Teses - Ciências Biológicas (Genética) - IBB
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ItemTese de doutorado Alterações genômicas e perfil de expressão gênica global em leiomiomas uterinos(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2011-06-22) Cirilo, Priscila Daniele Ramos [UNESP]; Rogatto, Silvia Regina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Os Leiomiomas Uterinos (LU) são os tumores benignos mais comuns do trato genital feminino afetando entre 25-30% das mulheres em idade reprodutiva. Embora com etiologia pouca conhecida, estes tumores constituem um importante problema de saúde pública, sendo a principal indicação para histerectomia. Aproximadamente 40- 50% dos LU apresentam anormalidades citogenéticas não randômicas, portanto, a outra metade pode conter alterações submicroscópicas, como as alterações no número de cópias de DNA (CNVs). Estudos de expressão gênica globais têm revelado o envolvimento de genes que participam das vias de proliferação e ciclo celular, do ácido retinóico, sinalização TGF-beta e IGF-1 em resposta ao estrógeno e a progesterona. Entretanto, poucos genes mapeados em regiões de CNVs foram diretamente associados com o desenvolvimento dos LU. O objetivo deste estudo foi investigar alterações no número de cópias de DNA em pacientes com LU múltiplos e únicos. Utilizando a técnica de CGH array, foram avaliadas 80 amostras de LU obtidas de 56 pacientes. O perfil de expressão gênica global foi investigado em 51 amostras com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos em relação ao miométrio adjacente (MM). Posteriormente, os dados genômicos e transcriptômicos foram integrados com o objetivo de identificar CNVs funcionais que possam estar associadas ao fenótipo tumoral, sendo esta análise importante para a descrição de novos marcadores moleculares e possíveis alvos terapêuticos. Amostras de DNA e RNA foram obtidas dos LU e MM de pacientes nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. As 80 amostras de DNA tumoral e DNA referência universal foram digeridas, marcadas e hibridadas em lâminas Agilent Human 4x44K CGH Microarrays. Os dados foram...ItemTese de doutorado Alterações genômicas na endometriose(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2011-05-30) Silveira, Cássia Gisele Terrassani [UNESP]; Rogatto, Silvia Regina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)A endometriose (EDT) é uma doença ginecológica crônica e heterogênea considerada um importante problema de saúde pública. As metodologias de Hibridação Genômica Comparativa de Alta resolução (HR-CGH) e CGH array (aCGH) são ferramentas importantes para a triagem de alterações genômicas em diferentes lesões endometrióides. No presente estudo, as análises de HR-CGH foram realizadas em 20 amostras de EDT fixadas em formalina e em blocos de parafina, de diferentes sítios e tipos histológicos, obtidas de oito pacientes submetidas à laparoscopia (Grupo I). Os componentes estromais e epiteliais foram isolados por microdissecção a laser. As amostras de endométrio tópico de três pacientes apresentaram perfis genômicos normais. Nos tecidos ectópicos, foi observada uma média de 68 regiões alteradas por caso. Análises comparativas entre os componentes estromais e epiteliais demonstraram alta freqüência de alterações genômicas comuns. As perdas foram mais prevalentes e envolveram principalmente os cromossomos 3p, 5q, 7p, 9p, 11q, 16q, 18q e 19q. A comparação entre os perfis de alteração de lesões de diferentes localizações derivadas da mesma paciente revelou a predominância de regiões comuns envolvidas em perdas e ganhos. Baseado nestes resultados foi realizada a análise de expressão protéica de sete marcadores de células-tronco pela metodologia de imunohistoquímica. A maioria das amostras apresentou expressão positiva dos marcadores CD9, CD34, c-Kit e Oct-4 em células isoladas do epitélio glandular e/ou células estromais. A presença de alterações genômicas comuns nos componentes estromal e epitelial de diferentes lesões sugere que a EDT apresenta uma origem monoclonal e a expressão positiva de marcadores de células-tronco sugere fortemente o envolvimento...ItemTese de doutorado Analisando a determinação sexual de vertebrados com base em redes de interação entre proteínas(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2013-02-21) Valente, Guilherme Targino [UNESP]; Martins, Cesar [UNESP]; Lemke, Ney [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Atualmente os sistemas biológicos vem sendo abordados por diversas áreas de pesquisas, dentre elas a biologia de sistemas. Essa área tem centrado esforços para descrever e compreender as relações entre os componentes bióticos e abióticos desses sistemas, utilizando para isso a teoria de grafos. Uma forma de estudar esses sistemas, é avaliar as interações entre proteínas, que são as interações biomoleculares mais abundantes nas células. Nesse contexto, a presente tese focou no desenvolvimento de um algoritmo computacional capaz de predizer interações entre proteínas de qualquer espécie ou conjunto protéico. Para isso, foram utilizadas técnicas de aprendizado de máquina (sub-área da inteligência artificial) para a construção e aplicação desse preditor, o qual mostrou-se eficaz em predizer interações entre proteínas de mais de 80 espécies diferentes, incluindo interações entre proteínas de parasita e hospedeiro. Esse novo preditor foi aplicado no proteoma de zebrafish (Danio rerio) e humanos (Homo sapiens), gerando assim redes de interações proteicas para ambas as espécies. As interações obtidas foram avaliadas em um contexto geral e o foco das análises foi direcionado para a sub-rede relacionada com as vias de determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Os resultados demonstraram uma relativa baixa conservação desses grafos ao longo da evolução dos vertebrados, tanto do ponto de vista global quanto da sub-rede relacionada com a determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Além disso, foi possível observar ao menos um hub conservado entre as duas sub-redes, o qual representa um novo alvo a ser avaliado por pesquisas experimentais. Contudo, os dados demonstram que o preditor gerado possui um grande potencial para diversas áreas de estudos e é bastante útil para predição de interações em larga-escala. Além disso, os aspectos evolutivos aqui...ItemTese de doutorado Análise bioquímica, estudos da relação estrutura-função e de expressão da proteína desacopladora mitocondrial de plantas(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2008-05-30) Fávaro, Regiane Degan [UNESP]; Maia, Ivan de Godoy [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Proteínas desacopladoras (UCPs; do inglês uncoupling proteins) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial que desacoplam a respiração da síntese de ATP. UCPs geram um fluxo de prótons através da membrana mitocondrial interna, dependente de ácidos graxos e sensível a nucleotídeos purínicos (PN). No presente trabalho, foram realizados vários estudos empregando UCPs de plantas (pUCP). Inicialmente, foi empreendida a caracterização bioquímica de uma UCP de milho (Zea mays; ZmUCP), representativa de espécies monocotiledôneas. Essa proteína, quando expressa em Escherichia coli e reconstituída em lipossomos, foi capaz de induzir um fluxo de prótons dependente de ácido linoléico (LA) e sensível a ATP com valores de Km, Vmax e Ki similares àqueles observados para pUCPs de espécies dicotiledôneas. A ZmUCP foi utilizada para investigar a importância de um par de histidinas presente no segundo loop matricial da UCP1 de mamíferos e ausente nas pUCPs. A introdução do referido par de histidinas na ZmUCP (Lys155His e Ala157His) provocou um aumento na afinidade por LA enquanto que a sua atividade permaneceu inalterada. Em um estudo mais abrangente de estrutura-função, mutações pontuais nos resíduos Lys147, Arg155 e Tyr269, localizados nas chamadas assinaturas das UCPs, e Cys28 e His83, específicos para pUCPs, foram introduzidas na proteína AtUCP1 de Arabidopsis. Os efeitos de tais mutações nas propriedades bioquímicas da AtUCP1 foram examinados usando sistema de reconstituição em lipossomos. O resíduo Arg155 parece ser crucial para a afinidade da AtUCP1 por LA enquanto que His83 tem importante função na atividade de transporte. Os resíduos Cys28, Lys147, e também Tyr269, são importantes para a correta funcionalidade da AtUCP1, já que suas substituições...ItemTese de doutorado Análise da composição e distribuição geográfica dos atuns da costa brasileira (Perciformes: Scombridae: Thunnini)(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015-02-25) Ramirez, Zoila Raquel Siccha [UNESP]; Oliveira, Claudio de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Tunas, bonitos and mackerels are marine pelagic fishes distributed in the tropical and subtropical oceans of the world. They are highly captured and traded throughout their distribution area being the eight species of the genus Thunnus those with higher commercial value. Correct species identification in fisheries is needed to take better conservation measures and efficient fisheries management. The results are discussed in two chapters, the first based on the identification of the species within the family Scombridae and the second testing population analysis in two species of tuna Katsuwonus pelamis and Thunnus obesus, offen captured in Brazil and Peru. For this, test the efficiency of the DNA barcode methology and amplification of the control region of species of the Scombridae family, with emphasis in the genus Thunnus, and the identification and separation of the populations of two tuna. Twenty species were analyzed with the COI (648 specimens) and eighteen with the D-loop (313 specimens). For the first part of the study, the COI gene discriminated 66% of the analyzed species, but those belonging to the genus Thunnus could not be separated, unlike the results found in the D-loop in which all species were properly separated and powerful tool for species identification of the Scombridae family, including genus Thunnus. In the population analysis (second chapter) using the D-loop was possible to identify two populations of T. obesus (Pacific and Atlantic), with a high value of Fst, highly structured and statistically significant and also of two populations of K.pelamis (clade I and clade II), but in this second case has not been verified a geographical isolation of populationsItemTese de doutorado Análise da estrutura populacional de Aedes aegytpi (Linnaeus, 1762) em algumas regiões do Brasil(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015-05-12) Bronzato, Aline Ribeiro [UNESP]; Ribolla, Paulo Eduardo Martins [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Aedes aegypti is considered the main vector of arboviruses affecting humans. Nowadays, the only feasible measure to eradicate the dengue fever depends exclusively of vector control. The deep knowledge about the structure and dynamics of Ae. aegypti population in distinct environments is critical, since genetically different populations may present differences related to vector competence and capacity. Brazil has regions with different climatic and geographic characteristics, therefore, detailed knowledge about mosquito population that colonizes different habitats is extremely important. The present study evaluated the population structure of Ae. aegypti mosquitoes in five different Brazilian cities (i.e., Belo Horizonte, Botucatu, Campo Grande, Maringá and Rondonópolis) using a microsatellite markers. Those markers were also used to evaluate the oviposition dynamic and the consequences of Ae. aegypti mosquitoes dispersion, of the city of Botucatu. Population macro-analysis, using DAPC evidenced, genetic clusters among individuals of the same locality, and population structure in mosquitoes of Belo Horizonte. Population