UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL VALOR NUTRICIONAL E PARÂMETROS DE QUALIDADE DE SUBPRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PARA CÃES Iris Mayumi Kawauchi Zootecnista 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL VALOR NUTRICIONAL E PARÂMETROS DE QUALIDADE DE SUBPRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PARA CÃES Iris Mayumi Kawauchi Orientadora: Profª. Drª. Nilva Kazue Sakomura Coorientador: Prof. Dr. Aulus Cavalieri Carciofi Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Zootecnia. 2012 iii Kawauchi, Iris Mayumi K22v Valor nutricional e parâmetros de qualidade de subprodutos de origem animal para cães / Iris Mayumi Kawauchi. – – Jaboticabal, 2012 xiv, 100 f. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2012 Orientadora: Nilva Kazue Sakomura Coorientador: Aulus Cavalieri Carciofi Banca examinadora: Jane Maria Bertocco Ezequiel, Euclides Braga Malheiros, Ricardo Souza Vasconcellos, Cristiana Fonseca Ferreira Pontieri Bibliografia 1. Energia metabolizável. 2. Farinha de carne e ossos. 3. Farinha de vísceras de aves. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:636.087.6:636.7 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. iii DADOS CURRICULARES DA AUTORA IRIS MAYUMI KAWAUCHI – filha de Roberto Keiji Kawauchi e Ivone Sakurai Kawauchi, nasceu em 12 de janeiro de 1982, na cidade de São Paulo, SP. Em março de 2002 ingressou no curso de Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Câmpus de Jaboticabal, durante o qual foi bolsista de Iniciação Científica sob orientação da Professora Dra. Nilva Kazue Sakomura. Graduou-se em julho de 2006 e em agosto do mesmo ano ingressou no curso de Mestrado em Zootecnia na mesma Instituição, sob orientação da Professora Dra. Nilva Kazue Sakomura e co-orientação do Professor Dr. Aulus Cavalieri Carciofi. Concluiu o curso de Mestrado em agosto de 2008 e em março de 2009 iniciou o curso de Doutorado em Zootecnia na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Câmpus de Jaboticabal, atuando no mesmo grupo de pesquisa no qual desenvolveu o Mestrado. De setembro de 2011 a janeiro de 2012 realizou estágio financiado pelo Programa de Doutorado no País com Estágio no Exterior (PDEE) da CAPES, no Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos da Facultad de Veterinaria da Universidad de Zaragoza (Espanha) sob co-orientação do Professor Dr. Carlos Castrillo. Atualmente, é Pesquisadora do Centro de Desenvolvimento Nutricional da Premier Pet, Dourado-SP. iv DEDICO Aos meus pais, Roberto Keiji Kawauchi e Ivone Sakurai Kawauchi, pelo amor incondicional, dedicação, proteção, paciência, exemplo, por investirem em minha formação pessoal e profissional e por me apoiarem e incentivarem sempre. Ao meu irmão, Rodrigo Kenji Kawauchi, pelo incentivo e por estar sempre ao meu lado. OFEREÇO Aos Professores Nilva Kazue Sakomura, Aulus Cavalieri Carciofi e Carlos Castrillo, por compartilharem seus conhecimentos, me incentivarem, pelo exemplo e por todas as oportunidades que me proporcionaram. v AGRADECIMENTOS À Professora Nilva Kazue Sakomura, por acreditar e investir em minha formação acadêmica, por aceitar orientar-me com nutrição de cães, conceder-me inúmeras oportunidades no decorrer destes 9 anos de orientação, pela paciência, por me incentivar e apoiar sempre, por estar disposta a ajudar-me sempre que precisei e por todos os valiosos ensinamentos, conselhos, pelo exemplo e pela amizade. Agradeço, também, pela fundamental participação na elaboração e discussão da presente tese. Muito obrigada, Professora!!! Ao Professor Aulus Cavalieri Carciofi por aceitar coorientar-me e fazê-lo de forma sempre participativa e presente, por disponibilizar as instalações , animais e todos os recursos de seu laboratório, pelas inúmeras oportunidades que me proporcionou e por todos os valiosos ensinamentos, conselhos, pelo exemplo e pela amizade. Muito obrigada por me incentivar e tornar possível a realização do estágio na Universidad de Zaragoza, oportunidade única e inesquecível em minha vida acadêmica e, principalmente, pessoal. Agradeço, também, pela fundamental participação na elaboração e discussão da presente tese. Muito obrigada, Professor!!! Ao Professor Carlos Castrillo da Universidad de Zaragoza e toda sua equipe, por receberem-me de braços abertos em seu Departamento, estarem sempre dispostos a ajudar e pela grande amizade. Agradeço especialmente ao Professor Castrillo, por dedicar-me sempre atenção e orientação e proporcionar- me grande aprendizado não somente acadêmico mas também ensinamentos que guardarei e recordarei com muito carinho por toda minha vida. Muito obrigada, Professor Castrillo!!!! À Universidade Estadual Paulista e ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia e seu corpo docente, por proporcionarem-me formação completa e de extrema qualidade, além de inúmeras oportunidades. Aos Professores que participaram de minha banca de qualificação, Jane Maria Bertocco Ezequiel, Euclides Braga Malheiros, Izabelle A. M. de Almeida Teixeira e o Pós-Doutorando Edney Pereira da Silva, pela enorme contribuição. vi Muito obrigada por proporcionarem maior entendimento e melhor discussão da presente tese. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa de estudo. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Programa PDEE, pela concessão de bolsa de estudo para realização de estágio na Universidad de Zaragoza. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento da presente tese. À Grandfood Indústria e Comércio Ltda. (Premier Pet), em especial, à Cristiana Fonseca F. Pontieri, por realizar parte das análises apresentadas na presente tese, sem as quais não seria possível obter todas informações desejadas sobre os alimentos avaliados. Agradeço também à Premier pela oportunidade em integrar sua equipe e por toda compreensão e auxílio, sem os quais seria extremamente difícil conciliar as atividades em Jaboticabal e Dourado. Às empresas que doaram os alimentos objeto de estudo da presente tese, os quais foram fundamentais na obtenção de amostra representativa do mercado de fornecedores de farinhas de origem animal para a indústria petfood. À Mogiana Alimentos S.A. (Guabi) pelo suporte ao Laboratório de Pesquisa em Nutrição e Doenças Nutricionais de Cães e Gatos no qual foi desenvolvida a presente pesquisa. Ao pós-doutorando Edney Pereira da Silva do Departamento de Zootecnia pelos valiosos ensinamentos, conselhos e colaboração direta na condução e interpretação dos resultados da presente tese. Aos pós-graduandos do Laboratório de Pesquisa em Nutrição de Cães e Gatos, Márcia, Juliana, Danilo, Bruna, Ana, Thaila, Márcio, Fernando, Clara, Raquel, Fabiano, Flávio, Chayanne, Leandro, Mariana, Mayara, Michele, Fernanda, Dóris, por me acolherem de forma a me sentir parte do grupo, pela amizade, pelos ensinamentos, conselhos, pela agradável convivência e grande aprendizado que me proporcionaram. Aos pós-graduandos do Setor de Avicultura, Mel, Dani, Edney, Anchieta, Joyce, Nayara, Juliano, Giuliana, Hilda, Katiane, Luciano, Carol, Roberto, Inez, vii Cléber, Allan, Gabriel, Camila, pela agradável convivência, amizade, valiosos ensinamentos e conselhos. À Aline Rebelato, estagiária do Laboratório de Pesquisa em Nutrição de Cães e Gatos e ao estagiário do Setor de Avicultura, Danilo, pelo fundamental auxílio na produção das rações e nas análises laboratoriais deste estudo. À técnica do Laboratório de Nutrição de Cães e Gatos, Cláudia Aparecida Nogueira pelo grande auxílio na realização das análises laboratoriais. Aos funcionários do Laboratório de Nutrição de Cães e Gatos, Elaine e Diego, pela agradável convivência e colaboração imprescindível neste estudo. Aos funcionários do Setor de Avicultura, Vicente, Robson, Izildo pela agradável convivência e colaboração na produção das rações experimentais. Aos funcionários da Fábrica de Rações, Helinho, Sr. Oswaldo e Sandra pelo empenho e dedicação na produção das rações experimentais. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação pela atenção, paciência e presteza. À minha família por me incentivarem e apoiarem sempre, pelos esforços para que concluísse esta importante etapa de minha vida, por todo o carinho e pelas orações que me proporcionaram calma e tranquilidade, principalmente, nos momentos difíceis. Aos meus familiares, em especial, batiam e tia Irene pelas visitas, incentivo e carinho. Aos meus cães, Ju, Yuka, Toddy, Sharon, Pluto e Mel por me proporcionarem momentos de muita alegria e paz, pelo companheirismo e lealdade. Aos amigos Márcia, Bruna, Thaila, Jú, Danilo, Ana, Fabrício e Joseli pela amizade, pela paciência, companheirismo e pelos momentos de descontração. Obrigada por estarem sempre ao meu lado!!! Ao Daniel, pela paciência e apoio, espero que seja feliz. A todos que direta ou indiretamente contribuíram e viabilizaram a conclusão desta importante etapa de minha vida. Muito obrigada!!! viii SUMÁRIO Página Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais ........................................ xiv RESUMO .............................................................................................................. 1 ABSTRACT .......................................................................................................... 2 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ...................................................... 3 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 3 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 6 Estatísticas do mercado “petfood” ................................................................ 6 Características qualitativas do processamento e das farinhas de origem animal ............................................................................................................ 7 Farinha de carne e ossos na alimentação de monogástricos ........................ 12 Farinha de vísceras de aves na alimentação de monogástricos.................... 14 Equações de predição em estudos de avaliação de ingredientes ................. 15 Avaliação de ingredientes por meio de metodologias de solubilidade in vitro 17 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 19 CAPÍTULO 2 – FARINHA DE CARNE E OSSOS NA ALIMENTAÇÃO DE CÃES ................................................................................................................... 24 RESUMO ....................................................................................................... 24 ABSTRACT .................................................................................................... 