UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química NuBBE-Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais Fungos endofíticos em Eugenia brasiliensis: prospecção química, biológica, enzimática e avaliação do co-cultivo e epigenética em Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. Carolina Rabal Biasetto Araraquara 2016 CAROLINA RABAL BIASETTO Fungos endofíticos em Eugenia brasiliensis: prospecção química, biológica, enzimática e avaliação do co-cultivo e epigenética em Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientadora: Profa. Dra. Angela Regina Araujo Co-orientadora: Profa. Dra. Daniela A. Bocchini Martins Araraquara 2016 DADOS CURRICULARES Dados Pessoais Nome: Carolina Rabal Biasetto Filiação: Antonio Carlos Biasetto e Maria Cecília Rabal Biasetto Nascimento: 17/04/1986 - Tabatinga-SP-Brasil. Endereço Profissional NuBBE “Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisilogia de Produtos Naturais” Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química de Araraquara - Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”- UNESP, Araraquara - SP. Endereço eletrônico: carolinarabal@yahoo.com.br Formação Acadêmica 2008 Graduação: Licenciatura em Química Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”- UNESP- Instituto de Química de Araraquara- SP. 2009-2011 Mestrado: Química, Área de Concentração - Química Orgânica Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”- UNESP- Instituto de Química de Araraquara- SP. Dissertação: Avaliação Química e Biológica do Fungo Endofítico Schizophyllum commune Isolado de Alchornea glandulosa. Orientadora: Profa. Dra. Angela Regina Araujo Bolsa: FAPESP 2012-2016 Doutorado: Química, Área de Concentração - Química Orgânica Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho”- UNESP- Instituto de Química de Araraquara- SP. Tese: Fungos endofíticos em Eugenia brasiliensis: prospecção química, biológica, enzimática e avaliação do co-cultivo e epigenética em Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. Orientadora: Profa. Dra. Angela Regina Araujo Co-orientadora: Profa. Dra. Daniela Alonso Bocchini Martins Bolsa: CNPq Produção Bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos a) PALOMINO GARCÍA, L. R. P.; BIASETTO, C. R.; ARAUJO, A. R.; DEL BIANCHI, V. L. Enhanced extraction of phenolic compounds from coffee industry’s residues through solid state fermentation by Penicillium purpurogenum. Food Science and Technology, v.35, n.4, p. 704-711, 2015. b) LISBOA, H. C. F.; BIASETTO, C. R.; MEDEIROS, J. B.; ARAUJO, A. R.; SILVA, D. H. S.; TELES, H. L.; TREVISAN, H. C. Endophytic fungi producing of esterases: evaluation in vitro of the enzymatic activity using pH indicator. Brazilian Journal of Microbiology, v. 44, n.3, p. 923-926, 2013. c) CHAPLA, V. M.; BIASETTO, C. R.; ARAUJO, A. R. Fungos endofíticos: uma fonte inexplorada e sustentável de novos e bioativos produtos naturais. Revista Virtual de Química, v. 5, p. 421-437, 2013. Trabalhos recentes publicados em anais de eventos a) BIASETTO, C. R.; SOMENSI, A.; BOLZANI, V. S.; YOUNG, M. C. M.; ARAUJO, A. R. Metabolites of Xylaria cubensis and Colletotrichum sp., endophytic fungi from Eugenia brasiliensis. In: 5nd Brazilian Conference on Natural Products (5nd BCNP) and the XXXI Annual Meeting on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (XXXI RESEM), 2015, Atibaia-SP, Brasil. b) LOPES, J. R.; ARAUJO, A. R.; BIASETTO, C. R. Fungo endofítico Diaporthe sp.: Prospecção química e biológica em meios sólidos. In: XXVII Congresso de Iniciação Científica da Unesp (CIC), 2015, Araraquara-SP, Brasil. c) FOGUEL, M. V.; BIASETTO, C. R.; ARAUJO, A. R.; ZANONI, M. V. B.; SOTOMAYOR, M. D. P. T. Physical-chemistry characterization of molecularly imprinted polymers (MIP) for dye Basic Red 9. In: XIV Brazilian MRS Meeting (SBPMat), 2015, Rio de Janeiro-RJ, Brasil. d) BIASETTO, C. R.; SOMENSI, A.; MEDINA, R. P.; ARAUJO, A. R.; BOLZANI, V. S.; CAVALHEIRO, A. J.; YOUNG, M. C. M.; FERREIRA, P. M. P. Metabolites produced by Diaporthe sp., an endophytic fungus from Eugenia brasiliensis (Myrtaceae). In: 31 nd Congresso Latinoamericano de Química (CLAQ-2014) and XXVII Congreso Peruano de Química, 2014, Lima-Peru. e) LOPES, J. R.; ARAUJO, A. R.; BIASETTO, C. R. Prospecção química em Diaporthe sp., um endófito de Eugenia brasiliensis. In: XXVI Congresso de Iniciação Científica da Unesp (CIC), 2014, Araraquara-SP, Brasil. f) PRECCARO, M.; MEDINA, R. P.; BIASETTO, C. R.; SOMENSI, A.; YOUNG, M.C.M.; YOKOYA, N. S.; LOPES, M. N.; ARAUJO, A. R.; SILVA, D. H. S. Bioprospecção de fungos endofíticos das algas vermelhas Asparagopsis taxiformis e Pyropia spiralis. In: 37ª Reunião Anual da SBQ, 2014, Natal-RN, Brasil. g) MEDINA, R.; BIASETTO, C.; SOMENSI, A.; YOKOYA, N.; LOPES, M.; ARAUJO, A.; SILVA, D. 5-Hydroxymethylmellein: an isocoumarin derivative from na endophytic fungus from red alga Asparagopsis taxiformis. In: 62ª International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (GA), 2014, Guimarães-Portugal. h) BIASETTO, C. R.; SOMENSI, A.; BOLZANI, V. S.; CAVALHEIRO, A. J.; YOUNG, M. C. M.; ARAUJO, A. R. Endophytic fungi from Eugenia brasiliensis: a bioprospection. In: 4nd Brazilian Conference on Natural Products (4nd BCNP) and the XXX Annual Meeting on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (XXX RESEM), 2013, Natal-RN, Brasil. i) SOMENSI, A.; BIASETTO, C. R.; RUFINO, M. P.; BOLZANI, V. S.; CAVALHEIRO, A. J.; YOUNG, M. C. M.; ARAUJO, A. R. Dereplication of endophytic fungi using NMR virtual design and hyphenated techniques. In: 4nd Brazilian Conference on Natural Products (4nd BCNP) and the XXX Annual Meeting on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (XXX RESEM), 2013, Natal- RN, Brasil. j) BIASETTO, C. R.; BOLZANI, V. S.; SILVA, D. H. S.; ARAUJO, A. R. Bioactive metabolites from Schizophyllum commune, an endophytic fungus residing in Alchornea glandulosa. In: São Paulo Advanced School on Bioorganic Chemistry (ESPCA), 2013, Araraquara-SP, Brasil. Participações em Reuniões Científicas a) 5 nd Brazilian Conference on Natural Products (5 nd BCNP) and the XXXI Annual Meeting on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (XXXI RESEM), 2015, Atibaia-SP, Brasil. b) First Brazilian Workshop on Bioinformatics/Chemometrics for Metabolomics, 2015, USP, Ribeirão Preto-SP, Brasil. c) 1º Encontro Nacional de Química Biotecnológica e Agroindustrial, 2015, USP, Ribeirão Preto-SP, Brasil. d) VI Workshop do NuBBE, 2015, IQ/UNESP, Araraquara-SP, Brasil. e) 31 nd Congreso Latinoamericano de Química (CLAQ-2014) and XXVII Congreso Peruano de Química, 2014, Lima-Peru. f) Workshop dos Programas de Pós-Graduação em Química e em Biotecnologia: Entrepreneurship for Graduate in Chemistry: a Glance for Brazilian Competitiveness Innovation & Development 2014, IQ/UNESP, Araraquara-SP, Brasil. g) Simpósio Recent Advances in NMR Spectroscopy: A Powerful Tool for Fundamental and Applied Research, 2014, IQ/UNESP, Araraquara-SP, Brasil. h) VIII Reunião de Avaliação do Programa BIOTA/FAPESP, 2014, São Pedro-SP. i) 4 nd Brazilian Conference on Natural Products (4 nd BCNP) and the XXX Annual Meeting on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (XXX RESEM), 2013, Natal-RN, Brasil. j) São Paulo Advanced School on Bioorganic Chemistry (ESPCA), 2013, Araraquara- SP, Brasil. k) V Workshop do NuBBE, 2012, IQ/UNESP, Araraquara-SP, Brasil. Participações em cursos de curta duração a) Participação no curso: “Planejamento Experimental e Otimização de Bioprocessos” (Carga horária: 8h), 2015, Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP, Brasil. b) Participação no curso: “Introduction to NMR and Metabolomics”, na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química de Araraquara- UNESP, 2014, SP, Brasil. c) Participação no curso: “Introduction to metabolomics and chemometrics applied to natural product chemistry”, na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química de Araraquara-UNESP, 2014, SP, Brasil. d) Participação no curso: “Aspectos práticos da interpretação de espectros de massas com ionização por electrospray e MALDi, e sua aplicação na análise do metabolismo de produtos naturais” (Carga horária: 8h), 2014, BIOTA/FAPESP, São Pedro, SP, Brasil. Supervisões a) Juliana Romano Lopes, graduanda em Química. Projeto: Fungos endofíticos: recursos renováveis na produção de metabólitos secundários novos e bioativos. Iniciação Científica desde 2014. IQ/Unesp, Araraquara-SP, CNPq. b) Amelie Sophie Schösser, aluna pelo programa IAESTE. Projeto: Prospecção química, biológica e enzimática em fungos endofíticos associados a Eugenia brasiliensis e avaliação da influência de moduladores epigenéticos. Estágio no período de 01/08/2013 a 30/09/2013. IQ/Unesp, Araraquara-SP. Aos meus queridos pais, Antonio e Maria Cecília. Meus exemplos de bondade, honestidade, respeito, caridade, perseverança e amor que servem e servirão de guia para toda minha vida. Se hoje escrevo esta tese de Doutorado, é que em todos os momentos da minha vida, recebi o apoio e um imenso incentivo para que me tornasse uma pessoa com qualidades e habilidades tanto profissional quanto pessoal. Eu tenho com certeza o melhor pai e a melhor mãe do mundo. Amo vocês. À minha querida orientadora Profa. Dra. Angela R. Araujo. Pela amizade, paciência, competência, dedicação e pelo imenso carinho e respeito com seus alunos. Suas inúmeras qualidades contribuíram para o meu crescimento profissional e pessoal. Obrigada por tudo. A senhora e sua família sempre estarão em meu coração. Ao meu querido esposo Vinicius. Pelo amor, constante incentivo, companheirismo, paciência e pelas valiosas palavras sábias e de conforto. Obrigada pelas discussões, ideias e pelo imenso auxílio na elaboração desta Tese. Obrigada por tudo. Você é meu porto seguro. Amá-lo me faz muito feliz. AGRADECIMENTOS À Deus, pela sua infinita sabedoria e benevolência que irradia e nos protegem em todos os momentos. Aos meus pais, pelo amor e carinho incondicional em todos os dias da minha vida. Muito obrigada pelas inúmeras renuncias que vocês fizeram para me proporcionar sempre o melhor. Mesmo com tantos obstáculos em nossas vidas pais, vocês conseguiram com muita garra e paciência superá-los e esses ensinamentos eu levarei para o resto da minha vida. Deus me presenteou com anjos, intitulados de pais. Quero agradecer a minha querida avó, Matilde (in memorian) pela sabedoria e exemplo de força. Ao amor da minha vida: Vinicius, pelo carinho, respeito, amor, incentivo e paciência em todos os momentos. Meu anjo da guarda. À minha eterna orientadora Profa. Dra. Angela, pela amizade, pelas incontáveis conversas e ensinamentos. Obrigada pela oportunidade em participar de um grupo tão especial como o dos Fungos Endofíticos. Aos meus eternos amigos do coração: Mônica e Ederson, Elaine e Higor, Carol e Josiel, Ju Castro, Marcos (Harry), Ju Brito e Miguel, Ju Holzbach e Maike, Andressa (Blossom), Rebeca e Camila Cotrim pela grande amizade, que carregarei comigo para o resto da vida. São amigos carinhosos, inesquecíveis, amigos leais, especiais, esforçados. Admiro vocês!! Quero estar sempre perto de vocês. Sou muito privilegiada em ter amigos/irmãos tão verdadeiros e especiais como vocês. As minhas amiguinhas: Andressa (Blossom) e Rebequinha, pela grande amizade, e pelas inúmeras conversas e conselhos sobre os erros e acertos da nossa pesquisa e vida pessoal. Aos meus amigos do coração: Daniara, Marco, Adriana, Wiliam, Paty, Júnior, Alessandra, Marco, João, Sheila, Néia, Vanessa, Miller, pela amizade tão especial e verdadeira. À minhas grandes amigas que mesmo à distância, são as minhas eternas amigas, Carol Factore e Aline Bozelli, pela amizade sincera e especial, essa que superou os limites de amizade e tornou-se laços de família. À minha sogra Maria José, ao meu sogro Donizete, a minha querida cunhada Camila e meu cunhado Heire, pelo carinho, paciência e apoio nesta trajetória. Aos amigos de grupo: Andressa, Maiara, Isabela, Mayra, Gislaine, Julia, Gustavo, Fernandinho, Yan, Juliana Romano, pela amizade, discussões, cumplicidade e pelos deliciosos jantares na casa da Profa. Angela. A minha aluna de Iniciação Científica, Juliana Romano, pela amizade e dedicação. Ao Dr. Nivaldo Boralle e a Lucineia, pela amizade e pelos espectros de RMN. À Juliana Rodrigues, João Bronzel e ao Marquinho pela paciência e ensinamentos. À minha co-orientadora Profa. Dra. Daniela A. B. Martins e à doutoranda Natália pela amizade e colaboração nos ensaios enzimáticos. À Profa. Dra. Maria Cláudia Young, Prof. Dr. Paulo Michel e Profa. Dra. Claudia Pessoa pelos ensaios biológicos. Ao Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho (Universidade Federal de São Carlos) e à Profa. Dra. Taicia Pacheco Fill (Universidade Estadual de Campinas) pela amizade e colaboração, pelas valiosas discussões e ensinamentos. Obrigada pela oportunidade de aprender novas metodologias e realizar análises em Espectrometria de Massas. À Viviane de Cassia Pereira (UFSCAR), pelos ensaios herbicidas. Aos amigos, professores e funcionários do Departamento de Química Orgânica. Aos funcionários da biblioteca e da pós-graduação pela dedicação, competência e por serem sempre prestativos. A todos os funcionários do Instituto de Química de Araraquara. