Dissertações - Biofísica Molecular - IBILCE

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Adsorção de polieletrólitos em macroíon opostamente carregado por física estatística de campos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-04) Garozi, Henry Frank Rodrigues; Carvalho, Sidney Jurado de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A adsorção de polieletrólitos em superfície opostamente carregadas tem sido objeto de estudo de diversos grupos de pesquisa devido a sua presença em processos biológicos e aplicabilidade em nanotecnologia. Neste trabalho é estudado a interação entre várias cadeias de polieletrólitos e uma superfície esférica opostamente carregada, e será analisada adsorção crítica das cadeias com a superfície, onde os íons da solução estão presentes de forma implícita em interações mediadas por potenciais do tipo Debye-Hückel. Visando isso, é utilizado o formalismo da Física Estatística de Campos no ensemble canônico para substituir graus de liberdade associados as posições das partículas por graus de liberdade associados a configurações de campos contínuos e locais, o que, empregando métodos funcionais e aproximação de ponto de sela, nos conduz a equações de campos que são resolvidas numericamente.
Adsorção de polieletrólitos em superfícies opostamente carregadas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015-06-12) Silva, Alexandre Nogueira da [UNESP]; Carvalho, Sidney Jurado de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Understanding the interactions between polyelectrolytes and oppositely charged macroíons is important due to the great number of biological processes and technological advances in which they are related. In this context the process known as adsorption is quite important, which led to a series of theoretical, experimental and theoretical-computational studies for his better understanding. On systems with plane geometry the problem has analytical solution, however for spherical and cylindrical geometry this no longer occurs due to the problem of lack of analytical solutions for the electrostatic potential in these geometries. The experiments show that there is a scaling relation between the concentration of ionic species contained in the electrolytic solution in which the polyelectrolyte-macroíon system lies and the surface charge density of the polymer and macroíon. In this study we used the concept of factorization, stemmed on the Supersymmetric Quantum Mechanics, applied to Edwards equation to obtain an approximate analytic solution for the spherical case in an agreement with the experimentally observed
Análise conformacional dos petídeos protonectina e protonectina (1-6), isolados e em associação, em mistura TFE-água
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2010-01-20) Baldissera, Gisele [UNESP]; Ruggiero, José Roberto [UNESP]; Chahine, Jorge [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Protonectina e Protonectina 1-6 são peptídeos extraídos do veneno da vespa social Agelaia pallipes pallipes. O primeiro apresenta atividade hemolítica, de degranulação de mastócitos e quimiotática, enquanto o segundo apresenta somente a atividade quimiotática quando atuam isoladamente. A associação destes dois peptídeos, em proporção 1:1 produz um aumento nas atividades hemolíticas e de degranulação de mastócitos, enquanto a atividade quimiotática decresce acentuadamente, ou seja, em associação apresentam um comportamento mais acentuado de interação com membranas. Dados de dicroísmo circular mostram que, quando associados, há um pequeno acréscimo no percentual de aminoácidos em conformação de hélice-α. A proposta deste trabalho é analisar, usando dinâmica molecular, os aspectos conformacionais da Protonectina isolada e em associação com a Protonectina 1 – 6 em misturas de TFE-água, para entender se e como ocorre essa associação, procurando destacar quais fatores podem ser determinantes nesse processo. A Protonectina isolada foi estudada por meio de dinâmicas moleculares de equilíbrio e dinâmica associada ao método de troca de réplicas. Com esse método, obteve-se dezesseis trajetórias de 60 ns varrendo o intervalo de temperaturas de 287 a 342 K, usando uma conformação em hélice alfa ideal como estrutura inicial. Usando o software WHAM e parâmetros como o RMSD e a primeira das componentes de uma Análise de Componentes Principais, PCA, como coordenadas de reação, obteve-se a superfície de energia livre, que apresenta dois mínimos principais. O mínimo com energia mais baixa contém estruturas ordenadas, com parte dos resíduos em alfa-hélice, ou em hélice-5 ou, ainda, numa combinação de “turns” e B-bridges, enquanto conformações aleatórias são encontradas no segundo mínimo. Destes dados o tempo de transição...
Análise do método suvrel na expressão diferencial a partir da matriz de contagens gerada com dados de RNA-SEQ
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-05-19) Tambonis, Tiago [UNESP]; Leite, Vitor B. Pereira [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
We are living in a time where advances in areas related to biology are routine, taking us to accustom to experiments with large number of variables. The RNA sequencing technology (RNA-Seq) is part of this framework and computational approaches applied in this context are not fully established and require more detailed analysis. Generally, in a experiment of analysis of di erential expression, total RNA samples or messengers (mRNA) is extracted, puri ed, fragmented, sequenced, mapped, and nally counted, generating an count table that relates how many reads was aligned to a given gene in a experimental condition. From this stage, it is proposed to use a variational method, called Suvrel (Supervised Variational Relevance), based on the minimization of a cost function that penalizes large distances between the same class of elements and favors small distances between di erent classes of elements to make the inference of relevance of each gene. The application of the method was performed on count table produced after of sequencing, alignment and summarization of 5 technical replicates containing Strategene Universal Human Reference RNA (UHRR) (part of Sequencing Quality Control Consortium, SEQC) together with ERCC 1 mix, and 5 technical replicates containing Ambion's Human Brain Reference RNA (HBRR) (part of SEQC also) together with the ERCC 2 mix. Using the ROC (Receiver Operating characteristic) curves generating from data of MAC-II project, setting the transcripts with log of fold-change greater than a cuto (from 0.5 to 2.0) as true positive and the others as true negative, the curves 6.2 and 6.4 were generated. From these graphs it is possible to conclude that the Suvrel method has higher AUCs in most of cuto s. It is appropriate to note that conclusions were obtained using a method that does not make any assumption about the distribution associated with the reads, using a simple normalization (divide the counts of a gene by its standard ...