microstructure analysis identified six sub-populations of Ae. aegypti mosquitoes among six sub-regions of Belo Horizonte. In addition, the microstructure analysis suggested intermediate population structure in the sub-regions of Campo Grande, and lack of genetic structure among mosquitoes from the sub-regions of Botucatu. Therefore, these results indicate that genetic organization occurs in correlation with city size - where large towns seem to provide genetic structure to the populations of Ae. aegypti. PCA analysis of ovitraps obtained in Botucatu indicated population organization of Ae. aegypti mosquitoes in families. Pedigree analysis and inbreeding coefficient indicated that only for out of 30 mosquitoes analyzed in the same ovitrap, keep restricted familial relationships. These results suggest that Ae. aegypti...ItemTese de doutorado Análise das relações filogenéticas e padrões de diversificação de Trichomycteridae (Teleostei, Siluriformes) utilizando sequências de DNA(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-03-02) Orrego, Luz Eneida Ochoa [UNESP]; Oliveira, Claudio de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Trichomycteridae é uma das famílias mais diversa da superfamília Loricarioidea com aproximadamente 300 espécies válidas, incluídas em 41 gêneros e oito subfamílias, e amplamente distribuídas pelas drenagens da América do Sul e Central. Trichomycteridae é caracterizada morfologicamente pela presença de um sistema opercular altamente modificado, envolvendo os ossos operculares e pré-operculares, assim como pela variação no tamanho do corpo e padrões de coloração. Também apresentam uma ampla diversidade trófica incluindo espécies onívoras, insetívoras, lepidófagas e hematófagas. A monofilia da família e suas subfamílias são bem suportadas por caracteres morfológicos, exceto Trichomycterinae, a qual inclui Trichomycterus, um grupo não-monofilético, taxonomicamente complexo, com elevado número de espécies e desconhecida diversidade. Embora múltiplos estudos tenham focado nas relações supragenéricas com reduzida representatividade de espécies, ainda não existem estudos utilizando caracteres moleculares com ampla amostragem de Trichomycteridae. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo principal estudar as relações filogenéticas de Trichomycteridae através da análise de sequências de DNA, usando duas aproximações: a análise multilocus, incluindo três genes mitocondriais e dois nucleares, e a implementação de análises filogenômicas usando 851 elementos ultraconservados do genoma (ultraconserved elements, UCEs). Com base na filogenia obtida, analisamos padrões de origem e diversificação, assim como sua correlação com a evolução do tamanho do corpo. Além disso, foram realizadas análises de biogeografia paramétrica para a reconstrução das áreas ancestrais. Os resultados obtidos pelas duas metodologias corroboram hipóteses morfológicas em relação à monofilia das subfamílias, exceto Glanapteryginae e Sarcoglanidinae, e revelam novas hipóteses de relacionamento dentro do clado Tridentinae-Stegophiliniae-Vandelliinae-Sarcoglanidinae-Glanapteryginae (TSVSG). As análises de divergência indicaram que a origem de Trichomyctreridae data do Cretaceo inferior com múltiplos eventos cladogenéticos ocorridos durante o final do Eoceno e inicio do Mioceno. A família apresenta uma alta heterogeneidade nas taxas de diversificação, com um shift evidente na origem da subfamília Trichomycterinae, o qual não está correlacionado com a evolução do tamanho do corpo. A reconstrução de áreas ancestrais indicou que o ancestral comum mais recente de Trichomycteridae esteve amplamente distribuído na região amazônica e drenagens costeiras do Atlântico Sul do Brasil. Diferentes processos geomorfológicos de dispersão e vicariância, principalmente associados com eventos de captura de cabeceira modelaram a distribuição atual dos membros de Trichomycteridae.ItemTese de doutorado Análise de ligação e associação no genoma com gagueira desenvolvimental persistente em famílias do Estado de São Paulo-Brasil(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2013-03-21) Domingues, Carlos Eduardo Frigério [UNESP]; Moretti-Ferreira, Danilo [UNESP]; Drayna, Dennis [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)A gagueira é uma doença comum que afeta a fluência da fala, caracterizada por repetições ou prolongamentos frequentes de sons, sílaba, palavras, ou por hesitações, ou interrupções no fluxo normal da fala. Trata-se de uma doença que tipicamente surge na infância em crianças com idade entre dois e quatro anos, com taxa de incidência estimada em torno de 5% da população. No entanto devido à elevada taxa de recuperação espontânea, estima-se uma prevalência de 1% na população em geral. Apesar do envolvimento de fatores ambientais, o fator genético é determinante para o desenvolvimento da doença. Algumas evidências que sustentam essa relação são: agregação familial, estudos com gêmeos e envolvendo adoções e, relações de consanguinidade em famílias com diversos afetados. Entretanto, trata-se de uma doença complexa na qual a identificação exata do tipo de herança é difícil de ser determinada uma vez que não seguem as leis de Mendel. Este estudo teve como principal finalidade realizar análises de ligação em 43 famílias brasileiras do Estado de São Paulo, não relacionadas, portadoras de gagueira desenvolvimental persistente a fim de identificar regiões cromossômicas com possíveis genes candidatos; Para as análises de ligação, inicialmente foi realizada a genotipagem de todas as famílias através de chips específicos para essa finalidade contendo 6056 marcadores SNP. Posteriormente, para o refinamento do mapa de ligação foram utilizados marcadores microssatélites polimórficos marcados com fluoróforos e analisados em sequenciador automático capilar. Para as estimativas das frequências alélicas destes marcadores na população brasileira foram utilizados amostras do