentro de cada variável. As médias dos teores de clorofila total e carotenoides não apresentaram diferença na condição estressora (Tabela 6). Os pré-tratamentos com V e Ve tiveram uma redução dos teores dos mesmos pigmentos na condição de estresse comparada com a condição de água para os respectivos tratamentos (Tabela 6). Para a antocianina, o maior teor foi observado nas plântulas que tiveram suas sementes pré-tratadas durante 20 horas com luz Vd e submetidas à restrição. 52 Tabela 6. Teores (µg/mg de cotilédone) de clorofila totais (CLR Totais), carotenoides (µg/mg de cotilédone) (CAR) e antocianinas (µg/mg de cotilédone) (ANT) de hipocótilo) em plântulas de tomateiro advindas de sementes postas para germinar em água (H2O) ou solução de polietilenoglicol (PEG; - 0,1 MPa) e pré-tratadas com luz durante 20 horas. Para os tratamentos com luz, foram considerados os seguintes comprimentos de onda: Vermelho (V); Vermelho extremo (Ve); Verde (Vd); Azul (A), bem como sementes permaneceram no escuro (E) ou não foram pré-tratadas (Nt). Tratamentos CLR Totais CAR ANT H2O PEG H2O PEG H2O PEG Nt 0,38368bc 0,34004a 0,10240b 0,09951a 0,00398bc 0,00538b* E 0,32607c 0,29721a 0,08541b 0,08528a 0,00571ab 0,00634b V 0,57366a 0,37963a* 0,14514a 0,10605a* 0,00291c 0,00532b* Ve 0,51747ab 0,23690a* 0,13773a 0,07323a* 0,00414abc 0,00615b* Vd 0,3260c 0,29661a 0,08634b 0,08712a 0,00616a 0,00856a* A 0,34179c 0,28346a 0,0844b 0,08052a 0,00527ab 0,00730ab* Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Médias com asterisco (*) indicam diferença entre as médias na condição de estresse (PEG) e condição controle (H2O), dentro de cada variável. 4. DISCUSSÃO O condicionamento fisiológico por meio de pré-tratamentos de sementes com diferentes soluções tem sido uma importante estratégia para melhorar a germinação e o crescimento de muitas espécies sob estresses abióticos. Dessa forma, visto que muito tem sido mostrado que a qualidade da luz fortemente pode controlar a germinação e o crescimento de plantas, foi esperado que o pré-tratamento com V, Ve, Vd e A associado ao hidrocondicionamento fosse capaz de induzir em sementes e plântulas de tomateiro a tolerância ao déficit hídrico. O que de fato aconteceu, pois o pré-tratamento das sementes durante 20 horas com luz V melhorou o TMG e IVG, comparado ao Nt, (Tabela 4). Essa melhora pode ser atribuída a luz V, já que não houve diferença do E em relação ao Nt. A luz vermelha ao ser percebida pelos fitocromos desencadeia uma série processos bioquímicos como aumento da biossíntese de giberilina (GA3) um importante precursor da germinação, o que ocorre logo após a reidratação da semente (TOYOMASU et al., 1998). 53 Adicionalmente o condicionamento fisiológico faz com que o processo de germinação se inicie, ocorrendo reparo de danos ocasionados nos tecidos e moléculas, síntese de enzimas, degradação de macromoléculas, como amido, e com isso a retomada do crescimento do eixo embrionário, ao passo que não ocorra à protrusão da radícula, sem afetar negativamente a capacidade de tolerância da semente a dessecação. Assim, posteriormente posta para germinar, a semente completará o processo de germinação mais rapidamente e com uma maior uniformidade, quando comparada com aquelas sementes não tratadas (LEE; KIM, 2000; BEWLEY; BLACK, 2013; PAPARELLA et al., 2015). Aliado a uma germinação mais rápida e uniforme, é possível que as plântulas também possam aumentar o seu crescimento e acúmulo de biomassa seca devido a maior absorção de água, mesmo sob condição de estresse abiótico (YAGMUR; KAYDAN, 2008), porém não foram encontrados aumentos no crescimento das plântulas em ambos os experimentos. Os fitocromos são cromoproteínas interconversíveis entre a forma inativa e ativa. Quando a forma inativa absorve luz vermelha ou até mesmo um pouco de luz azul, altera a conformação estrutural de seu cromóforo e se converte na forma ativa (Fve), e ao absorver na faixa do vermelho extremo retorna à forma inativa (Fv) (VICTÓRIO; LAGES, 2009). Na maioria das sementes, a maior taxa germinativa ocorre na região vermelha, seguido por uma zona de inibição na região do vermelho extremo (PIÑA-RODRIGUES,1988; SMITH, 2000). A forma ativa do fitocromo é responsável pelo estimulo à germinação das sementes de várias espécies. Este estimulo a germinação é depende do balanço entre Fve/Fv, e quando essa taxa é maior, as sementes são estimuladas a germinação. Por outro lado, quando a razão Fve/Fv é menor, ocorre a inibição da germinação, o que provavelmente pode ter ocorrido no experimento II, onde sementes pré-tratadas durante 20 horas com Ve resultou em uma menor porcentagem de germinação em relação as sementes pré- tratadas com V. O pré-tratamento das sementes com luz verde durante 20 horas reduziu consideravelmente a porcentagem da germinação (36%) quando observado o pré- tratamento durante 10 horas com a mesma luz (58% e 96%, respectivamente), sugerindo assim uma resposta antagônica da luz verde à germinação de sementes 54 de tomateiro, o que leva a crer que a maior porcentagem de germinação (96%) deve-se apenas a embebição das sementes (Tabela 1 e 4). Baixos teores de clorofilas e carotenóides podem atuar como fortes indicadores de estresse abiótico (AHMAD et al., 2010; ZHU et al., 2014), desta forma os teores destes pigmentos foram reduzidos na condição de estresse, porém, não houve diferença entre os tratamentos sob déficit hídrico em ambos os experimentos (Tabela 3 e 6). O aumento nos teores das antocianinas podem ocorrer com a função de atenuar os danos ocasionados pelo estresse, de fato isto aconteceu em plântulas que tiveram suas sementes pré-tratadas com 20 horas de exposição à luz Vd, apenas este tratamento apresentou maior teor de antocianinas (Tabela 6), o que reforça o fato de que a luz verde pode agir como antagonista à germinação de sementes de tomateiro, pois o mesmo tratamento apresentou a menor porcentagem de germinação (58%) sob déficit hídrico (Tabela 4). 4.1. Considerações O sucesso do condicionamento fisiológico é fortemente correlacionado com a espécie bem como o método de condicionamento aplicado (JISHA et al., 2013; PAPARELLA et al., 2011. Dessa forma, embora apenas o pré-tratamento com V possa melhorar a germinação de sementes, é necessário considerar que diferentes períodos de exposição e qualidade da luz associados ao hidrocondicionamento podem ainda ser explorados com o objetivo de induzir a tolerância de tomateiro, bem como de outras espécies economicamente importantes, a estresses abióticos.Com isto conclui-se que o pré-tratamento de sementes de tomateiro com luz vermelha durante 20 horas pode induzir tolerância ao déficit hídrico. 5. REFERÊNCIAS 55 AHMAD, M.; CASHMORE, A. R. HY4 gene of A. thaliana encodes a protein with characteristics of a blue-light receptor. Nature, 366, 162–166, 1993. BEWLEY, J. D.; BRADFORD, K. J.; HILHORST, H. W. M.; NONOGAKI, H. Seeds: Physiology of development, germination and dormancy. 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