Análise fatorial de múltiplos parâmetros de desempenho elétrico de filmes finos de óxidos metálicos processados por solução
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-09-03) Cantuária, José Bruno; Santos, Lucas Fugikawa [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Neste trabalho, foram estudadas as propriedades elétricas de filmes finos de óxido de zinco (ZnO) depositados por solução (spin-coating) de um precursor orgânico (acetato de zinco) em diferentes condições ambientais (temperatura, umidade e irradiância de luz), controladas em laboratório. A corrente dos dispositivos produzidos foi monitorada em função do tempo usando como parâmetros a irradiância de luz (entre 107 e 433 W/m2) usando uma lâmpada com espectro na região do ultravioleta-visível-infravermelho próximo (UV-vis-NIR) com o intuito de simular o espectro solar, a dose de irradiação (controlada pelo tempo de irradiação, entre 30 minutos e 120 minutos), a tensão aplicada (5 V e 30 V), a umidade relativa do ambiente (entre 30% e 80%) e a temperatura (32 oC e 50 oC). Além de um tempo de resposta considerável (da ordem de vários minutos) para a condutividade atingir o seu valor final após a incidência de luz, percebeu-se um fenômeno de fotocondutividade persistente (após o desligamento da luz). Diversos parâmetros de resposta (valor máximo de condutância, condutância final sob irradiação, tempo de subida, tempo de queda, etc.) foram definidos e utilizados como dados de entrada de uma análise de resultados baseados em uma análise multifatorial completa, de dois níveis, envolvendo como fatores as condições ambientais da realização dos ensaios. O design experimental (DOE) utilizado teve 5 fatores (temperatura, umidade, dose, irradiância e temperatura), totalizando 32 corridas experimentais, adicionados a mais 3 corridas experimentais com valores intermediários dos fatores, com o intuito de aumentar o número de graus de liberdade do sistema. A análise de variância (ANOVA) foi realizada nos resultados obtidos com o intuito de se determinar a significância dos fatores nos efeitos observados. Por fim, os resultados obtidos foram utilizados para se compor modelos de resposta que podem ser utilizados na predição dos resultados experimentais a partir da geração de superfícies de resposta em determinadas condições ambientais específicas.
Análise vibracional do α-tocoferol
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2010-11-29) Koga, Daniel Inoue [UNESP]; Cornélio, Marinônio Lopes [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O α-tocoferol é a principal dentre as moléculas que desempenham o papel biológico de vitamina E, sendo a que apresenta maior biodisponibilidade e atividade. Além dos papéis como vitamina, o α-tocoferol tem diversas funções no organismo incluindo a inibição de proteínas da família PLA2. Esse trabalho apresenta a análise vibracional do α-tocoferol inteiro no vácuo seguido pela otimização geométrica da molécula em ambiente protéico. O estudo do tocoferol no vácuo foi realizado dentro do formalismo do DFT usando o funcional de correlação-troca B3LYP e a base de funções 6-311G**. A análise vibracional foi realizada em um programa desenvolvido pelo autor. Em ambiente protéico, o processo foi dividido em duas etapas: a otimização geométrica do sistema inteiro no formalismo da dinâmica molecular e a otimização somente do ligante e de um envelope protéico em DFT. Por dificuldades computacionais não foi possível a análise vibracional do sistema.
Aplicação da equação de Paisson-Boltzmann com condição de contorno para regulação carga-potencial a sistemas polieletrolíticos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2007-09-21) Pazianotto, Ricardo Antonio Almeida [UNESP]; Neto, João Ruggiero [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
No presente trabalho, foram avaliados modelos teóricos para a descrição da autodissociação de poliácido fraco, e para a formação de complexos entre polieletrólitos de cargas opostas. Os modelos descritos utilizam simetria cilíndrica e o modelo celular para representar a solução polieletrolítica. A equação de Poisson-Boltzmann, com condições de contorno que levam em conta a regulação carga-potencial, é utilizada nos modelos teóricos para descrever as interações eletrostáticas. Para auto-dissociação de poliácidos fracos, foram obtidos valores teóricos de pH, calculados em função da concentração de polímeros e de sal, os quais estão em boa concordância com resultados experimentais da diluição do ácido poligalacturônico e alginato. Na formação de complexos, a energia livre eletrostática e energia livre de mistura de Flory-Huggins foram combinadas para obter diagramas de estabilidade teóricos, em diferentes condições, para analisar alguns parâmetros críticos. Estes diagramas apresentam boa concordância quando comparados com resultados experimentais da complexação entre: goma arábica e gelatina, alginato e quitosana, DNA e quitosana, poli-L-lisina e sulfato de condroitina.