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida e pelo auxílio financeiro. “Aquilo que escuto eu esqueço, Aquilo que vejo eu lembro, Aquilo que faço eu aprendo.” Confúcio “Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.” Madre Teresa de Calcutá “O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis.” Fernando Pessoa RESUMO A capacidade biossintética dos fungos endofíticos, aliado aos estudos químico e biológicos relatados para Eugenia brasiliensis, motivou a idealização do projeto, a prospecção química, biológica e enzimática em fungos endofíticos associados a folhas, caules e frutos saudáveis de Eugenia brasiliensis e a avaliação do co-cultivo e epigenética em Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp., na obtenção de novas substâncias. O isolamento dos fungos endofíticos, resultou em dezessete linhagens de fungos endofíticos, sendo estes cultivados em escala reduzida em meio líquido de batata e dextrose (PDB) e Czapek, a 25 o C, sob modo estático para obtenção dos respectivos extratos brutos em AcOEt. A avaliação metabólica destes extratos foi realizada por CCDC, HPLC-DAD e RMN de 1 H, como também a potencialidade enzimática e biológica pela avaliação das atividades antifúngica, anticolinesterásica e citotóxica, sendo que estes extratos demonstraram ser promissores. A prospecção inicial conduziu a seleção de três fungos endofíticos identificados como Xylaria cubensis (Eb_caH_5), Diaporthe sp. (Eb_caS_4), e Colletotrichum sp. (Eb_frmH_1), os quais foram cultivados (escala ampliada) em PDB para isolamento e determinação/elucidação estrutural dos metabólitos secundários. O estudo de Xylaria cubensis, resultou no isolamento de 8 substâncias, sendo da classe dos nucleosídeos, dicetopirazinas, isocumarinas e citocalasinas. De Diaporthe sp. foi isolado e identificado 8 substâncias: duas dicetopiperazinas, ácido nitropropiônico, uracila, tirosol, zygosporina D, pirrolidona (inédita) e alternariol. Colletotrichum sp. resultou no isolamento de 6 substâncias, sendo três dicetopiperazinas, além das substâncias N-(2-feniletil)acetamida, N-acetiltriptamina e metanoato de 2-hidroxibutila 3-indol (inédita). Todas as classes de substâncias produzidas por estes fungos endofíticos apresentam diversas atividades biológicas relatadas na literatura. Destaca-se a atividade fitotóxica da citocalasina D frente a coleóptilos de trigo superior ao herbicida comercial GOAL ® . Para verificar a influência na produção metabólica de Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp., utilizou-se estratégias como o co-cultivo em meio sólido (PDA) e líquido (PDB) e a epigenética (escala reduzida), nas quais os endófitos mostraram produção metabólica diferente em relação à produção das monoculturas e na ausência do modulador epigenético ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), respectivamente. As ferramentas estatísticas, como PCA (Análise de componentes principais) e PLS-DA (Análise discriminante com calibração multivariada por mínimos quadrados parciais) permitiram uma rápida identificação e localização dos perfis metabólicos dos co- cultivos comparados às monoculturas. Estes dados contribuem para o conhecimento dos perfis metabólicos, biológicos e enzimáticos dos fungos endofíticos isolados de Eugenia brasiliensis, bem como suas interações com o hospedeiro. Palavras-chave: Fungos endofíticos. Xylaria cubensis. Diaporthe sp. Colletotrichum sp. Co- cultivo. Epigenética. ABSTRACT The biosynthetic capacity of endophytic fungi, allied chemical and biological studies reported to Eugenia brasiliensis motivated the idealization of the project, prospection chemical, biological and enzymatic in endophytic fungi associated with healthy leaves, stems and fruits from Eugenia brasiliensis and evaluation co-culture and epigenetic in Xylaria cubensis, Diaporthe sp. and Colletotrichum sp., in obtaining new substances. The isolation of endophytic fungi resulted in seventeen endophytics fungi, these being cultivated in small scale on potato dextrose broth (PDB) and Czapek at 25 °C under static mode to obtain the corresponding crude extracts in AcOEt. The metabolic evaluation of these extracts was performed by CCDC, HPLC-DAD and 1 H NMR, also enzymatic and biological potential were performed by antifungal, cytotoxic, and anticholinesterase activities, and these extracts have shown promise. The preliminary prospection led to the selection of three endophytic fungi identified as Xylaria cubensis (Eb_caH_5), Diaporthe sp. (Eb_caS_4) and Colletotrichum sp. (Eb_frmad_1) which were cultivated (larger scale) in PDB for isolation and determination or structural elucidation of secondary metabolites. The study of Xylaria cubensis resulted in the isolation of eight substances, as follows: nucleoside, diketopiperazines, isocoumarins and cytochalasins class. From Diaporthe sp. was isolated and identified eight substances, as follows: two diketopiperazines, nitropropionic acid, uracil, tyrosol, zygosporin D, pyrrolidone (unpublished) and alternariol. Colletotrichum sp. resulted in the isolation of six substances, three diketopiperazines, besides the substances N-(2- phenylethyl) acetamide, Nβ-acetyltryptamine and 3-hydroxybutan-2-yl-1H-indol-3-ylacetate (unpublished). All classes of substances produced by these endophytic fungi present several biological activities reported in the literature. Noteworthy is the phytotoxic activity of cytochalasin D against wheat coleoptile higher than commercial herbicide GOAL®. To verify the influence on the metabolic production of Xylaria cubensis, Diaporthe sp. and Colletotrichum sp., used strategies such as the co-culture on solid (PDA) and liquid medium (PDB) and epigenetic (small scale), in which endophytes showed an interesting and different metabolic production when compared with the production of monocultures and the absence of epigenetic modulator SAHA, respectively. The statistical tools, such as PCA (Principal component analysis) and PLS-DA (discriminant analysis with multivariate calibration partial least squares) allowed quick identification and location of the metabolic profiles of the co- culture compared monocultures. These data will contribute to the knowledge of the metabolic profiles, biological and enzymatic of endophytic fungi isolated from Eugenia brasiliensis and their interactions with host. Keywords: Endophytic fungi. Xylaria cubensis. Diaporthe sp. Colletotrichum sp. Co-culture. Epigenetic. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema representativo de “crosstalk” entre espécies endófito-endófito. (A) “Crosstalk” entre fungos endofíticos; (B) “Crosstalk” entre fungos e bactérias endossimbiontes; (C) “Crosstalk” entre fungos e bactérias endófiticas. ....................... 37 Figura 2. Eugenia brasiliensis (a), frutos (b) e folhas (c). ........................................... 38 Figura 3. Substâncias bioativas isoladas de fungos endofíticos. .................................. 41 Figura 4. Esquema representativo da fibra de celulose. ............................................... 43 Figura 5. Fotos de Xylaria cubensis (a), Diaporthe sp. (b) e Colletotrichum sp. (c) cultivados em PDA em placa de Petri. ......................................................................... 45 Figura 6. Substâncias isoladas dos gêneros Xylaria, Diaporthe e Colletotrichum........ 46 Figura 7. Compostos isolados do co-cultivo de fungos. .............................................. 48 Figura 8. Metilação da citosina do DNA. ................................................................... 49 Figura 9. Acetilação nos resíduos de lisina da histona. ............................................... 50 Figura 10. Modificações na histona: cromatina “aberta” e “fechada”. ......................... 51 Figura 11. Estruturas de moléculas utilizadas como moduladores epigenéticos........... 52 Figura 12. Compostos isolados do cultivo de fungos com moduladores epigenéticos.. 53 Figura 13. Isolamento dos fungos endofíticos de Eugenia brasiliensis........................ 61 Figura 14. Cultivo e obtenção dos extratos brutos em PDB e Czapek (escala reduzida). ................................................................................................................................... 62 Figura 15. Isolamentos dos metabólitos da fração Eb_Xyl-Fr1, produzidos por Xylaria cubensis. ..................................................................................................................... 65 Figura 16. Isolamentos dos metabólitos da fração Eb_Xyl-Fr2, produzidos por Xylaria cubensis. ..................................................................................................................... 65 Figura 17. Isolamentos dos metabólitos da fração Eb_Xyl_5-Fr3, produzidos por Xylaria cubensis. ......................................................................................................... 66 Figura 18. Isolamentos dos metabólitos da fração Eb_Diap_4-Fr1, produzidos por Diaporthe sp. .............................................................................................................. 66 Figura 19. Isolamentos dos metabólitos da fração Eb_Diap_4-Fr3, produzidos por Diaporthe sp. .............................................................................................................. 67 Figura 20. Fracionamento de Eb_Colle_1_Fr1 e isolamento dos metabólitos da fração Eb_ Colle_1-Fr1.2, produzidos por Colletotrichum sp. ................................................ 68 Figura 21. Isolamentos dos metabólitos da fração Eb_ Colle_1-Fr2, produzidos por Colletotrichum sp. ....................................................................................................... 69 Figura 22. Regiões de micro-extração dos co-cultivos. ............................................... 70 Figura 23. Micro-extração dos co-cultivos fúngicos. .................................................. 70 Figura 24. Cultivo e obtenção dos extratos brutos em PDB com moduladores epigenéticos. ............................................................................................................... 72 Figura 25. Isolamentos dos metabólitos do extrato Diap_SAHA_500 µM , produzidos por Diaporthe sp., com o modulador SAHA 500 µM. ................................................. 72 Figura 26. Prospecção enzimática nos fungos endofíticos isolados de Eugenia brasiliensis. ................................................................................................................. 75 Figura 27. Fungos endofíticos isolados do caule de Eugenia brasiliensis. ................... 