RESSALVA 

Atendendo solicitação do(a) 
autor(a), o texto completo deste 

trabalho será disponibilizado 
somente a partir de 24/03/2019. 



UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA  FILHO” 

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE  ARARAQUARA 

0 

NAYLA DE SOUZA PITANGUI 

REGULAÇÃO  TRANSCRICIONAL,  METABÓLICA  E PERFIL DE MICRORNAs 

DOS BIOFILMES DE Histoplasma capsulatum: GENES, METABÓLITOS E RNAs   

NÃO CODIFICANTES  COMO  ALVOS TERAPÊUTICOS  E/OU BIOMARCADORES 

Araraquara 

2017 



UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA  FILHO” 

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE  ARARAQUARA 

0 

NAYLA DE SOUZA PITANGUI 

REGULAÇÃO  TRANSCRICIONAL,  METABÓLICA E PERFIL DE MICRORNAs 

DOS BIOFILMES DE Histoplasma capsulatum: GENES, METABÓLITOS E RNAs   

NÃO CODIFICANTES  COMO  ALVOS TERAPÊUTICOS  E/OU BIOMARCADORES 

Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em 

Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia da 

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – 

UNESP como pré-requisito para obtenção do título de 

Doutor. 

Orientadora: Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida 

Coorientador: Dr. Paulo César Gomes 

Araraquara 

2017 



 
0 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 



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III 

Este trabalho foi desenvolvido na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara/SP – 

UNESP, sendo a doutoranda contemplada com bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de 

Pessoal de Nível Superior – CAPES – e contou com auxílio financeiro da Fundação de   

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (processo nº 2013/05853-1) e do 

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Universal    

(processo  nº 480316/2012-0). 



IV 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no 

mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”. 

Madre Teresa de Calcuta 



V 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Dedicatória 

A quem esteve constantemente em meus pensamentos aliviando qualquer aflição e 

aplaudindo as minhas vitórias: Deus, meus pais Arnaldo e Sônia, meu marido 

Anderson e a minha jóia preciosa Tomás. 



VI 
 

 

Agradecimentos 

Acima de tudo, demonstro minha maior gratidão a Deus, por me capacitar física e 

intelectualmente para o desenvolvimento deste trabalho e por estar traçando os  melhores  

caminhos para a minha  vida. 

Aos meus pais que, em primeiro lugar, me deram uma base sólida  e  me  fazem  viver  

diariamente o verdadeiro sentido de “família”. Como é bom saber que tenho vocês, que sempre     

me incentivam com suas opiniões que nunca falham sobre os meus caminhos e  com  seus  

aplausos que enchem o coração e que fazem todo o esforço valer a pena. Vocês são os meus 

maiores e melhores professores da vida. A minha gratidão é eterna por tudo o que representam     

e fazem. Amo vocês meus  exemplos! 

Ao meu marido, Anderson, por todo  seu carinho,  proteção e amor.  Que esteve comigo  em todos  

os momentos desta jornada, tornou os meus dias muito  mais leves com o  seu  carinhoso  “Bom 

dia meu amor”, enfrentou sol, chuva e frio pra que eu não ficasse sozinha e acreditou em mim 

quando eu mesma não acreditei. Impossível não agradecer ainda  sua  paciência.  Amo  você 

minha fortaleza! 

Ao meu filho amado Tomás, que com toda certeza, tem sido a melhor experiência de  toda a  

minha vida e que tem me incentivado a alcançar os meus maiores sonhos. “Antes deles a gente 

acha que não vai dar. Que não vai ter tempo, que vai sobrar cansaço. Que está com sono e então 

“deixa pra amanhã, não tem problema”... mas eles chegam  e provam  que  amanhã  vai  ser 

tarde, que na  verdade, o cansaço  é que a gente deixa pra depois.  Que o  tempo se multiplica.  

Que a força se reproduz. Eles nos mostram que o trabalho agora é garantia de escola, viagens, 

alegria, brinquedos, comida, vacinas, roupinhas e leite. Eles chegam e chacoalham tudo. Eles 

chegam e tiram tudo do lugar, mas na verdade eles criam novos lugares para tudo. E assim a 

gente vai... se desdobra para que não falte nada, e não só isso; a gente se vira  em  mil e uma  

para que, além de não faltar, que ainda sobre;  sobre, principalmente, alguns minutinhos ao  

lado deles”. Amo você minha  vida! 

A minha querida irmã Camila, minha sobrinha Amelie e ao meu cunhado Fábio, que mesmo do 

outro lado do mundo estão presentes em meus pensamentos e me fizeram entender que quanto 

maior a distância, maior também é o amor e a alegria do  reencontro.  Amo  vocês  minha  

saudade! 

A minha avó Amélia (in memoriam) que acompanha todas as etapas da  minha  caminhada  e 

que acalenta meu coração nas horas mais críticas! Amo você eternamente    minha companheira! 



VII 
 

 
A minha avó Lourdes, por todo amor e  carinho! 

Aos meus sogros Beta e Silvio, aos meus cunhados Danilo, Fabiana e Gustavo, e aos meus 

sobrinhos Leo e Lara, por me acolherem desde sempre em sua casa e no coração. Hoje nós 

sabemos que nossa família é o nosso bem maior. Amo vocês minha   família! 

A minha confidente pessoal e profissional, aquela que transmite todo o seu conhecimento e 

experiência, aquela que não mede esforços pra me fazer o bem,  que se doa  de todo o coração,  

que passa meses sem me ver, mas não passa uma semana sem se preocupar comigo, que me 

deseja o melhor e que me ensinou muito sobre a vida acadêmica. Minha irmã  de  coração, 

Janaína! 

Aquele por quem a afinidade foi imediata, que muito, mas muito mais que um co-orientador  

soube me ouvir em quantas situações pessoais e  profissionais  foram  necessárias,  aquele  

mineiro que devagar me faz repensar em minhas fraquezas e quer o meu melhor, que assumiu, 

junto comigo, várias das minhas preocupações e que foi fundamental para o êxito  deste  

trabalho. Meu amigo e professor  Paulo! 

Aquela que foi meu porto seguro em Araraquara, não importa o que havia, eu sabia  que  

poderia contar com ela a qualquer hora do dia ou da noite! Ela me  trasmitiu dicas  valiosas 

para ter sucesso em cultura de células, microscopia, citometria de fluxo e maternidade! Minha 

gratidão é eterna por todo o seu apoio minha grande amiga e mãe do Augusto,   Claudia! 

A quem, graças a Deus, cruzou meu caminho e embora tenha sido por pouco tempo, ocupou um 

lugar enorme em meu coração e em minha vida! Minha amiga e mãe exemplar Thais Bernardi!   

A minha comadre e madrinha que me acompanha desde a  faculdade!  Aquela  que  passou 

comigo por muitas experiências ao longo destes 12 anos, dividindo trabalhos e preocupações! A 

minha amiga Fernanda  Gullo! 

A companheira das horas de almoço, café e desabafo! A quem  esteve sempre  presente nos  

últimos 4 anos e se dispôs de coração! A quem me deixou mais segura em Araraquara, minha 

amiga Natália! 

A quem tenho imensa admiração e respeito pela sua  dedicação  incansável  à  carreira  

acadêmica. Ah como sou grata por ter conhecido este exemplo de profissional, que não mede 

esforços e nem distância para transmitir sua experiência e conhecimento! Com toda a certeza a 

colaboração com ela tornou possível a concretização deste trabalho! Meus sinceros  

agradecimentos a Professora Maria Lucia Taylor! Agradeço  ainda  a    companheira  científica 



VIII 
 

 
Gabriela Rodríguez-Arellanes por todo o conhecimento compartilhado e  pela  sua  

disponibilidade de ajudar em todas as  necessidades! 

A orientadora deste trabalho, que me deu a grande oportunidade de  ingressar  em  um  

laboratório no qual pude contar com uma  estrutura  física e  científica  gigantesca  e que, acima 

de tudo, confiou em meu trabalho. Agradeço a ela por ter permitido que eu fizesse parte deste  

time. Aquela que se desdobra em mil para que tudo possa correr bem. Com toda certeza ela foi 

fundamental para o meu crescimento profissional. Agradeço a professora, orientadora, mãe e 

mais um milhão de funções que ela agarra com unhas e dentes, Ana Marisa Fusco   Almeida! 

A profa. Maria José Soares Mendes Giannini, que me inspira tanto com sua postura pessoal e 

profissional. Aquela que mesmo ausente se fez tão presente e contribuiu tanto para que “o dar      

o melhor de mim mesma” fosse feito. Você é um exemplo de sucesso.   Obrigada Zezé! 

Ao professor Francisco Javier Enguita, que me proporcionou a exploração de  um mundo novo  

na investigação dos  microRNAs. 

Ao professor Mario Sergio Palma, por abrir as portas do seu laboratório e acreditar em nosso 

trabalho! 

Ao professor Alessandro Varani, pela sua disponibilidade em colaborar com o desenvolvimento 

deste trabalho dominando as ferramentas de  bioinformática! 

A técnica do laboratório, Rosângela, por toda ajuda e  por  compartilhar  sua  infinita 

experiência comigo. Hoje acredito que ela conhece cada fungo como  ninguém e é sempre muito 

bom contar com o conhecimento dela. Muito obrigada  Rô! 

A Rosemira pelo seu querer bem com o coração mais puro e   verdadeiro. 

A Junya de Lacorte, por quem tenho admiração pela sua dedicação ao trabalho de forma séria    

e comprometida. Aquela que me ensinou com tanta paciência. Obrigada pela nossa    parceria! 