Avaliação computacional de mecanismos de quinases e proteínas relacionadas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-04-26) Dias, Raphael Vinicius Rodrigues; Oliveira, Leandro Cristante [UNESP]; Melo, Fernando Alves [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A proteína Carboxyl-terminal Src Kinase, Csk, é uma proteína tirosina quinase com função de reguladora essencial para as proteínas da família das Src quinases (SFKs). Seu mal funcionamento regulatório tem sido reportado como responsável por diversas moléstias como: deformações na fase de desenvolvimento embrionário, manifestação de cânceres de mama, próstata, pâncreas, leucemia, linfoma e cólon. A CSK apresenta uma alta homologia sequencial com as SFKs, mas com disposições distintas de seus domínios. Outro diferencial é a ausência de uma porção terminal contendo uma tirosina que possa ser fosforilada, elemento fundamental para os demais membros das SFKs que podem se autofosforilar. Curiosamente, sua estrutura cristalográfica apresenta conformações distintas classificadas como formas ativa e inativa sendo o objetivo principal desse trabalho, modelar as transições e avaliar os seus possíveis mecanismos fazendo um link de como mudanças conformacionais entre essas duas conformações estão relacionadas com a ação da proteína quinase Csk baseando-se em experimentos in vitro. Complementarmente, a proteína adaptadora Grb2 relacionada com regulações de proteínas pertencente ao universo das quinases como a FGFR2, também é alvo do estudo. O conjunto quinase mais proteína adaptadora desempenham um importante papel na transmissão de sinal em cascatas de sinalizações envolvidas em processos celulares fundamentais como proliferação celular, diferenciação e apoptose. Dessa maneira, Grb2 é um alvo em potencial para o estudo de interações com pequenas moléculas de interesse biológico por seus efeitos anticarcinogênicos como a Cumarina 1,2-Benzopirona e Morina (2’,3,4’,5,7-pentahidroxiflavona). Experimentos in vitro comprovam a interação entre a proteína adaptadora Grb2 e o ligante Cumarina e Morina, sendo neste trabalho avaliado a determinação espacial e o conjunto de interações entre os complexos formados.
Avaliação das propriedades de interação envolvendo as proteínas Albumina de Soro Humano (HSA) e Albumina de Soro Bovino (BSA).
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-04) Tavares Neto, Ernesto; Oliveira, Leandro Cristante de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Albumina de Soro Humano (HSA) é uma proteína com grande importância biológica especialmente por sua função transportadora. Alterações em suas características de transporte é um problema chave em estudos atuais. O estresse oxidativo é responsável por causar grande parte dessas modificações em HSA, proteína que sofre com as espécies reativas ao oxigênio (ROS). O excesso de ROS está diretamente relacionado ao processo de oxidação em proteínas. O trabalho foi dividido em duas propostas distintas, onde na primeira os resíduos de aminoácidos de sítio I, Trp-214 e Lys-199, foram modificados computacionalmente e comparados aos dados experimentais obtidos por colaboradores. Assim, foi avaliado as alterações na afinidade de ligação com o composto fenilbutazona. Os agentes taurina monocloramina (Tau-NHCl) e taurina dibromamina (Tau-Nbr2) foram usados para oxidar a HSA. Foram observadas experimentalmente alterações espectroscópicas na proteína resultantes da oxidação do Trp-214, indicando a formação de N'-formylkynurenine (NFK). A oxidação da HSA via Tau-NBr2 gerou um significante aumento na constante de associação com a fenilbutazona, o que não foi verificado via Tau-NHCl. Os resíduos Trp-214 e Lys-199 foram substituídos computacionalmente e simulados pelos respectivos produtos da oxidação. A energia de interação calculada usando a função Amber score mostrou que a forma nativa da HSA apresentou uma energia de interação menor do que para os casos oxidados, HSA com Trp-214 modificado para NFK e HSA com Lys-199 modificada para sua forma carbonilada. Assim, os resultados computacionais corroboraram com os obtidos experimentalmente indicando que as alterações oxidativas dos resíduos de aminoácidos no sı́ tio I da HSA afetam suas propriedades de ligação. Na segunda proposta, a Albumina de Soro Bovino (BSA), uma proteína homóloga a HSA, foi avaliada por sua estrutura similar e por possuir algumas especificidades em sua sequência primária. A análise computacional revelou que HSA oferece algumas vantagens como a preferência pela ligação de compostos em comparação a BSA. Neste trabalho, a mesma abordagem computacional e experimental foi usada para caracterizar as especificidades na afinidade de ligação entre as proteínas humana e bovina. O composto 4-(Dicyanomethylene)-2-methyl-6-(4-dimethylaminostyryl)-4H pyran (DCM) foi utilizado nessas análises. As simulações de docking e dinâmica molecular mostraram que o composto apresenta uma maior afinidade verificada pelas energias de ligação para as interações no sítio I da HSA comparado aos sítios II e III, e o deslocamento do DCM de seu sítio de ligação na presença de compostos de mesmo sítio mostrou que o mesmo ocorre experimentalmente. Também foi mostrado pelas simulações computacionais que o DCM possui maior afinidade de ligação para a HSA (sítio I) comparado ao mesmo sítio da BSA, e esses resultados corroboraram com a medida experimental das constantes de associação (avaliado por fluorescência e pela supressão da fluorescência intrínseca das proteínas). Em geral, esses resultados sugerem a existência de especificidades nas características de ligação entre as espécies da albumina, indicando potenciais causadores das diferenças e fornecendo pontos de partida para estudos futuros envolvendo essas proteínas e compostos com propriedades farmacológicas.