grupo controle, não relacionadas, previamente selecionadas. Apenas duas famílias (BRPD_47 e BRPD_50) sob o padrão de herança dominante...ItemTese de doutorado Análise dos genes GL1 E PTCH1 em indivíduos com anomalias craniofaciais de linha média, olho e face(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2012-07-01) Bertolacini, Cláudia Danielli Pereira [UNESP]; Ribeiro-Bicudo, Luciene Arilho [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Classificada como a quarta anomalia congênita mais frequente em recém-nascidos, as anomalias craniofaciais constituem um grupo diverso e complexo, determinando, na maioria das vezes aos seus portadores, um prognóstico reservado. Dentre as alterações craniofaciais destacam-se aquelas que ocorrem em função de alterações no desenvolvimento da linha média craniofacial. Alguns estudos genéticos mostram o envolvimento de vários genes durante os diferentes processos de desenvolvimento craniofacial. O gene Sonic Hedgehog (SHH) é expresso durante o desenvolvimento normal dos tecidos da linha média facial. Alguns estudos relatam a atividade da via sinalizadora do gene SHH na formação craniofacial, especialmente sua influência sobre os defeitos de linha média. Os genes mais conhecidos relacionados à rede sinalizadora do SHH compreendem, além do SHH, os genes ZIC2, TGIF, PTCH1, GLI2, FAST1, TDGIF, SUFU e o DHCRT. O objetivo desse trabalho foi realizar a análise de mutações nos genes GLI2 e PTCH1, através do sequenciamento direto, em 110 indivíduos com anomalias craniofaciais de linha média, olho e face, previamente analisados para os genes SHH, TGIF e SIX3. Os resultados obtidos pelo sequenciamento do gene GLI2 mostraram a presença de quatorze variações em regiões codificadoras, em 14 indivíduos brasileiros sem parentesco: 1 deleção, 1 inserção, 9 variantes não sinônimas e 3 variantes sinônimas. Nenhuma dessas variações foram encontradas nos 96 controles brasileiros normais. Seis dos quatorze indivíduos apresentavam manifestações fenotípicas que variavam de fissura de lábio/palato isolada com polidactilia, anomalia de arco branquial a Holoprosencefalia (HPE) semi-lobar. Novas variantes foram encontradas nesse gene em pacientes com comprometimento na junção temporomandibular (ATM), um novo achado...ItemTese de doutorado Análise Estrutural do Componente Telomerase Transcriptase Reversa de Leihmania major(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-07-25) Viviescas Maldonado, Maria Alejandra; Nogueira Cano, Maria Isabel [UNESP]; Henrique Fernandes, Carlos Alexandre [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários primitivos entre os quais estão os causadores de um espectro de doenças conhecidas como leishmaniose, as quais afetam milhões de pessoas no mundo inteiro, sendo o Brasil um dos países que apresenta maior número de casos por ano. Os tratamentos e vacinas disponíveis para a leishmaniose apresentam problemas como toxicidade, alto custo e baixa eficiência, tornando importante a busca por novos alvos terapêuticos. Dada sua importância para a estabilidade genômica e proliferação celular, os telômeros têm sido considerados como alvos terapêuticos potenciais no tratamento da leishmaniose. Os telômeros são as extremidades físicas dos cromossomos lineares compostos por complexos ribonucleoproteicos que envolvem a interação entre proteínas, DNA e RNA. A maioria dos eucariotos mantêm o tamanho dos telômeros pela ação do complexo telomerase, que é minimamente composto por uma proteína (TERT, Telomerase Reverse Transcriptase) e um RNA longo não codificador (TER, Telomerase RNA). Os dois componentes do complexo telomerase em Leishmania sp. foram identificados, porém não há informação disponível sobre suas estruturas. O objetivo principal deste estudo foi a caracterização estrutural do componente TERT de Leishmania major. Utilizando alinhamentos múltiplos de sequências, foi possível verificar que os quatro domínios estruturais das telomerases canônicas estão presentes no componente TERT em Leishmania sp. Três destes domínios foram estudados independentemente utilizando várias ferramentas de bioinformática. O domínio TEN (Telomerase essential N-terminal) é o mais amino-terminal e é importante na interação com o DNA telomérico e proteínas teloméricas. Em L. major, este domínio mostra uma baixa conservação de estrutura primária quando comparado com outros eucariotos, mas preserva o único motivo estrutural. Este domínio está composto principalmente por elementos desordenados e hélices-α e mostra uma baixa conservação de estrutura primária quando comparado com outros eucariotos, mas preserva seu motivo funcional característico. O domínio TRB (Telomerase RNA Binding) é importante na interação entre o componente TERT e o componente TER. Em L. major, o domínio TRB apresenta uma conservação estrutural parcial, mas possui substituições em resíduos de aminoácidos próprias do gênero Leishmania que poderiam alterar o mecanismo de interação TERT/TER. O domínio RT é o centro catalítico do TERT. Este domínio é altamente conservado em L. major e apresenta conservação de todos os motivos funcionais, assim como do centro catalítico. Para corroborar os resultados in silico com dados experimentais, os três domínios foram individualmente expressos em sistema heterólogo e protocolos de purificação das proteínas recombinantes são apresentados. O objetivo é utilizar estas proteínas em estudos de interação proteínas-ácidos nucleicos e proteína-proteína para verificar o grau de conservação destas interações, uma vez que nesses parasitos o TERT compartilha características estruturais com outros TERT, embora também apresente peculiaridades do gênero. Os resultados gerados neste trabalho podem fornecer conhecimento sobre a evolução da enzima telomerase e indicar se a telomerase de L. major poderá ser considerada um alvo terapêutico parasita-específico.ItemTese de doutorado Análise funcional da presença de cromossomo B, utilizando o peixe