A todos os companheiros desta vida  acadêmica  desafiadora,  que  em  algum  momento 

certamente me ajudaram nesta caminhada científica: Lili, Mari,  Priscila,  Carol  Tatoo,  

Mônica, Rodrigo, Haroldo, Aline, Laranja, Panta, Fer Sangalli, Carol Mineira,  Regina,  

Jaque, Warley, Ana Cerrejón, Suélen, Julhiany, Tati, Wanessa, Luana, Kayla, Fernando 

Rogério Pavan, Paula Carolina de Souza, Gabriela Guimarães Sousa Leite, Felipe Oliveira, 

Camila Fernandes, Bibiana, Letícia, Maysa, Rosana, Marina, Christiane Pienna, Alexandra 

Ivo de Medeiros, Rondinelli Herculano, Natan, Mateus, Bruna, Andrei Moroz, Marisinha, 

Iracilda Zeppone Carlos, Eliana, Maria Célia Bertolini, Iguatemy Lourenço Brunetti, Renata 

Pires, Eliana Gertrudes de Macedo Lemos e Rosely Maria Zancopé   Oliveira. 



IX 
 

 
A dedicação das funcionárias da secretaria de pós-graduação, fundamentais para o bom 

andamento das atividades acadêmicas. Obrigada Claudia, Daniela, Flávia e   Joyce! 

A minha madrinha e comadre Cynthia Silva, que tem acompanhado de perto todas as  etapas 

mais importantes da minha vida e que torce verdadeiramente pelo meu   sucesso. 

As minhas amigas farmacêuticas, que estão sempre dispostas a ouvir e dividir qualquer 

dificuldade: Bruna, Carol, Dani, Gi Spósito, Tha Frezin e Thais Ferreira.  E  aquelas  que 

sempre me acompanham na caminhada da vida: Tawana, Aila e   Graciele. 

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, ao Conselho 

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq e a Fundação de Amparo à 

Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pelo suporte   financeiro. 

Enfim, a todos aqueles citados aqui e os que por ventura eu tenha me esquecido,  que  

contribuíram direta ou indiretamente para minha travessia nesta  etapa  tão  importante  da  

minha carreira. Muito  obrigada! 



X 
 

 
ÍNDICE DE FIGURAS 

Figura 1. Representação Esquemática das tecnologias “Ômicas” e  suas moléculas. 34 

Figura   2.   Crescimento   de  leveduras   de   H.   capsulatum   em   culturas planctônicas  e 51 

biofilmes. 

Figura 3. Eletroferograma da Integridade do RNA. 52 

Figura 4. Validação das bibliotecas de cDNA. 53 

Figura 5. Diagramas de Venn do transcriptoma de H. capsulatum. 59 

Figura 6. Perfil transcriptômico de H. capsulatum. 60 
 

Figura  7.  Ensaio  de  Viabilidade  de  Mø  AMJ2-C11  infectados  com  leveduras     de  H. 65 

capsulatum após 5 h. 
 

Figura 8. Fold  Change  Plot  dos  transcritos  diferencialmente  expressos  em biofilmes vs. 68 

culturas planctônicas da cepa EH-315 de H.  capsulatum. 

Figura   9.   Fold   Change  Plot   dos  transcritos  diferencialmente   expressos  em  culturas 71 

planctônicas da cepa EH-315 vs. culturas planctônicas da cepa 60I de H.   capsulatum. 

Figura  10.  Fold  Change  Plot  dos transcritos diferencialmente  expressos em biofilmes da 74 

cepa EH-315 vs. biofilmes da cepa 60I de H.  capsulatum. 

Figura 11.  Fold Change  Plot dos transcritos diferencialmente expressos em    biofilmes vs. 76 

culturas planctônicas da cepa 60I de H.  capsulatum. 

Figura 12. Perfis de citometria ilustrando a intensidade de fluorescência    (FI)  de leveduras 77 

de  H.  capsulatum na  infecção  de células  fagocíticas AMJ2-C11, analisadas  por citômetro 

de fluxo FACSCantoTM. 

Figura 13. Perfis de citometria ilustrando a intensidade de fluorescência    (FI)  de leveduras 78 

de  H.  capsulatum na  infecção  de células  fagocíticas AMJ2-C11, analisadas  por citômetro 

de fluxo FACSCantoTM. 

Figura  14.  Perfil  de  infecção  de  diferentes  cepas  de  H.  capsulatum  à    Mø  alveolares 78 

murinos. 

Figura  15.  Ensaio  de  Viabilidade  de  Mø  THP-1  like  infectados  com  leveduras  de H. 80 

capsulatum após 5 h. 



XI 
 

 
 

Figura 16. Perfis de citometria ilustrando a intensidade de fluorescência    (FI)  de leveduras 81 

de H. capsulatum na infecção de Mø THP-1 like e, analisadas por citômetro de fluxo 

FACSCantoTM. 

Figura 17. Perfis de citometria ilustrando a intensidade de fluorescência    (FI)  de leveduras 82 

de H. capsulatum na infecção de Mø THP-1 like e, analisadas por citômetro de fluxo 

FACSCantoTM. 

Figura 18. Perfil de infecção de diferentes cepas de H. capsulatum à  Mø humanos. 82 

Figura 19. Eletroferograma da Integridade do RNA de Mø THP-1 like. 84 
 

Figura   20.   Volcano   Plot  dos  perfis  de  miRNAs  detectados   em  Mø   infectados  com 86 

leveduras de H.  capsulatum. 

Figura 21.  Fold Change Plot dos miRNAs diferencialmente  expressos em Mø   THP-1 não 90 

infectados e infectados com leveduras de H.   capsulatum. 

Figura  22.  Análise de agrupamento  hierárquico  da  expressão  de miRNAs aberrantes em 93 

Mø infectados com leveduras de H.  capsulatum. 

Figura 23. Redes de interação miRNA-RNAm. 95 

Figura 24. Redes de interação miRNA-RNAm. 101 

Figura 25. Produção de polissacarídeos totais por  H. capsulatum. 103 

Figura 26. Perfil cromatográfico (1) dos metabólitos de leveduras de   H. capsulatum. 104 

Figura 27. Perfil cromatográfico (2) dos metabólitos de leveduras de   H. capsulatum. 105 
 

Figura 28. Diagramas comparativos dos  metabólitos de biofilmes  e  culturas planctônicas 

de H.  capsulatum por massas moleculares. 

Figura 29. Sobreposição dos metabólitos totais detectados nas amostras de biofilmes e 

culturas planctônicas da cepa EH-315 de H. capsulatum por   LC-MS/MS. 

Figura 30. Metabólitos de massas moleculares comuns entre biofilmes e culturas 

planctônicas da cepa EH-315 de H. capsulatum distribuídos em um range de 200-1800   Da. 

Figura 31. Diagramas comparativos dos  metabólitos de biofilmes  e  culturas planctônicas 

de H. capsulatum por intensidade  relativa. 

Figura 32. Metabólitos de massas moleculares comuns entre biofilmes e culturas 

planctônicas   da  cepa   EH-315   de   H.   capsulatum,   mas   produzidos   com intensidades 

 
106 

 
 

107 
 
 

109 
 
 

110 
 
 

111 



XII 
 

 
 

diferentes. 
 

Figura 33. Metabólitos de massas moleculares exclusivas dos biofilmes e das culturas 

planctônicas da cepa EH-315 de H. capsulatum distribuídos em um range de 200-2400   Da. 

Figura 34. Representação esquemática do perfil  metabólico  de  H.  capsulatum  em 

biofilmes e em culturas  planctônicas. 

 
 

113 
 
 

114 



XIII 
 

 
ÍNDICE DE  TABELAS 

 
 

Tabela 1. Conteúdo das placas comerciais (Exiqon) Human miRNome, Painéis I e   II, V4. 46 
 

Tabela 2. Concentração  de RNA obtido após extração  utilizando o Kit  RNeasy  Plant Mini 52 

Kit®. 

Tabela 3. GDEs pela cepa EH-315 em biofilmes e em  crescimento planctônico. 55 

Tabela 4. GDEs pelas cepas EH-315 e 60I em crescimento planctônico. 56 

Tabela 5. GDEs pelas cepas EH-315 e 60I em biofilmes. 57 

Tabela 6. GDEs pela cepa 60I em biofilmes e em crescimento planctônico. 58 
 

Tabela 7. Categorização funcional dos genes com expressão significativamente   alterada em 64 

biofilmes  vs.  culturas  planctônicas  da  cepa  EH-315  de  H.  capsulatum  obtidos  por  RNA- 

Seq. 

Tabela 8. Categorização funcional dos genes com expressão significativamente   alterada em 67 

culturas  planctônicas  da  cepa  EH-315  vs.  culturas  planctônicas  da  cepa   60I   de   H. 

capsulatum obtidos por  RNA-Seq. 

Tabela  9.  Categorização  funcional  dos  genes  com  expressão significativamente alterada 70 

nos biofilmes da cepa EH-315 vs. biofilmes da  cepa  60I  de  H.  capsulatum  obtidos  por RNA-

Seq. 

Tabela  10.  Categorização  funcional  dos  genes com expressão  significativamente alterada 73 

em biofilmes da cepa 60I vs. culturas planctônicas de H. capsulatum obtidos por    RNA-Seq. 

Tabela 11. Concentração de RNA obtido após extração utilizando o Kit    RNeasy Plant Mini 83 

Kit®. 

Tabela 12.  miRNAs diferencialmente expressos em Mø THP-1  não  infectados  e infectados 88 

com leveduras de H.  capsulatum. 

Tabela  13.  Vias  associadas  aos  genes-alvo   regulados  pelos    miRNAs  diferencialmente 98 

expressos por Mø infectados com H.  capsulatum. 