Avaliação do pH como efeito modulador da interação entre a proteína Grb2 monomérica e a molécula de cumarina (1,2-benzopirona)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-11-21) Moreira, Giovana Casteluci; Melo, Fernando Alves de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer é uma das principais causas de morte na atualidade e se manifesta através da proliferação acelerada e descontrolada de células. Uma das principais vias de sinalização ativadas para o desenvolvimento da doença é a via da MAPK/ERK, responsável pelos processos de proliferação e diferenciação celular. O reconhecimento de fatores de crescimento por proteínas de membrana, como a FGFR2, recruta a proteína Grb2, que atua como uma ponte entre a proteína quinase e outras proteínas que ativam a proteína ERK, responsável por ativar fatores de transcrição no núcleo. Apesar de ser classificada como proteína adaptadora, a Grb2 regula a via da MAPK/ERK através de um equilíbrio monômero-dímero, em que o monômero permite a transdução de sinal e o dímero inibe esse processo. Além disso, a Grb2 é capaz de inibir a FGFR2 – que está relacionada com diversos tipos de cânceres, como o câncer de estômago, pele e mama. Desta maneira, a Grb2 é um alvo promissor para o desenvolvimento de terapias antitumorais. Um dos principais desafios da medicina moderna é o desenvolvimento de medicamentos e estratégias que sejam cada vez menos adversas aos pacientes e, nesse contexto, as moléculas de origem natural têm ganhado destaque no meio científico, devido sua grande biodisponibilidade e inúmeras propriedades benéficas para o ser humano. Devido à pouca literatura disponível a respeito de mecanismos moleculares de interação entre Grb2 e moléculas de origem natural, neste trabalho nós realizamos a caracterização dos mecanismos de interação entre o monômero de Grb2 e a molécula de cumarina (1,2-benzopirona), que possui atividade anticarcinogênica e inibe a proliferação celular. Os estudos biofísicos foram conduzidos em duas condições de pH (7,0 e 8,0) por se aproximarem do pH intracelular de células saudáveis e cancerosas, respectivamente. Os resultados da caracterização estrutural indicam que o monômero é mais flexível e estável em pH 8,0 do que em pH 7,0. A interação entre a proteína e a molécula foi classificada como favorável e hidrofóbica (ΔG < 0; ΔH e ΔS > 0), com constantes de afinidade (Ka) moderadas e da ordem de 104 M-1 para o pH 7,0 e 105 M-1 para o pH 8,0. A combinação dos resultados de STD-RMN e análises computacionais mostraram que a molécula de cumarina interage com o sítio de interação por meio de encaixes distintos, comprovando que mudanças conformacionais induzidas pelo aumento de pH modulam o mecanismo de interação de Grb2 com cumarina. Além disso, foi verificado que a estabilidade estrutural do monômero se mostrou dependente da concentração de cumarina, sendo fortemente perturbada na proporção de [2:1] de cumarina:Grb2. A partir desses resultados, concluímos que a conformação estrutural da Grb2 é sensível às mudanças de pH e isso pode influenciar na interação desta proteína com outras moléculas e proteínas parceiras. Estes resultados, se levados em consideração, podem contribuir para o desenvolvimento de medicamentos e tratamentos, contra o câncer, e baseados em Grb2, mais eficazes.
