Bioatividade de flavonoides sobre células pulpares humanas sensibilizadas por lipopolissacarídeos e associação com scaffolds fibrilares para modulação da dentinogênese em ambiente inflamatório degenerativo

Reversing a pro-inflammatory microenvironment into a regenerative one remains a challenge in Vital Pulp Therapy (VPT) for teeth with carious pulp exposure. This thesis investigates the inflammatory modulation and metabolism of human dental pulp cells (hDPCs) sensitized by lipopolysaccharides (LPS), along with the effect of flavonoids in this context. It also evaluates the incorporation of flavonoids into a polycaprolactone/nano-hydroxyapatite (PCL/nHA) fibrous scaffold, aiming at the release of the molecule for inflammatory modulation and induction of dentinogenesis in a degenerative environment. In Study 1, hDPCs (N = 4 donors) were continuously exposed to E. coli LPS (0.1, 1, and 10 µg/mL) for 7 days to simulate chronic inflammation. Sustained decreases in viability, NF-κB pathway activation, increased reactive oxygen species (ROS), upregulation of IL8, IL6, TNF, and IL1B, along with downregulation of COL1A1, ALPL, DSPP, and DMP1, were observed, resulting in reduced mineral deposition and impaired regenerative potential. In Study 2, the flavonoids quercetin (QU), hesperetin (HT), and taxifolin (TX) (1–100 µM) were tested in healthy and LPS-sensitized hDPCs (10 µg/mL). Concentrations of 5 µM QU, 10 µM HT, and 100 µM TX were cytocompatible and, in healthy hDPCs, stimulated biomineralization. Under LPS challenge, they enhanced viability and dentinogenic differentiation, reduced ROS and inflammatory mediators, promoted cell migration, inhibited NF-κB, and intensified biomineralization compared with LPS alone. Among them, HT displayed the most promising profile, combining inflammatory modulation with regenerative stimulation. In Study 3, PCL/nHA scaffolds were produced by electrospinning, either subjected or not to alkaline hydrolysis (H-), and functionalized or not with HT, yielding four groups: PCL/nHA, PCL/nHA+HT, H-PCL/nHA, and H-PCL/nHA+HT. Hydrolysis increased hydrophilicity, HT adsorption, and short-term release (~18 µM within 7 days), while enhancing calcium release without compromising scaffold structure for up to 120 days. H-PCL/nHA+HT promoted higher hDPC migration, fibronectin deposition, proliferation, dentinogenic marker expression, and matrix mineralization. In RAW 264.7 macrophages, it reduced TNF-α, IL-1β, and nitrite production. In a 3D pulp capping model under chronic inflammation, it downregulated pro-inflammatory markers and upregulated pro-resolutive and dentinogenic markers, favoring the regenerative profile of hDPCs. In vivo, HT-releasing scaffolds showed good tissue integration, reduced inflammatory infiltration, early M2-skewed macrophage polarization, and well-organized extracellular matrix deposition. Taken together, this thesis demonstrates that the in vitro model of chronic LPS exposure partially reproduces the degenerative inflammatory environment, in which the metabolism of hDPCs is impaired. The release of HT from fibrous scaffolds proved feasible, providing a multifunctional platform capable of coordinating immune response and odontogenic differentiation, offering a promising strategy for dentin-pulp complex regeneration under prolonged inflammatory conditions.

Resumo (português)

A reversão de um microambiente pró-inflamatório para um ambiente regenerativo permanece um desafio nos procedimentos de Terapia Pulpar Vital (TPV) em dentes com exposição pulpar por cárie. Esta tese investigou a modulação inflamatória e o metabolismo de células pulpares humanas (hDPCs) sensibilizadas por lipopolissacarídeos (LPS), e o efeito de flavonoides nesse cenário. Também avaliou a incorporação de flavonoide em scaffold fibrilar de policaprolactona/nano-hidroxiapatita (PCL/nHA) visando a liberação da molécula para modulação inflamatória e indução da dentinogênese em ambiente degenerativo. No Estudo 1, hDPCs (N=4 doadores) foram expostas continuamente a LPS de E. coli (0,1, 1 e 10 µg/mL) por 7 dias, simulando inflamação crônica. Observou-se queda sustentada de viabilidade, ativação da via NF-κB, aumento de espécies reativas de oxigênio (EROS), elevação de IL8, IL6, TNF e IL1B, redução de COL1A1, ALPL, DSPP e DMP1, com menor deposição mineral, caracterizando comprometimento regenerativo. No Estudo 2, os flavonoides quercetina (QU), hesperetina (HT) e taxifolina (TX) (1–100 µM) foram avaliados em hDPCs sensibilizadas ou não por LPS (10 µg/mL). As concentrações de 5 µM QU, 10 µM HT e 100 µM TX mostraram-se citocompatíveis e, em hDPCs saudáveis, estimularam biomineralização. Sob desafio com LPS, aumentaram viabilidade e diferenciação dentinogênica, reduziram EROS e mediadores inflamatórios, promoveram migração celular, inibiram NF-κB e intensificaram a biomineralização em comparação ao LPS isolado. A HT apresentou o perfil mais promissor, combinando modulação inflamatória e estímulo regenerativo. No Estudo 3, scaffolds PCL/nHA foram produzidos por eletrofiação, submetidos ou não à hidrólise alcalina (H-), e funcionalizados ou não com HT, formando quatro grupos: PCL/nHA, PCL/nHA+HT, H-PCL/nHA e H-PCL/nHA+HT. A hidrólise aumentou a hidrofilia, a adsorção de HT e a liberação modulada (~18 µM em 7 dias), além de potencializar a liberação de cálcio sem comprometer a estrutura do scaffold por 120 dias. O H-PCL/nHA+HT promoveu maior migração de hDPCs, deposição de fibronectina, proliferação, expressão de marcadores dentinogênicos e mineralização da matriz. Em macrófagos RAW 264.7, reduziu TNF-α, IL-1β e nitrito. No modelo 3D de capeamento pulpar sob inflamação crônica, reduziu marcadores pró-inflamatórios e aumentou marcadores pró-resolutivos e dentinogênicos, indicando favorecer o perfil regenerativo das hDPCs. In vivo, os scaffolds com liberação de HT apresentaram boa integração tecidual, redução do infiltrado inflamatório, polarização precoce de macrófagos para o fenótipo M2 e deposição organizada de matriz extracelular. De forma integrada, esta tese demonstra que o modelo in vitro de exposição crônica a LPS reproduz, em parte, o ambiente inflamatório degenerativo, no qual há comprometimento do metabolismo de hDPCs. A liberação modulada de curto prazo de HT em scaffolds fibrilares mostrou-se viável, proporcionando uma plataforma multifuncional capaz de coordenar a resposta imune e a diferenciação odontoblástica, oferecendo uma estratégia promissora para a regeneração do complexo dentina-polpa em condições inflamatórias prolongadas.

Palavras-chave

Flavonoides, Lipopolissacarídeos, Pulpite, Regeneração tecidual guiada, Nanofibras, Flavonoids, Lipopolysaccharides, Pulpitis, Guided tissue regeneration, Nanofibers