XIV 
 

 
LISTA  DE ABREVIATURAS 

 
 

ACN – acetonitrila 

BCRJ – banco de células do Rio de  Janeiro 

BHI-broth – meio infusão cérebro-coração caldo 

Cbp1 – Calcium binding  protein 

CBSI – Candida bloodstream infections 

cDNA – DNA complementar 

CFSE – 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl Ester 

CID – decomposição induzida por  colisão 

Ct – Cycle threshold 

DL50  – Dose Letal 50% 

DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s  medium 

DNA – ácido desoxirribonucleico 

EF-1α – elongation factor  1-alpha 

EPB41 – Erythrocyte protein band 4.1 

EthD-1 – homodímero de etídio 

ESI – fonte de ionização “electrospray” 

FI – intensidade de  fluorescência 

FR – Forward-reverse 

GAPDH –  Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 

GC/MS – cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas 

GDEs –  Genes Diferencialmente Expressos 

GO – gene  ontology 

HBF – high biofilm  formers 

HIV – Vírus da imunodeficiência humana 

Hsp60 – Heat shock protein 60  kDa 

IP-PGC-TOF/MS – cromatografia de pareamento iônico-coluna de carbono grafítico poroso 

acoplada a um sistema de espectrometria de massas do tipo tempo de   voo 

LC-ESI-MS – cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas por ionização 

electrospray 

LC-MS – cromatografia líquida acoplada à espectrometria de   massas 

LC-MS/MS – cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas   sequencial 



XV 

LCMS-IT-TOF – espectrômetro de massas híbrido que combina as tecnologias Ion Trap  e 

tempo de voo 

LBF – low biofilm formers 

LNA – Locked Nucleic Acid 

MØ – macrófagos 

MEC – matriz extracelular 

miRNAs – microRNAs 

MOI – multiplicidade de infecção (Multiplicity of infection) 

ncRNAs – RNAs  não-codificantes 

NGS – Next Generation Sequencing 

pb – pares de bases 

PBS – phosphate-buffered  saline 

PCR – reação em cadeia pela  polimerase 

PEI – polissacarídeos extracelulares insolúveis 

PES – polissacarídeos extracelulares solúveis 

PI – polissacarídeos  intracelulares 

PMA – phorbol 12-myristate 13-acetate 

PMSF – Phenylmethylsulfonyl fluoride 

QS – quorum-sensing 

RIN – RNA integrity number 

RNA – ácido ribonucléico 

RNAi – RNA de interferência 

RNAm – RNA mensageiro 

RNAr – RNA ribossomal 

RNAt – RNA  transportador 

RP – HPLC – Reversed phase high-performance liquid chromatography 

RPKM – reads per kilobase por  million 

RPMI – Roswell Park Memorial Institute 

RQ – quantificação relative (Fold  Change) 

RT-qPCR – reverse transcription-quantitative PCR 

SFB – soro fetal bovino 

S/N – relação sinal-ruído 

TCA – ácido tricloroacético 

TFA – ácido trifluoroacético 



XVI 

UFLC – Ultra Fast Liquid Chromatograph 

UV – ultravioleta 

YPS3 – yeast-phase-specific 



XVII 

RESUMO 

Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um patógeno fúngico dimórfico causador de 

uma importante micose sistêmica, denominada histoplasmose. A patogenia da histoplasmose 

ocorre como resultado da inalação dos microconídios da fase miceliar, que afetam 

primariamente os pulmões onde ocorre a diferenciação em leveduras, que posteriormente, 

induzem uma infecção pulmonar e disseminação para outros órgãos, particularmente em 

indivíduos imunocomprometidos. Recentemente, foi estabelecida uma correlação  entre  o 

modo de infecção de H. capsulatum e a  formação  de  biofilmes,  estruturas  caracterizadas 

como redes tridimensionais complexas que induzem, entre  outros,  a  resistência  antifúngica. 

Por esta razão, é emergente a identificação de um novo alvo e/ou biomarcador que possa ser 

selecionado, a fim de estabelecer um novo regime  terapêutico  e/ou  ferramenta  diagnóstica 

para a histoplasmose. Com base nisto, este trabalho tem como objetivo analisar a regulação 

transcricional codificante e metabólica diferencial entre as duas formas de crescimento de H. 

capsulatum, em biofilmes e em crescimento planctônico, bem como determinar o perfil de 

microRNAs (miRNAs) aberrantes em células hospedeiras em resposta à infecção com  

leveduras livres e biofilmes. O sequenciamento completo das regiões transcritas foi realizado 

utilizando a plataforma HiSeq da Illumina e a investigação do padrão de miRNAs em 

macrófagos (Mø) hospedeiros infectados foi conduzida empregando uma técnica  de  RT-  

qPCR (reverse transcription-quantitative PCR). Subsequentemente, a produção de 

polissacarídeos totais foi determinada em amostras de culturas planctônicas, biofilmes e 

sobrenadante dos biofilmes e, adicionalmente, a abundância dos metabólitos de natureza não 

proteica e pequenos peptídeos nestas formas de crescimento foi estabelecida por LC-MS/MS. 

Em resumo, os dados obtidos revelaram que a estruturação das leveduras em biofilmes induz 

uma regulação negativa nos processos transcricionais direta (genoma codificante – RNAm) e 

indiretamente (genoma não-codificante – miRNAs) e, nos  processos  metabólicos  das 

leveduras, resultante da: a) expressão reprimida da maioria dos genes (≈80% down-regulated) 

quando as leveduras livres passam a organizarem-se em  biofilmes;  b)  superexpressão  de  

todos os miRNAs alterados na comparação de células infectadas com biofilmes vs. leveduras 

planctônicas; c) intensidade relativa reduzida (DOWN) da maioria dos metabólitos (57%) 

produzidos pelas células em biofilmes em relação à intensidade nas homólogas livres, 

considerando os metabólitos com a mesma massa molecular entre biofilmes e culturas 

planctônicas e; d) produção significativamente  menor  de  metabólitos  exclusivos  pelas 

culturas em biofilmes (8%) vs. células planctônicas (18%). Por conseguinte, no  presente  

estudo,  através das abordagens desenvolvidas foram indicadas as moléculas (genes,    miRNAs 



XVIII 
 

 
e metabólitos) que constituem uma fonte potencial para delinear: a)  um  marcador  de  

biofilmes na infecção às células hospedeiras; b) novos protótipos para a terapêutica da 

histoplasmose e; c) novos biomarcadores  como  ferramentas  diagnósticas  para  a 

histoplasmose. 

Palavras-chave: Transcriptômica. Metabolômica. MicroRNAs. Histoplasma capsulatum. 

Biofilmes. 



XIX 
 

 
ABSTRACT 

Histoplasma capsulatum variety capsulatum is a dimorphic fungal pathogen that causes an 

important systemic mycosis, called histoplasmosis.  The  pathogenesis  of  histoplasmosis 

occurs as a result of the inhalation of mycelial microconidia, which primarily affect the lungs 

where differentiation occurs in yeast, which subsequently induce pulmonary infection and 

dissemination to other organs, particularly in immunocompromised individuals. Recently, a 

correlation was established between the mode of infection of  H.  capsulatum  and  the 

formation of biofilms, structures characterized as complex three-dimensional networks that 

induce, among others, antifungal resistance.  For  this reason,  it  is emerging the  identification 

of a new target that can be selected in order to establish a new therapeutic strategy for 

histoplasmosis. Based on this, this work aims to analyze the differential transcriptional and 

coding transcriptional regulation between the two forms of growth of H. capsulatum  in  

biofilms and planktonic growth, as well as to determine the profile of aberrant microRNAs 

(miRNAs) in host cells post-infection with free yeasts and biofilms.  Complete sequencing of  

the transcribed regions was performed using the Illumina HiSeq  platform  and  the  

investigation of the miRNA pattern in  infected  host macrophages (Mø) was conducted  using   

a reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) technique.  Subsequently,  the production 

of total polysaccharides was determined in samples of planktonic cultures, biofilms and 

supernatant of the biofilms and, additionally, the abundance of non-protein metabolites and 

small peptides in these growth forms was established by LC-MS/MS. In summary, the data 

obtained showed that the structure of yeasts in biofilms induces a negative regulation in the 

direct (coding genome - mRNA) and indirectly (non-coding genome  -  miRNAs)  

transcriptional processes and in the yeasts metabolic processes, resulting from: a) suppressed 

expression of most genes (≈80% down-regulated) when the free yeasts are organized in 

biofilms; b) overexpression of all altered miRNAs in the comparison of cells infected with 

biofilms vs. planktonic yeasts; c) reduced relative intensity (DOWN) of most of  the  

metabolites (57%) produced by cells in biofilms compared to the intensity in the free 

homologues, considering the metabolites with the same molecular mass between biofilms and 

planktonic cultures; d) significantly lower production of exclusive metabolites by cultures in 

biofilms (8%) vs. planktonic cells (18%). Accordingly, in the present study, the approaches 

performed indicated molecules (genes, miRNAs and metabolites)  that  are a potential source  

for delineating: a) a marker of biofilms in infection to host cells; b) new prototypes for 

histoplasmosis therapy and; c) new biomarkers as diagnostic tools for    histoplasmosis. 

Key words: Transcriptomic. Metabolomic.  MicroRNAs.  Histoplasma  capsulatum. Biofilms. 