Busca por flavonoides como potencial ligante ao domínio RBD da proteína S para combate da Covid-19 por meio da plataforma DockThor
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-15) Garcia, Camila Gonçalves; Fossey, Marcelo Andrés [UNESP]; Araújo, Gabriela Campos de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O enfrentamento da pandemia, iniciada no ano de 2019 e ocasionada pelo novo coronavírus, o SARS-CoV-2, tem provocado muitos desafios para a ciência do mundo todo. É inédito o modo acelerado, pelo qual vem ocorrendo a busca por potenciais tratamentos de combate ao vírus. Na esteira dessa preocupação, esta pesquisa tem como objetivo buscar flavonoides com potencial de ligantes ao domínio RBD da proteína S, para o combate da Covid-19. A busca tem como objeto seis farmacológicos originados da flora brasileira. Trata-se de flavonoides, compostos com considerável capacidade de promover benefícios à saúde. A definição da estrutura do domínio RBD, da proteína Spike (S) do SARS-CoV-2, que foi utilizada nesta pesquisa, se deu a partir de uma busca em bancos de dados, por estruturas do SARS-CoV-2 com e sem inibidores complexados. A seleção dos seis flavonoides aplicados na busca por novos inibidores, junto ao SARS-CoV-2, foi realizada a partir do estudo de alguns trabalhos que pesquisaram os diferentes tipos desses compostos fenólicos. Em seguida, realizou-se o docking molecular dos compostos e estruturas selecionados na proteína alvo. Foram realizados dockings utilizando a estrutura RBD da proteína S, com o receptor ACE2 humano e sem a ACE2, permitindo a comparação entre os resultados encontrados. Essa comparação entre os dockings, com e sem a ACE2, permitiu observar por exemplo diferenças nas quantidades de aminoacidos encontrados e na qualificação posicional da genisteína. Desse modo, teve-se como resultado a determinação de um conjunto de compostos promissores, sendo possível destacar que a melhor correlação foi verificada nas áreas próximas às folhas β antiparalelas da estrutura analisada.
Caracterização biofísica da interação entre o domínio SH3 C-Terminal da Grb2 com cumarina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-07-29) Pedro, Renan Pereira; Melo, Fernando Alves de [UNESP]; Caruso, Icaro Putinhon; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As sinalizações celulares possuem um constante e preciso controle de sobrevivência e crescimento. Durante o processo de proliferação celular, essas sinalizações também estão sujeitas a falhas que podem gerar perda do crescimento celular dando início a um crescimento descontrolado ocasionando tumores. Uma das vias que sofrem essas alterações é a via Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), que é mediada por proteínas como a adaptadora Growth factor receptor bound-protein 2 (Grb2). A Grb2 é composta por um domínio SH2 flanqueado por dois domínios SH3, um N-Terminal e outro C-Terminal. Além da Grb2 atuar como adaptadora, também regula a via MAPK através de seu equilíbrio de estados monômeros/dímeros. Com a finalidade de entender a dinâmica estrutural do domínio SH3 C-Terminal, as ressonâncias do domínio foram observadas através dos deslocamentos químicos da cadeia principal. Os parâmetros de relaxação mostraram a presença de um sítio superficial em dinâmica conformacional lenta em escala de tempo de μs – ms. Sítios em trocas conformacionais frequentemente estão envolvidos em reconhecimento molecular. A análise da supressão de fluorescência mostrou que ocorre interação entre o domínio SH3c e a molécula cumarina, possuindo uma interação entropicamente dirigida em uma proporção 1:1 com constante de associação Kb ~ 105 M-1. Trabalhos computacionais feitos em colaboração corroboraram com os resultados da fluorescência indicando três possíveis sítios de interação.
Caracterização biofísica da interação entre o flavonoide Morina e a proteína Transaldolase isolada de Corynebacterium pseudotuberculosis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-03-31) Prado, Ana Karla Miranda [UNESP]; Souza, Fátima Pereira de [UNESP]; Fossey, Marcelo Andres [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria gram-positiva causadora da Linfadenite Caseosa (LC) em caprinos e ovinos. A LC é uma doença infectocontagiosa crônica que prejudica a produção de carne, leite e lã em vários países, incluindo o Brasil. Uma vez que o tratamento da doença é muitas vezes inviável e ineficaz, a eliminação dos animais infectados no rebanho tem sido uma das principais medidas de contenção da enfermidade. Vários grupos de pesquisa vem se dedicando ao estudo de C. pseudotuberculosis visando a identificação de fatores moleculares envolvidos na virulência e patogenicidade durante a infecção. Embora alguns destes componentes já tenham sido descritos, como a fosfolipase D, novos estudos são necessários para que seja possível compreender as diversas interações regulatórias que são intrínsecas a esse microrganismo, assim muitos grupos de pesquisas produzem de forma recombinante a enzima transaldolase de C. pseudotuberculosis, envolvida na glicólise e no metabolismo das pentoses-fosfato a fim de buscar inibidores que possam controlar sua ação enzimática. Nesse contexto, os flavonoides são compostos polifenólicos encontrados nas plantas e, em alguns casos, atuam como inibidores de infecções por microrganismos. Assim, a motivação deste trabalho consistiu em identificar e quantificar uma possível interação do flavonoide morina com a enzima transaldolase, a fim de bloquear a atividade de replicação e infecção de LC. Deste modo os objetivos desse estudo foram realizar a expressão, purificação, a caracterização da estrutura secundária e estabilidade térmica por dicroísmo circular e verificação de interação entre transaldolase e morina por espectroscopia de fluorescência da proteína transaldolase. Os resultados da expressão mostram que a proteína transaldolase com 40kDa foi purificada em cromatografia de afinidade seguida de cromatografia de exclusão molecular. A sua estrutura secundária apresentou 74% de alfa hélice, 0% de folha beta, 7,9% de alças e 18,1 % de estruturas aleatórias. A análise da desnaturação térmica mostrou que a temperatura de melting foi de 48°C, indicando que a proteína é estável. A interação entre Morina e Transaldolase apresentou mecanismo de supressão estáticodinâmico, com uma constante de associação moderada e um sítio de interação. A análise termodinâmica mostrou que o processo de interação é espontâneo ∆G<0, endotérmico ∆H>0 e entrópico ∆S<0. Assim, sabendo-se que a proteína Transaldolase é a proteína chave no processo das infecções por Corynebacterium pseudotuberculosis e considerando as propriedades antibacterianas e antiproliferativas do flavonoide morina, sugere-se que este composto possa ser investigado para os seus usos específicos. Sugere-se que a interação da transaldolase com a Morina possa exercer um papel de carreador ou seja, uma forma pela qual a proteína leva a molécula para o local que ela atua, e, assim, a Morina consiga realizar sua função antiproliferativa e bloquear as infecções.