81 Figura 28. Fungos endofíticos isolados dos frutos maduros e das folhas de Eugenia brasiliensis. ................................................................................................................. 81 Figura 29. Cromatogramas dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek (λ= 254 nm) dos endófitos isolados dos frutos maduros: Eb_frmH_1 (a), Eb_frmH_2 (b), Eb_frmH_3 (c), Eb_frmH_4 (d), Eb_frmH_5 (e) e Eb_frmH_6 (f). ............................ 83 Figura 30. Cromatogramas dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek (λ= 254 nm) dos endófitos isolados de caules de E. brasiliensis: Eb_caH_1 (a), Eb_caH_3 (b), Eb_caH_4 (c), Eb_caH_5 (d), Eb_caH_6 (e), Eb_caH_7 (f), Eb_caS_1 (g), Eb_caS_2 (h), Eb_caS_3 (i) e Eb_caS_4 (j)................................................................................. 84 Figura 31. Cromatograma do extrato bruto obtido em PDB e Czapek (λ= 254 nm) do endófito isolado de folhas de E. brasiliensis: Eb_flH_1. .............................................. 85 Figura 32. Espectros de RMN de 1 H dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek dos endófitos isolados de caules de E. brasiliensis: Eb_caH_1 (a), Eb_caH_3 (b), Eb_caH_4 (c), Eb_caH_5 (d), Eb_caH_6 (e), Eb_caH_7 (f), Eb_caS_1 (g), Eb_caS_2 (h), Eb_caS_3 (i) e Eb_caS_4 (j) (DMSO-d6, 300 MHz). .................................................. 86 Figura 33. Espectros de RMN de 1 H dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek dos endófitos isolados dos frutos maduros de E. brasiliensis: Eb_frmH_1 (a), Eb_frmH_2 (b), Eb_frmH_3 (c), Eb_frmH_4 (d), Eb_frmH_5 (e) e Eb_frmH_6 (f) (DMSO-d6, 300 MHz). ......................................................................................................................... 87 Figura 34. Espectros de RMN de 1 H dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek do endófito isolado de folhas de E. brasiliensis: Eb_flH_1 (DMSO-d6, 300 MHz). .......... 87 Figura 35. Estrutura do ácido nitropropiônico. ........................................................... 88 Figura 36. Produção de xilanase (a), β-xilosidase (b), endoglucanase (c), β-glicosidase (d), amilase (e) e pectinase (f) por diferentes isolados fúngicos, em FES, tendo bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo como substratos (misturas a 1:1 m/m). ................... 92 Figura 37. Cromatogramas do extrato bruto de Xylaria cubensis em PDB (escala ampliada). ................................................................................................................... 95 Figura 38. Espectro de RMN de 1 H do extrato bruto de X. cubensis em PDB (escala ampliada) (DMSO-d6, 300 MHz). ............................................................................... 96 Figura 39. Cromatogramas do extrato bruto de Colletotrichum sp. em PDB (escala ampliada). ................................................................................................................... 96 Figura 40. Espectro de RMN de 1 H do extrato bruto de Colletotrichum sp. em PDB (escala ampliada) (DMSO-d6, 300 MHz). .................................................................... 96 Figura 41. Cromatogramas do extrato bruto de Diaporthe sp. em PDB (escala ampliada). ................................................................................................................... 97 Figura 42. . Espectro de RMN de 1 H do extrato bruto de Diaporthe sp. em PDB (escala ampliada) (DMSO-d6, 300 MHz). ............................................................................... 97 Figura 43. Comparação dos cromatogramas dos extratos brutos de Xylaria cubensis, Colletotrichum sp. e Diaporthe sp. em PDB (escala ampliada) a λ= 254 nm................ 97 Figura 44. Comparação dos espectros de RMN de 1 H dos extratos brutos de Xylaria cubensis, Colletotrichum sp. e Diaporthe sp. em PDB (escala ampliada) (DMSO-d6, 300 MHz). ......................................................................................................................... 98 Figura 45. Inibição/estímulo do crescimento dos coleóptilos de trigo sob a atividade dos extratos brutos em escala ampliada (PDB). ........................................................... 99 Figura 46. Substâncias produzidas pelo fungo endofítico X. cubensis cultivado em PDB. ......................................................................................................................... 101 Figura 47. Estrutura da substância 1 (Adenosina). .................................................... 102 Figura 48. Principais correlações de HMBC da substância 1. ................................... 103 Figura 49. Espectro de RMN de 1 H da substância 1 (DMSO-d6, 600 MHz). ............. 104 Figura 50. Mapa de contorno de HSQC da substância 1 (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 105 Figura 51. Mapa de contorno de HMBC da substância 1 (DMSO-d6, 600 MHz)....... 105 Figura 52. Mapa de contorno de COSY da substância 1 (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 106 Figura 53. Espectro de Massas da substância 1. ........................................................ 106 Figura 54. Estrutura da substância 2 (ciclo(Pro-Tyr)). .............................................. 107 Figura 55. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 2. ..................... 108 Figura 56. Espectro de RMN de 1 H da substância 2 (DMSO-d6, 600 MHz). ............. 109 Figura 57. Mapa de contorno de HSQC da substância 2 (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 110 Figura 58. Mapa de contorno de HMBC da substância 2 (DMSO-d6, 600 MHz)....... 110 Figura 59. Mapa de contorno de COSY da substância 2 (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 111 Figura 60. Estrutura das substâncias 3 (ciclo(Pro-Val)) (a) e 4 (ciclo(Val-Tyr)) (b) .. 111 Figura 61. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 3. ..................... 112 Figura 62. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 4. ..................... 113 Figura 63. Espectro de RMN de ¹H da substância 3 e 4 (DMSO-d6, 600 MHz). ........ 114 Figura 64. Mapa de contorno de HSQC da substância 3 e 4 (DMSO-d6, 600 MHz). . 115 Figura 65. Mapa de contorno de HMBC da substância 3 e 4 (DMSO-d6, 600 MHz). 115 Figura 66. Mapa de contorno de COSY da substância 3 e 4 (DMSO-d6, 600 MHz). . 116 Figura 67. Estrutura da substância 5 (5-carbóxi-6-hidroxi-3-metil-3,4- dihidroisocumarina). ................................................................................................. 116 Figura 68. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 5. ..................... 117 Figura 69. Espectro de RMN de ¹H das substâncias 5 (CH3OH-d4, 600 MHz). ......... 119 Figura 70. Mapa de contorno de HSQC da substância 5 (CH3OH-d4, 600 MHz)....... 120 Figura 71. Mapa de contorno de HMBC da substância 5 (CH3OH-d4, 600 MHz). .... 120 Figura 72. Mapa de contorno de COSY da substância 5 (CH3OH-d4, 600 MHz)....... 121 Figura 73. Estrutura da substância 6 (7-hidroximeleína). .......................................... 121 Figura 74. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 6. ..................... 122 Figura 75. Espectro de RMN de 1 H da substância 6 (CH3OH-d4, 600 MHz). ............ 123 Figura 76. Mapa de contorno de HSQC da substância 6 (CH3OH-d4, 600 MHz)....... 124 Figura 77. Mapa de contorno de HMBC da substância 6 (CH3OH-d4, 600 MHz). .... 124 Figura 78. Mapa de contorno de COSY da substância 6 (CH3OH-d4, 600 MHz)....... 125 Figura 79. Estrutura da substância 7 (citocalasina D)................................................ 125 Figura 80. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 7. ..................... 126 Figura 81. Inibição/estímulo do crescimento dos coleóptilos de trigo sob a atividade da citocalasina D. .......................................................................................................... 128 Figura 82. Espectro de RMN de ¹H da substância 7 (CH3OH-d4, 300 MHz). ............ 129 Figura 83. Espectro de RMN de 13 C da substância 7 (CH3OH-d4, 300 MHz). ........... 130 Figura 84. Mapa de contorno de HMBC da substância 7 (CH3OH-d4, 300 MHz). .... 131 Figura 85. Mapa de contorno de HSQC da substância 7 (CH3OH-d4, 300 MHz)....... 132 Figura 86. Mapa de contorno de COSY da substância 7 (CH3OH-d4, 300 MHz)....... 132 Figura 87. Estrutura da substância 8 (citocalasina C). ............................................... 133 Figura 88. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 8. ..................... 133 Figura 89. Espectro de RMN de ¹H da substância 8 (DMSO-d6, 600 MHz). ............. 135 Figura 90. Espectro de RMN de 13 C da substância 8 (DMSO-d6, 600 MHz). ............ 136 Figura 91. Mapa de contorno de HSQC da substância 8 (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 137 Figura 92. Mapa de contorno de HMBC da substância 8 (DMSO-d6, 600 MHz)....... 137 Figura 93. Mapa de contorno de COSY da substância 8 (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 138 Figura 94. Espectro de Massas da substância 8. ........................................................ 138 Figura 95. Substâncias produzidas pelo fungo endofítico Diaporthe sp. cultivado em PDB. ......................................................................................................................... 139 Figura 96. Estrutura da substância 9 (Uracila). ......................................................... 140 Figura 97. Espectro de RMN de 1 H da substância 9 (DMSO-d6, 300 MHz). ............. 141 Figura 98. Estrutura da substância 10 (Tirosol). ....................................................... 141 Figura 99. Espectro de RMN de ¹H da substância 10 (DMSO-d6, 300 MHz). ........... 142 Figura 100. Estrutura da substância 11 (Zygosporina D). ......................................... 143 Figura 101. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 11................... 143 Figura 102. Espectro de RMN de ¹H da substância 11 (CDCl3, 600 MHz). ............... 145 Figura 103. Mapa de contorno de HMBC da substância 11 (CDCl3, 600 MHz). ....... 146 Figura 104. Mapa de contorno de HSQC da substância 11 (CDCl3, 600 MHz). ........ 147 Figura 105. Mapa de contorno de COSY da substância 11 (CDCl3, 600 MHz). ........ 147 Figura 106. Espectro de Massas da substância 11. .................................................... 148 Figura 107. Estrutura da substância 12 (5-isobutil-3,4-dimetil-1H-pirrol-2(5H)-ona). ................................................................................................................................. 148 Figura 108. Estrutura parcial A. ............................................................................... 149 Figura 109. Estrutura parcial B................................................................................. 149 Figura 110. União das estruturas parciais A e B. ...................................................... 149 Figura 111. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 12................... 150 Figura 112. Espectro de RMN de ¹H da substância 12 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 152 Figura 113. Espectro de RMN de 13 C da substância 12 (DMSO-d6, 600 MHz). ........ 153 Figura 114. Mapa de contorno de HSQC da substância 12 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 154 Figura 115. Mapa de contorno de HMBC da substância 12 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 154 Figura 116. Mapa de contorno de COSY da substância 12 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 155 Figura 117. Espectro de Massas da substância 12. .................................................... 155 Figura 118. Estrutura da substância 13 (Alternariol). ................................................ 156 Figura 119. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 13................... 