XX 
 

 
SUMÁRIO 

 
 

Índice de Figuras X 

Índice de Tabelas XIII 

Lista de Abreviaturas XIV 

Resumo XVII 

Abstract XIX 

Capítulo I – Tese 23 

1. Introdução 24 

2. Objetivos 33 

2.1. Objetivo geral 33 

2.2. Objetivos específicos 33 

2.3. Representação Esquemática 33 

3. Materiais e Métodos 35 

3.1. Microrganismos e condições de cultivo 35 

3.2. Culturas planctônicas e formação dos biofilmes de  H. capsulatum 36 

3.3. Análise transcriptômica 36 

3.3.1. Extração  do  RNA das cepas EH-315  e 60I de H. capsulatum  para sequenciamento 36 

em larga escala (Illumina Hi Seq) utilizando o kit RNeasy Plant    Mini Kit® 

3.3.2. Quantificação e avaliação da pureza e integridade do RNA das amostras 37 

3.3.3. Construção das bibliotecas de DNA complementar (cDNA) 37 

3.3.4. Clusterização  e  sequenciamento  dos  transcritos  das  cepas  EH-315  e  60I  de  H. 39 

capsulatum em biofilmes e em crescimento  planctônico 

3.3.5. Análise dos dados de sequenciamento 39 

3.3.6. Identificação, categorização funcional e localização de domínios proteicos 40 

3.4. Determinação  da viabilidade  celular  e  porcentagem  de infecção  em  Mø alveolares 40 

(AMJ2-C11) por diferentes cepas de H.  capsulatum 

3.4.1. Cultura de células AMJ2-C11 40 

3.4.2. Determinação da viabilidade celular após infecção de células    AMJ2-C11 utilizando 41 

o kit Live/Dead® 

3.4.3. Infecção por H. capsulatum às células AMJ2-C11    e determinação  da porcentagem 42 

de infecção por citometria de  fluxo 

3.5. Screening  de  miRNAs  expressos  em  células  hospedeiras  após  interação   com  H. 43 



XXI 
 

capsulatum 

3.5.1. Seleção de cepas e condições de cultivo 43 

3.5.2. Seleção da linhagem celular 43 

3.5.3. Cultura de células THP-1 43 

3.5.4. Determinação  da viabilidade celular após infecção  de Mø  THP-1  like  utilizando o 44 

kit Live/Dead® 

3.5.5. Ensaio   de  infecção  de  H.   capsulatum  em   Mø  THP-1  like  e   determinação  da 44 

porcentagem de infecção por citometria de  fluxo 

3.5.6. Obtenção do RNA total, quantificação e avaliação da integridade 45 

3.5.7. Síntese de cDNA 45 

3.5.8. Quantificação dos miRNAs por PCR-Real Time 45 

3.5.9. Análise bioinformática dos miRNAs diferencialmente expressos 46 

3.6. Análise metabolômica 47 

3.6.1. Determinação   de  polissacarídeos  totais   em   amostras  de  culturas  planctônicas, 47 

biofilmes e sobrenadante dos biofilmes de H.   capsulatum 

3.6.2. Extração dos metabólitos 48 

3.6.3. Análises cromatográficas 48 

3.6.4. Análises  de  cromatografia   líquida  acoplada  à  espectrometria  de    massas  (LC- 49 

MS/MS) 

3.6.5. Análise dos dados de LC-MS/MS 49 

4. Resultados e Discussão 50 

4.1. Culturas planctônicas e formação dos biofilmes de H. capsulatum 50 

4.2. Análise transcriptômica 51 

4.2.1. Quantificação e avaliação da pureza e integridade do RNA das amostras 51 

4.2.2. Construção das bibliotecas de cDNA 52 

4.2.3. Sequenciamento dos transcritos de  H.  capsulatum  em biofilmes e   em crescimento 53 

planctônico 

4.3. Determinação  da viabilidade  celular  e  porcentagem  de infecção  em  Mø alveolares 74 

(AMJ2-C11) por diferentes cepas de H.  capsulatum 

4.3.1. Determinação da viabilidade celular após infecção de células    AMJ2-C11 utilizando 74 

o kit Live/Dead® 

4.3.2. Determinação  da porcentagem  de infecção  às células AMJ2-C11 por  citometria de 77 

fluxo 



XXII 
 

 
4.4. Screening  de  miRNAs  expressos  em  células  hospedeiras  após  interação   com  H. 78 

capsulatum 

4.4.1. Determinação  da viabilidade celular após infecção  de Mø  THP-1  like  utilizando o 78 

kit Live/Dead® 

4.4.2. Determinação  da porcentagem  de  infecção  em  Mø  THP-1  like  por citometria de 81 

fluxo 

4.4.3. Quantificação e avaliação da pureza e integridade do RNA das amostras 82 

4.4.4. Análise  da expressão  de  miRNAs  em células THP-1  após infecção com leveduras 85 

de H. capsulatum 

4.5. Análise metabolômica 102 

4.5.1. Produção de polissacarídeos totais em amostras de  culturas planctônicas,  biofilmes   

e sobrenadante dos biofilmes de H.  capsulatum 

102 

4.5.2. Análises cromatográficas 103 

4.5.3. Análises de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC- 

MS/MS) 

105 

4.5.3.1. Fracionamento das amostras 105 

4.5.3.2. Abundância total de metabólitos dos biofilmes e das culturas planctônicas 106 

4.5.3.3. Abundânca de metabólitos com massas moleculares comuns entre biofilmes e 

culturas planctônicas 

107 

4.5.3.3.1. Abundância dos metabólitos por range de massas moleculares 107 

4.5.3.3.2. Abundância dos metabólitos por intensidade relativa 110 

4.5.3.4. Abundânca de metabólitos com massas moleculares  exclusivas  dos biofilmes  e 

das culturas planctônicas 

4.5.3.5. Representação esquemática do perfil metabólico de H. capsulatum em biofilmes e 

culturas planctônicas 

112 

114 

5. Conclusões 119 

6. Referências 120 

Capítulo II – Artigos 129 



23 

Capítulo 1 - Tese 



24 
 

 
1. INTRODUÇÃO 

 
Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um patógeno fúngico dimórfico, que 

quando inalado na fase miceliar afeta primariamente os pulmões e, em geral, indivíduos 

imunocomprometidos, causando uma importante micose sistêmica denominada histoplasmose 

(Rodríguez-Cerdeira et al.,  2012). 

As infecções fúngicas invasivas têm aumentado durante as duas últimas décadas na 

América Latina e no mundo inteiro e, o número de pacientes em risco tem crescido 

drasticamente (Sifuentes-Osornio, Corzo-León e Ponce-De-León, 2012). Estima-se que 

aproximadamente 1,2 bilhões de pessoas são acometidas mundialmente por algum tipo de 

doença fúngica e, este dado se torna ainda mais alarmante considerando o número de pessoas  

que morrem anualmente por uma doença fúngica, um número que supera as mortes causadas  

por malária e tuberculose, com uma estimativa de 1,5 a 2 milhões de pessoas (Denning e 

Bromley, 2015). 

A histoplasmose é descrita como uma micose amplamente distribuída  nas  Américas, 

com uma particular endemia nos vales dos rios Ohio e Mississipi  nos  Estados  Unidos,  

México, Brasil e algumas regiões das Guianas (Guiana  Shield)  (Damasceno  et  al.,  2016). 

Além disso,  microfocos são registrados no leste dos Estados Unidos, sul da Europa e sudeste   

da Ásia. Atualmente, tem sido descrito como um patógeno de ampla dispersão geográfica em 

vista das oito populações genéticas de H. capsulatum distribuídas mundialmente entre as 

latitudes 54° Norte e 38° Sul (Kasuga et al., 2003; Anderson et  al.,  2006,  Calanni  et  al., 

2013), de maneira que tais populações foram classificadas em clados, sendo: (i) clado Norte 

Americano classe 1; (ii) clado Norte Americano classe 2; (iii) clado  Latino  Americano  grupo 

A; (iv) clado Latino Americano grupo B; (v) clado Australiano; (vi)  clado  Holandês;  (vii) 

clado Euro-Asiático e; (viii) clado Africano (Kasuga et al.,   2003). 

No Brasil, micoses sistêmicas ocasionadas por H.  capsulatum  são  relativamente 

comuns, sendo descritas em casos clínicos  isolados ou  na  ocorrência de surtos  (Brilhante  et 

al., 2012; Myint et al., 2014). Neste contexto, Oliveira, Unis e Severo (2006) relataram 26  

surtos de histoplasmose no Brasil desde 1958, envolvendo 184 pacientes, com o número de  

casos por surto variando de 2 – 13. No entanto, estes dados não são otimizados uma vez que a 

histoplasmose pulmonar aguda é pouco diagnosticada e muitas vezes confundida com a 

tuberculose ou a leishmaniose (Antinori et al.,  2014). 

De fato, surtos de histoplasmose aguda têm sido registrados em diversos Estados 

brasileiros, entre  eles São  Paulo, Rio de Janeiro, Espírito  Santo, Mato  Grosso,  Minas  Gerais, 



25 
 

 
Goiás, Amazonas e Rio Grande do Sul, nos quais os indivíduos são infectados após exposição 

aos propágulos fúngicos em ambientes contaminados, envolvendo também pacientes 

imunocompetentes (Ferreira e Borges, 2009; Faiolla et al., 2013;  Passos et  al.,  2014).  Em 

áreas endêmicas, aproximadamente 10% dos indíviduos imunocompetentes desenvolvem os 

sintomas da doença (Damasceno et al., 2016). Apesar disso, indivíduos HIV-positivos estão 

predispostos a infecções fúngicas em função das alterações significativas em  sua  resposta 

imune celular (Colombo et al.,  2012). 

Tendo, portanto, uma distribuição mundial, H. capsulatum é encontrado 

preferencialmente em excrementos de morcegos e aves na sua fase miceliar, a qual se  

caracteriza como o morfotipo geofílico, sapróbio-infectivo deste fungo, sendo capaz de 

permanecer no ambiente por períodos prolongados, fator que favorece sua disseminação 

(Rodríguez-Cerdeira et al.,  2012). 