Caracterização biofísica e estrutural da metaloproteinase não-hemorrágica do veneno de Bothrops moojeni e da endo-β-glicanase do Bacillus subtilis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2011-04-08) Akao, Patricia Kimi [UNESP]; Murakami, Mário Tyago [UNESP]; Neto, João Ruggiero [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Metaloproteinases presentes no veneno de serpentes são toxinas hemostaticamente ativas que interferem em diferentes níveis na cascata de coagulação e têm sido exploradas como ferramenta bioquímica nas pesquisas de coagulação, diagnósticos, modelos de inibidores de metaloproteinases e compreensão do mecanismo de ação de venenos. Estudos estruturais complementados por ensaios de docking molecular têm ajudado muito na compreensão de suas especificidades e mecanismo de ação. Assim, neste trabalho a metaloproteinase não-hemorrágica fibrinogenolítica da classe PI, isolada do veneno de Bothrops moojeni (BmooMP -I) foi cristalizada e sua estrutura resolvida a 1,76 Å de resolução. O íon zinco catalítico possui uma coordenação octaédrica formada por três histidinas canônicas (His 140 , His 144 e His 150 ) e por três moléculas de solvente. Uma comparação seqüencial e estudos estruturais indicaram que os motivos que compreendem os resíduos 153-164 e 167-176 possuem uma característica saliente, que diferencia as outras SVMPs hemorrágicas das não-hemorrágicas de classe PI, podendo estes motivos estarem diretamente envolvidos no desenvolvimento da atividade hemorrágica. Além do projeto principal, foram realizados estudos com a proteína endo-1,4-β-glicanase de Bacillus subtilis (Cel5A), que hidrolisa a ligação glicosídica β(1-4) do polímero de celulose. Esse polímero tem recebido grande atenção do meio acadêmico e industrial devido ao seu potencial na produção de açúcares solúveis, produtos químicos e biocombustíveis. Porém para o aproveitamento da biomassa celulósica é necessário a ação sinérgica do coquetel enzimático formado por endo-1,4-β-glicanases, celobiose-hidrolases ou exo-1,4-β-glicanases e β-glicosidases. Assim, o gene Cel5A constituído pelo domínio catalítico e o módulo de ligação à carboidratos (CBM) foi clonado...
Caracterização biofísico-química das proteínas FGFR2 e Grb2 e sua dinâmica de interação
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-04-23) Tedesco, Jéssica Andrade; Melo, Fernando Alves de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
FGFR2 (Fibroblast Growth Factor Receptor 2) é uma proteína receptora que apresenta um papel crucial na regulação do metabolismo celular, expressão gênica, crescimento, divisão e diferenciação celular. Vias de sinalização se iniciam com a ligação de fatores de crescimento aos seus receptores localizados na porção extracelular proteína FGFR2, induzindo sua fosforilação seguida de recrutamento de proteínas parceiras do citosol. Uma destas parceiras é a proteína adaptadora Grb2 (Growth Factor Receptor Bound Protein 2). O mecanismo de interação entre estas duas proteínas é fundamental para o funcionamento da via de sinalização MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase). Elucidar tal mecanismo é crucial para o estudo da sinalização celular e seus comportamentos aberrantes. Experimentos TROSY-based de taxas de relaxação transversa foram realizados em colaboração com o Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear (CNRMN). Os espectros 1D 1H do domínio quinase demonstram uma boa estruturação e dinâmica de acordo com a proteína. Tempos de relaxação aparente entre 16,2 e 23,5 ns foram encontrados, sendo compatíveis com proteínas que apresentam massa molecular entre 38,508 ± 7,709kDa, coerentes com a massa molecular de 40kDa do domínio quinase. Os espectros 2D 15N da interação entre FGFR2 e Grb2 mostram uma perda de sinal relacionado os domínios SH3-Grb2 quando comparados aos espectros da proteína Grb2 pura. Esta perda de sinal demonstra que ambos os domínios C- e N-terminal SH3-Grb2 estão participando da interação com FGFR2, enquanto o domínio SH2-Grb2 permanece dinâmico. Experimentos de DSC e DLS foram realizados com Grb2 em diferentes pHs para a determinação de possíveis alterações na sua estrutura devido à mudança entre pHs ácidos e bases. Constatou-se boa conformação, congruente com resultados observados na literatura, para pHs básicos. No entanto, em pHs ácidos foi observado um aumento na turbidez da solução impossibilitando a realização das análises. Tal comportamento gera duas hipóteses: a agregação da proteína devido à mudança significativa na carga total da proteína e a formação de transições de fase líquido-líquido.