25 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 26 2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 27 2.1 Avaliação da composição química e das características qualitativas da farinha de carne e ossos produzida no Estado de São Paulo – Brasil ..... 27 2.2 Ensaio de digestibilidade .................................................................... 28 3. RESULTADOS ........................................................................................... 32 3.1 Composição química da farinha de carne e ossos ............................. 32 3.2 Características qualitativas da farinha de carne e ossos .................... 32 3.3 Digestibilidade e energia metabolizável da farinha de carne e ossos 33 ix 4. DISCUSSÃO .............................................................................................. 34 5. CONCLUSÕES .......................................................................................... 42 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 43 Tabela 1. Composição química (g/kg de produto) das farinhas de carne e ossos produzidas por sete fabricantes do Estado de São Paulo – Brasil ...... 47 Tabela 2. Características qualitativas das farinhas de carne e ossos produzidas no Estado de São Paulo – Brasil (valores sobre a matéria natural) ........................................................................................................... 49 Tabela 3. Concentrações (mg/100g de matéria natural) de putrescina (PUT), cadaverina (CAD), histamina (HIM), tiramina (TIM), serotonina (SRT), agmatina (AGM), espermidina (EPD), feniletilamina (FEM), espermina (EPM), triptamina (TRM) e aminas totais nas farinhas de carne e ossos produzidas no Estado de São Paulo – Brasil ....................................... 50 Figura 1. Relação entre teores de colágeno expresso com base na proteína bruta (g/kg) e de matéria mineral (g/kg de matéria seca) entre oito farinhas de carne e ossos produzidas no Estado de São Paulo – Brasil ....... 51 Figura 2. Regressão entre valores de solubilidade da proteína da farinha de carne e ossos em pepsina a 0,0002% e coeficientes de digestibilidade aparente da proteína bruta determinados em ensaio de digestibilidade com cães ............................................................................................................... 51 Tabela 4. Ingestão de nutrientes e de energia bruta (g/dia e MJ/dia, respectivamente, com base na matéria natural), coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes, energia digestível e energia metabolizável (ED e EM, MJ/kg, com base na matéria natural) das farinhas de carne e ossos avaliadas no ensaio de digestibilidade ............................... 52 Tabela 5. Coeficientes de digestibilidade aparente da proteína bruta e energia bruta das farinhas de carne e ossos determinadas em ensaio de digestibilidade e solubilidade da proteína bruta das referidas matérias- primas determinadas por meio de método in vitro de solubilidade em pepsina em três concentrações e respectivos coeficientes de correlação de Pearson (r) com os valores obtidos in vivo .................................................... 53 x CAPÍTULO 3 – FARINHA DE VÍSCERAS DE AVES NA ALIMENTAÇÃO DE CÃES ................................................................................................................... 54 RESUMO ....................................................................................................... 54 ABSTRACT .................................................................................................... 55 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 56 2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 57 2.1 Avaliação da composição química e das características qualitativas da farinha de vísceras de aves produzida no Estado de São Paulo – Brasil......................................................................................................... 57 2.2 Ensaio de digestibilidade .................................................................... 58 3. RESULTADOS ........................................................................................... 62 3.1 Composição química da farinha de vísceras de aves ......................... 62 3.2 Características qualitativas da farinha de vísceras de aves ............... 62 3.3 Digestibilidade e energia metabolizável da farinha de vísceras de aves .......................................................................................................... 63 4. DISCUSSÃO .............................................................................................. 64 5. CONCLUSÕES .......................................................................................... 69 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 70 Tabela 1. Composição química (g/kg de produto) das farinhas de vísceras de aves produzidas por oito fabricantes do Estado de São Paulo – Brasil .... 73 Tabela 2. Características qualitativas das farinhas de vísceras de aves produzidas no Estado de São Paulo – Brasil (valores sobre a matéria natural) ........................................................................................................... 75 Tabela 3. Concentrações (mg/100g de matéria natural) de putrescina (PUT), cadaverina (CAD), histamina (HIM), tiramina (TIM), serotonina (SRT), agmatina (AGM), espermidina (EPD), feniletilamina (FEM), espermina (EPM), triptamina (TRM) e aminas totais nas farinhas de vísceras de aves produzidas no Estado de São Paulo – Brasil ..................... 76 Tabela 4. Ingestão de nutrientes e de energia bruta (g/dia e MJ/dia, respectivamente, com base na matéria natural), coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes, energia digestível e energia xi metabolizável (ED e EM, MJ/kg, com base na matéria natural) das farinhas de vísceras de aves avaliadas no ensaio de digestibilidade .......................... 77 Figura 1. Regressão entre valores de solubilidade da proteína da farinha de vísceras de aves em pepsina a 0,02% e coeficientes de digestibilidade aparente da proteína bruta determinados em ensaio de digestibilidade com cães ............................................................................................................... 78 Tabela 5. Coeficientes de digestibilidade aparente da proteína bruta e energia bruta das farinhas de vísceras de aves determinadas em ensaio de digestibilidade e solubilidade da proteína bruta das referidas matérias- primas determinadas por meio de método in vitro de solubilidade em pepsina em três concentrações e respectivos coeficientes de correlação de Pearson (r) com os valores obtidos in vivo .................................................... 79 CAPÍTULO 4 – EQUAÇÕES DE PREDIÇÃO DA ENERGIA METABOLIZÁVEL DA FARINHA DE CARNE E OSSOS E DA FARINHA DE VÍSCERAS DE AVES PARA CÃES.............................................................................................. 80 RESUMO ....................................................................................................... 80 ABSTRACT .................................................................................................... 81 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 82 2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 83 2.1 Conjunto de dados para estimativa das equações de predição da energia metabolizável da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves ................................................................................ 83 2.2 Estimativa das equações de predição ................................................ 84 2.3 Análises estatísticas ........................................................................... 84 2.4 Estimativa da energia metabolizável da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves com base na adaptação do sistema de equações do NRC (2006).............................................................. 85 3. RESULTADOS ......................................................................................... 86 3.1 Equações de predição da energia metabolizável da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves com base em seus xii constituintes químicos e no coeficiente de solubilidade da proteína em pepsina......................................................................................... 86 3.2 Sistema de equações adaptado do NRC (2006) para estimativa da energia metabolizável da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves ................................................................................ 87 3.3 Estimativa da energia metabolizável da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves por meio de equações de predição e pelo sistema de equações adaptado do NRC (2006)......................... 88 4. DISCUSSÃO ............................................................................................ 89 5. CONCLUSÕES ........................................................................................ 93 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 93 Tabela 1. Composição química analisada (g/kg e energia bruta em MJ/kg de alimento), coeficientes de digestibilidade aparente da proteína e da energia, solubilidade da proteína em pepsina e valores de energia metabolizável (MJ/kg de alimento) da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves para cães ...................................................................... 95 Tabela 2. Equações de regressão linear múltipla para predizer a energia metabolizável (MJ/kg de alimento) da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves em função dos constituintes químicos dos alimentos (g/kg de alimento) e do coeficiente de solubilidade da proteína em pepsina . 96 Tabela 3. Energia metabolizável aparente (EM, MJ/kg de alimento) da farinha de carne e ossos (FCO) para cães determinada em ensaio de digestibilidade e estimada por meio de equações de predição em função dos constituintes químicos do alimento (g/kg de alimento) e da solubilidade da proteína em pepsina a 0,0002% e por meio do sistema de equações adaptado do NRC (2006) ............................................................................... 97 Tabela 4. Energia metabolizável aparente (EM, MJ/kg de alimento) da farinha de vísceras de aves (FVA) para cães determinada em ensaio de digestibilidade e estimada por meio de equações de predição em função dos constituintes químicos do alimento (g/kg de alimento) e da solubilidade da proteína em pepsina a 0,02% e por meio do sistema de equações adaptado do NRC (2006) ............................................................................... 