Sendo assim, a patogenia da histoplasmose  inicia-se  quando  H.  capsulatum  é 

adquirido pela inalação de microconídios infectivos ou fragmentos de hifas, que atingem os 

alvéolos pulmonares, onde ocorre a diferenciação de microconídios em leveduras, que por sua 

vez são fagocitadas por macrófagos (Mø). As leveduras se multiplicam dentro dos 

fagolisossomas e, nessa fase, em contraste a função usual dos Mø de eliminar  os 

microrganismos nocivos, estas células propiciam um ambiente favorável e protetor para a 

sobrevivência e replicação da fase leveduriforme de H.  capsulatum,  a  qual  se  caracteriza 

como o morfotipo parasitário-virulento deste fungo (Tagliari et al.,   2012). 

Após a infecção, as manifestações clínicas abrangem desde um quadro assintomático, 

estado que ocorre com grande parte dos hospedeiros imunocompetentes após baixa exposição   

ao inóculo, à infecção disseminada e rapidamente fatal em hospedeiros imunocomprometidos.   

O papel da imunidade celular na defesa contra H. capsulatum é bem  estabelecido  (Deepe,  

2009; Antonello et al., 2011; Kroetz e Deepe, 2012; Deepe e Buesing, 2012). De fato, a forma 

disseminada da histoplasmose é mais comumente associada à reativação de focos quiescentes  

em indivíduos imunocomprometidos, em particular em pacientes infectados com o HIV 

(Marques et al., 2015). Segundo Ferreira e Borges (2009), entre 107 casos de histoplasmose 

disseminada diagnosticados na enfermaria de Doenças Infecciosas do Hospital de Clínicas da 

Universidade Federal de Uberlândia, Brasil, apenas um dos casos foi associado a um paciente 

imunocompetente. 

Adicionalmente, os fatores de virulência desenvolvidos pelo fungo  são  essenciais para  

o sucesso da infecção. Entre eles destacam-se: a) a transição micélio-levedura induzida pela 

temperatura,  a  qual  se  denomina  dimorfismo  térmico;  b)  os mecanismos  para  aquisição de 



26 
 

 
ferro; c) uma pequena proteína secretada que é capaz de se ligar ao Ca2+ em baixas  

concentrações (Cbp1); d) uma proteína de choque térmico (Hsp60); e) uma  proteína  

extracelular específica da fase leveduriforme (YPS3); f) um polissacarídeo da parede celular, 

denominado α-(1-3)-glucano; g) a produção de melanina e; h) a formação dos biofilmes de H. 

capsulatum, que constituem estruturas cruciais no desenvolvimento de infecções, uma vez que 

microrganismos estruturados em biofilmes exibem altos níveis de resistência aos 

antimicrobianos em função da baixa perfusão de drogas, favorecendo o desenvolvimento de 

fenótipos resistentes (Weaver, Sheehan e Keath, 1996; Nosanchuk et  al.,  2002;  Rappleye, 

Engle e Goldman, 2004; Bohse e Woods, 2007; Pitangui et al., 2012; Sardi et al.,    2014). 

Um biofilme pode ser definido como uma comunidade séssil de microrganismos, 

individualizado por células aderentes a um substrato, interface ou adesão célula-célula, 

circundadas por uma matriz extracelular (MEC) de polissacarídeos e que diferem  

profundamente das células homólogas livres em relação ao crescimento, expressão gênica e 

tradução de proteínas (Costerton et al., 1995). De fato, nosso grupo tem explorado aspectos 

únicos e determinantes para a formação dos biofilmes de H. capsulatum in vitro e  suas  

possíveis implicações na infecção às células hospedeiras. Da mesma forma, outros 

investigadores caracterizaram recentemente a susceptibilidade antifúngica reduzida  de  

biofilmes de H. capsulatum in  vitro  frente aos agentes antifúngicos itraconazol e anfotericina  

B, bem como frente à farnesol sozinho e combinado com antifúngicos, indicando os biofilmes 

como os prováveis implicadores das infecções fúngicas recorrentes (Brilhante et al.,   2015). 

Diante deste contexto, a gravidade destas formações resistentes na patogênese da 

histoplasmose se torna ainda mais relevante em vista dos relatos recentes que descrevem 

clinicamente a identificação de infecções por H. capsulatum em indivíduos com dispositivos 

médicos ou implantes cirúrgicos e ainda, relatos de histoplasmose endovascular em pacientes 

com implantes vasculares (Carreto-Binaghi et al.,  2015). 

Neste sentido, estudos prévios publicados pelo nosso grupo estabeleceram uma 

correlação  entre o modo de infecção  de H. capsulatum e a formação  dos biofilmes (Pitangui  

et al., 2012; Sardi et al., 2014; Pitangui et al., 2016). Diante desta problemática, é reafirmada     

a emergência da identificação de um novo alvo que possa ser selecionado,  a  fim  de  

estabelecer um novo regime terapêutico para a histoplasmose. Neste contexto, atualmente as 

abordagens “Ômicas” constituem ferramentas extremamente promissoras para a investigação   

de alvos e/ou biomarcadores dos biofilmes microbianos, no  que diz  respeito  à quantificação 

das mudanças globais na abundância de transcritos de RNA mensageiro (RNAm) 

(transcriptômica),  proteínas  (proteômica/secretômica)  e  outros  componentes  biomoleculares 



27 
 

 
(metabolômica) em diferentes condições as quais uma célula ou organismo estiver submetido 

(Ozsolak e Milos, 2011; Muszkieta et al., 2013). Tais ferramentas tiveram início na chamada  

Era Pós-Genômica e foram desenvolvidas para solucionar as limitações que permeiam a 

genômica de um organismo em questão. O sequenciamento genômico reflete a informação 

genética através de técnicas que identificam a sequência de nucleotídeos no genoma do 

organismo. Assim, é fato que aspectos tais como sequência, número e sintenia dos genes 

contidos no núcleo de uma célula se mantêm estáticos durante o ciclo  celular,  no  entanto 

existe um equilíbrio dinâmico entre: a) transcrição gênica, b) tradução proteica e, c) produção  

de subprodutos metabólicos de acordo com a condição biológica a qual a célula é sujeita, 

definindo então diferentes transcriptomas, proteomas e metabolomas para a mesma célula ao 

longo de sua diferenciação celular (De Hoog and Mann,   2004). 

Dessa forma, as análises transcriptômica, proteômica e metabolômica podem ser 

empregadas para a obtenção das diferenças entre a assinatura transcricional, traducional e 

metabólica de um microrganismo em biofilmes e em crescimento planctônico. Este campo de 

pesquisa tem adquirido novos conceitos e neste contexto Azevedo et al. (2009)  sugeriu  uma 

nova tendência, a chamada “biofômica” (biofomics) – uma abordagem “Ômica” para o campo 

dos biofilmes. O objetivo desta abordagem é reunir em um banco de dados o grande conjunto   

de dados ômicos gerados a partir dos estudos da habilidade de um microrganismo aderir à 

superfícies, se comunicar com células vizinhas e formar biofilmes.  Tais  dados  coletados  

seriam disponíveis à comunidade científica e identificariam uma  única  assinatura  dos  

biofilmes incluindo informações importantes como, fatores ambientais, fisiológicos e 

mutacionais que afetam a capacidade de um microrganismo desenvolver  biofilmes.  Isto  

poderia então impactar positivamente na Biologia de Sistemas e consequentemente no 

desenvolvimento de uma nova ferramenta diagnóstica e/ou terapêutica para estas formações 

resistentes. 

O transcriptoma total comparativo constitui uma abordagem estratégica para investigar 

fatores envolvidos na patogênese de H. capsulatum. Esta análise utiliza o sequenciamento do 

RNA em larga escala caracterizando o transcriptoma, que corresponde ao conjunto  completo   

de regiões transcritas em um genoma de maneira significativamente mais sensível quando 

comparado às abordagens de hibridização microarray (Wang et al., 2009a). Os dados obtidos 

utilizando sequenciamento de RNA também têm sido utilizados para identificar novos eventos  

de splicing e quantificar a expressão de genes a partir de células cultivadas em diferentes 

condições experimentais (Marioni et al., 2008; Mortazavi et al., 2008; Sultan et al., 2008; 

Trapnell, Pachter e Salzberg,  2009). 



28 

Segundo Wang et al. (2009b), plataformas de RNA-Seq são extremamente sensíveis e, 

neste estudo, caracteriza-se como uma ferramenta útil para categorizar, de forma inédita, os 

genes que representam a assinatura transcricional de H. caspulatum em suas diferentes formas 

de crescimento (biofilmes e planctônico), de maneira que serão identificados genes candidatos 

potenciais que codificam proteínas chave e que podem ser amplamente estudados como 

putativos alvos terapêuticos e/ou biomarcadores durante a infecção às células   hospedeiras. 

Alguns estudos têm reportado alterações transcricionais nos biofilmes de espécies de 

bactérias, entre elas Pseudomonas aeruginosa, Desulfovibrio vulgaris  e  espécies  de 

Sulfolobus (Manos et al., 2008; Koerdt et al., 2011; Clark et al., 2012) e patógenos fúngicos, 

como Candida albicans (De Cremer et al.,  2016). 

Neste contexto, muitas informações importantes têm sido obtidas a partir da utilização 

de métodos Ômicos empregados em estudos recentes e tais informações podem ser integradas 

para o desenvolvimento de uma nova terapia das infecções causadas por biofilmes    fúngicos. 

No âmbito das análises transcriptômicas, uma investigação recente destaca dados 

relevantes a cerca dos biofilmes de C. albicans. Tal espécie caracteriza-se como a mais 

prevalente e patogênica entre todas as espécies de Candida relacionadas  às  infecções 

sistêmicas (Candida bloodstream infections – CBSI) e, este  fato, é decorrente da habilidade    

do patógeno de formar biofilmes robustos. De acordo com Rajendran et al. (2016), os isolados 

clínicos de candidemia podem ser estratificados em dois grupos, os quais podem ter: a) alto 

potencial de formação de biofilmes (high biofilm formers – HBF) e; b) baixo potencial de 

formação de biofilmes (low biofilm formers – LBF). Assim, há um fenótipo heterogêneo dos 

biofilmes, o qual, de acordo com a sua classificação, impacta diretamente nos  resultados 

clínicos e na mortalidade. Os autores deste estudo constataram, por análise comparativa de 

RNA-Seq, que há uma expressão gênica diferencial significativa entre os isolados HBF e LBF 

de C. albicans. A partir dos resultados transcriptômicos obtidos foi possível destacar uma 

importância destacada para a via aspartato aminotransferase na formação dos biofilmes, a qual 

pode ser explorada como um potencial alvo em biofilmes   fúngicos. 