156 Figura 120. Espectro de RMN de 1 H da substância 13 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 158 Figura 121. Mapa de contorno de HSQC da substância 13 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 159 Figura 122. Mapa de contorno de HMBC da substância 13 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 159 Figura 123. Espectro de Massas da substância 13. .................................................... 160 Figura 124. Substâncias produzidas pelo fungo endofítico Colletotrichum sp. cultivado em PDB. ................................................................................................................... 161 Figura 125. Estrutura da substância 14 ciclo(Pro-Ile). .............................................. 162 Figura 126. Espectro de RMN de ¹H da substância 14 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 163 Figura 127. Mapa de contorno de HSQC da substância 14 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 163 Figura 128. Estrutura da substância 15 ciclo(Pro-Leu).............................................. 164 Figura 129. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 15................... 164 Figura 130. Espectro de RMN de ¹H da substância 15 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 166 Figura 131. Mapa de contorno de HSQC da substância 15 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 167 Figura 132. Mapa de contorno de HMBC da substância 15 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 167 Figura 133. Mapa de contorno de COSY da substância 15 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 168 Figura 134. Estrutura da substância 16 (N-(2-feniletil) acetamida). .......................... 169 Figura 135. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 16................... 170 Figura 136. Espectro de RMN de ¹H da substância 16 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 171 Figura 137. Mapa de contorno de HSQC da substância 16 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 172 Figura 138. Mapa de contorno de HMBC da substância 16 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 172 Figura 139. Mapa de contorno de COSY da substância 16 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 173 Figura 140. Espectro de Massas da substância 16. .................................................... 173 Figura 141. Estrutura da substância 17 (N-acetiltriptamina). .................................... 174 Figura 142. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 17................... 175 Figura 143. Espectro de RMN de ¹H da substância 17 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 176 Figura 144. Mapa de contorno de HSQC da substância 17 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 177 Figura 145. Mapa de contorno de HMBC da substância 17 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 177 Figura 146. Mapa de contorno de COSY da substância 17 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 178 Figura 147. Espectro de Massas da substância 17 ..................................................... 178 Figura 148. Estrutura da substância 18 (metanoato de 2-hidroxibutila 3-indol). ........ 179 Figura 149. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 18................... 180 Figura 150. Espectro de RMN de ¹H da substância 18 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 181 Figura 151. Mapa de contorno de HSQC da substância 18 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 182 Figura 152. Mapa de contorno de HMBC da substância 18 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 182 Figura 153. Mapa de contorno de COSY da substância 18 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 183 Figura 154. Espectro de Massas: molécula protonada ([M+H] + ) e principais fragmentos da substância 18. ....................................................................................................... 183 Figura 155. Estrutura da substância 19 ciclo(Pro-Phe). ............................................. 184 Figura 156. Principais correlações de COSY e HMBC da substância 19................... 184 Figura 157. Espectro de RMN de ¹H da substância 19 (DMSO-d6, 600 MHz). ......... 186 Figura 158. Mapa de contorno de HSQC da substância 19 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 187 Figura 159. Mapa de contorno de HMBC da substância 19 (DMSO-d6, 600 MHz). .. 187 Figura 160. Mapa de contorno de COSY da substância 19 (DMSO-d6, 600 MHz). ... 188 Figura 161. Co-cultivos realizados entre: Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. ..................................................................................................... 190 Figura 162. Cromatogramas dos extratos de: Xylaria cubensis (a), Diaporthe sp. (b) e co-cultivo (c)............................................................................................................. 192 Figura 163. Cromatogramas de íons extraídos para m/z 497-498 (-) dos extratos de: Xylaria cubensis (a), Diaporthe sp. (b) e co-cultivo (c). ............................................ 192 Figura 164. Cromatogramas de íons extraídos para m/z 543-544 (-) dos extratos de: Xylaria cubensis (a), Diaporthe sp. (b) e co-cultivo (c). ............................................ 193 Figura 165. Espectro de massas (alta resolução), referente aos picos produzidos pelo co-cultivo e propostas de fórmulas moleculares. ........................................................ 194 Figura 166. Propostas geradas pelo banco AntiBase aos metabólitos de m/z 497,2776 [M-H] - . ..................................................................................................................... 194 Figura 167. Propostas geradas pelo banco AntiBase aos metabólitos de m/z 543,2831 [M-H] - . ..................................................................................................................... 195 Figura 168. Fragmentação do metabólito de m/z 497,2776 [M-H] - . .......................... 196 Figura 169. Fragmentação do metabólito de m/z 543,2831 [M-H] - . .......................... 196 Figura 170. Propostas geradas pelo Dicionário de Produtos Naturais aos metabólitos com a massa molecular na faixa de 498 a 499 g mol -1 . .............................................. 197 Figura 171. Propostas geradas pelos Bancos de Dados Metlin e Massbank aos metabólitos de m/z 543,2831 [M-H] - . ........................................................................ 198 Figura 172. Gráfico de scores da PLS-DA normalizado e centrado na média: PC1xPC2. ................................................................................................................................. 199 Figura 173. Gráfico de scores da PLS-DA normalizado e centrado na média: PC1xPC3. ................................................................................................................................. 199 Figura 174.Gráfico de scores da PLS-DA normalizado e centrado na média: PC1xPC2. ................................................................................................................................. 202 Figura 175. Gráfico de scores da PCA normalizado: PC1xPC2. ............................... 203 Figura 176: LC-MS (baixa resolução) dos extratos na presença do modulador SAHA: Diap_500 µM (a), do Diap_controle (b); m/z 265,2 [M+H] + (c) e m/z 271,2 [M+H] + (d). ................................................................................................................................. 206 Figura 177: LC-MS (alta resolução) dos extratos na presença do modulador SAHA: Diap_500 µM (a), do Diap_controle (b); m/z 265,0 [M+H] + (c) e m/z 271,0 [M+H] + (d). ................................................................................................................................. 207 Figura 178. Estrutura do ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA). ...................... 207 Figura 179. Espectro de RMN de 1 H do Pico 1_LC-SPE-TT (SAHA) (DMSO-d6, 600 MHz). ....................................................................................................................... 208 Figura 180. Espectro de massas do Pico 1_LC-SPE-TT (SAHA). ............................ 208 Figura 181. Estrutura da substância 20 (N-feniloctanodiamida). ............................... 209 Figura 182. Espectro de RMN de ¹H do Pico 2_LC-SPE-TT (DMSO-d6, 600 MHz). 210 Figura 183. Espectros de comparação de RMN de ¹H na região de 2,05-2,40 ppm, referente aos Pico 1_LC-SPE-TT e Pico 2_LC-SPE-TT (DMSO-d6, 600 MHz). ....... 210 Figura 184. Espectro de massas do Pico 2_LC-SPE-TT (Sub 20). ............................ 211 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Meios de cultura utilizados para o cultivo dos fungos endofíticos................ 57 Tabela 2. Equipamentos para o desenvolvimento do projeto. ...................................... 60 Tabela 3. Tempo de esterilização das folhas, frutos e ramos. ...................................... 61 Tabela 4. Dados dos fracionamentos em coluna aberta dos extratos AcOEt (escala ampliada). ................................................................................................................... 64 Tabela 5.Massas das frações obtidas do fracionamento dos extratos AcOEt (escala ampliada). ................................................................................................................... 64 Tabela 6. Massa dos extratos brutos obtida do cultivo dos endófitos dos caules, folhas e frutos maduros em PDB e Czapek (escala reduzida). ................................................... 82 Tabela 7. Avaliação dos extratos brutos frente ao fitopatógeno C. sphaerospermum e inibição da AChE. ....................................................................................................... 89 Tabela 8. Avaliação dos extratos brutos em PDB frente às células tumorais. .............. 90 Tabela 9. Avaliação dos extratos brutos em Czapek frente às células tumorais. .......... 91 Tabela 10. Avaliação dos extratos brutos em escala ampliada (PDB) frente ao fitopatógeno C. sphaerospermum e inibição da AChE. ................................................ 98 Tabela 11. Avaliação dos extratos brutos em escala ampliada (PDB) frente às células tumorais. ..................................................................................................................... 98 Tabela 12. Médias de crescimento dos coleóptilos sob o efeito dos extratos brutos de Diaporthe sp, Colletotrichum sp. e X. cubensis e do herbicida comercial GOAL ® . .... 100 Tabela 13. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 1 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 103 Tabela 14. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 2 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 108 Tabela 15. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 3 e 4 (δ em ppm e J em Hz). ........................................................................................................................... 113 Tabela 16. Dados de RMN de 1 H (CH3OH-d4, 600 MHz) de 5 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 118 Tabela 17. Dados de RMN de 1 H (CH3OH-d4, 600 MHz) de 6 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 122 Tabela 18. Dados de RMN de 1 H (CH3OH-d4, 300 MHz) de 7 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 127 Tabela 19. Médias de crescimento dos coleóptilos sob o efeito da citocalasina D e do herbicida comercial GOAL®. ................................................................................... 128 Tabela 20. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 8 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 134 Tabela 21. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 300 MHz) de 9 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 140 Tabela 22. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 300 MHz) de 10 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 142 Tabela 23. Dados de RMN de 1 H (CDCl3, 600 MHz) de 11 (δ em ppm e J em Hz)... 