98 xiii Tabela 5. Energia metabolizável aparente (EM, MJ/kg de alimento) da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves para cães determinada em ensaio de digestibilidade e estimada por meio de equações de predição em função dos constituintes químicos do alimento (g/kg de alimento) e da solubilidade da proteína em pepsina a 0,02% e por meio do sistema de equações adaptado do NRC (2006)............................... 99 Figura 1. Energia metabolizável da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves observada em ensaio de digestibilidade e estimada por equações de predição .................................................................................... 100 xiv 1 VALOR NUTRICIONAL E PARÂMETROS DE QUALIDADE DE SUBPRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PARA CÃES RESUMO – Os objetivos da presente tese foram avaliar o panorama qualitativo e determinar, por meio de métodos in vivo e in vitro, o valor nutricional da farinha de carne e ossos (FCO) e da farinha de vísceras de aves (FVA) para cães, além de estabelecer equações para predição da energia metabolizável (EM) destes alimentos com base em seus respectivos constituintes químicos e na solubilidade em pepsina. Objetivou-se ademais padronizar para cães a metodologia de solubilidade em pepsina da FCO e da FVA. Procedeu-se à ampla amostragem das FCO e FVA comercializadas no Estado de São Paulo - Brasil, sendo avaliadas 15 FCO e 15 FVA em relação às suas características qualitativas e, destas, oito farinhas de cada tipo foram avaliadas também em ensaio de digestibilidade com cães. Foram realizados dois ensaios de digestibilidade pelo método de coleta total de fezes e urina e a digestibilidade dos nutrientes e EM dos alimentos determinados pelo método de substituição. Em cada ensaio foram utilizados 18 cães adultos da raça beagle, distribuídos em delineamento em blocos casualizados, com três blocos (período), nove dietas e duas repetições por dieta. Formulou-se uma dieta basal e dietas teste foram obtidas pela mistura de 700 g/kg da dieta basal e 300 g/kg de cada uma das farinhas avaliadas. Foi determinada a solubilidade da proteína dos ingredientes em pepsina nas concentrações de 0,02%, 0,002% e 0,0002%. Tanto a FCO como a FVA apresentaram características qualitativas adequadas, com exceção de contaminação por Salmonella spp. por algumas amostras. A FCO apresentou reduzidos valores de digestibilidade e de EM, ao contrário da FVA, para a qual verificaram-se bons resultados. A solubilidade da proteína da FCO e da FVA em pepsina a 0,0002% e a 0,02%, respectivamente, são métodos qualitativos válidos. A EM em MJ/kg de FCO e de FVA pode ser estimada pelas equações: EM1= -3,048 + (0,016 * g PB) + (-0,021 * g colágeno/kg PB) + (0,027 * g EEA) + (9,309 * Solubilidade em pepsina 0,02%), R2= 0,898, QMres.= 1,149; EM2= -8,410 + (0,032 * g PB) + (0,032 * g EEA), R2= 0,894, QMres.= 1,170; EM3= -4,713 + (0,027 * g PB) + (0,030 * g EEA) + (-0,009 * g Ca), R2= 0,895, QMres.= 1,166. Palavras-chave: animais de companhia, energia metabolizável, farinha de carne e ossos, farinha de vísceras de aves. 2 NUTRITIONAL VALUE AND QUALITY PARAMETERS OF ANIMAL BY- PRODUCTS FOR DOGS ABSTRACT – This study aimed to evaluate the quality and to determine by in vivo and in vitro methods the nutritional value of meat and bone meal (MBM) and poultry by-product meal (PM) for dogs, and to establish prediction equations for metabolizable energy (ME) of these foods based on their chemical composition and on the protein solubility in pepsin. Moreover this study aimed to standardize the protein solubility in pepsin methodology of MBM and PM for dogs. MBM and PM marketed in Sao Paulo State – Brazil were sampled and it were evaluated 15 MBM samples and 15 PM samples to assess their qualitative characteristics and eight of each type of meal were evaluated in the digestibility trial with dogs. It were carried out two digestibility trials by the total collection of feces and urine method and nutrient digestibility and energy values of foods it were determined by the substitution method. In each trial, 18 adult beagle dogs were distributed in a randomized block design with three blocks (period), nine diets and two replicates per diet. It was formulated a basal diet and test diets were obtained by blending 700 g/kg of the basal diet and 300 g/kg of each of the meals evaluated. It was determined the protein solubility in pepsin at 0.02%, 0.002% and 0.0002%. Both the MBM as PM presented appropriate qualitative characteristics, except for Salmonella spp. contamination by some samples. The MBM presented reduced digestibility and ME values for dogs, as opposed to PM, which presented good results. The protein solubility in pepsin at 0.0002% and 0.02% for MBM and PM respectively, are valuable qualitative methods. ME in MJ/kg of both MBM and PM could be estimated by the equations: ME1= -3.048 + (0.016 * g CP) + (-0.021 * g collagen/kg CP) + (0.027 * g fat) + (9.309 * Protein solubility in pepsin 0.02%), R2= 0.898, QMres = 1.149; ME2= -8.410 + (0.032 * g CP) + (0.032 * g fat), R2= 0.894, QMres.= 1.170; EM3= -4.713 + (0.027 * g CP) + (0.030 * g fat) + (-0.009 * g calcium), R2= 0.895, QMres.= 1.166. Keywords: companion animals, meat and bone meal, metabolizable energy, poultry by-product meal. 3 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais Introdução Após grande expansão inicial em volume produzido, com crescimento de mais de 8% em produção ao ano, o mercado “petfood” encontra-se hoje mais amadurecido e com maior competitividade entre as empresas. Nos últimos anos, em função da dificuldade de expansão em volume de vendas, as empresas têm sido obrigadas a direcionar seus esforços de crescimento em faturamento por meio da criação e diferenciação de novos produtos, que tenham maior valor agregado. A recente implantação de Boas Práticas de Fabricação e a especialização e competitividade do mercado têm proporcionado, também, resultados positivos sobre as características nutricionais das rações. Neste cenário, a demanda por matérias- primas de qualidade tem crescido e como alimentos industrializados para cães e gatos utilizam como base ingredientes de origem animal, o conhecimento da qualidade e do valor nutricional da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves é crucial para a indústria “petfood”. Além disso, nos últimos anos, têm-se tornado cada vez mais importante que o incremento da produção científica esteja vinculado ao desenvolvimento de tecnologias capazes de minimizar o impacto ambiental causado pelo desenvolvimento, muitas vezes desordenado. Os subprodutos oriundos da indústria de processamento animal são um exemplo deste descompasso entre desenvolvimento científico e econômico e geração de resíduos considerados potenciais agentes poluentes. Por muitos anos, compunham parte do elo da cadeia produtiva, reciclando-se dentro do processo fabril. Entretanto, com o veto à utilização de subprodutos de origem animal na alimentação de ruminantes, houve grande interesse na busca por alternativas que possibilitassem o uso racional destes ingredientes. Neste contexto, a indústria de alimentos para animais de companhia é uma grande consumidora de tais matérias-primas, o que minimiza os efeitos 4 negativos da utilização e/ou descarte inapropriados que estes materiais poderiam causar ao meio ambiente. De acordo com a Associação Nacional dos Fabricantes de Alimentos para Animais de Estimação (ANFALPET, 2012b), em 2011, a indústria brasileira produziu 1,98 milhões de toneladas de alimentos para cães e gatos, proporcionando faturamento de R$ 8,209 bilhões. Considerando que pelo menos 30% a 35% das rações para cães e gatos são constituídas por derivados de origem animal, estima- se consumo de, aproximadamente, 600.000 toneladas de farinhas animais pelo setor “petfood”, o que insere de forma importante este segmento na cadeia produtiva de proteína animal do país. Em contrapartida, é importante considerar, também, que cães e gatos são exigentes em relação à quantidade e qualidade das fontes proteicas utilizadas em suas dietas. Características nutricionais como teor de proteína, sua digestibilidade e composição ou perfil em aminoácidos essenciais biodisponíveis são determinantes na eficiência de utilização proteica do alimento (CASE et al., 2000). Assim, os principais aspectos que devem ser considerados na avaliação qualitativa de um ingrediente proteico incluem: sua digestibilidade e perfil de aminoácidos, que remetem ao seu valor biológico (POND et al., 1995); sua relação proteína/matéria mineral, a qual é estreita em ingredientes de origem animal e mais favorável em matérias-primas vegetais (COWELL et al., 2000) e sua palatabilidade. Para cães e gatos, de forma geral, ingredientes proteicos de origem animal possuem melhor balanço de aminoácidos essenciais quando comparados às matérias-primas de origem vegetal (NEIRINCK et al., 1991; CLAPPER et al., 2001). Contudo, a literatura revela que existe divergência quanto à qualidade e digestibilidade de farinhas de subprodutos de origem animal (PARSONS et al., 1997; JOHNSON et al., 1998; SHIRLEY e PARSONS, 2001; RAVINDRAN et al., 2002). Tal fato pode ocorrer em virtude de diferenças nas concentrações de proteína, minerais e gordura, além do processamento a que o ingrediente foi submetido (SKURRAY e HERBERT, 1974; JOHNSON e PARSONS, 1997; HENDRIKS et al., 2002). Assim, a maior dificuldade relacionada à utilização dos ingredientes de origem animal vem sendo a diversidade de produtos, que apresentam padrões nutricionais e de qualidade bastante distintos. Variações nas proporções empregadas de 5 diferentes tecidos animais e na qualidade destes, bem como no processamento adotado na indústria de farinhas, tornam bastante distintas a qualidade sanitária e o valor nutricional dos ingredientes. Grandes variações de qualidade podem ser verificadas entre diferentes produtores e mesmo entre partidas de uma mesma empresa. Por outro lado, o conhecimento da composição química e a precisão dos valores energéticos dos alimentos são de grande importância na formulação econômica de rações. Assim, quando se deseja predizer a qualidade nutricional dos alimentos, informações sobre a digestibilidade de seus nutrientes são imprescindíveis. Neste contexto, é importante ressaltar que as determinações in vivo requerem mais tempo, são mais dispendiosas e exigem