A abordagem metabolômica permite um melhor entendimento acerca dos fenômenos 

complexos que ocorrem em nível de metabólitos durante os estágios de desenvolvimento  de 

um biofilme, identificando os metabólitos em diferentes vias celulares e os avaliando como 

alvos terapêuticos potenciais e/ou como marcadores do biofilme na infecção às células 

hospedeiras. Com esta finalidade, plataformas de cromatografia líquida acoplada à 

espectrometria de massas (LC-MS/MS) têm sido amplamente empregadas na identificação de 

biomarcadores  (Hou  et  al.,  2014;  Li  et  al.,  2014;  Zhou  et  al.,  2014).  Dessa  forma, neste 



29 

trabalho foi desenvolvida a padronização de uma análise metabolômica não direcionada para 

detecção de diversos grupos de metabólitos como moléculas de baixa massa molecular não 

proteicas e pequenos peptídeos, a fim de se obter posteriormente, um perfil metabólico 

característico de H. capsulatum em suas diferentes formas de crescimento. Tendo em vista o 

estudo do metabolismo celular, é necessário  destacar algumas descrições feitas por Lindon et  

al. (2006) a partir dos seguintes conceitos: a) o metaboloma de um sistema biológico 

compreende o conjunto de todos os compostos químicos (intra- e extracelulares) consumidos 

(substratos) e excretados (metabólitos); b) o perfil metabólico, também denominado 

metabolômica, é definido como a investigação quantitativa de uma classe ampla de substratos 

intracelulares e metabólitos e; c) fingerprinting metabólico, também  denominado 

metabonômica, constitui uma investigação qualitativa de metabólitos selecionados necessários 

para classificar uma amostra. 

Uma investigação conduzida por Zhu et al. (2013) revelou o perfil metabólico dos 

biofilmes de C. albicans por uma técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria 

de massas (GC/MS), a partir da qual foram identificados 31 metabólitos produzidos 

diferencialmente entre culturas de biofilmes e células planctônicas. Este estudo demonstrou 

ainda que a trealose é determinante para o desenvolvimento dos biofilmes de C. albicans, uma 

vez que a ausência deste metabólito resultou na formação anormal e no aumento da 

sensibilidade dos biofilmes aos agentes antifúngicos anfotericina B e miconazol. 

Adicionalmente, um estudo desenvolvido por Chen et al. (2014) detectou 16 metabólitos 

diferencialmente produzidos entre culturas planctônicas e biofilmes de C.  albicans, dos quais   

a maioria foi identificada como aminoácidos ou compostos relacionados, através  de  um 

sistema de cromatografia de pareamento iônico-coluna de carbono grafítico poroso acoplada a 

um sistema de espectrometria de massas do tipo tempo de voo   (IP-PGC-TOF/MS). 

Então, em vista da complexidade e da variabilidade dos biofilmes de  fungos 

patogênicos, a integração de diferentes dados “Ômicos” se faz necessária. A combinação dos 

métodos “Ômicos” constitui um campo que tem sido explorado por alguns grupos de pesquisa 

em função da complementariedade entre eles. Esta combinação é o principal desafio  da 

biologia de sistemas em vista da grande quantidade de dados gerado pelos projetos “Ômicos”, 

os quais, uma vez integrados permitem o mapeamento e a elucidação de  informações 

peculiares, em termos quantitativos, a cerca do comportamento de uma célula, tecido ou 

organismo em uma determinada condição biológica a qual estiver submetido (Moreira, 2015). 

Muszkieta et al. (2013) integraram três diferentes métodos “Ômicos”, microarray, RNA-seq e 

análise  proteômica,  para comparar  as diferentes  assinaturas transcriptômica  e proteômica dos 



30 
 

 
biofilmes de Aspergillus fumigatus. De acordo com os autores, alguns genes foram, de fato, 

correspondentes às proteínas diferencialmente reguladas, no entanto, há muitos desafios que 

permeiam a correlação entre dados de transcriptoma e proteoma. Estes desafios referem-se ao 

fato de que os dados detectados do transcriptoma codificante (RNAm) não refletem todos os 

processos regulatórios de uma célula, tais como os processos pós-transcricionais e a regulação 

pós-traducional, reafirmando a necessidade de integrar as abordagens “Ômicas”. Assim, a 

comparação e a integração de abordagens “Ômicas” em diferentes níveis tem um potencial 

promissor para fornecer novas informações, que se reúnem para caracterizar a assinatura dos 

biofilmes microbianos, no que diz respeito à habilidade de formação, atividade fisiológica e 

estrutura. 

De maneira adicional, a identificação dos microRNAs (miRNAs) expressos por uma 

célula ou organismo em uma determinada condição caracteriza o miRNoma. Assim, a 

identificação dos miRNAs diferencialmente expressos após interação H. capsulatum-célula 

hospedeira também constitui uma abordagem de importância cada vez mais reconhecida a ser 

desenvolvida neste trabalho, em vista da ocorrência generalizada dos miRNAs e suas diversas 

funções como moléculas regulatórias (Law et al.,  2013). 

De fato, RNAs não-codificantes (ncRNAs) ganharam a atenção  de muitos  

pesquisadores em função de inúmeras investigações que destacam o seu papel em diversos 

processos biológicos e doenças, incluindo vários tipos de cânceres humanos, doenças 

cardiovasculares e doenças respiratórias alérgicas, principalmente  por  regularem  a  expressão 

de vários genes (Garofalo, Leva e Croce, 2014; Leung e Natarajan, 2014; Liu et al., 2014; 

Rebane e Akdis, 2014; Yao-Shu, Xiao-Lin e Yong, 2014). Entre os ncRNAs, destacam-se os 

miRNAs, pequenas moléculas de RNA que afetam a estabilidade dos RNAm e cujas funções 

regulatórias são bem estabelecidas (O'connell et al.,  2010). 

Os miRNAs apresentam-se em cadeia simples com 19 a 23 nucleotídeos e, de forma 

geral, a biogênese dessas pequenas moléculas tem origem no núcleo celular chegando ao 

citoplasma onde reconhecem os RNAm alvos e reprimem os processos pós-transcricionais ou 

induzem a clivagem do RNAm (Chitwood e Timmermans, 2007; Costa, Leitão  e  Enguita, 

2012). As proteínas Argonautas, presentes no citoplasma, estão envolvidas no processo de 

maturação do miRNA, permitindo sua ligação ao RNAm, para que então inicie a inibição dos 

processos trancricionais dos RNAm-alvo. Essa atividade regulatória que miRNAs apresentam    

é um processo complexo, uma vez que um único RNAm transcrito pode ser alvo de vários 

miRNAs, assim como um único miRNA pode regular diversos RNAm-alvo (Costa, Leitão e 

Enguita, 2012; Turchinovich et al.,  2013). 



31 
 

 
De maneira detalhada, a biogênese dos miRNAs inicia-se  no  núcleo  a partir de um 

locus específico do genoma onde há a formação  de um miRNA primário  (ou  pri-miRNA).  

Este miRNA é processado pelo complexo  DROSHA-DGCR8, o que resulta na  formação de  

um miRNA precursor também chamado pré-miRNA, que por sua vez é transportado para o 

citoplasma através de poros nucleares pela Exportina 5. No citoplasma, os pré-miRNAs são 

reconhecidos pela enzima DICER, que é responsável pela  clivagem  do loop  destes 

precursores, processo que culmina na obtenção de fragmentos de 19 a 23 pares de bases e que 

permanecem ligados a essa enzima. Este complexo, entre a DICER e o pequeno fragmento, 

recruta diversas proteínas da família Argonauta, que em conjunto formam o complexo RISC. 

Finalmente, este complexo agrupado com o miRNA maduro têm como alvo uma sequência 

complementar do RNAm atuando na regulação negativa da expressão gênica por induzirem a 

clivagem da cauda poli-A (deadenilação) através da ação de exonucleases ou por inibirem a  

ação dos ribossomos na tradução (Li e Rana,  2014). 

Poucas investigações têm demonstrado a expressão anormal de miRNAs em células 

hospedeiras em resposta às infecções fúngicas. Neste contexto, são descritos os miRNAs com 

expressão significativamente aumentada ou diminuída em relação aos controles em células 

epiteliais respiratórias e Mø murinos infectados com C. albicans e, em monócitos humanos e 

células dendríticas infectadas com A. fumigatus (Monk et al., 2010; Das Gupta et al., 2014; 

Muhammad et al., 2015; Agustinho et al., 2017). Recentemente, um estudo descreveu ainda o 

perfil de miRNAs desregulados após a infecção por C. albicans in vivo, em modelo animal 

alternativo Caenorhabditis elegans e, identificaram 16 miRNAs superexpressos e 4 miRNAs 

reprimidos nos nematodos em resposta à infecção (Sun et al., 2016). Com base nisso, os 

resultados obtidos no  presente estudo  contemplam a identificação de miRNAs desregulados  

em Mø hospedeiros em resposta à infecção com leveduras de H. capsulatum empregando a 

tecnologia de RT-qPCR (reverse transcription-quantitative PCR), uma plataforma  que 

determina a abundância relativa de miRNAs nas amostras biológicas   selecionadas. 