144 Tabela 24. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 12 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 151 Tabela 25. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 13 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 157 Tabela 26. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 14 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 162 Tabela 27. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 15 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 165 Tabela 28. Dados de RMN de 1 H e 13 C (DMSO-d6, 600 MHz) de 16 (δ em ppm e J em Hz). ........................................................................................................................... 170 Tabela 29. Dados de RMN de 1 H e 13 C (DMSO-d6, 600 MHz) de 17 (δ em ppm e J em Hz). ........................................................................................................................... 175 Tabela 30. Dados de RMN de 1 H e 13 C (DMSO-d6, 600 MHz) de 18 (δ em ppm e J em Hz). ........................................................................................................................... 180 Tabela 31. Dados de RMN de 1 H (DMSO-d6, 600 MHz) de 19 (δ em ppm e J em Hz). ................................................................................................................................. 185 Tabela 32. Massa dos extratos brutos obtida dos co-cultivos e monoculturas (PDA) dos endófitos X. cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. ......................................... 191 Tabela 33. Massa dos extratos brutos obtida dos co-cultivos e monoculturas (PDB) dos endófitos X. cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. ......................................... 200 Tabela 34. Avaliação dos extratos dos co-cultivos frente aos fitopatógenos C. cladosporioides e C. sphaerospermum (400 ug) e inibição da AChE. ........................ 201 Tabela 35. Massa dos extratos brutos obtida do cultivo de Xylaria cubensis na presença dos moduladores SAHA e AZA e do controle. .......................................................... 205 Tabela 36. Massa dos extratos brutos obtida do cultivo de Diaporthe sp. na presença dos moduladores SAHA e AZA e do controle. .......................................................... 205 Tabela 37. Massa dos extratos brutos obtida do cultivo de Colletotrichum sp. na presença dos moduladores SAHA e AZA e do controle. ............................................ 205 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS e SÍMBOLOS AChE Enzima Acetilcolinesterase HPLC High performance liquid chromatography DAD Detector de Arranjo de Diodos UV Ultravioleta PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth C18 Sílica gel de fase reversa tipo Octadecil silano CC Cromatografia em Coluna CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa ESI-EM Espectrometria de massas – Ionização por electrospray LC-MS Chromatography Liquid-Spectrometry Mass TOF Time of Flight (Tempo de vôo) SPE-TT Solid Phase Extraction-Transfer Tube Ext. Extrato grad. Gradiente min. Minutos nm Nanômetro RMN de 1 H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN de 13 C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy HMBC Gradient Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence COSY Correlation Spectroscopy HOMODEC Homonuclear Decoupling MHz/Hz Megahertz / Hertz ppm Partes por milhão TMS Tetrametilsilano NuBBE Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais pág. Página Phe Fenilalanina Tyr Tirosina http://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography Ile Isoleucina Leu Leucina Pro Prolina Val Valina rpm Rotações por minuto s Segundos Sub Substância SAHA Ácido hidroxâmico suberoilanilida AZA 5-azacitidina FES Fermentação em estado sólido HAT Histona acetiltransferase HDAC Histona desacetilase DNMT DNA metiltransferase Xyl Xylaria cubensis Diap Diaporthe sp. Colle Colletotrichum sp. PCA Análise de componentes principais PLS-DA Análise discriminante com calibração multivariada PLS Mínimos Quadrados Parciais δ Deslocamento químico λ Comprimento de onda μ Micro [α]D Rotação Óptica [M+H] + Molécula protonada [M-H] - Molécula desprotonada [M+Na] + Molécula sodiada J Constante de acoplamento s Singleto sl Singleto Largo d Dubleto dd Duplo dubleto t Tripleto m Multipleto m/z Relação massa-carga SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 33 1.1 Fungos: uma visão geral ..................................................................................... 33 1.2 Fungos Endofíticos .............................................................................................. 34 1.3 Espécie vegetal hospedeira: Eugenia brasiliensis ............................................... 37 1.4 Potencial biotecnológico dos endófitos ............................................................... 39 1.4.1 Metabólitos bioativos ........................................................................... 39 1.4.2 Enzimas ............................................................................................... 42 1.5 Gêneros: Xylaria, Diaporthe e Colletotrichum .................................................... 44 1.6 Co-cultivo ............................................................................................................ 46 1.7 Epigenética .......................................................................................................... 48 2. OBJETIVOS GERAIS .......................................................................................... 55 2.1 Objetivos Específicos ........................................................................................... 55 3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 57 3.1 Materiais .............................................................................................................. 57 3.1.1 Meios de cultivo ................................................................................................. 57 3.1.2 Solventes ............................................................................................................ 57 3.1.3 Reagentes ........................................................................................................... 57 3.1.4 Cromatografia em Coluna .................................................................................. 57 3.1.5 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) ............................... 58 3.1.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diodos (HPLC-DAD).................................................................................................................. 58 3.1.7 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono (RMN de 1 H e 13 C) .. 58 3.1.8 Espectrometria de Massas .................................................................................. 58 3.1.9 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas............ ............................................................................................................ 59 3.1.10 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a SPE-TT ......................... 59 3.1.11 Análise de rotação óptica [α] D 25 ....................................................................... 59 3.1.12 Equipamentos ................................................................................................... 60 3.2 Métodos ............................................................................................................... 60 3.2.1 Obtenção da linhagem fúngica ........................................................................... 60 3.2.2 Obtenção dos extratos brutos dos endófitos em PDB e Czapek (escala reduzida) 62 3.2.3 Obtenção dos extratos brutos de Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. em PDB (escala ampliada) .................................................................................... 63 3.2.4 Fracionamento dos extratos brutos em PDB (escala ampliada) .......................... 63 3.2.5 Isolamento dos metabólitos produzidos por Xylaria cubensis (Eb_caH_5) ......... 64 3.2.6 Isolamento dos metabólitos produzidos por Diaporthe sp. (Eb_caS_4) .............. 66 3.2.7 Isolamento dos metabólitos produzidos por Colletotrichum sp. (Eb_frmH_1) .... 67 3.2.8 Co-cultivo .......................................................................................................... 69 3.2.8.1 Co-cultivo em meio sólido (PDA) .................................................................... 69 3.2.8.2 Co-cultivo em meio líquido (PDB) ................................................................... 70 3.2.9 Epigenética ........................................................................................................ 71 3.2.10 Ensaios Biológicos ........................................................................................... 73 3.3.10.1 Avaliação da atividade antifúngica 1 .............................................................. 73 3.3.10.2 Avaliação da atividade anticolinesterásica 1 ................................................... 73 3.3.10.3 Avaliação da atividade antitumoral (citotoxicidade) 2 .................................... 73 3.3.10.4 Avaliação da atividade fitotóxica sobre o crescimento de coleóptilos de trigo (Triticum aestivum L.) 3 ................................................................................................ 74 3.2.11 Prospecção Enzimática .................................................................................... 74 3.2.11.1 Xilanase ........................................................................................................ 76 3.2.11.2 -xilosidase ................................................................................................... 76 3.2.11.3 Endoglucanase .............................................................................................. 76 3.2.11.4 -glicosidase ................................................................................................. 76 3.2.11.5 Pectinase ....................................................................................................... 77 3.2.11.6 Amilase ......................................................................................................... 77 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................. 78 4. Isolamento de fungos endofíticos associados à Eugenia brasiliensis e prospecção química, biológica e enzimática dos extratos brutos produzidos pelos fungos endofíticos isolados. ................................................................................................... 80 4.1 Fungos isolados do caule, dos frutos maduros e das folhas ............................... 80 4.2. Prospecção química dos fungos endofíticos isolados ......................................... 82 4.2.1 Rendimento dos extratos brutos obtidos pelo cultivo em escala reduzida ............ 82 4.2.2 Perfil cromatográfico dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek (escala reduzida).......................................................................................................................... 83 4.2.3 Perfil químico (RMN de 1 H) dos extratos brutos obtidos em PDB e Czapek (escala reduzida).......................................................................................................................... 85 4.2.4 Avaliação das atividades biológicas dos extratos brutos (escala reduzida) produzidos pelos fungos endofíticos isolados dos caules, frutos maduros e folhas ....... 88 4.2.4.1 Ensaio antifúngico e anticolinesterásico .......................................................... 88 4.2.4.2 Ensaio antitumoral .......................................................................................... 90 4.2.5 Prospecção enzimática ....................................................................................... 