ciclídeo Astatotilapia latifasciata como modelo(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2016-07-18) Marques, Diego Ferreira [UNESP]; Martins, Cesar [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Os cromossomos supernumerários (cromossomos B) são elementos extras, não homólogos ao complemento A e já foram descritos em uma gama de espécies representando os principais grupos de eucariotos. Estudos com esses elementos têm sido mais direcionados as investigações em nível estrutural, sendo que aspectos funcionais têm sido pouco explorados. Dentre as espécies de peixes, os ciclídeos tem recebido grande interesse científico uma vez que sofreram um rápido e extenso processo de radiação adaptativa e até o momento, cromossomos B já foram descritos em 21 espécies de ciclídeos, variando em quantidade de um a três. Considerando os aspectos citados, atrelados à possibilidade do uso de ferramentas que integram dados funcionais, genômicos e citogenéticos, o presente projeto visou analisar o perfil transcricional de tecidos-alvo de A. latifasciata afim de investigar possíveis interferências motivadas pelo cromossomo B relacionadas ao nível de transcrição em indivíduos com presença ou ausência desse elemento extra. Uma gama de genes diferencialmente expressos evidenciada nos tecidos analisados, mostra que B cromossomo pode interferir em diferentes vias fisiológicas da célula. Os resultados mostraram grande contribuição para a discussão sobre a importância funcional do cromossomo B, identificando vários genes relacionados ao ciclo celular, manutenção da estrutura celular e resposta imune. Foram identificados genes altamente expressos localizados no B, o que mostra sua interferência direta. Entretanto a maioria dos genes diferencialmente expressos estão localizados nos cromossomos do complemento normal, cuja função está sendo afetada pela presença deste elemento. Outro ponto importante foi a observação de uma possível ação de repressão do cromossomo B em testículo e aumento dos níveis de expressão em ovário, sugerindo uma possível ação no mecanismo de "drive" desse cromossomo nos gametas femininos.ItemTese de doutorado Análise funcional das proteínas desacopladas mitocondriais de plantas utilizando RNA-seq e mutantes de inserção(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-10-01) Laitz, Alessandra Vasconcellos Nunes [UNESP]; Maia, Ivan de Godoy [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Mitochondrial inner membrane uncoupling proteins (UCP) dissipate the proton electrochemical gradient established by the respiratory chain, thus affecting the yield of ATP synthesis. These proteins play a role in maintaining mitochondrial function and their importance as cellular oxidative stress tolerance component has been demonstrated in several studies performed in vitro and in vivo. In this study, the functional role of plant UCPs was investigated. In a first approach, a transcriptomic analysis of tobacco plants overexpressing the AtUCP1 gene of Arabidopsis thaliana was performed using RNA-seq analysis. The RNA-sequencing generated over a million of reads with 150 base pair on average for each library. From these reads, a set of approximately 34,000 contigs was obtained. A total of 816 differentially expressed genes between transgenic lines and wild-type control was identified. Amongst them, 239 were up-regulated (p≤0,001) and 577 were down-regulated (p≤0,001). In parallel, a gene expression analysis was performed using Arabidopsis insertion mutants for the AtUCP1-3 genes, two of them (atucp2 and atucp3) being characterized in this study. The main purpose was to verify the functionality and the existence of redundancy between the target genes. According to the obtained results, a compensatory expression was observed only in the atucp3 background, in which the AtUCP1 and AtUCP2 genes were induced both in normal physiological conditions and under salt and osmotic stressesItemTese de doutorado Análise funcional do papel da enzima DNA metiltransferase 2 (DNMT2) no desenvolvimento e resposta à estresses e identificação e caracterização de fragmentos derivados de tRNA (tRFs) em Arabidopsis thaliana(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015-08-07) Rosa, Cristiane de Santis Alves [UNESP]; Nogueira, Fabio Tebaldi Silveira [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)DNA methylation is associated with genetic regulation, cell memory, silencing of transposable elements, genomic imprinting and repression of pseudo-elements coming from duplicate sequences. Methylation patterns are established, kept and translated via an appropriate functional DNA methylation machinery, which includes a family of proteins classified into three methyltransferase enzyme groups: DNMT1, DNMT3 e DNMT2. DNA methyltransferase 2 (DNMT2) was first identified by searching for novel DNA methyltransferase candidates. DNMT2 is highly conserved in different kingdoms and does not have a biological function well defined so far; however, it has been shown that DNMT2 can methylate both DNA and RNA in animal cells, most specifically transfer RNA (tRNA). In human cells, DNMT2 is localized both in the nucleus and in the cytoplasm, being capable to migrate from nucleus to cytoplasm under stress conditions. In the cytoplasm, DNMT2 methylates tRNAs, possibly to protect against cleavage events that occur under stress conditions. When these cleavages occur in a specific pattern, small RNA fragment emerges (tRFs). tRFs are found in several species, including Arabidopsis thaliana. It seems that these tRNA fragments are part of a new RNAi pathway. However, its biological role has not been reveal yet. The aim of this work is to evaluate the possible role(s) of DNMT2 in plant development and stress response and also establish its possible role in tRNA protection. So far we demonstrated that AtDNMT2 has both nuclear and cytoplasmic cellular localization and can also be visualized in what