Neste contexto, a identificação dos miRNAs anormalmente regulados em uma célula 

infectada constitui uma abordagem promissora para o desenvolvimento de novas opções 

terapêuticas e ferramentas diagnósticas. Em vista das alternativas terapêuticas empregando 

miRNAs, atualmente destaca-se uma tecnologia baseada na administração de um RNA de 

interferência (RNAi) para regular ou mimetizar a função de um  miRNA  in  vivo.  Tal  

tecnologia fundamenta-se na utilização dos chamados antimiRs ou mimics. Os antimiRs 

caracterizam-se como oligonucleotídeos anti-sentido de cadeia simples utilizados para inibir a 

função  de  um  miRNA.  Embora  o  mecanismo  de  ação  exato  destas  moléculas  permaneça 



32 

desconhecido, esta ferramenta tem demonstrado eficácia in vivo ao atuar em um miRNA e 

impedir sua atividade de repressão gênica, por meio da complementariedade perfeita entre a 

sequência do oligonucleotídeo administrado e o miRNA-alvo (Van Rooij et  al., 2008). Com 

este intuito, a indústria farmacêutica Santaris Pharma  desenvolveu  uma droga  experimental 

para o tratamento da hepatite C, nomeada Miravirsen (anteriormente conhecido como 

SPC3649), a qual atua como um antagonista de miR-122, um miRNA reconhecidamente 

importante para a replicação  do vírus da hepatite C. Atualmente,  a droga encontra-se em fase   

II de Ensaios Clínicos e, quando administrada por via intravenosa ou subcutânea  em 

chimpanzés tem impedido a função do miR-122 resultando na redução da carga viral (Borgia     

et al., 2016). Por outro lado, as opções terapêuticas com o emprego de miRNAs também 

concentram-se no fornecimento sintético de um miRNA mimic. Os mimics são 

oligonucleotídeos curtos de fita-dupla que são reconhecidos e transportados até o complexo 

RISC no citoplasma celular, a partir do qual o oligonucleotídeo pode atuar como um miRNA 

endógeno aumentando o nível do miRNA de interesse e bloqueando potencialmente  a 

expressão do(s) gene(s)-alvo (Van Rooij et al.,  2008). 

Adicionalmente, no âmbito do diagnóstico, miRNAs têm sido propostos como 

biomarcadores estáveis de várias doenças e neste campo de pesquisa, a nova ferramenta 

miRview mets (Rosetta Genomics Ltd., Nova Jersey, EUA) representa o que há de mais atual 

e evoluído. Esta ferramenta caracteriza-se como um teste diagnóstico capaz de identificar o 

tecido de origem de um tumor metastático por meio da quantificação do nível de expressão de 

48 miRNAs reconhecidos como biomarcadores tumorais. Assim, o teste tem a propriedade de 

designar o sítio primário para uma amostra de câncer com base na expressão de miRNAs do 

tecido tumoral (Meiri et al.,  2012). 

Então, em linhas gerais, os objetivos propostos e executados neste projeto concentraram-

se na busca de um novo alvo (terapia)  e/ou  candidatos  a  marcadores moleculares 

(diagnóstico) da histoplasmose em hospedeiros eucarióticos, a fim de estabelecer com clareza as 

vias de sinalização alteradas nos sistemas de infecção estudados. Para tanto, as tecnologias 

“Ômicas”, entre elas, transcriptoma e metaboloma, e um screening de miRNAs foram as 

abordagens empregadas para investigar a regulação transcricional, metabólica, bem como o 

perfil de RNAs não codificantes (miRNAs) de células leveduriformes  de  H.  capsulatum 

estruturadas em biofilmes e os resultados obtidos são fundamentais para a consolidação do 

estudo da virulência dos biofilmes de H. capsulatum destacando informações científicas 

inovadoras a respeito do tema na  ciência. 



119 

5. CONCLUSÕES

Os dados gerados pelo sequenciamento possibilitaram comparar as diferenças 

transcricionais dentro da mesma espécie (biofilmes  vs.  culturas  planctônicas)  e  entre 

diferentes cepas (EH-315 vs. 60I). Sendo assim, a análise transcriptômica revelou genes-alvo que 

caracterizam a assinatura transcricional dos biofilmes  e da infectividade  de uma  cepa e, em 

conclusão, destaca-se ainda que a maioria dos genes é reprimida (≈80% down-regulated) 

quando as leveduras livres passam a organizarem-se em   biofilmes. 

Conclui-se também que há um padrão de expressão anormal de  miRNAs  em  Mø 

THP-1 em resposta à infecção com leveduras de H. capsulatum (cepa EH-315 em culturas 

planctônicas e biofilmes e cepa 60I em culturas planctônicas). Tais miRNAs identificados são 

responsáveis pelo destino das células infectadas, uma  vez  que atuam  regulando 

negativamente a expressão de um gene (RNAm) alvo, interferindo em vias que determinam a 

patogênese da histoplasmose e que envolvem desde os aspectos inerentes à adesão às células 

hospedeiras, bem como à resposta inflamatória e ainda, à morte celular. Além disso, os 

resultados obtidos indicam que os genes-alvo EPB41 e NUFIP2 têm sua expressão 

potencialmente desregulada em células hospedeiras após a infecção com H.  capsulatum.  

Assim, em vista da importância funcional reconhecida dos miRNAs  identificados  neste 

estudo, estes ncRNAs podem viabilizar uma estratégia terapêutica no  futuro, a fim    de reverter 



120 

a relação miRNA-RNAm à normalidade celular, por meio do  fornecimento  de  um 

determinado miRNA (mimics) ou através do bloqueio de um miRNA expresso (antagomiRs). 

Destaca-se ainda que no screening diferencial biofilmes vs. culturas planctônicas todos os 

miRNAs alterados foram superexpressos na célula infectada, fato que demonstra a atuação de 

tais miRNAs convergindo para a regulação negativa da expressão gênica em resposta  à 

infecção por biofilmes. 

Adicionalmente, a análise metabolômica diferencial demonstra que  em  biofilmes  há 

um aumento substancial de PEI e PI comparado ao crescimento de ambas as cepas (EH-315 e 

60I) em culturas planctônicas, constatando a produção de matriz  extracelular,  bem  como 

maior reserva energética indispensável a estas formações. Subsequentemente, a análise de 

abundância dos metabólitos detectados por LC-MS/MS revelou três grupos de metabólitos, 

sendo a) a grande maioria de moléculas com massas moleculares comuns (74%)  entre 

biofilmes e culturas planctônicas, das quais 95% apresentam massa molecular  ≤  800  Da  e 

57% têm uma intensidade relativa reduzida quando as leveduras passam a estruturarem-se em 

biofilmes (DOWN); b) 8% das moléculas  produzidas  exibiram  massa  exclusiva  nos 

biofilmes, das quais a maioria (55%) apresentou massa molecular ≥ 800 Da e; c) 18% das 

moléculas produzidas exibiram massa exclusiva nas culturas planctônicas. Portanto, em 

biofilmes há uma produção significativamente menor de metabólitos   exclusivos. 

Em conclusão, a integração entre as abordagens desenvolvidas revela  que a 

estruturação das leveduras em biofilmes induz uma regulação negativa que impacta nos 

processos transcricionais direta (genoma codificante – RNAm) e indiretamente (genoma não- 

codificante – miRNAs) e, nos processos metabólicos, sugerindo uma redução significativa da 

atividade metabólica evidenciada tanto na biologia do fungo em biofilme (regulação 

transcricional e metabólica), como  na interação in vitro biofilmes-células  hospedeiras (perfil 

de miRNAs). 

Em conjunto, através das plataformas exploradas foram identificadas (genes  e 

miRNAs) e detectadas (metabólitos) moléculas que constituem uma fonte potencial para 

delinear: a) um marcador de biofilmes na infecção às células hospedeiras; b) novos protótipos 

para a terapêutica da histoplasmose e; c) novos biomarcadores como ferramentas diagnósticas 

para a histoplasmose. 

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	NAYLA DE SOUZA PITANGUI
	REGULAÇÃO  TRANSCRICIONAL,  METABÓLICA  E PERFIL DE MICRORNAs

	NAYLA DE SOUZA PITANGUI
	REGULAÇÃO  TRANSCRICIONAL,  METABÓLICA E PERFIL DE MICRORNAs
	ÍNDICE DE FIGURAS
	ÍNDICE DE  TABELAS
	LISTA  DE ABREVIATURAS
	RESUMO
	ABSTRACT
	SUMÁRIO
	Lista de Abreviaturas XIV
	Capítulo I – Tese 23
	3. Materiais e Métodos 35
	4. Resultados e Discussão 50
	Capítulo II – Artigos 129