Caracterização bioquímica de uma serino-protease produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora sp
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2010-02-23) Zanphorlin, Letícia Maria [UNESP]; Gomes, Eleni [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Fungos termofílicos têm despertado grande interesse acadêmico e industrial por produzirem uma variedade de enzimas termoestáveis com potenciais aplicações em processos biotecnológicos como biocatálise nas indústrias de couro, farmacêutica, têxtil e alimentícia, e na preparação de produtos de limpeza e cosméticos. Particularmente, as proteases, além de participarem de inúmeros processos fisiológicos vitais como vias metabólicas, hemostasia e sinalização celular, também representam hoje cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste trabalho, descrevemos a produção, purificação e caracterização bioquímica de uma serino-protease produzida por um fungo termofílico do gênero Myceliophthora. As taxas de atividade proteolítica foram avaliadas através de fermentação em meio sólido (FES) e submerso (FSM) e observou-se um rendimento na atividade proteolítica 4,5 vezes maior para o meio sólido. A enzima bruta obtida por ambos os procedimentos (FES e FSM) exibiu a mesma temperatura ótima de 50 ºC, porém em relação ao pH ótimo houve um deslocamento de 7 (FSM) para 9 (FES) sugerindo que o perfil enzimático do fungo difere de acordo com suas condições de fermentação. Baseado nesses resultados prosseguiu-se os estudos com o extrato bruto obtido por FES. A imobilização da enzima bruta em esferas de alginato de cálcio resultou no aumento da temperatura ótima e na estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. O extrato bruto obtido por FES foi, então, fracionado por métodos cromatográficos como exclusão molecular e troca-iônica que resultaram na protease pura com peso molecular de 28,2 kDa determinado por espectrometria de massa. A protease pura demonstrou pH ótimo de 9,0 e temperatura ótima de 45 °C que corroboram...
Caracterização da interação de inositol hexafosfato e cloreto com hemoglobina humana: aspectos energéticos e estruturais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2010-01-22) Silva, Vanessa de Cássia Teixeira da [UNESP]; Colombo, Marcio Francisco [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A ligação do O2 à Hemoglobina (Hb) é um processo regulado por interações alostéricas. Os íons Inositol hexafosfato (IHP) e cloreto, e prótons, são efetores alostéricos que estabilizam a Hb na estrutura quaternária T, diminuindo a afinidade da proteina pelo O2 em meio alcalino. A ligação de IHP também altera a cooperatividade de algumas hemoglobinas como, por exemplo a hemoglobina desArg, uma variante da HbAo da qual o resíduo arginina 141 das cadeia alfas foram retirados enzimaticamente. Estas argininas são prováveis sitios de interação com ions cloreto. Neste trabalho investigou-se a influência que a ligação de ânions Cl - e/ou IHP à Hb nas propriedades funcionais e conformacionais da proteína. Foi determinado o efeito destas interações na afinidade e cooperatividade de ligação de oxigênio à proteína, na liberação de prótons com a oxigenação ( efeito Bohr ), e na conformação da proteína. O papel de resíduos específicos nestes efeitos foi investigado comparando resultados obtidos com HbAo, Hb-desArg, e Hb Chesapeake (R92L), um mutante natural na qual a arginina 92 esta substituída por leucina. Os resultados mostraram que a retirada do resíduo C-terminal da cadeia alfa, arginina 141, suprimiu a cooperatividade da hemoglobina, diminui o número de prótons liberados durante a oxigenação, e que esta liberação de prótons foi a mesma na presença ou ausência de íons cloreto. Ainda, a retirada deste resíduo não interferiu no efeito Bohr dependente de IHP. Os resultados mostraram que a saturação de oxigênio ligados à HbA0 na presença de IHP não induziu a mudança na estrutura quaternária observada na ausência deste ânion, e na sua presença em meio com NaCl. Apesar disto, a cooperatividade da ligação é mantida. A arg-141α tem papel fundamental na estabilização pelo IHP da estrutura quaternária...