seen to be the cytoskeleton. We determined that AtDNMT2 does not play role in tRNA AspGTC protection under oxidative stress, though AtDNMT2 is up regulated in different stresses. The mutant plant Atdnmt2 does not have obvious phenotype, what makes harder to understand its biological role, leading us to deeper molecular studies. In this context, the present work reveals...ItemTese de doutorado Análise funcional e evolutiva do cromossomo B em Astyanax paranae (Characiformes, Characidae)(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-02-26) Silva, Duílio Mazzoni Zerbinato de Andrade; Foresti, Fausto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Cerca de 15% dos organismos eucariotos possuem elementos genômicos adicionais dispensáveis chamados cromossomos B. Na maioria dos casos a composição e os efeitos da presença destes cromossomos é desconhecida. Estes elementos estão presentes em diversas espécies de peixes do gênero Astyanax. Assim, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar a composição do cromossomo B de A. paranae, bem como os efeitos da presença deste cromossomo nesta espécie e sua relação com cromossomos B de espécies próximas. Foram identificados sete genes codificadores de proteínas no cromossomo B de A. paranae, dos quais quatro mostraram expressão diferencial nos ovários de fêmeas 0B e 1B. Além disto, quatro destes genes estão presentes nos cromossomos B de A. fasciatus e de A. bockmanni. Desta forma, nós concluímos que o cromossomo B de A. paranae interfere na expressão dos genes que carrega em seu próprio benefício e possui uma origem comum com cromossomos B encontrados em outras espécies de Astyanax. Além deste objetivo principal do trabalho, também foi realizada uma análise do DNA mitocondrial de A. paranae e, por extensão, dos vertebrados em geral. Esta análise revelou inicialmente que o conteúdo de bases do DNA mitocondrial dos vertebrados tende a um padrão comum. Adicionalmente, foi possível distinguir grupos entre as classes de vertebrados com conteúdos semelhantes na composição de bases do DNA mitocondrial, indicando que a evolução do DNA destas organelas poderia estar relacionada às características biológicas de cada grupo, como modo de respiração, ocupação do meio terrestre ou aquático, modo de vida em água doce ou salgada e taxa metabólica dos organismos.ItemTese de doutorado Análise genética da reposição de estoques de peixes na bacia do rio Sapucaí-Mirim (SP): Implicações na conservação(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-07-27) Mendonça, Bruna Bueno [UNESP]; Porto-Foresti, Fabio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Múltiplos fatores antropogênicos têm causado grande interferência nos ecossistemas aquáticos continentais, entre eles estão os represamentos dos rios. As alterações causadas por essas construções afetam profundamente populações de peixes, podendo levar até mesmo a extinção das espécies que não apresentam adaptação às alterações provocadas nestes ecossistemas. Assim, ação como o repovoamento através do supportive breeding tem sido empregada a fim de manter populações naturais vulneráveis. Porém, no Brasil, poucos trabalhos de soltura de alevinos levam em conta características genéticas para a formação dos estoques de reprodutores. Além disso, poucos trabalhos de repovoamento se preocupam com a eficiência destes, não havendo monitoramento da diversidade genética dos indivíduos liberados pós-soltura. O presente estudo empregou loci microssatélites a fim de acessar a diversidade e estrutura genética de populações de Astyanax altiparanae em Pequenas Centrais Hidrelétricas (PCHs), no rio Sapucaí-Mirim de 2015 a 2017, onde ocorre soltura de alevinos desde 2011. Além disso, foi proposto o uso de marcadores microssatélites, como ferramentas para auxiliar na formação de banco de reprodutores e estimar o índice de recaptura de indivíduos provenientes de estoques de cultivo provenientes de repovoamentos em populações naturais. Os bancos de reprodutores analisados dos anos de 2015 e 2016 mostram que os indivíduos que compõem esse banco apresentam alta diversidade genética (A = 24, 35; AR = 16,27; HE = 0,856), com valores do índice de fixação (Fis) variando de 0,146 a 0,207 (P-value = 0, 007). O estoque de 2015 apresentou desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg para a maioria dos loci. Isto sugere junto com os valores do Fis, que este estoque pode apresentar indivíduos pertencentes a diferentes populações, o que indica necessidade da distinção dos reprodutores de acordo com cada PCH respeitando essa diferenciação genética. As analises das diferentes populações da natureza ao longo do ano de 2015 a 2017 também revelaram alta diversidade genética (A = 23,26, AR = 11,78, HE = 0,918), não mostrando diminuição destes índices ao decorrer dos anos. Os valores de Fis variaram de 0,120 a 0,225 (P-value = 0, 007) e os valores de estruturação genética (Fst) variaram de 0 a 0, 023 (P-value = 0,0018). As análises de diversidade genética somada e as de estruturação sugerem que estas populações podem estar sendo homogeneizadas pela soltura de indivíduos provenientes do mesmo estoque. Além disso, os microssatélites se mostraram ferramentas eficientes para o monitoramento de estoques de reprodutores bem como para a estimativa de recaptura em solturas do rio Sapucaí-Mirim, demonstrando recaptura de 0,19 a 0,79%. Desta forma, o presente trabalho demonstra a importância do uso de marcadores moleculares, como os microssatélites, na estimativa da diversidade genética e dos níveis de parentesco em programas de repovoamento a fim de propor o manejo adequado das diferentes populações e identificar os efeitos destes programas.ItemTese de doutorado Análise modular de dados de expressão para avaliação de múltiplos tumores com auxílio de métodos heurísticos(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-26) Seco, Giordano Bruno Sanches; Rybarczyk Filho, José Luiz [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Os grandes avanços nas ciências biológicas, especialmente na área das ciências ômicas, tem permitido aos pesquisadores realizar a coleta de grandes quantidades de dados biológicos. O TCGA (The Cancer Genome Atlas) é uma base de dados online que contém dados de diversos tipos de tumores e níveis de informação biológica, como por exemplo: expressão de mRNA (RNA-seq), expressão de microRNA (miRNA; miRseq) e metilação. Apesar das possibilidades que essa abundância de dados traz para os pesquisadores, tal área ainda carece de métodos de integração desses dados. O objetivo desta tese é o desenvolvimento de uma metodologia integrativa para avaliação de tecidos tumorais com o uso de três níveis de informação biológica (dados de RNA-seq, metilação e miRNA). Essa metodologia é baseada em machine learning não supervisionado, para obter um mapa modular que é composto por tumores e seus processos biológicos. Os processos biológicos foram prospectados do Gene Ontology e avaliados os níveis de profundidade de cada processo biológico para os módulos, bem como a frequência média de sondas induzidas ou reprimidas dos processos. Por meio de análise estatística, foi possível elaborar os mapas modulares que foram capazes de determinar vias biológicas de importância geral em 32 tumores. Tais achados envolvem vias como: síntese e transporte de lipídios, regulação da metilação, fibrinólise, regulação da atividade transcricional, transição epitélio-mesênquima, homeostase iônica, regulação de receptores de células do sistema imune e regulação de vias de sinalização mediadas por proteínas tirosina quinase. Foi realizada também uma análise mais específica do tumor mamário (BRCA),com auxílio de redes mRNA-mRNA (RNAseq e metilação) e miRNA-mRNA (miRseq). Esta última análise, conseguiu demonstrar que o tumor mamário tinha como alteradas, principalmente, as vias de diferenciação e desenvolvimento tecidual, efluxo de colesterol, angiogênese e vascularização. Em especial, a metodologia foi capaz de determinar genes e miRNAs cuja expressão ou metilação apresentam-se significantemente induzidos ou reprimidos nos dados como: o AR, ARHGDIG, PPARG, SUMO1 e o STAT3. Saliento que essa é uma metodologia de análise exploratória alternativa desenvolvida para reaproveitamento de grandes quantidades de dados biológicos. Especialmente quando esses dados não apresentem paridade caso/controle, o que dificulta a realização da análise de expressão diferencial, considerada como padrão ouro.ItemTese de doutorado Análise molecular de pacientes com holoprosencefalia(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015-02-12) Gamba, Bruno Faulin [UNESP]; Ribeiro-Bicudo, Lucilene Arilho [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Craniofacial anomalies are skull development changes and face that may or may not be accompanied by structural malformations and / or functional CNS. These represent the fourth most common cause among the congenital anomalies in newborns, determining, among the patients, poor prognosis in most cases. Holoprosecephaly is a malformation of the central nervous system due to a fault in the division of right and left hemispheres of the brain. It is known that the etiology is multiple and complex. The HPE phenotype is variable including a continuous spectrum from severe manifestations involving abnormalities of the brain and face to clinically normal individuals. Genetics evidences are presented every year by groups studying holoprosencephaly and the genotype/phenotype remains a challenge for geneticists. We analyzed ADN samples from 124 patients with clinical diagnosis for holoprosencephaly. All ADNs samples were subjected to molecular analysis by MLPA technique ( SALSA® MLPA® KIT -B1 holoprosencephaly P187 and P036 SALSA® MLPA® KIT - Human telomere -E1 -3). Thus, we identified deletions / duplications in genes already described for HPE, such as: three deletions in the SHH gene, one deletion of the TGIF gene and one duplication in ZIC2 gene. Among the 124 samples, 26 ADN samples were selected for analysis by arrayCGH allowing the identification of microdeletions/microduplications in new chromosomal regions: 2p25.2 - p25.1, 2p21, 8p23.2, 10p15.3, 13q14.2 and Xq13.3. MLPA and arrayCGH are often used in research on the etiology of HPE, in that way the efficiency of these techniques, since the methodology used in this study allowed the identification of deletions / duplications in chromosome individuals studied, corroborating the literature and identinfy new chromosomal regions to be elucidated to understand the etiology of this diseaseItemTese de doutorado Análise molecular de pacientes com síndromes de Smith-Magenis(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2011-03-03) Vieira, Gustavo Henrique [UNESP]; Moretti-Ferreira, Danilo [UNESP]; Srivastava, Anand Kumar [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)A síndrome de Smith-Magenis (SMS) foi descrita , em 1986, como uma síndrome que envolvia uma mutação na região 17p em 9 pacientes. Sua prevalência esta estimada em um caso a cada 25.000 nascidos vivos. A SMS apresenta fenótipo que inclui características físicas, no desenvolvimento e comportamentais. Os sinais faciais se caracterizam por uma face larga e de forma quadrangular, braquicefalia, frontal proeminente, sinofre, fendas palpebrais alongadas para cima, ponte nasal larga, hipoplasia de face média, nariz largo e achatado, micrognatia na infância com relativa prognatia com a idade e lábio superior protruso e em „v‟ invertido. Os sinais clínicos mais importantes na SMS são comportamentais que levam a autoagressão, hiperatividade e déficit atenção. Foram estudados 31 pacientes brasileiros com suspeita diagnóstica de SMS. As análises genéticas realizadas para avaliar este grupo incluíram técnicas de citogenética molecular (FISH), aCGH, PCR quantitativa e busca por mutações na região de transcrição do gene RAI1. Os