91 5. Estudo dos metabólitos de Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. . 95 5.1 Avaliação do perfil químico e cromatográfico dos extratos brutos de X. cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. em escala ampliada (PDB) ................. 95 5.2 Avaliação do perfil biológico dos extratos brutos de X. cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. em escala ampliada (PDB) .......................................................... 98 5.2.1 Avaliação da atividade fitotóxica sobre o crescimento de coleóptilos de trigo (Triticum aestivum L.) 3 ................................................................................................ 99 5.3 Identificação estrutural das substâncias produzidas por Xylaria cubensis ..... 101 5.3.1 Identificação estrutural da substância 1 ........................................................... 102 5.3.2 Identificação estrutural da substância 2 ........................................................... 107 5.3.3 Identificação estrutural das substâncias 3 e 4 ................................................... 111 5.3.4 Identificação estrutural da substância 5 ........................................................... 116 5.3.5 Identificação estrutural da substância 6 ........................................................... 121 5.3.6 Identificação estrutural da substância 7 ........................................................... 125 5.3.7 Identificação estrutural da substância 8 ........................................................... 133 5.4 Identificação estrutural das substâncias produzidas por Diaporthe sp. .......... 139 5.4.1 Identificação estrutural da substância 9 ........................................................... 140 5.4.2 Identificação estrutural da substância 10 ......................................................... 141 5.4.3 Identificação estrutural da substância 11 ......................................................... 143 5.4.4 Identificação estrutural da substância 12 ......................................................... 148 5.4.5 Identificação estrutural da substância 13 ......................................................... 156 5.5 Identificação estrutural das substâncias produzidas por Colletotrichum sp. .. 161 5.5.1 Identificação estrutural da substância 14 ......................................................... 162 5.5.2 Identificação estrutural da substância 15 ......................................................... 164 5.5.3 Identificação estrutural da substância 16 ......................................................... 169 5.5.4 Identificação estrutural da substância 17 ......................................................... 174 5.5.5 Identificação estrutural da substância 18 ......................................................... 179 5.5.6 Identificação estrutural da substância 19 ......................................................... 184 6. Co-cultivo e epigenética: Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. . 190 6.1 Co-cultivo: Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. ..................... 190 6.1.1 Co-cultivo em meio sólido (PDA) ..................................................................... 191 6.1.1.1 Análise multivariada dos dados de LC-MS do co-cultivo em PDA ................. 198 6.1.2 Co-cultivo em meio líquido (PDB) .................................................................... 200 6.1.2.1 Atividade biológica do co-cultivo em meio líquido (PDB) .............................. 201 6.1.2.2 Análise multivariada dos dados de LC-MS do co-cultivo em PDB ................. 201 6.1.2.3 Análise multivariada dos dados de RMN de 1 H do co-cultivo em PDB ........... 202 6.2 Epigenética: Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp. ................... 204 6.2.1 Cultivo dos endófitos na presença dos moduladores ......................................... 204 6.2.2 Isolamento dos metabólitos produzidos na presença do modulador SAHA ........ 207 7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 213 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 215 Introdução____________________________________________________32 Introdução Introdução____________________________________________________33 1. INTRODUÇÃO 1.1 Fungos: uma visão geral Os fungos são organismos heterotróficos, ou seja, adquirem os nutrientes no meio ambiente, parasitando outros organismos vivos ou pela decomposição de matéria orgânica. Os fungos podem infectar diferentes hospedeiros, levando-os à morte ou desenvolvendo uma relação simbiótica com os mesmos (MAUSETH, 2003; SCHARDL, 2004). Os fungos constituem o segundo maior grupo de espécies sobre a Terra, estimados em 5,1 milhões de espécies existentes, sendo que apenas 98 mil foram descritas (BLACKWELL, 2011; MOORE; ROBSON; TRINCI, 2011). Os fungos habitam praticamente todos os nichos ecológicos da Terra e possuem a capacidade de utilizar vários substratos para o seu desenvolvimento. Fungos, durante o seu desenvolvimento, utilizam diferentes rotas biossintéticas que levam à produção de inúmeros metabólitos secundários, além da produção de enzimas de interesse comercial (ZAIN et al., 2014). O estudo sistemático de metabólitos secundários oriundos de fungos iniciou-se em 1922 por Harold Raistrick, que caracterizou mais de 200 metabólitos fúngicos (RAISTRICK, 1950). No entanto, a atenção voltou-se aos metabólitos produzidos por fungos somente após a descoberta e desenvolvimento da penicilina. As indústrias famacêuticas investiram em programas de triagem e por volta de 1950 descobriram-se valiosos produtos microbianos com aplicações farmacêuticas. Deste modo, a busca por metabólitos secundários bioativos continuou ininterruptamente, e milhares de compostos que inibem o crescimento de bactérias, fungos, protozoários, parasitas, insetos, vírus e células tumorais foram descobertos (ZAIN et al., 2014). Destes, dos que foram estudados do ponto de vista químico e biológico, foram isolados uma grande variedade de micromoléculas bioativas, que incluem desde substâncias tóxicas como aflatoxinas, ocratoxinas e citreoviridinas a substâncias com aplicações terapêuticas (GUNATILAKA, 2006; MILLER; TRENHOLM, 1991). Dentre os medicamentos de maior repercussão terapêutica para doenças infecciosas destacam-se os antibióticos -lactâmicos das classes de penicilina e cefalosporina, como os exemplos mais conhecidos de produtos de fungos. A atorvastatina (Lipitor) é um dos medicamentos mais vendidos, um hipocolesterolêmico de origem microbiana, que vendeu mais de (US) $ 11 bilhões em 2004 e, se incluirmos as vendas da Pfizer e Astellas Pharma no período de 2004 a 2014, as vendas estão na faixa de (US) $12-14 bilhões de dólares dependendo do ano (NEWMAN; CRAGG, 2015). Introdução____________________________________________________34 Substâncias isoladas de fungos são empregadas também no combate de pragas, que consomem um grande percentual da produção agrícola mundial, calculado em bilhões de dólares em prejuízos. Esses metabólitos atuam como agroquímicos naturais, como por exemplo, os alcaloides indólicos, derivados de pirrolizidinas, quinazolinas e criptocina (antimicótico), que são inibidores de fitopatógenos (insetos, fungos, herbívoros) (ZHANG; SONG; TAN, 2006). Várias vantagens são observadas quanto à utilização de fungos na obtenção de produtos naturais bioativos em relação a outras fontes naturais, pois são recursos renováveis e a sua produção em escala ampliada pode ser realizada usando a tecnologia existente, como variação do meio e otimização das condições de cultivo. Como exemplo, a manipulação no meio de cultura do Penicillium notatum, resultou em um aumento de 6000 vezes na produção da penicilina (DEMAIN, 2000). Outra vantagem está relacionada com a conservação ambiental uma vez que requerem uma única e pequena remoção de material vivo (BILLS, 1995). Dentro deste contexto os fungos endofíticos representam um significativo reservatório de diversidade genética e uma fonte importante para a descoberta de novos metabólitos secundários bioativos (GUNATILAKA, 2006). 1.2 Fungos Endofíticos Os micro-organismos como fungos, bactérias e vírus tem atraído a atenção de pesquisadores durante séculos, pela percepção da importância destes para os humanos, animais e plantas, apesar dos efeitos negativos, os fungos são responsáveis pela produção de vitaminas, antibióticos, bem como utilizados em processos fermentativos e de biotransformação (IÓCA; ALLARD; BERLINCK, 2014). De 23.000 compostos ativos (antimicrobianos, citotóxicos, antivirais e imunossupressores) a partir de micro-organismos, 42% são produzidos por fungos e 32% por actinomicetos. 12% dos antibióticos são produzidos por bactérias não filamentosas e cerca de 20% são produzidos por fungos filamentosos (DEMAIN, 2014). Produtos naturais bioativos isolados de fungos endófitos associados a plantas superiores estão atraindo a atenção de químicos e biólogos devido ao aumento constante de publicações dedicadas à este tema nos últimos anos (113 artigos de pesquisa sobre metabólitos secundários de fungos endófitos no período de 2008-2009, 69 em 2006-2007, 36 em 2004-2005, 14 em 2002 - 2003, e 18 em 2000-2001) (ALY et al., 2010). Introdução____________________________________________________35 Fungos endófitos (endon = no interior; phyton = planta) são micro-organismos que colonizam assintomaticamente o interior de plantas, sendo encontrados em órgãos vegetais como as folhas, caule, frutos, sementes e raízes, podendo habitar a planta por toda vida, sendo transmitidos, em alguns casos, para futuras gerações através da semente do hospedeiro (GUNATILAKA, 2006; RODRIGUEZ et al., 2009; TAN; ZOU, 2001; KUSARI; PANDEY; SPITELLER, 2013). Azevedo e Araújo (2007) definem como micro-organismos endófitos todos aqueles que são cultiváveis ou não e que habitam o interior de vegetais sem prejudicar o seu hospedeiro e sem produzir estruturas externas emergindo dos vegetais. Normalmente, os endófitos penetram nas plantas por aberturas naturais (estômatos e hidatódios), feridas, também pela produção de enzimas hidrolíticas, em especial as celulases, que facilitam sua penetração. Após a entrada na planta hospedeira, os endófitos podem colonizar os espaços inter ou intracelulares e em vasos condutores com xilema e floema (AZEVEDO; ESPOSITO, 2010). As interações estabelecidas pelos endófitos podem variar desde o mutualismo (endófito e planta hospedeira obtém vantagens) até o parasitismo (somente o endófito é beneficiado). Na associação mutualística o endófito recebe nutrientes e proteção da planta hospedeira, enquanto o endófito sintetiza metabólitos bioativos, auxiliando nas respostas de defesa da planta, quer por inibição de enzimas ou por compostos de sinalização (BAE et al., 2009; KUSARI, 2015). A visão mutualística da interação fungo endofítico-planta tem sido associada à endofíticos de gramíneas de regiões temperadas. Esta visão foi sustentada principalmente por estudos com endofíticos do gênero Neotyphodium, os quais infectam gramíneas, protegendo-as contras herbívoros pela produção de alcaloides (BULTMAN; BELL, 2003). Alguns relatos sugerem um complexo sistema de comunicação envolvendo cruzamento de informações genéticas entre endófitos e sua planta hospedeira durante a formação da associação. Além disso, os genes podem regular a produção de metabólitos secundários bioativos pelos endófitos e essas interações podem induzir à expressão de genes que conferem resistência as plantas hospedeiras (BAILEY et al., 2006). Como citado, os fungos endofíticos podem influenciar direta ou indiretamente na fisiologia da planta hospedeira, reduzindo ou prevenindo o stress. Em plantas sensíveis a seca, os fungos endofiticos, além de armazenarem e secretarem açúcar e álcool, também reduzem a transpiração das folhas, evitando assim o stress hídrico da planta (ZHANG; SONG; TAN, 2006). Uma pesquisa com endófitos isolados da planta Vinca