maior empenho em relação aos procedimentos in vitro. Por outro lado, a validação dos métodos in vitro deve estar baseada no grau de relacionamento entre os resultados obtidos por meio de procedimentos in vitro e in vivo, quando considerados materiais idênticos (BOISEN e EGGUM, 1991). A indústria de alimentos para cães e gatos utiliza em sua rotina a metodologia in vitro de solubilidade da proteína em pepsina como critério para controle de qualidade e recebimento de lotes, porém, ainda existe controvérsia com relação à melhor concentração de pepsina. Assim, a padronização desta ferramenta seria importante para definir de forma precisa e prática a qualidade da proteína dos ingredientes empregados. Outro aspecto importante relacionado ao potencial de utilização de um ingrediente refere-se à determinação de sua energia metabolizável, que por sua vez envolve a realização de ensaios de metabolismo e análises laboratoriais, que são procedimentos que exigem instalações, equipamentos e materiais específicos, dificultando sua determinação, principalmente, em nível de indústria. Desta forma, a utilização de tabelas e/ou equações de predição são alternativas para se estimar o valor energético dos ingredientes. As equações de predição baseadas em parâmetros físicos e químicos dos alimentos podem aumentar a precisão no processo de formulação de rações, por meio da correção dos valores energéticos. Consequentemente, a utilização desta ferramenta é mais apropriada quando a 6 composição química do alimento apresenta grande variabilidade (ALBINO e SILVA, 1996), como no caso da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves. Diante do exposto, os objetivos da presente tese foram: 1. Fornecer informações acerca das características qualitativas da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves comercializadas no Estado de São Paulo – Brasil e determinar o valor nutricional destes ingredientes para cães; 2. Padronizar para cães o método in vitro de solubilidade da proteína da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves em pepsina; 3. Estabelecer equações de predição da energia metabolizável para cães da farinha de carne e ossos e da farinha de vísceras de aves a partir de seus constituintes químicos e da solubilidade da proteína dos alimentos em pepsina. Revisão de literatura Estatísticas do mercado “petfood” Existem, no Brasil, 34,3 milhões de cães e 18,3 milhões de gatos, o que permite ao país ocupar a segunda posição mundial em população de tais espécies e o posiciona como sexto maior em faturamento pela comercialização de produtos destinados ao mercado “pet” (ANFALPET, 2012a). Em 2011 foram produzidas 1,98 milhões de toneladas de alimentos industrializados para cães e gatos, o que correspondeu a faturamento de R$ 8,209 bilhões (ANFALPET, 2012b). A demanda por matérias-primas de qualidade capazes de abastecer a indústria “petfood” acompanha a ascensão do segmento. Neste contexto, a formulação de alimentos para cães e gatos utiliza como base ingredientes de origem animal, dentre estes, os mais empregados são a farinha de carne e ossos e a farinha de vísceras de aves. Considerando que em 2010 foram produzidas, aproximadamente, 24,5 milhões de toneladas de carne bovina, suína e de aves (MAPA, 2012) e assumindo que há perda de cerca de 35% no abate, na forma de resíduos não comestíveis, chega-se a, aproximadamente, 8,5 milhões de toneladas em produtos não comestíveis e/ou recicláveis, como farinhas e gordura animal. Todo este grande volume de co-produtos do processamento de aves, bovinos e suínos necessita de destinação adequada, evitando-se contaminação ambiental e agregando valor e 7 renda às integrações e frigoríficos, que hoje processam e destinam parte destes ingredientes ao mercado “petfood”. Assim, é cada vez mais importante que os subprodutos da indústria de farinhas animais sejam adequadamente trabalhados e apresentem a qualidade necessária para que possam destinar-se às rações animais, estimulando ações que conduzam à emissão zero, ou seja, que os resíduos de uma indústria se constituam em matéria-prima para a indústria seguinte da cadeia (BELLAVER, 2002). Características qualitativas do processamento e das farinhas de origem animal O processo básico para produção de farinhas animais inicia-se com a separação, em frigoríficos, ou com a coleta em casas de carne e açougues, de resíduos provenientes de abate animal que são impróprios para serem utilizados na alimentação humana, mas que sejam isentos de microorganismos patogênicos e de materiais estranhos à sua composição. A seguir, é feita retirada do excesso de água e os materiais coletados que tenham tamanho superior a cinco centímetros devem ser triturados e, então, processados em digestores para cocção com ou sem pressão, por tempo variável dependendo do método considerado. A gordura deve ser drenada, prensada ou centrifugada e o resíduo sólido moído na forma de farinha com especificações de granulometria variáveis (BELLAVER, 2010). Porém, existem vários pontos nos quais a qualidade das farinhas pode ser prejudicada: a) umidade; b) textura; c) contaminações no processo; d) contaminações com materiais estranhos ao processo; e) tempo decorrido entre abate e processamento, que deve ser o mais breve possível, ocorrendo preferencialmente, em intervalo de até 24 horas. Além disso, é importante identificar pontos críticos desde a coleta da matéria-prima, até a utilização das rações contendo as farinhas e que serão destinadas às diferentes espécies (BELLAVER, 2002). Ao avaliar de forma individual cada um dos aspectos acima mencionados, observa-se que a umidade pode ser indicativa da qualidade do processamento a que a matéria-prima foi submetida, uma vez que teores muito baixos podem sugerir superprocessamento, com queima do ingrediente e consequente perda de nutrientes. Tal efeito pode resultar de desgaste do digestor, excessivo tempo de 8 retenção no equipamento e/ou defeitos ou má regulagem de manômetros e termômetros. Por outro lado, se o teor de umidade for superior a 8% pode predispor a farinha à contaminação bacteriana e suas eventuais consequências (BELLAVER, 2002). No processo de obtenção das farinhas, é permitida inclusão de quantidades variáveis de ossos, os quais, por serem de difícil trituração, podem ser segregadas partículas maiores para posterior remoagem, visando manutenção de granulometria adequada. Portanto, uma farinha com boa textura não deve apresentar retenção em peneira Tyler 6 (3,36mm), máximo de 3% de retenção na Tyler 8 (2,38mm) e máximo de 10% de retenção na peneira Tyler 10 (1,68mm) (BELLAVER, 2002). Ainda de acordo com Bellaver (2002) são considerados contaminantes do processo de obtenção das farinhas de origem animal, a inclusão de sangue, penas, resíduos de incubatório, cascos, chifres, pêlos e conteúdo digestivo. A adição de tais frações deve ser minimizada em função da definição de cada produto, visando manter os padrões de qualidade e repetibilidade do ingrediente comercializado. Já os contaminantes estranhos ao processo, em geral, estão associados à falta de equipamentos adequados ou até mesmo às ações fraudulentas que visam elevar, a baixo custo, principalmente o teor de proteína do ingrediente. É importante destacar que é proibido utilizar animais mortos, qualquer que seja sua procedência, para produção de farinhas. Assim, fica evidente a importância do estabelecimento de uma rotina de verificação da qualidade, embasada em especificações de qualidade, tanto de matérias-primas como de dietas. As especificações dos ingredientes dependem de disponibilidade no mercado e da natureza da matéria-prima com seus padrões conhecidos. Por exemplo, na recepção de ingredientes existem três classes de avaliação que servem de referência para aceitar ou devolver o embarque, a saber: a) provas sensoriais, b) provas rápidas e c) provas de laboratório (BELLAVER, 2005). Observa-se, portanto, que determinadas características físicas, químicas e sensoriais podem ser avaliadas para auxiliar a verificar a qualidade de farinhas de origem animal, como por exemplo, sua coloração, odor, granulometria, contaminação por material estranho ao processo de obtenção do ingrediente, 9 empedramento, umidade, teor de peróxidos, acidez, presença de aminas, avaliação bacteriológica para Salmonella spp., bem como teores de matéria mineral, proteína e gordura. Neste contexto, é importante ressaltar que a fração de lipídeos dos ingredientes de origem animal apresenta elevada susceptibilidade aos processos deteriorativos, como autoxidação, a qual está associada à reação do oxigênio com ácidos graxos. A oxidação é um processo autocatalítico que, uma vez iniciada, se desenvolve em aceleração crescente. Fatores como temperatura, enzimas, luz e íons metálicos podem favorecer a formação de radicais livres que, em contato com oxigênio molecular, forma peróxido. Quando tal composto reage com outra molécula oxidável, induz a formação de hidroperóxido e outro radical livre. Os hidroperóxidos dão origem a dois radicais livres, capazes de atacar outras moléculas e formar mais radicais livres, originando assim uma progressão geométrica. As moléculas formadas, contendo o radical livre, ao se romperem formam produtos de peso molecular mais baixo (aldeídos, cetonas, álcoois e ésteres), os quais são voláteis e responsáveis pelos odores da rancificação (ADAMS, 1999). O índice de peróxido é a forma usual para detectar rancidez da fração de gordura dos alimentos. Baseia-se na quantificação do cátion de uma base, necessário para neutralizar compostos oxidados, sendo o resultado expresso em mili-equivalentes/kg e, tradicionalmente os valores situam-se entre 0 e 20 mEq/kg (BELLAVER e ZANOTTO, 2004). A ocorrência de possíveis processos oxidativos também pode ser detectada pela análise de TBA, sigla em inglês que remete ao ácido tiobarbitúrico. O teste de TBA baseia-se na reação do ácido tiobarbitúrico com produtos de decomposição dos hidroperóxidos, que são peróxidos cujo radical é o hidrogênio. Torna-se importante esclarecer que peróxidos são produtos intermediários instáveis, sobretudo a temperaturas elevadas ou em presença de metais de transição. No decurso de sua decomposição produzem-se compostos de natureza diversa, como aldeídos, cetonas, hidroxiácidos, hidrocarbonetos, polímeros, entre outros, os quais são genericamente designados produtos secundários. Dentre estes, um dos principais é o malonaldeído, um aldeído com três átomos de carbono (SILVA et al., 1999). 