	Capítulo 1 - Tese
	1. INTRODUÇÃO
	2. OBJETIVOS
	2.2. Objetivos específicos
	2.3. Representação Esquemática
	3. MATERIAIS  E MÉTODOS
	3.3. Análise transcriptômica
	3.3.2. Quantificação e avaliação da  pureza e integridade do  RNA das  amostras
	3.3.3. Construção das bibliotecas de DNA complementar   (cDNA)
	3.3.4. Clusterização e sequenciamento dos transcritos das cepas EH-315 e 60I de H. capsulatum em biofilmes e em crescimento  planctônico
	3.3.5. Análise dos dados de  sequenciamento
	3.3.6. Identificação, categorização funcional e localização de domínios   proteicos
	3.4. Determinação da viabilidade celular e porcentagem de infecção em Mø alveolares (AMJ2-C11) por diferentes cepas de H.  capsulatum
	3.4.2. Determinação da viabilidade celular após infecção de células  AMJ2-C11  utilizando o kit  Live/Dead®
	3.4.3. Infecção por H. capsulatum às células AMJ2-C11 e determinação  da  porcentagem de infecção por citometria de  fluxo
	3.5. Screening de miRNAs expressos em células hospedeiras após interação com H. capsulatum
	3.5.2. Seleção da linhagem  celular
	3.5.3. Cultura de células THP-1
	3.5.4. Determinação da viabilidade celular após infecção de Mø THP-1 like utilizando  o kit Live/Dead®
	3.5.5. Ensaio de infecção de H. capsulatum em Mø THP-1 like e determinação da porcentagem de infecção por citometria de  fluxo
	3.5.6. Obtenção do RNA total, quantificação e avaliação da   integridade
	3.5.7. Síntese de cDNA
	3.5.8. Quantificação dos miRNAs por PCR-Real  Time
	3.5.9. Análise bioinformática  dos miRNAs diferencialmente  expressos
	3.6. Análise metabolômica
	3.6.2. Extração  dos metabólitos
	3.6.3. Análises cromatográficas
	3.6.4. Análises de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC- MS/MS)
	3.6.5. Análise dos dados de  LC-MS/MS
	4. RESULTADOS  E DISCUSSÃO
	4.2. Análise transcriptômica
	4.2.2. Construção das bibliotecas de  cDNA
	4.2.3. Sequenciamento dos transcritos de H. capsulatum em biofilmes e em crescimento planctônico
	4.3. Determinação da viabilidade celular e porcentagem de infecção em Mø alveolares (AMJ2-C11) por diferentes cepas de H.  capsulatum
	4.3.2. Determinação da porcentagem de infecção às células AMJ2-C11 por citometria de fluxo
	4.4. Screening de miRNAs expressos em células hospedeiras após interação com H. capsulatum
	4.4.2. Determinação da porcentagem de infecção em Mø THP-1 like por citometria de fluxo
	4.4.3. Quantificação e avaliação da  pureza e integridade do  RNA das  amostras
	4.4.4. Análise da  expressão de miRNAs em células THP-1 após infecção  com leveduras  de H. capsulatum
	4.5. Análise metabolômica
	4.5.2. Análises cromatográficas
	4.5.3. Análises de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS)
	4.5.3.2. Abundância total de metabólitos dos biofilmes e das culturas   planctônicas
	4.5.3.3. Abundância de metabólitos com massas moleculares comuns entre biofilmes e culturas planctônicas
	4.5.3.3.2. Abundância dos metabólitos por intensidade  relativa
	4.5.3.4. Abundância de metabólitos com massas moleculares exclusivas dos biofilmes e  das culturas planctônicas
	4.5.3.5. Representação esquemática do perfil metabólico de H. capsulatum em biofilmes e culturas planctônicas
	5. CONCLUSÕES
	6. REFERÊNCIAS

	Capítulo 2 - Artigos
	Clinical Microbiology: Open Access
	Introduction
	Methods
	Results
	Discussion
	Abstract

	Tropical Medicine & Surgery
	Introduction
	Epidemiology
	Virulence Factors Relevant for Nosocomial Candidemia
	Drugs Resistance
	Prophylaxis in Nosocomial Infection
	Conclusion
	GENETIC EVALUATION AND ACTIVITY OF ANTIFUNGAL AGAINST CLINICAL ISOLATES CANDIDA ALBICANS BIOFILMS
	Nayla De Souza Pitangui
	Caetano Toshiro Yamashita
	Ana Marisa Fusco-Almeida
	Maria José Soares Mendes-Giannini
	Janaina De Cássia Orlandi Sardi
	ABSTRACT
	1. INTRODUCTION
	2. MATERIAL AND METHODS
	3. RESULTS
	4. DISCUSSION
	5. CONCLUSION
	REFERENCES
	Luciana Arantes Soares,1 Fernanda Patrícia Gullo,1 Janaina de Cássia Orlandi Sardi,1 Nayla de Souza Pitangui,1 Caroline Barcelos Costa-Orlandi,1 Fernanda Sangalli-Leite,1 Liliana Scorzoni,1 Luis Octávio Regasini,2 Maicon Segalla Petrônio,2
	1. Introduction
	2. Methods
	3. Results
	4. Discussion
	5. Conclusion
	Conflict of Interests
	Acknowledgments
	References
	Research Article
	Ana Carolina Alves de Paula e Silva,1 Caroline Barcelos Costa-Orlandi,1
	1. Introduction
	2. Materials and Methods
	3. Results
	4. Discussion
	Conflict of Interests
	Acknowledgments
	References

	Review Article
	Laura Elena Carreto-Binaghi,1 Lisandra Serra Damasceno,2 Nayla de Souza Pitangui,3 Ana Marisa Fusco-Almeida,3  Maria José Soares  Mendes-Giannini,3
	1. Introduction
	2. Etiologic Agents of HAI
	4. Biofilm Formation
	5. Quorum Sensing (QS)
	6. H. capsulatum Infection in Drug-Induced Immunocompromised   Individuals
	7. Fungal Respiratory Infections in the Hospital Environment
	8. Molecular Biology as
	9. Conclusions
	Conflict of Interests
	Authors’ Contribution
	Acknowledgments
	References


	Yeast-Aggregates Generates Nuclear Damage to the Cultured Murine Alveolar Macrophages
	INTRODUCTION
	MATERIALS AND METHODS
	Macrophage Cultures
	Ethics Statement
	Infection Rate of H. capsulatum in Alveolar Macrophages Detected by Colony Forming Units (CFU)
	Indirect Immunofluorescence
	Comet Assay
	TUNEL Assay
	Labeling of the Nuclear Envelope Proteins SUN2, Nesprin2, and Emerin
	Statistical Analyses
	RESULTS
	in AMJ2-C11 Alveolar Macrophage Cell-Line Detected by CFU
	Flow Cytometry Assay
	Comet Assay
	TUNEL
	Labeling of the Nuclear Envelope Proteins SUN2, Nesprin2, and Emerin
	DISCUSSION
	AUTHOR CONTRIBUTIONS
	ACKNOWLEDGMENTS
	SUPPLEMENTARY  MATERIAL
	REFERENCES
	Janaína de Cássia Orlandi Sardi1,3,#, Fernanda Patrícia Gullo1,#, Irlan Almeida Freires3, Nayla de Souza Pitangui1 Maicon Petrônio Segalla2, Ana Marisa Fusco-Almeida1, Pedro Luiz Rosalen3, Luís Octávio Regasini2,4,  Maria José Soares Mendes-Giannini1,*
	1
	We tested the antifungal potential of caffeic acid and eight of its derivative esters against C. albicans ATCC 90028 and nine clinical isolates, and carried out a synergism assay with fluconazole and nystatin. Propyl caffeate (C3) showed the best anti...
	intrinsic resistance mechanisms (Ying et al., 2013; Fernandez-Ruiz et al., 2015; Liao et al., 2015; Seifi et al., 2015; Freitas et al., 2015). Therefore, the development of novel strategies to minimize the toxic effects of current antifungals and impr...
	filtrate was serially washed with saturated aqueous citric acid solution (three times), saturated aqueous NaHCO3 (three-times), water (two-times), dried over MgSO4, and evaporated under reduced pressure. The crude products were purified over a silica ...
	(0.5 < FICI ≤ 1.0), indifferent (1.0 < FICI < 4.0) and antagonistic (FICI ≥ 4.0) (Soares et al., 2014).
	5
	1. Caffeic acid and all of its synthesized derivatives showed a fungicidal activity against C. albicans ATCC 90028 and presented a structure-activity relationship. As seen in Table 2, the caffeic acid molecule (C0) without structural change and the de...
	µg/mL and 400 µg/L, respectively. When combined, both C3 and the antifungals had their SI value increased, indicating selectivity for yeasts rather than NOK cells (Table 5).
	90028. This could be due to acquisition of resistance mechanisms as the isolates belonged  to diabetic patients. A recent study showed that this group of patients is prone to develop Candida infections in cases of poor glycemic control (Zomorodian et ...
	studies should focus on the effects of these combinations against Candida biofilms and establish C3 mechanism(s) of action.
	Denning DW, Gugnani HC (2015) Burden of serious fungal infections in Trinidad and Tobago. Mycoses. 58: 80-84.
	Gullo FP, Sardi JC, Santos VA, Sangalli-Leite F, Pitangui NS, Rossi SA, de Paula E Silva AC, Soares LA, Silva JF, Oliveira HC, Furlan M, Silva DH, Bolzani VS, Mendes-Giannini MJ, Fusco-Almeida AM (2012) Antifungal activity of maytenin and pristimerin....
	Newman DJ, Cragg GM (2016) Natural Products as Sources of New Drugs over the 30 Years from 1981 to 20140. J Nat Prod. DOI: 10.1021/acs.jnatprod.5b01055. [In press].
	Rzepecka-Stojko A, Kabała-Dzik A, Moździerz A, Kubina R, Wojtyczka RD, Stojko R, Dziedzic A, Jastrzębska-Stojko Ż, Jurzak M, Buszman E, Stojko J (2015) Caffeic Acid phenethyl ester and ethanol extract of propolis induce the complementary cytotoxic eff...
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	in oropharyngeal samples of type-1 diabetes mellitus patients. Mycoses 47: 315-318.
	Figure 1
	16
	ATCC 90028.
	17
	Table 3. Antifungal activity of caffeic acid derivative esters (C3, C4 and C6) against nine oral clinical isolates of Candida albicans. MIC/MFC values are expressed in µg/mL.
	C4 C6

	Table 4. Antifungal effects of propyl caffeate (C3) combined with fluconazole and nystatin against Candida albicans ATCC 90028 and nine oral clinical isolates. MIC values are expressed in µg/mL.
	19
	Table 5. IC50 value and Selective Index  (SI) of propyl caffeate (C3), fluconazole (FCZ)  and nystatin (NYST) showing the toxicity of the compounds against yeasts in relationship  to human oral keratinocytes (NOK cells).
	21