minor identificou, em uma linhagem isolada do caule, o alcaloide vincamina, um estimulante cerebral e vasodilatador, Introdução____________________________________________________36 sendo este metabólito encontrado primeiramente no caule e folhas da planta hospedeira (YIN; SUN, 2011). Estes fatos evidenciam as interações endófito-hospedeiro e um possível cruzamento de informações genéticas entre os organismos envolvidos. No entanto, este dogma de interação mutualística entre fungos endofiticos e plantas está sendo questionado, pois a adaptação em seu hospedeiro não depende somente da presença do endófito, mas também do genótipo da planta e do endófito, de vários fatores abióticos e de outras espécies que interagem com o hospedeiro direta ou indiretamente (FAETH, 2002; MULLER; KRAUSS, 2005). Pode-se citar algumas razões do questionamento deste dogma como conflitos entre o hospedeiro e a reprodução dos fungos endofíticos, os custos energéticos de abrigar o endófito e a supressão do sistema imunológico do hospedeiro para que o endófito sobreviva e com isso aumente a suscetibilidade a outros fungos patógenos. Estes fatores podem desestabilizar a simbiose e conduzir mudanças na reprodução do fungo e do hospedeiro e nas interações endófito-planta (SAIKKONEN et al., 2004). Outros autores sugerem que a colonização assintomática é uma balança de antagonismo, onde ocorre um equilíbrio entre a virulência do fungo endofítico e as respostas de defesa da planta. Esta balança é dinâmica e pode ser alterada sob condições de stress do hospedeiro ou alterações fisiológicas em um dos organismos envolvidos (SCHULZ et al., 2005). Recentemente, revelou-se que a interação endófito-planta pode não ser apenas o equilíbrio entre a virulência e as respostas de defesa, mas uma interação mais complexa. Por exemplo, o endófito F. solani, isolado de C. acuminata, que produz o anticancerígeno camptotecina (KUSARI et al., 2009), poderia também produzir os precursores da camptotecina. No entanto, a enzima envolvida na biossíntese deste composto está presente somente na planta hospedeira (KUSARI; ZÜHLKE, SPITELLER, 2011). Então é necessário reconsiderar se a transferência horizontal de genes (planta para genoma do endófito ou vice- versa) é o único mecanismo no qual os endófitos possam produzir os mesmos compostos que seu hospedeiro (KUSARI; SPITELLER, 2011). Como as plantas são colonizadas por diversos micro-organismos endofíticos, estes podem interagir direto ou indiretamente como outros endófitos. Estas interações desempenham um papel fundamental na produção de metabólitos por bactérias e fungos endofíticos (Figura 1) (KUSARI; HERTWECK; SPITELLER, 2012). Introdução____________________________________________________37 Figura 1. Esquema representativo de “crosstalk” entre espécies endófito-endófito. (A) “Crosstalk” entre fungos endofíticos; (B) “Crosstalk” entre fungos e bactérias endossimbiontes; (C) “Crosstalk” entre fungos e bactérias endófiticas. Fonte: Adaptado de Kusari; Hertweck; Spiteller (2012, p.795) 1.3 Espécie vegetal hospedeira: Eugenia brasiliensis O gênero Eugenia é um dos mais representativos da familia Myrtaceae. No Brasil, existem 350 espécies nativas desse gênero. Eugenia brasiliensis Lam. é uma árvore encontrada no litoral das florestas brasileiras comumente conhecida como grumixama ou cereja brasileira (FISCHER et al., 2005). O fruto é rico em antocianinas e carotenoides, o que confere uma alta capacidade antioxidante e anti-inflamatória para estes extratos (TEIXEIRA et al., 2015). E. brasiliensis (Figura 2) possui casca e folhas aromáticas, sendo que suas folhas são utilizadas na medicina popular no tratamento de reumatismo, artrites e diabetes, além de demonstrarem atividades antidepressiva e anti-inflamatória, as quais podem ser atribuídas a presença dos compostos fenólicos (COLLA et al., 2012; PIETROVSKI et al., 2008). Introdução____________________________________________________38 Figura 2. Eugenia brasiliensis (a), frutos (b) e folhas (c). Fonte: Autor Estudos fitoquímicos das folhas de E. brasiliensis, descrevem o isolamento e identificação de triterpenos como α-amirina, β-amirina, betulina, e compostos fenólicos como a quercetina, catequina e galocatequina (MAGINA et al., 2012). Estudos realizados por Dametto (2014) por LC-MS/MS com os frutos de E. brasiliensis permitiram a identificação de várias antocianinas como a delfinidina-3-O-- laminaribiosídeo, delfinidina-3-Ogalactosídeo, delfinidina-3-O-glicosídeo, cianidina-3-O- galactosídeo, dentre outras. Estudos biológicos com os extratos das folhas de E. brasiliensis mostraram atividade antioxidante e anti-inflamatória, evidenciada pela inibição de enzimas cicloxigenases COX-1 e COX-2. As substâncias isoladas das folhas de E.brasiliensis pertencem à classe dos dissacarídeos, flavanonas, chalconas e neolignanas. Estas e outras questões instigam o estudo químico, enzimático e biológico dos fungos endofíticos associados a esta espécie vegetal, objetivando obter dados que direcionem para a compreensão da relação endófito-hospedeiro e a utilização dos produtos destes endófitos nas áreas de interesse. Introdução____________________________________________________39 1.4 Potencial biotecnológico dos endófitos Os fungos endofíticos possuem a capacidade de produzir uma ampla variedade de enzimas e metabólitos secundários, que exibem diversas atividades biológicas (CORRÊA, 2014). Atualmente os micro-organismos são uma das formas de vida mais importantes, a qual fornece ferramentas biotecnológicas para a transformação da matéria orgânica, assim como a produção de produtos químicos e bioquímicos úteis (IÓCA; ALLARD; BERLINCK, 2014). A investigação do potencial dos fungos endofíticos para a produção de enzimas e metabólitos bioativos é de grande interesse, dadas as inúmeras possibilidades de aplicações biotecnológicas destes compostos. Considerando que os endofíticos constituem a maior parcela da diversidade fúngica inexplorada, ainda há poucos estudos relatando concretas aplicações biotecnológicas deste nicho (NISA et al., 2015). Entre micro-organismos capazes de produzir enzimas destacam-se os fungos filamentosos, pelo seu fácil cultivo e elevada produção de enzimas extracelulares de grande interesse industrial. Os fungos endofíticos representam uma fonte pouco explorada na obtenção de enzimas com diferentes aplicações tecnológicas (BHAGOBATY; JOSHI, 2012). 1.4.1 Metabólitos bioativos Trabalhos mostraram que os fungos endófitos como, Didymostilbe sp., isolado de Taxus chinensis var. (WANG, Y.; TANG, 2011) e Botryodiplodia theobromae Pat., isolado de Morinda citrifolia Linn., (PANDI; MANIKANDAN; MUTHUMARY, 2010) produzem o fármaco taxol, sendo este isolado pela primeira vez do fungo endofítico Taxomyces andreanae durante os anos 90 (STIERLE et al.,1993). Na produção de paclitaxel pelo endófito Penicillium aurantiogriseum, isolado de Corylus avellana, foi possível identificar clusters de genes envolvidos nesta produção diferentes do hospedeiro, demonstrando a evolução biossintética em espécies de Penicillium, independente da planta hospedeira (YANG et al., 2014; NEWMAN; CRAGG, 2015). Com as evidências de que fungos endófitos podem também produzir o taxol visualizou-se um novo processo, talvez mais eficiente e menos dispendioso, para a produção deste importante fármaco. Outros produtos potencialmente bioativos produzidos por fungos endofíticos merecem destaque, como os anticancerígenos: derivados de antracenediona (ZHANG et al., 2010), 22- oxa-(12)-citocalasinas (PRITI et al., 2009) e novos meroterpenoides (pestalafones J e K) (WANG, B., 2016). Pesquisas ainda relatam outros compostos com atividades promissoras como a antraquinonas (ZHANG; SONG; TAN, 2006) e a 10-hidroxicamptotecina (SHWETA Introdução____________________________________________________40 et al., 2010), poderosos agentes antineoplásicos, isolado dos fungos endófitos Pleospora sp. e Fusarium solani, respectivamente; e o subglutinol A e B, um agente imunossupressor, produzido pelo endófito Fusarium subglutinans (GUO et al., 2008). Kusari e Spiteller (2011) descreveram a produção de hipericina a partir de um endófito isolado de Hypericum perforatum, um agente no combate a depressão e ansiedade. Em 2012, isolou-se do fungo endofítico pertencente ao gênero Phoma associado a Arisaema erubescens, os metabólitos tricodermina e cercosporamida, com fortes atividades antifúngicas e antineoplásicas (WANG, L. et. al., 2012). Dentro deste contexto, os produtos naturais de fungos endofíticos apresentam um amplo espectro de atividades biológicas, sendo alguns exemplos, antimicrobiana (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011; WANG, L. et. al., 2012), ansiolítica (KUSARI; SPITELLER, 2011), neuroprotetiva (ALY et al., 2010), propriedades imunossupressoras (GUO et al., 2008) e antineoplásicos (YANG et al., 2014; WANG, B., 2016; SHWETA et al., 2010; WANG, L. et. al., 2012) (Figura 3). Introdução____________________________________________________41 Figura 3. Substâncias bioativas isoladas de fungos endofíticos. O O CH3 CH3 OH O CH3 CH3 OH R O CH3 CH3 OH O CH3 CH3 OH O O CH3 CH3 O CH3 CH3 OH CH3 CH3 OHO CH3 CH3 CH3 O CH3 O CH3 OHH O O O OH OH OH OH Cercosporamida Antifúngico, Antineoplásico Phoma species O O OH OH NH2 OH CH3 O O CH3 O CH3 CH3 O OCOCH3 CH3 Tricodermina Antifúngico, Antineoplásico Phoma species R=OH; pestaloteol A R=H; pestaloteol B Antimicrobiano Pestalotiopsis theae Pestaloteol C Antimicrobiano Pestalotiopsis theae Pestaloteol D Antimicrobiano Pestalotiopsis theae Enfumagina Antimicrobiano Hormonema sp. OH O OH OH OH OHOOH CH3 CH3 Hipericina Ansiolítico Hypericum perforatum NNH NHCH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 O Crisogenamida A Neuroprotetiva Penicillium chrysogenum H O O O O CH3 CH3 OH H HCH3 CH3 H CH3 CH3 H Subglutinol A Imunossupressor Fusarium subglutinans O O OH H O Ph O CH3 O O OH Ph NH Ph O AcO AcO OH Taxol Antineoplásico Penicillium aurantiogriseum N OH N O O OOH CH3 10-hidroxicamptotecina Antineoplásico Fusarium solani Pestalofone J Antineoplásico Pestalotiopsis fici O CH3 O OH OCH3 COOCH3OH -CH3 O O O OH CH3 CH3 Fonte: Aly; Debbab; Proksch (2011); Wang, L. et al. (2012); Kusari; Spiteller. (2011); Aly et al. (2010); Guo et al. (2008); Yang et al. (2014); Wang, B. et al. (2016); Shweta et al. (2010); Wang ,L. et. al. (2012). Introdução____________________________________________________42 1.4.2 Enzimas As enzimas de origem microbiana ocupam lugar de destaque no mercado biotecnológico, sendo inúmeras as aplicações em processos industriais. As proteases, por exemplo, são comercializadas em grande escala em biorremediação, nas indústrias de alimentos, detergente, couro e na indústria farmacêutica. As amilases, por sua vez, são utilizadas nas indústrias de amido e panificação; em cosméticos e produtos farmacêuticos. As pectinases são empregadas na extração de óleos vegetais, nas indústria têxtil e de sucos naturais. As xilanases são utilizadas em indústrias de alimentos, de fármacos, de polpa de celulose e papel (SAID; PIETRO, 2004). As celulases são utilizadas em indústrias de papel, alimentícia, farmacêutica e, mais recentemente, na hidrólise da xilana presente em materiais lignocelulósicos, para a obtenção de xilose, a qual pode ser convertida em etanol de segunda geração por alguns micro-organismos fermentadores (KUHAD; GUPTA; SINGH, 2011; SHARADA, 2014). Estima-se que, a venda mundial de enzimas industriais já atingiu um valor de US 1,6 bilhões de dólares, dos quais a celulase e enzimas aliadas ocupam no mercado uma posição significativa (SHARADA, 2014). Devido à atividade significativa das substâncias produzidas pelos fungos e a capacidade de serem facilmente cultivados em escala industrial, coquetéis de celulases em fungos são um excelente ponto de partida para aplicações em biorrefinarias (PAYNE, 2015). Um dos problemas para a utilização de enzimas nos processos industriais