10 Outra forma de avaliar a qualidade de farinhas de origem animal é por meio da determinação de seu teor de acidez, que baseia-se na reação entre um álcali e o ácido graxo livre, ou seja, são os miligramas de uma base (KOH ou NaOH) requeridos para neutralizar os ácidos graxos livres presentes em um grama de amostra (BELLAVER e ZANOTTO, 2004). Outro indicativo da qualidade sanitária e nutricional de ingredientes de origem animal corresponde à concentração destes em aminas biogênicas, que são produtos da descarboxilação de aminoácidos originados, em geral, por decomposição bacteriana ou por processos putrefativos de proteínas de origem animal. Armazenamento inadequado de materiais crus ou de produtos processados que apresentam contaminação bacteriana são fontes usuais de aminas dietéticas (BARNES et al., 2001). Podem ser classificadas em função do número de grupamentos amina, da estrutura química, da via biossintética e ainda quanto ao grau de substituição do hidrogênio da amônia (ROSSATO, 2005). Existe ainda um subgrupo denominado de poliaminas, o qual é composto por putrescina, espermidina e espermina. Poliaminas são compostos de baixo peso molecular, de característica catiônica e que são sintetizados a partir de metionina e ornitina por meio de mecanismo altamente específico (SMITH et al., 2000). Embora a real importância das poliaminas sobre o metabolismo seja ainda incerta, acredita- se que estas sejam substâncias anabólicas que possuem propriedades hormonais e podem contribuir tanto para manutenção da homeostase celular como estarem relacionadas às atividades relevantes como proliferação e diferenciação celular e ao desenvolvimento de neoplasias (SEILER, 1996). Smith (1990) observou que frangos alimentados com dieta suplementada com 0,2% de putrescina apresentaram taxa de crescimento mais acelerado em relação ao grupo controle, ou seja, sem suplementação. Porém, constataram, também, que a partir de 0,8% de putrescina, esta se torna tóxica. Observa-se que o limiar entre os efeitos benéficos e aqueles indesejáveis decorrentes do consumo de aminas biogênicas e poliaminas é muito estreito. Portanto, a presença de tais compostos na dieta em quantidades adequadas é importante para a saúde do animal, mas, por outro lado, podem causar efeitos tóxicos quando em altas concentrações (GLORIA, 2006). 11 É importante, portanto, determinar o perfil e concentração de aminas biogênicas e poliaminas em alimentos, uma vez que estas substâncias podem causar desnaturação ou efeitos tóxicos quando consumidas em grande quantidade. Exemplificando, em humanos, pode provocar enxaqueca e crise hipertensiva. Além disso, a intoxicação alimentar causada por ingestão de histamina provoca efeitos cutâneos, gastrintestinais, hemodinâmicos e neurológicos. Em compostos não fermentáveis, a presença de aminas em alta concentração é considerado indicativo de atividade de bactérias indesejáveis. De forma geral, uma ferramenta bastante eficiente no controle do desenvolvimento de microrganismos indesejáveis em alimentos é por meio da manutenção de sua atividade de água a valores reduzidos. Atividade de água (aw) é um parâmetro que representa a “água disponível” de determinado material, sendo definida pela relação p/p0, onde p representa a pressão parcial atual do vapor de água e p0 a pressão máxima possível de água pura (pressão de saturação) à uma mesma temperatura. A aw é um valor adimensional, sendo que água pura possui aw de 1,0 e materiais totalmente livres de água possuem aw igual a 0. A aw pode também ser representada como ERH/100, onde ERH é a umidade relativa de equilíbrio no material, expresso como porcentagem (SCOTT, 1957). Interessante notar que cada microrganismo possui uma aw mínima necessária para seu crescimento. Por exemplo, para desenvolvimento bacteriano (Halobacterium, Halococcus) é necessária uma aw mínima de 0,75; para leveduras (Saccharomyces) de 0,62 e para fungos (Monascus), aw mínima de 0,61 (LEISTNER et al., 1981). Porém, existem muitos fatores que interagem com a aw do material, sendo os principais seu teor de umidade e sua composição, pois estes irão definir a propensão do material à deterioração, independente da aw (LOWE e KERSHAW, 1995). Além disso, um dos principais problemas relacionados aos alimentos de origem animal é a elevada susceptibilidade destes à contaminação por bactérias do gênero Salmonella spp. Os níveis de contaminação por Salmonella spp verificados em insumos de origem animal, permitem presumir que esteja havendo autoreciclagem dessa enterobactéria em empresas avícolas, já que a maioria destas transformam em farinha, vísceras e penas resultantes do abate de aves, para 12 posteriormente utilizá-las como componentes das rações. Portanto, na produção de farinhas de origem animal, é imprescindível que se atente ao controle de pontos críticos e eliminação das causas de variação para dar certificação de garantia do processo. Por outro lado, é igualmente importante a manutenção de condições que inviabilizem a recontaminação das farinhas em todo processo produtivo, ou seja, desde sua concepção até sua utilização em dietas destinadas às distintas espécies. Considerando que a recontaminação de farinhas por Salmonella spp. é muito frequente, deve-se monitorar todo processo produtivo ao longo do ano, o que evitaria perda de qualidade por recontaminação. Além disso, é importante ressaltar que as temperaturas de processamento para produção de farinhas eliminam grande parte, senão toda contaminação bacteriana dos subprodutos, porém, a recontaminação é algo que tem grande chance de acontecer devido aos erros no manuseio, transporte, armazenagem, entre outros (BELLAVER, 2001). Na tentativa de reduzir o risco de colonização bacteriana em farinhas de origem animal, tem sido prática comum em graxarias adição de substâncias a base de formaldeído, que impedem o crescimento bacteriano. Embora este seja um efeito desejável, existe também a hipótese de tais compostos reduzirem a digestibilidade dos aminoácidos e da energia das farinhas, apresentar resíduos na carne e na gordura de produtos destinados à alimentação humana, além de serem potenciais causadores de tumorações em animais de estimação. Todos estes possíveis efeitos indesejáveis fazem com que haja necessidade de maior embasamento científico sobre as reais implicações de tais substâncias no metabolismo dos animais (BELLAVER, 2001). Além disso, é importante destacar que as boas práticas de fabricação devem anteceder ao uso de aditivos. Farinha de carne e ossos na alimentação de monogástricos Para melhor entendimento do processo de produção de farinhas de origem animal, é importante definir determinados termos, apresentados no Guia Técnico Ambiental de Graxarias – Série P+L, da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental – CETESB (2006): 13 - Abatedouros (ou Matadouros): realizam abate de animais, produzindo carcaças (carne com ossos) e vísceras comestíveis. Algumas unidades também fazem desossa das carcaças e produzem os chamados “cortes de açougue”, porém, não industrializam a carne; - Frigoríficos: podem ser divididos em dois tipos – aqueles que abatem animais, separam sua carne e suas vísceras e as industrializam, gerando seus derivados e subprodutos, ou seja, fazem todo processo dos abatedouros/matadouros, além de industrializarem a carne; e aqueles que não abatem animais, porém compram a carne em carcaças ou cortes, bem como vísceras, de matadouros ou de outros frigoríficos para seu processamento e geração de derivados e subprodutos, ou seja, somente industrializam a carne; - Graxarias: processam subprodutos e/ou resíduos de abatedouros ou frigoríficos e de casas de comercialização de carnes (açougues), produzindo, principalmente, sebo ou gordura animal (para indústria de sabões/sabonetes, rações animais e para indústria química) e farinhas de origem animal (para rações animais). Há graxarias que também produzem sebo ou gordura e/ou o chamado adubo organo-mineral somente a partir de ossos. Podem ser anexas aos abatedouros e frigoríficos ou unidades de negócio independentes. Assim sendo, os materiais que compõem a farinha de carne e ossos têm origem na coleta de resíduos de abate em frigoríficos, abatedouros e açougues a partir de ossos e tecidos, após desossa completa da carcaça de bovinos. O processo inicia-se com a moagem, quando necessária em virtude do tamanho das peças, seguindo-se o cozimento em digestores, prensagem para extração de gordura e novamente moagem com especificações de granulometria pré- estabelecidas. Ao produto não se deve adicionar sangue, cascos, chifres, pêlos e conteúdo estomacal a não ser aqueles incluídos involuntariamente dentro dos princípios de boas práticas de fabricação. Além disso, não deve conter matérias estranhas ao processamento (BELLAVER, 2005). Supõe-se, assim, que a composição do material bruto terá significativo efeito na qualidade do produto obtido, sendo que alguns aspectos do processo podem, também, influir sobre o resultado final, como por exemplo, o sobreaquecimento pode prejudicar a palatabilidade e qualidade da farinha de carne e ossos (BELLAVER, 2005). 