resultados demostraram que mais de 90% dos casos neste estudo tinham deficiência mental, atraso no desenvolvimento da fala e comportamento de auto-injúria. Além disso, 30% (9/30) tiveram deleção ou mutação de ponto na região 17p11.2 e RAI1 gene, sendo que 67% apresentaram uma deleção clássica (6/9), 11% tinham uma deleção atípica (1/9) e 22% (2/9) tinham uma mutação no gene RAI1. Foi possível determinar o ponto de quebra das deleções observadas e determinar os genes envolvidos. A deleção atípica descrita neste trabalho atingiu parte do gene RAI e até o momento não havia sido descrita. Além disso, duas mutações de ponto, no exon 3 do gene foram descritas. Por fim, dentro grupo estudado, foi diagnosticado um caso com síndrome da deleção 1p36, sendo possível a sugestão de um novo...ItemTese de doutorado Análises cromossômicas e genômicas aplicadas ao estudo evolutivo e estrutural dos satelitomas em espécies do gênero Gymnotus (Teleostei, Gymnotiformes)(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-19) Melo, Silvana de; Foresti, Fausto [UNESP]; Utsunomia, Ricardo; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Um dos tipos mais abundantes de DNA repetitivo, o DNA satélite, apresenta importantes aspectos estruturais e evolutivos, como o acúmulo diferencial entre espécies próximas e taxas de evolução molecular variadas. O satelitoma, identificado como o conjunto total de DNAs satélites (satDNA) de determinado organismo, permite uma investigação mais aprofundada em abundância e riqueza desses elementos repetitivos entre espécies, mas ainda é de conhecimento restrito entre espécies de peixes. Mapeamentos prévios de DNA repetitivo no gênero Gymnotus evidenciaram uma ampla diversificação na distribuição dessas sequências no genoma do grupo, todavia é restrita a porção de DNA repetitivo reportado pela limitação de metodologias passadas. Dessa forma, a associação recente de plataformas de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) com análises de bioinformática proporcionam um acesso mais refinado ao genoma, permitindo a anotação de um maior número de elementos repetitivos nos componentes desse grupo. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar a evolução do DNA satélite e a distribuição física de famílias de satDNAs em espécies de peixe elétrico do gênero Gymnotus, a partir da construção do satelitoma dos grupos. Os genomas das espécies dos principais clados de Gymnotus foram acessados e a metodologia de filtragem pela plataforma RepeatExplorer e satMiner permitiu a identificação do satelitoma em cada um dos grupos abordados, caracterizando massivamente as famílias de satDNAs dentro de complexos de espécies diferentes em Gymnotus, destacando os processos de diferenciação genética, a evolução e a dinâmica destas sequências entre representantes do grupo.ItemTese de doutorado Análises da competência vetorial e associação global do genoma em mosquitos Aedes aegypti da cidade de Botucatu infectados com Dengue vírus(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-05-30) Oda, Leticia Tiemi Egami; Souza Neto, Jayme Augusto de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)Dengue é a arbovirose de maior crescimento nos últimos anos, repercutindo em impactos sociais e econômicos devido às altas taxas de morbidade e mortalidade desencadeadas pela infecção. O vírus dengue tem como principal vetor o mosquito Aedes aegypti. Por apresentar hábito hematofágico, antropofílico, de rápido desenvolvimento, é um excelente transmissor do vírus. Medidas de controle estão restritas à eliminação do mosquito vetor, uma vez que um tratamento específico ou uma vacina não estão disponíveis à população. E uma característica que determina a disseminação de doenças é a alta competência vetorial de seus mosquitos vetores, a qual tem sido associada à fatores genéticos do mosquito e ambientais. Sabe-se que a variabilidade genética dos mosquitos é um dos fatores que pode determinar o sucesso da relação mosquito-patógeno específico. Com isso, no presente trabalho foram estudadas as competências vetoriais de mosquitos Aedes aegypti da cidade de Botucatu infectados com DENV-2 e DENV-4 a fim de entender melhor a competência vetorial desses mosquitos. Além disso, foram feitas tentativas para selecionar linhagens resistentes e susceptíveis desses mosquitos infectados com ambos os sorotipos. Os mosquitos infectados com DENV-2 foram genotipados pela metodologia de SNP chip e posteriormente foram realizadas análises de estudo global do genoma (GWAS) afim de encontrar fatores genéticos relacionados com os diferentes fenótipos susceptível e resistente dos mosquitos. Como resultados observou-se diferentes competências vetoriais dos mesmos mosquitos infectados com diferentes sorotipos. Os mosquitos infectados com DENV-2 foram aproximadamente 70% susceptíveis, e mosquitos infectados com DENV-4 aproximadamente 70% foram resistentes, possuindo assim competências vetoriais opostas. Já no estudo da seleção dos fenótipos foi possível uma seleção de 80% até a geração F3 de mosquitos infectados com DENV-2, apesar do número baixo de indivíduos nas seleções. Os mosquitos infectados com DENV-4 não obtiveram uma taxa de seleção muito elevada, visto que as seleções foram feitas só até a geração F-2. Os resultados das análises de GWAS mostraram possíveis associações dos SNPs com os fenótipos estudados, apesar de não serem estatisticamente significantes para a correção de Bonferroni. Com isso, concluímos que a diferença vetorial é bastante dependente do sorotipo viral; para as análises de seleção e formação de linhagem é necessário um maior número de indivíduos nas primeiras infecções; e no estudo GWAS apesar da associação não ter sido significativa, devido ao baixo número de indivíduos, e dos parâmetros de correção estatística não serem ideais para indivíduos de uma única população, acredita-se que as associação encontradas de alguns SNPs com os fenótipos estudados sejam verdadeiras.