é o alto custo envolvido e alternativas para solucionar este problema é o cultivo de micro-organismos por fermentação em estado sólido (FES), devido à possibilidade de utilização de substratos lignocelulósicos de baixo custo e amplamente disponíveis, como resíduos agrícolas, agroindustriais, florestais e urbanos, que suportam o crescimento microbiano e estimulam a produção das enzimas (GAO et al., 2008; GRAMINHA et al., 2008; SUKUMARAN et al., 2009). No Brasil, estes resíduos e subprodutos agrícolas/agroindustriais são abundantes, o que possibilita a sua utilização em bioprocessos, especialmente no que se refere ao bagaço de cana-de-açúcar (LEITE et al., 2009), cuja produção anual é estimada em torno de 186 milhões de toneladas (SOCCOL et al., 2010). O cultivo de fungos filamentosos por FES simula as condições do habitat onde estes micro-organismos são naturalmente encontrados e, em geral, possibilita a vantagem em termos de elevadas concentrações enzimáticas e produtividade fermentativa (GERVAIS; MOLIN, 2003; YOON, 2014). A principal fonte de enzimas industriais são os fungos filamentosos, devido a sua excelente capacidade de produção de enzimas extracelulares. Deste modo, fungos endofíticos Introdução____________________________________________________43 são capazes de degradar matrizes complexas (Figura 4) para a produção do combustível etanol e outros produtos com valor agregado. Além disso, os fungos endofíticos podem se tornar a nova fonte de enzimas úteis industrialmente, como as amilases, lipases e proteases (CORRÊA, 2014). Bhagobaty e Joshi (2012) relatam que endófitos isolados das plantas Potentilla fulgens e Osbeckia stellata apresentaram a produção de xilanase, lipase, protease, amilase e celulase. O fungo endofitico Acremonium strictum, isolado de biomas brasileiros, apresentou boas atividades celulolíticas quando cultivado em bagaço de cana-de açúcar (GOLDBECK et al, 2013). Já o endófito Cylindrocephalum sp., isolado de Alpinia calcarata, demonstrou elevada atividade amilolítica (SUNITHA et al., 2012). Figura 4. Esquema representativo da fibra de celulose. Fonte: Adaptado de J. Hettenmaier & Sohne. Celulose Microfibrila Macrofibrila Introdução____________________________________________________44 1.5 Gêneros: Xylaria, Diaporthe e Colletotrichum Os fungos pertencentes a esses gêneros são fungos filamentosos, já isolados como endofíticos em nosso grupo de pesquisa, porém de outras plantas hospedeiras. O endófito Xylaria sp. (Figura 5a), é conhecido por produzir muitos metabólitos novos e bioativos, como por exemplo, citocalasinas (CAFÊU et al., 2005), fitoxinas (ABATE; ABRAHAM; MEYER, 1997), ciclopeptídeos (WU et al., 2011), sesquiterpenos eremofilanos (SONG et al., 2012), entre muitas outras. Xylaria cubensis, isolado de Litsea akoensis, produziu sesquiterpenoides como 10-hidroxitujopsena e xylaritriol, um novo diterpenoide (cubentriol), um alcaloide (akodionina), uma nova isocumarina (akolitserina) (FAN et al., 2014), dentre outras. O endófito Diaporthe sp. (Figura 5b), que em sua forma assexuada é denominado Phomopsis sp. produz as citocalasinas H e J, as quais demostraram ter efeitos inibitórios potentes frente aos neutrófilos humanos, atuando como inibidores potenciais de NADPH- oxidase e podendo assim ser alvos promissores para o desenvolvimento de agentes anti- inflamatórios (CHAPLA et al., 2014). Estudos realizados por Silva et al. (2006) com o fungo Phomopsis cassiae conduziram ao isolamento de dois novos policetídeos e cinco novos sesquiterpenos da classe dos cadinanos, sendo que algumas destas apresentaram atividade antifúngica contra os fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum, e também atividade citotóxica, in vitro, contra linhagem celular de tumor cervical humano (HeLa). Destaca-se o isolamento de duas novas benzopiranonas (Diaporteona A e B) deste fungo, as quais inibiram o crescimento da linhagem Mycobacterium tuberculosis (BUNGIHAN et al., 2011). O endófito Diaporthe sp., isolado de Camptotheca acuminate, produziu quatro análogos da lovastatina, um importante redutor de colesterol (LIU et al., 2013). Já o endófito Phomopsis vexans, isolado de Solanum xanthocarpum, produziu 550 mg L -1 de lovastatina (PARTHASARATHY; SATHIYABAMA, 2015). Um composto inédito, derivado de triterpenoide tretracíclico 19- nor-lanostana, isolado de Diapothe sp., exibiu atividade antibacteriana significativa frente a bactérias Gram-positiva e negativa, especialmente às Streptococcus pyogenes e Pseudomonas aeruginosa, bem como à linhagem patogênica humana Staphylococcus aureus (LI et al., 2015). Colletotrichum (Figura 5c), é conhecido pela produção do ácido colletótrico, produzido por C. gloesporioides, associado à espécie vegetal Artemisia mongolica, que apresentou bioatividade contra as linhagens de Bacilus subtilis e Staphylococcus aureus (ZOU et al., 2000). Ressalta-se que Colletotrichum gloeosporioides, isolado como endófito de Introdução____________________________________________________45 Piper nigrum, produziu o alcaloide piperina, o qual é um metabolito característico da planta hospedeira. A piperina é relatada por apresentar atividades biológicas como: antimicrobianas, antidepressivas, anti-inflatmatórias, antioxidantes e antitumorais (CHITHRA et al., 2014). Nos estudos com Colletotrichum sp., um endófito de Buxus sinica (planta tradicional da medicina Chinesa), isolou-se três novos compostos (colletotrichonas A-C), os quais apresentaram excelentes atividades antibacterianas (WANG, W. et al., 2016). Dentro deste contexto, é evidente a grande diversidade e potencialidade biológica destes gêneros de fungos endofíticos. Figura 5. Fotos de Xylaria cubensis (a), Diaporthe sp. (b) e Colletotrichum sp. (c) cultivados em PDA em placa de Petri. (a) (b) (c) Fonte: Autor Introdução____________________________________________________46 Figura 6. Substâncias isoladas dos gêneros Xylaria, Diaporthe e Colletotrichum. Gênero: Xylaria Gênero: Diaporthe Gênero: Colletotrichum N H CH2 OHCH3 H CH3 O OH CH3 O OAc O COOCH3 OH OH O CH3 Citocalasina D Akolitserina Akodionina Cubentriol 19,20-epoxicitocalasina Xylaritriol N H CH3 OHCH3 H CH3 O OH CH3 O OAc O O OH CH3 CH2 CH3 CH3 OH CH3 OH N N H O O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH OH CH3 CH3 H N H CH3 OHCH3 CH3 OH CH3 O OH Citocalasina J Lovastatina Diaportheona A triterpenoide tretracíclico 19-nor-lanostana 3,11,12- trihidroxicadaleno Ácido colletótrico Piperina Colletotrichona A Colletotrichona C OH CH3 CH3 CH3 OH OH CH3 CH3 O O CH3 CH3 O OH O OH OH CH3 CH3 CH3 OH CH3 OH CH3 CH3 CH3 O OH O OH CH3 CH3 CH3 O O CH3 CH3 OCH3 CH3 O O CH3 CH3 OH O OH N O O O O O O O CH3 CH3 O CH3 OHCH3 OH O O O O CH3 CH3 O CH3 CH3 H H Fonte: Cafêu et al. (2005); Fan et al. (2014); Chapla et al. (2014); Bungihan et al. (2011); Parthasarathy; Sathiyabama et al. (2015); Li et al. (2015); Zou et al. (2000); Chithra et al. (2014); Wang,W. et al. (2016). 1.6 Co-cultivo Estudos recentes do genoma de micro-organimos revelaram que tais organismos são capazes de biossintetizar metabólitos secundários com diversidade estrutural superior as já existentes. Como muitos genes, responsáveis pela biossíntese de produtos naturais podem estar silenciados em condições laboratoriais, instiga-se o desenvolvimento de novas estratégias para a ativação das vias biossintéticas. Neste sentido uma das estratégias é o co- cultivo de micro-organismos, que envolve o cultivo de dois ou mais micro-organismos no mesmo ambiente. Introdução____________________________________________________47 Os micro-organismos não vivem isoladamente na natureza, fazendo parte de complexos ecossistemas e, por isso, as comunidades microbianas carregam um imenso potencial para a produção de novos compostos. Há uma diversidade de sinalizações e interações ocorrendo entre os micro-organismos que são capazes de instigar a produção de novos compostos. Tais compostos, produzidos de forma dinâmica, são de muito interesse para a descoberta de novos fármacos. A sobrevivência em um ambiente competitivo exige estratégias que provavelmente culminam na produção de compostos bioativos (BRAKHAGE & SCHROECKH, 2011; BERTRAND et al., 2014). O co-cultivo de micro-organismos pode ser realizado tanto em meios sólidos ou líquidos e, recentemente, os estudos centraram-se nas interações e na descoberta de novos metabólitos bioativos de origem microbiana (BERTRAND et al., 2014). Estudos realizados com co-cultivos de Trichophyton rubrum e Bionectria ochroleuca em meio sólido foi possível observar a inibição do crescimento a longa distância entre os micro-organismos. A partir deste co-cultivo foi identificado o metabólito: 4"-hidroxisulfoxi- 2,2"-dimetiltielavina P (um trímero substituído de ácido 3,5-dimetilorselínico) (Figura 7) (BERTRAND et al., 2013). A co-cultura em meio líquido de Fusarium tricinctum e F. begoniae induziram a produção de dois novos depsipeptídeos como subeniatinas A e B (Figura 7), os quais não foram detectados nas monocultutras (WANG, J. et al., 2013). O co-cultivo de Inonotus obliquus e Phellinus punctatus demonstrou a redução na produção de biomassa micelial, mas houve um aumento na produção de compostos fenólicos, melaninas e da classe dos triterpenoides lanostanos (ZHENG et al., 2011). Nonaka e colaboradores (2011) isolaram uma nova substância, denominada secopenicilida C e outras quatro conhecidas, como: penicilida, MC-141, pestalasina A e estromemicina (Figura 7), todas do co-cultivo líquido de Penicillium pinophilum e Trichoderma harzianum. A produção desses compostos, exceto a pestalasina A foi de 2 a 6 vezes superior no co-cultivo comparado a monocultura P. pinophilum, o qual é responsável pela produção destes compostos isoladamente. Devido à complexidade dos extratos microbianos, métodos analíticos avançados, como a espectrometria de massas, são fundamentais para o êxito na detecção e identificação de metabólitos produzidos pelos co-cultivos (BERTRAND et al., 2014). A comparação da produção da monocultura com a do co-cultivos pode ser avaliada por ferramentas estatísticas como scores de PCA (Análise de componentes principais), PLS (Mínimos quadrados parciais), PLS-DA (Análise discriminante com calibração multivariada), dentre outras. Introdução____________________________________________________48 Figura 7. Compostos isolados do co-cultivo de fungos. OR CH3 O CH3 CH3 O O CH3 CH3 CH3 CH3 OH O O CH3 CH3 CH3 O CH3 OH O R=SO3 4"-hidroxisulfoxi-2,2"-dimetiltielavina P Co-cultivo: Trichophyton rubrum e Bionectria ochroleuca Subeniatinas A e B Co-cultivo: Fusarium tricinctum e Fusarium begoniae N CH3 CH3 OH OCH3 O R O CH3 CH3CH3 O N CH3 OHO CH3 CH3 (A) R=H (B) R=CH3 CH3 CH3 OH OHO O OH OH CH3 O O O O CH3 CH3 CH3 OH O O OH CH3 CH3 O O CH3 OH CH3 O O CH3 CH3 O O CH3 OH CH3 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 OO OH O CH3 CH3 Secopenicilida C Co-cultivo: Penicillium pinophilum e Trichoderma harzianum Pestalasina A Co-cultivo: Penicillium pinophilum e Trichoderma harzianum Penicilida Co-cultivo: Penicillium pinophilum e Trichoderma harzianum MC-141 Co-cultivo: Penicillium pinophilum e Trichoderma harzianum Stromemicina Co-cultivo: Penicillium pinophilum e Trichoderma harzianum Fonte: Bertrand et al. (2013); Wang, J. et al. (2013); Nonaka et al. (2013). 1.7 Epigenética Os fungos são organismos capazes de biossintetizar uma grande diversidade química e biológica de metabólitos secundários. Infelizmente, métodos de fermentação em condições laboratoriais são ineficientes para mimetizar o habitat natural de um organismo. Como muitos Introdução____________________________________________________49 genes, responsáveis pela biossíntese de produtos naturais não são expressos no ambiente artificial de laboratório, instiga-se o desenvolvimento de novas estratégias para a ativação das vias biossintéticas (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011; WILLIAMS et al., 2008). Neste sentido uma das e