14 Garcia e Phillips (2009) ao caracterizarem farinhas de carne e ossos produzidas a partir de bovinos, suínos e de aves em combinação ou não, observaram que quando não há mistura entre espécies para obtenção da matéria- prima, a farinha de origem bovina apresentou maior proporção de ossos em relação à suína e de aves. Os autores consideraram que a relação alométrica entre massa corpórea e do esqueleto justifica, ao menos em parte, tal diferença, uma vez que a razão entre massa óssea e corpórea total é maior em grandes animais, como bovinos, do que em animais pequenos, como aves e suínos. Já quando a farinha de carne e ossos é obtida a partir da mistura de materiais de duas ou mais espécies, a tendência é de que se adicione menor proporção de ossos. Estudos em aves têm demonstrado que ao se avaliar a farinha de carne e ossos por meio da metodologia de substituição, na qual se utiliza uma dieta basal e uma dieta teste composta por proporções conhecidas e pré-determinadas da dieta basal e do alimento a ser estudado, existe influência do teor de inclusão do ingrediente sobre os resultados de energia metabolizável obtidos (DEGROOT e KETEKES, 1988; MARTOSISWOYO e JENSEN, 1988; DALE, 1989). Assim, Dale (1997) verificou relação inversa entre teor de inclusão da farinha de carne e ossos e valores de energia metabolizável resultantes. Segundo o autor, tal efeito pode ser consequência da influência negativa do elevado teor de minerais, sobretudo cálcio e fósforo, sobre o aproveitamento dos nutrientes da farinha de carne e ossos. Farinha de vísceras de aves na alimentação de monogástricos A farinha de vísceras de aves corresponde a uma fonte proteica comum para frangos de corte. Em tempos remotos, era possível considerar sua composição química razoavelmente constante, com níveis nutricionais semelhantes aqueles apresentados no NRC (1994). Porém, nos últimos anos, a indústria de alimentos para animais de companhia, tem-se mostrado disposta a pagar valores diferenciados para farinhas com determinados padrões de qualidade, favorecendo a segmentação do mercado e disponibilizando produtos de qualidade distinta (DOZIER et al., 2003). Segundo Bellaver (2005), a farinha de vísceras de aves é o produto resultante da cocção, prensagem e moagem de vísceras de aves, sendo permitida inclusão de cabeças e pés. Não deve conter, porém, penas, exceto aquelas que podem ocorrer não intencionalmente, e, tampouco, é permitida utilização de resíduos de 15 incubatórios e de outras matérias estranhas à sua composição, como cascas de ovos. A farinha de vísceras de aves é uma fonte proteica de valor considerável em dietas para cães, porém, informações sobre a composição química e a digestibilidade de seus nutrientes indicam que esta é um produto extremamente variável (HAN e PARSONS, 1990; JOHNSON et al., 1998, DOZIER et al., 2003). Com base em amostras de dez indústrias que produzem farinha de vísceras de aves destinada ao mercado “petfood” no sudeste dos Estados Unidos, Dozier et al. (2003) verificaram que o teor de proteína bruta variou de 63,0% a 69,3%, de extrato etéreo de 10,9% a 15,1% e de matéria mineral de 10,7% a 18,5%. Cramer et al. (2007) ao avaliarem diferentes fontes proteicas de origem animal, verificaram que a farinha de vísceras de aves com baixo teor de matéria mineral possuía, 954 g/kg de matéria seca e 719 g/kg de proteína bruta, 149 g/kg de extrato etéreo e 111 g/kg de matéria mineral, valores expressos com base na matéria seca. Já a farinha de vísceras convencional apresentou 951 g/kg de matéria seca, 726 g/kg de proteína, 129 g/kg de gordura e 125 g/kg de matéria mineral. Verificaram também, correlação negativa entre teor de matéria mineral e taxa de eficiência proteica e digestibilidade de aminoácidos essenciais e não essenciais. Entretanto, os autores sugeriram que o efeito negativo sobre a digestibilidade dos aminoácidos resultou, ao menos em parte, do processamento a que estas farinhas foram submetidas e não da sua composição em matéria mineral. Equações de predição em estudos de avaliação de ingredientes Vários métodos diretos (ensaios biológicos) e indiretos (equações de predição) têm sido aplicados no intuito de se determinar a energia metabolizável dos alimentos para monogástricos (NUNES et al., 2001; RODRIGUES et al., 2001; SÁ- FORTES, 2005; CAVALARI et al., 2006). A equação de predição que utiliza como base as características químicas e físicas dos alimentos corresponde a um método indireto para se estimar a energia metabolizável destes. Representa uma importante ferramenta para formular rações, já que o ensaio biológico depende de metodologias de difícil execução pela indústria, além do maior tempo necessário para obterem-se os resultados (SAKOMURA e ROSTAGNO, 2007). 16 De acordo com SAKOMURA e ROSTAGNO (2007) para a indústria de rações, o uso de equações é de extrema importância, não somente por estimar o valor energético dos alimentos, mas também por possibilitar a realização de ajustes necessários de acordo com a variação na composição dos ingredientes, principalmente com relação ao teor de proteína, gordura e fibra. Assim, as equações de predição da energia permitem maximizar a utilização dos dados de composição obtidos mediante análises laboratoriais de rotina. A construção de equações de predição da energia metabolizável de ingredientes comumente utilizados pela indústria é uma ferramenta bastante utilizada na formulação de alimentos para animais de produção, em especial aves e suínos. No caso das indústrias de alimentos para animais de companhia, a escassez de informações relacionadas ao aproveitamento de nutrientes e da energia de ingredientes e não de dietas, dificulta e, de certa forma, limita o estabelecimento de equações de predição. Considerando a grande variabilidade na composição nutricional e no teor de energia metabolizável dos subprodutos de origem animal, a elaboração de equações de predição que possibilitem estimar a digestibilidade e aproveitamento da energia de tais matérias-primas, proporcionaria informações que seriam de grande valia para a indústria pet. Permitiria ao nutricionista, por exemplo, utilizar tais ingredientes de forma mais criteriosa, segura e possibilitaria um controle de qualidade mais eficiente, estimulando a produção de matérias-primas de melhor qualidade, com maior potencial à exportação. Diversos estudos foram realizados com aves e suínos com intuito de determinar equações para predição da energia metabolizável de subprodutos. Rodrigues et al. (2001), em estudo com pintos em crescimento e galos adultos, verificaram forte correlação negativa entre a estimativa, por meio de equações, da energia metabolizável do milheto, milho e seus subprodutos e suas respectivas concentrações em matéria mineral. Nunes (1999) concluiu que as equações que consideravam a composição em proteína bruta e fibra em detergente neutro foram melhores na estimativa da energia metabolizável do grão de trigo e seus subprodutos para aves. No entanto, o referido autor também observou que matéria mineral e extrato etéreo foram bons preditores do conteúdo energético dos alimentos. 17 Dolz e de-Blas (1992) obtiveram boas estimativas da energia metabolizável aparente e verdadeira corrigidas pelo balanço de nitrogênio da farinha de carne e ossos para aves, quando utilizaram teores de extrato etéreo e de proteína bruta no modelo. Já Azevedo (1996) verificou melhor predição da energia ao considerar proteína bruta e proteína digestível em pepsina a 0,02%. No entanto, observou que os parâmetros que compunham o modelo variavam em função da origem e da composição do alimento, ou grupo de alimentos, para o qual as equações foram estimadas. É importante considerar que equações com grande número de variáveis, apesar de mais precisas nas estimativas, podem se tornar inviabilizadas, já que a determinação de certos componentes, como diâmetro geométrico médio e densidade dos alimentos, em condições práticas, muitas vezes não é possível. Assim, o uso de equações com menor número de variáveis, sendo estas baseadas em análises que fazem parte da rotina de laboratórios, facilita e estimula sua adoção (NUNES, 1999). O uso de equações de predição da digestibilidade dos nutrientes com base na composição química dos alimentos, além de tornar prática a avaliação das matérias- primas utilizadas na indústria de alimentação animal, possibilita emprego de resultados de digestibilidade obtidos em ensaios in vitro. Já equações de predição da energia metabolizável que atribuem fatores para estimar o conteúdo energético dos nutrientes, em geral, refletem o calor gerado pela combustão da matéria orgânica, a digestibilidade de seus constituintes nutritivos e a correção da estimativa de perdas de energia pela urina como resultado do metabolismo das proteínas. Portanto, uma equação será capaz de predizer de forma precisa o teor de energia metabolizável de um alimento quando a digestibilidade deste for semelhante àquela apresentada pelas dietas/ingredientes que deram origem à equação (NRC, 2006). Avaliação de ingredientes por meio de metodologias de solubilidade in vitro Para Boisen e Eggum (1991) métodos in vitro que empregam incubações devem estar acompanhados de sistemas enzimáticos que tenham características semelhantes àquelas do trato gastrintestinal. De maneira geral, tais métodos aferem 18 a taxa inicial de hidrólise e determinam valores de digestibilidade dos alimentos que predizem aquela verificada em ensaios in vivo. Entretanto, uma das maiores críticas ao método enzimático relaciona-se ao fato de este corresponder a uma técnica laboratorial que pretende simular um complexo mecanismo de digestão que acontece dentro do trato digestório dos animais, sendo que existem muitos aspectos que são limitantes para obtenção de tal objetivo. Uma das consequências de tais limitações é que, de modo geral, grande parte dos resultados obtidos por meio de métodos de solubilidade in vitro são contraditórios (SWAISGOOD e CATIGNANI, 1991). Dentre os métodos enzimáticos, o da solubilidade da proteína em pepsina é o mais utilizado quando se deseja avaliar a qualidade da proteína dos alimentos de origem animal, sendo o único reconhecido pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1984). Além disso, é amplamente aceito pela indústria de alimentos por ser relativamente simples, de baixo custo, rápido e por possibilitar comparações entre grande número de amostras ao mesmo tempo (RAVINDRAN e BRYDEN, 1999). A concentração de pepsina parece ser o fator crítico na adoção deste método. Parsons et al. (1997) verificaram que o teor de 0,002% de enzima foi mais eficiente em predizer a qualidade da proteína da farinha de carne e ossos em relação à 0,2% de pepsina recomendada pela AOAC (1984). Os autores concluíram que 0,2% de pepsina foi uma concentração excessiva, o que dificultou a detecção de diferenças de qualidade entre as amostras de ingredientes. Johnston e Coon (1979) verificaram, de modo semelhante, que ensaios que utilizaram 0,2% de pepsina não foram eficientes em distinguir entre uma farinha de peixes de boa qualidade e uma que sofreu super-processamento por ação do calor. Todavia, as concentrações de 0,02% e 0,002% de pepsina indicaram melhor as diferenças qualitativas entre subprodutos. Na prática, cada laboratório de controle de qualidade, após grande número de análises, estabelece valores-referência que são usados para classificar os alimentos como de boa ou baixa qualidade. Porém, é possível constatar que ainda não está suficientemente esclarecido o valor nutricional que deve ser atribuído a um alimento classificado como de baixa qualidade. Assim, maior volume de pesquisas nesta área 19 contribuiria sobremaneira para integrar os resultados laboratoriais com o valor nutritivo atribuído aos ingredientes que serão usados nas rações dos animais monogástricos (SAKOMURA e ROSTAGNO, 2007). Referências ADAMS, C.A. 