Caracterização estrutural e biofísica de duas proteínas relacionadas: β-1,3-1,4-glicanase de Bacillus subtilis 168 e α-L-arabinofuranosidase termoestável de Thermotoga petrophila RKU-1
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2012-02-12) Souza, Angelica Rodrigues de [UNESP]; Murakami, Mário Tyago [UNESP]; Santos, Camila Ramos dos [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Esta dissertação aborda o estudo de duas proteínas, uma β-1,3-1,4-glicanase (EC 3.2.1.73) de Bacillus subtilis 168 (liquenase) e outra α-L-arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55) da família GH51 de Thermotoga petrophila RKU-1, ambas com potenciais aplicações biotecnológicas. A liquenase é responsável pela catálise da clivagem de β-D-glicanas unidas por ligações tipo 1,3 e 1,4, por outro lado a arabinofuranosidase de estudo é responsável pela hidrólise de resíduos α-1,2, α-1,3 e α-1,5-L-arabinofuranosil e age em combinação com outras enzimas para despolimerização de arabinose em polissacarídeos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo realizar estudos estruturais e biofísicos dessas duas proteínas com o intuito de obter informações moleculares importantes que pudessem contribuir para utilização das mesmas em processos biotecnológicos, como o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica por exemplo. Desta forma, foi verificado que a liquenase apresenta massa molecular de 28 kDa, mostra um enovelamento típico de membros da família GH16 com estrutura β-jelly e mostrou uma termotolerância reduzida, abaixo de 50°C. Por outro lado, a arabinofuranosidase é uma enzima termofílica com massa molecular de 57 kDa e com a presença de dois domínios: um domínio catalítico com enovelamento barril (α/β) e um domínio C-terminal β-sanduíche, que possui um motivo β-hairpin único para arabinofuranosidases encontradas no gênero Thermotoga. Desta forma, foi possível concluir que a liquenase de estudo é uma enzima monomérica e que sua reduzida termotolerância limita sua aplicação em processos industriais acima de 50°C. Desta forma, esta é uma candidata a estudos de engenharia de proteínas. E com relação a arabinofuranosidase, possui uma estrutura hexamérica, quando em solução, e sua elevada estabilidade térmica sugere que esta é uma forte candidata a futuras aplicações industriais
Compreendendo a cinética de enovelamento da α–espectrina por meio de interações não nativas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-03-22) Silva, Fernando Bruno da [UNESP]; Leite, Vitor Barbanti Pereira [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O objetivo deste trabalho foi caracterizar o atrito interno que são evidenciados nos domínios R15, R16 e R17 da chicken brain α–Espectrina. A Espectrina é uma proteína que faz parte do citoesqueleto e foi descoberta primeiramente em eritrócitos, sendo importante para manter a estabilidade, estrutura e forma da membrana celular. Esta proteína é composta de duas subunidades, α e β, sendo que cada um dos domínios presentes nestas subunidades apresentam 106 amino ́acidos. Além disso, estes domínios apresentam alta similaridade estrutural (RMSD < 1 A) e os resultados experimentais indicam que o domínio R15 apresenta um tempo de enovelamento que é três ordens de grandeza menor que seus homólogos (R16 e R17), esta observação foi atribuída aos efeitos do atrito interno na taxa de enovelamento. Portanto, neste trabalho foi estudado o enovelamento do R15, R16 e R17 utilizando o modelo baseado em estrutura Cα . Em nossas simulações, além das interações homogêneas para os contatos nativos (conhecido como modelo vanilla), foi adicionado um potencial atrativo para as interações não nativas hidrofóbicas (conhecido como modelo flavored ) utilizando a tabela do potencial de interação Miyazawa-Jernigan, bem como simulações com carga fixa e a pH constante, onde foram analisadas as interações eletrostáticas no processo de enovelamento. Por fim, realizaram-se simulações com o acoplamento para melhor descrever o sistema estudado.
Contribuição eletrostática e não eletrostática na interação de peptídeos líticos com membranas modelo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2010-08-31) Leite, Natália Bueno [UNESP]; Neto, João Ruggiero [UNESP]; Cabrera, Márcia Perez dos Santos [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Peptídeos bioativos são de elevado interesse como substitutos de antibióticos convencionais já que alguns destes apresentam atividade antimicrobiana. Eles são predominantemente catiônicos e tem sido mostrado que sua atividade antimicrobiana é modulada por interações eletrostáticas, hidrofóbicas e por características elásticas das membranas, seu alvo. Neste trabalho analisou-se a importância da carga elétrica líquida (Q) e hidrofobicidade na interação de quatro peptídeos com membranas modelo de caráter aniônico e zwitteriônico utilizando medidas de potencial eletrocinético, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Estes peptídeos denominados mastoparanos apresentam carga liquida de +1 a +4, devido à presença de resíduos ácidos e básicos, foram extraídos do veneno de vespas, três dos quais de espécie nativa da bodiversidade nacional, mostraram intensa atividade antimicrobiana. Nos peptídeos com Q = +1 e +2 predomina o caráter hidrofóbico enquanto nos demais o caráter hidrofílico; o peptídeo com Q = +4 tem sua estrutura resolvida por NMR e devido à alta homologia entre essa seqüência e dos demais se supõe que eles também sejam anfipáticos. A atividade lítica é caracterizada por uma razão [P]/[L] crítica entre as concentrações totais de peptídeo e lipídeo, acima da qual ocorre um processo cooperativo de liberação de corante do interior das vesículas. A razão crítica, a eficiência do vazamento e a cooperatividade mostraram ser dependentes na densidade superficial de carga da vesícula e da carga liquida do peptídeo. Observaram-se razões [P]/[L] críticas da ordem de sub-micromolar tanto em vesícula zwitteriônica quanto em vesícula aniônica. As curvas dose-resposta tornaram-se menos cooperativas com o aumento da carga líquida dos peptídeos, mostrando que a razão crítica aumenta com a carga. Os espectros...

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