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Formulou-se uma dieta basal e oito dietas teste foram obtidas pela mistura de 700 g/kg da dieta basal e 300 g/kg de cada uma das oito FCO. Dezoito cães adultos da raça beagle foram distribuídos em delineamento em blocos casualizados, com três blocos (períodos), nove dietas e duas repetições por dieta. A solubilidade da proteína das FCO foi determinada nas concentrações de 0,02%, 0,002%, e 0,0002% de pepsina. Correlações de Pearson e regressões lineares simples foram determinadas entre os resultados in vivo e solubilidade da proteína em pepsina. Os teores médios e desvios em g/kg de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), proteína bruta (PB), colágeno na PB, extrato etéreo hidrólise ácida (EEA) e energia bruta (EB) em MJ/kg da FCO foram, respectivamente: 934±14,1; 547±36,5; 437±27,5; 297±33,2; 125±20,7 e 13,86±1,47. As FCO apresentaram, em média, 0,44±0,22 mg NaOH/g de acidez, ausência de peróxido, 0,497±0,048 de atividade de água, presença de Salmonella spp. em 13% das amostras, 3,27±1,99 mg tmp/kg de TBA e 10,89±4,49 mg/100 g de aminas totais. Os coeficientes médios de digestibilidade da MS, MO, PB, EEA e EB da FCO foram, respectivamente: 0,453±0,0535; 0,723±0,0428; 0,760±0,0235; 0,842±0,0505 e 0,777±0,0187. A energia digestível e metabolizável média da FCO foi de, respectivamente, 11,27±1,317 e 10,17±1,316 MJ/kg. A solubilidade em pepsina a 0,0002% apresentou correlação com a digestibilidade da PB e da EB determinadas in vivo. A FCO apresenta reduzidos valores de digestibilidade dos nutrientes e baixa densidade energética para cães. A solubilidade em pepsina a 0,0002% é um método qualitativo válido para avaliar o aproveitamento da proteína entre distintas FCO. Palavras chave: cão, digestibilidade, método in vitro, subprodutos de origem animal. 25 Meat and bone meal in the feed of dogs ABSTRACT – Meat and bone meal (MBM) is an important protein source in dog diets, however, presents qualitative and nutritional characteristics quite variable. This study aimed to evaluate the qualitative characteristics and to determine the average chemical composition and nutritional value of MBM produced in São Paulo State - Brazil on feeding dogs by in vivo and in vitro tests. It was determined the chemical composition of 31 samples and 15 MBM were evaluated by their qualitative characteristics. The nutritional value for dogs of eight from these samples was determined in digestibility trial by substitution method. It was formulated a basal diet and eight test diets were obtained by mixing 700 g/kg of the basal diet and 300 g/kg of each of the eight MBM. Eighteen adult beagle dogs were distributed in a randomized block design with three blocks (periods), nine diets and two replications per diet. The MBM protein solubility was determined at 0.02%, 0.002% and 0.0002% pepsin concentrations. Pearson correlations and linear regressions were fitted from the in vivo and protein solubility in pepsin results. The average and standard deviations levels in g/kg of dry matter (DM), organic matter (OM), crude protein (CP), collagen in CP and fat and gross energy (GE) in MJ/kg of MBM were, respectively: 934±14.1; 547±36.5; 437±27.5; 297±33.2; 125±20.7 e 13.86±1.47. The MBM presented, on average, 0.44 mg NaOH/g of acidity, absence of peroxide, 0.497 water activity, presence of Salmonella spp. in 13% of samples, 3.27 mg tmp/kg of TBA and 10.89 mg/100g of total amines. The average of total tract apparent digestibility of DM, OM, CP, fat and GE of MBM were: 0.453±0.0535; 0.723±0.0428; 0.760±0.0235; 0.842±0.0505 and 0.777±0.0187. The average of digestible and metabolizable energy of MBM were, respectively, 11.27±1.317 and 10.17±1.316 MJ/kg. The protein solubility at 0.0002% pepsin was correlated with CP and GE digestibility determined in vivo. The MBM presents reduced digestibility and low energy density for dogs. The protein solubility at 0.0002% pepsin is a valuable qualitative method to evaluate the protein digestibility between different MBM. Keywords: animal by-products, digestibility, dog, in vitro method. 26 1. Introdução Farinha de carne e ossos é o produto resultante do processamento de tecidos de mamíferos e contêm, genericamente, ossos, vísceras, músculos e gordura (KIRSTEIN, 1999; NARODOLAWSKY, 2003). Devido à natureza heterogênea das fontes de farinha de carne e ossos e das inúmeras causas de variação em seu processamento, o valor nutricional do ingrediente pode variar bastante (ADEDOKUN e ADEOLA, 2005). Portanto, aspectos como tempo decorrido entre coleta e processamento do material, ocorrência de contaminação química, física ou microbiológica, origem da matéria- prima, ou seja, a partir de qual ou quais espécies o ingrediente foi obtido e quais partes da carcaça e/ou órgãos foram incluídos no digestor, entre outras fontes de variação, irão impactar de forma decisiva a qualidade sanitária, composição química e valor nutricional do ingrediente. O grande número de causas de variação dificulta a utilização racional e eficaz da farinha de carne e ossos em alimentos industrializados para cães. O conhecimento da qualidade sanitária, composição química e valor nutricional médio do ingrediente possibilitaria sua inclusão em dietas de forma a ponderar a adição de proteína, gordura e minerais e, consequentemente, de energia proveniente de tal combinação, sem deixar de considerar a segurança alimentar do ingrediente. Diversos estudos determinaram o valor nutricional da farinha de carne e ossos para aves (MARTOSISWOYO e JENSEN, 1988; DOLZ e de BLAS, 1992) e suínos (ADEDOKUN e ADEOLA, 2005; OLUKOSI e ADEOLA, 2009), porém, não foi localizado na literatura estudos com cães. É importante considerar, entretanto, que a infraestrutura e necessidade de material biológico para construção e manutenção de laboratório que permita avaliações in vivo em animais de companhia é bem mais onerosa do que a necessária para estudos em animais de produção. Uma alternativa prática e viável, tanto do ponto de vista econômico como de tempo requerido para obtenção de resultados, são as avaliações in vitro. No caso de subprodutos de origem animal, a solubilidade da proteína em pepsina é uma ferramenta usual na indústria petfood, sendo utilizada como critério para controle de qualidade e recebimento de lotes. Porém, a concentração de pepsina que melhor representa os achados in vivo em cães ainda não está bem definida. Assim, a 27 padronização desta ferramenta seria importante para determinar de forma precisa, prática e acurada o aproveitamento da proteína da farinha de carne e ossos por cães. Apesar da escassez de estudos e das inúmeras causas de variação qualitativa e nutricional da farinha de carne e ossos, esta corresponde a um dos principais ingredientes utilizados na formulação de alimentos industrializados para cães, principalmente, quando se busca redução no custo de produção. Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi caracterizar a farinha de carne e ossos produzida no Estado de São Paulo – Brasil, por meio da avaliação de suas características qualitativas e de composição química e determinar os coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes e sua energia digestível e metabolizável para cães. Além disso, padronizar a metodologia de solubilidade da proteína em pepsina da farinha de carne e ossos para avaliar a qualidade deste ingrediente para cães. 2. Material e métodos 2.1 Avaliação da composição química e das características qualitativas da farinha de carne e ossos produzida no Estado de São Paulo – Brasil Foram obtidas 31 amostras de farinhas de carne e ossos (FCO) fabricadas por sete empresas processadoras de subprodutos de origem animal e que atendem à indústria petfood, localizadas no Estado de São Paulo – Brasil (Tabela 1). Nestas foram determinadas a composição em matéria seca (MS) por secagem da amostra em estufa (método 934.01), cinzas (MM) por incineração em forno mufla (método 942.05), nitrogênio de acordo com método de Kjeldahl (método 954.01), sendo a proteína bruta (PB) calculada como N x 6,25. O extrato etéreo (EE) foi mensurado após extração com éter de petróleo pelo método de Soxhlet (método 920.39). Tais procedimentos analíticos foram realizados de acordo com as recomendações da Association of Official Analytical Chemists (1995). Estimou-se o conteúdo de matéria orgânica (MO) por diferença entre o teor de MS e de MM. Com base na composição química e procedência (fabricante/fornecedor) das amostras coletadas, foram selecionadas 15 farinhas (A1, A4, A5, B2, C1, C2, D3, D5, D6, E2, E4, F1, G2, G6 e G7) com as quais objetivou-se estabelecer um 28 panorama qualitativo das FCO comercializadas no Estado de São Paulo – Brasil. Neste contexto, foram eleitas amostras de distintos fabricantes/fornecedores e que fossem representativas da indústria de FCO do Estado de São Paulo – Brasil. As FCO selecionadas foram avaliadas quanto a ocorrência de processo oxidativo, com base na determinação do índice de peróxido, acidez e na quantificação de malonaldeído por meio do ácido tiobarbitúrico (TBA), segundo método descrito por Pikul et al. (1989), o qual quantifica o malonaldeído utilizando ácido tricloroacético e reagente de TBA, seguido de aquecimento para desenvolvimento máximo de cor e mensuração espectrofotométrica a 538 nm. A qualidade microbiológica das FCO foi avaliada por meio da determinação da atividade de água, presença/ausência de Salmonella spp. em 25g de amostra pelo método ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) de acordo com recomendações da AOAC (método 996.08, 2005). Para tanto, utilizou-se o sistema automatizado VIDAS® que corresponde a um teste imunoenzimático que permite a detecção de antígenos de Salmonella spp. Além disso, foi feita dosagem das aminas putrescina, cadaverina, histamina, tiramina, serotonina, agmatina, espermidina, feniletilamina, espermina e triptamina. Para tanto, as amostras foram homogeneizadas em ácido tricloroacético a 5%, agitadas e centrifugadas (Modelo RC 5C plus, Sorvall Products, Newtown, CT, EUA) para obtenção do sobrenadante, o qual foi lido por cromatografia líquida de alta performance (HPLC, Shimadzu modelo LC-10AD, Kyoto, Japão) por par iônico, derivação pós-coluna com o-ftalaldeido e detecção fluorimétrica, seguindo a metodologia descrita por Vale e Gloria (1997). As FCO foram avaliadas também em relação aos teores de cálcio, fósforo e ferro por meio da digestão úmida das amostras, utilizando-se solução nitroperclórica. O fósforo foi mensurado por espectrofotometria visível (Labquest Bio 2000. Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, Brasil) e o cálcio e o ferro por espectrofotometria de absorção atômica (GBC-932 AA, Scientific Equipment PTY LTD, Melbourne- Austrália) de acordo com metodologias descritas na AOAC (1995). 2.2 Ensaio de digestibilidade 2.2.1 Animais e protocolo experimental 29 Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, Brasil). Foram utilizados dezoito cães da raça Beagle adultos saudáveis, com 3,6±0,3 anos de idade e 12,04�0,20 kg de peso corporal. Dentre as 15 FCO anteriormente mencionadas foram selecionadas oito (A4, A5, B2, C1, C2, D6, F1 e G2) para as quais foram determinados os coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes (CDA) e valores de energia digestível (ED) e metabolizável (EM). Para que fosse possível determinar o valor nutricional médio da FCO comercializada no Estado de São Paulo – Brasil, adotou-se como critério de seleção a composição química das amostras, sendo eleitas aquelas que apresentassem distintos teores de nutrientes. Os cães foram mantidos em gaiolas de metabolismo individuais (100 x 100 x 100 cm) equipadas com sistema para separar fezes de urina. O período experimental foi de 10 dias, sendo cinco de adaptação e cinco de coleta total de fezes e urina, conforme recomendações da AAFCO (2009). Os cães foram alimentados duas vezes ao dia (0800 e 1600) e a água foi disponibilizada ad libitum. Estimou-se a EM das dietas com base na composição química destas e a quantidade fornecida foi calculada como 397 kJ EM por kg0,75 (National Research Council, 2006). Decorridos 30 min do fornecimento de alimento, os comedouros foram retirados e o alimento não consumido foi pesado e registrado. No primeiro dia de coleta as gaiolas de metabolismo foram higienizadas, sendo removidas e descartadas fezes e urina. A partir deste ponto e pelos cinco dias seguintes, todas as fezes e urina produzidas por cada cão foram coletadas. As amostras de fezes foram pesadas e congeladas (-15° C) e a urina foi coletada em recipientes contendo 1 mL de solução de ácido sulfúrico (1 Eq/L) e após mensuração do volume foi congelada. 2.2.2 Dietas Os CDA, ED e EM das FCO foram determinados pelo método de substituição, conforme descrito por Sakomura e Rostagno (2007). Para tanto, foi formulada uma dieta basal com 382,3 g/kg de milho, 180,0 g/kg de quirera de arroz, 172,3 g/kg de farelo de soja, 92,1 g/kg de glúten de milho 60%, 71,5 g/kg de gordura de aves, 50,0 30 g/kg de farinha de vísceras de aves e 51,80 g/kg de microingredientes, basicamente fontes de vitaminas, minerais e aminoácidos. A composição química da dieta basal atendeu as recomendações da AAFCO (2009) para cães adultos, apresentando 851,2 g/kg de MO, 122,8 g/kg de extrato etéreo hidrólise ácida, 237,8 g/kg de PB e 18,46 MJ/kg de energia bruta. A partir da dieta basal foram obtidas oito dietas teste, as quais corresponderam a proporção de 700 g/kg da dieta basal e 300 g/kg, com base na matéria natural, de cada uma das oito FCO selecionadas. As dietas experimentais foram misturadas e moídas em moinho de martelos (Modelo 4, D’Andrea, Limeira, Brasil) com peneira de 0,8 mm antes de serem processadas em extrusora de rosca simples (Mab 400S, Extrucenter, Monte Alto, Brasil). Aferiu-se a densidade do extrusado, a qual foi mantida entre 420 e 455 g/L (densidade úmida). O pré-condicionador foi mantido a 95° C e a temperatura de extrusão variou de 107-119° C. 2.2.3 Desenho experimental O estudo foi delineado em blocos casualizados, com duas repetições dentro de bloco, sendo que cada bloco correspondeu ao período experimental em um total de três períodos. Foram avaliadas nove dietas experimentais (dieta basal e oito dietas teste), totalizando 18 cães por bloco. Ao final do estudo, obtiveram-se um total de seis observações para cada dieta. A distribuição dos animais foi feita de forma a evitar que o mesmo cão consumisse a mesma dieta em blocos distintos. 2.2.4 Análises laboratoriais Ao final de cada período de coleta, o total de fezes de cada cão foi homogeneizado de forma a compor uma única amostra por animal, sendo esta seca em estufa de ventilação forçada a 55° C por 72 h. As amostras de fezes, das dietas e das FCO foram moídas em moinho de faca (Mod MA-350, Marconi, Piracicaba, Brasil) com peneira de 1 mm. A urina foi seca no mesmo equipamento e nas mesmas condições descritas para secagem das fezes. Dietas e fezes foram analisadas quanto a MS, MM e PB seguindo as respectivas metodologias anteriormente mencionadas para avaliação das FCO. Foi determinado o extrato etéreo hidrólise ácida (EEA) das dietas, fezes e das oito FCO 31 avaliadas no ensaio de digestibilidade em extrator Soxhlet precedido de hidrólise ácida (método 954.02) de acordo com procedimentos descritos na AOAC (1995). A energia bruta (EB) das dietas, fezes, urina e das FCO foi determinada em bomba calorimétrica (IKA WORKS, C-200, EUA). A qualidade da proteína das FCO foi avaliada por meio da quantificação, por método colorimétrico (AOAC, 2005), da hidroxiprolina (método 990.26), com intuito de estimar o conteúdo de colágeno. Para tanto, as amostras foram submetidas à digestão com ácido sulfúrico e a absorbância aferida em espectrofotômetro (Ultrospec 1000, Pharmacia Biotech, Reino Unido) a 558 nm. Os cálculos para estimativa do teor de colágeno foram realizados de acordo com AOAC (2005). Foi determinada a solubilidade da proteína das FCO em pepsina por método de filtração, conforme AOAC (1995, método 971.09), porém, foram avaliadas concentrações de 0,02%, 0,002% e 0,0002% de pepsina, uma vez que estudos de diversas fontes proteicas de origem animal em outras espécies já demonstraram que o teor de 0,2% proposto pela AOAC (1995), por ser muito elevado, não é capaz de discriminar de forma eficiente diferenças qualitativas entre farinhas (BIELORAI et al., 1982; BELLAVER et al., 2000). Todas as análises foram realizadas em duplicata, com coeficiente de variação inferior a 5%. 2.2.5 Coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes e valores de energia metabolizável da farinha de carne e ossos Os CDA, ED e EM das dietas experimentais foram calculados pelo método de coleta total de fezes e urina de acordo com procedimentos descritos pela AAFCO (2009). Os CDA, ED e EM das FCO foram calculados pelo método de substituição (SAKOMURA e ROSTAGNO, 2007; SÁ-FORTES et al., 2010; KAWAUCHI et al., 2011) que utiliza como base os valores dos CDA, ED e EM da dieta basal e das dietas teste e a proporção de inclusão das FCO, corrigida para MS, conforme equação proposta por Matterson et al. (1965): CDAFCO = CDAdb + ����������� � � çã� �� �����ã� �� �� �� ���� ����� �� � ��� ����� (� ��⁄ )/���� 32 onde CDAFCO é o coeficiente de digestibilidade aparente da FCO, CDAdb é o coeficiente de digestibilidade aparente da dieta basal e CDAdt é o coeficiente de digestibilidade aparente da dieta teste. 2.2.6 Análises estatísticas Foi atendida a pressuposição de normalidade dos erros, sendo os dados analisados em delineamento em blocos casualizados pelo procedimento GLM do SAS (2004). Foram determinados os coeficientes de correlação linear de Pearson e, quando significativos, procedeu-se a análise de regressão linear simples entre os valores de digestibilidade da proteína e da energia obtidos in vivo (método de substituição) e aqueles estimados pelo método da solubilidade da proteína em pepsina. Valores de p<0,05 foram considerados significativos. 3. Resultados 3.1 Composição química da farinha de carne e ossos As FCO apresentaram variações, principalmente, em relação aos teores de gordura, colágeno, minerais e EB (Tabela 1). A quantificação da gordura por método de extração com éter de petróleo resultou em valores de extrato etéreo inferiores quando comparado ao método que realiza hidrólise ácida anteriormente à extração. Destacou-se, também, o elevado teor de MM das amostras e, consequentemente, a concentração de PB foi reduzida, com valores entre 386,3 e 487,1 g/kg de amostra. Por outro lado, a composição em gordura das farinhas foi relativamente elevada, com valores de até 167,1 g/kg de amostra, quando considerado método de extração com prévia hidrólise ácida. Este balanço entre alto teor de minerais e de gordura fez com que os ingredientes apresentassem densidade energética mediana de 13,86 MJ/kg de amostra. Apesar do colágeno constituir parte da fração proteica das FCO, este apresentou elevada correlação positiva com a MM (Figura 1). 3.2 Características qualitativas da farinha de carne e ossos Aparentemente, o processamento das matérias-primas para produção de FCO possibilitou relativo controle sobre a ocorrência de processos oxidativos e inibiu 33 o crescimento microbiano, o que pode ser verificado pelos baixos índices de acidez, atividade de água, ausência de peróxido e reduzido teor de aminas totais (Tabelas 2 e 3). Foi constatada presença de Salmonella spp. em duas amostras, o que em situações práticas inviabiliza a utilização da farinha na produção de alimentos. Entretanto, no presente estudo, uma das FCO contaminadas com Salmonella spp. foi avaliada no ensaio de digestibilidade em virtude deste ter ocorrido anteriormente à análise para detecção do patógeno. Observou-se que determinadas características apresentaram maior variação, como índice de acidez, número de TBA e teores de aminas. Além disso, nas 15 farinhas avaliadas, as concentrações de serotonina e de feniletilamina não puderam ser determinadas (< 0,04 mg/100g de amostra). 3.3 Digestibilidade e energia metabolizável da farinha de carne e ossos Observou-se variabilidade entre as FCO avaliadas em relação aos valores de digestibilidade da MS, MO, EEA e nas densidades energéticas (P<0,05) dos alimentos. A digestibilidade da FCO variou de 0,381 a 0,503 (Tabela 4). Os resultados médios de digestibilidade aparente dos nutrientes da FCO indicaram que o alimento apresenta reduzido aproveitamento e, consequentemente, baixa ED e EM. A digestibilidade da MS apresentou média de 0,453, o que significa que menos da metade do ingrediente foi digerido e absorvido pelos animais. Além disso, considerando que cães, por possuírem ancestralidade carnívora e, portanto, elevada capacidade de digerir proteína e gordura, isto torna os valores médios de 0,760 e de 0,842 de digestibilidade dos respectivos nutrientes também abaixo do esperado. Tais achados resultaram em reduzidos valores médios de ED e EM da FCO. Com intuito de melhor compreender os resultados verificados para digestibilidade dos nutrientes e densidades energéticas das FCO procedeu-se à avaliação dos coeficientes de correlação de Pearson entre o teor de