Otimização de protocolo de extração de RNA para transcriptoma da chuva de sementes de plantas nativas

Abstract

O isolamento de RNA (Ácido Ribonucleioco) de alta qualidade é requisito básico para construção de transcriptomas. Porém, a boa extração de RNA vegetal é desafiadora, pois as plantas são ricas em metabólitos secundários, afetando a integridade e pureza do RNA, que é uma molécula instável. A falta de estudos e especificações sobre extração de RNA em plantas silvestres representa uma lacuna na construção de transcriptoma, que limita a nossa compreensão dos processos genéticos e a base molecular de fenótipos. Portanto, isolar o RNA de folhas demanda ajustes nos protocolos, exigindo procedimentos específicos para cada espécie. Os objetivos da pesquisa foram otimizar o protocolo de isolamento de RNA de folhas de plantas nativas da Mata Atlântica com frutos consumidos e dispersos por aves e obter RNA íntegro e puro para sequenciamento transcriptômico. Foram coletadas folhas de cinco indivíduos das espécies Allophylus edulis, Cupania vernalis, Guarea kunthiana, Lacistema hasslerianum, Pera glabrata e Schinus terebinthifolia, em fragmentos de Mata Atlântica, em Paranapanema/SP. Para as extrações e purificações de RNA, foram utilizados quatro protocolos de extração. As extrações foram quantificadas em Nanodrop (ng/μL) e validadas quanto à integridade das amostras por RIN (RNA Integrity Number) e enviadas para a construção de transcriptoma. As espécies P. glabrata (x̄ : 176,04 ng/μL e 6.44 de RIN), G. kunthiana (x̄ 55,26 ng/μL e 5.72 de RIN), C. vernalis (x̄ 44,68 ng/μL e 6.54 de RIN), L. hasslerianum (x̄ : 55,26 ng/μL de 6.16 de RIN) e A. edulis (x̄ 148,68 ng/μL e 6.52 de RIN ) apresentaram bons resultados de quantidades e integridades com as adaptações de protocolos realizados, aptos para a montagem dos transcriptomas. A espécie S. terebinthifolia não obteve pureza ou quantidade suficientes para a construção de transcriptoma. Ainda assim, muitas espécies nativas precisam de mudanças especificas no protocolo devido suas especificidades metabólicas.

The isolation of high-quality RNA (Ribonucleic Acid) is a basic requirement for transcriptome assembly. However, plant RNA extraction is challenging, since plants are rich in secondary metabolites, which affect the integrity and purity of RNA, an inherently unstable molecule. The lack of studies and specifications on RNA extraction in wild plants represents a gap in transcriptome construction, limiting our understanding of genetic processes and the molecular basis of phenotypes. Therefore, isolating RNA from leaves requires adjustments to protocols, demanding specific procedures for each species. The objectives of this research were to optimize the RNA isolation protocol from leaves of native Atlantic Forest plants with fruits consumed and dispersed by birds, and to obtain intact and pure RNA for transcriptome sequencing. Leaves were collected from five individuals of the species Allophylus edulis, Cupania vernalis, Guarea kunthiana, Lacistema hasslerianum, Pera glabrata, and Schinus terebinthifolia in fragments of Atlantic Forest in Paranapanema/SP. For RNA extractions and purifications, four extraction protocols were used. Extractions were quantified in Nanodrop (ng/μL) and validated for sample integrity by RIN (RNA Integrity Number), then sent for transcriptome construction. The species P. glabrata ( x̄ ng/μL and 6.44 RIN), G. kunthiana ( x̄ : 176.04 : 55.26 ng/μL and 5.72 RIN), C. vernalis ( x̄ ng/μL and 6.54 RIN), L. hasslerianum ( x̄ : 44.68 : 55.26 ng/μL and 6.16 RIN), and A. edulis ( x̄ : 148.68 ng/μL and 6.52 RIN) showed good results in terms of quantity and integrity with the adapted protocols, being suitable for transcriptome assembly. The species S. terebinthifolia did not yield sufficient purity or quantity for transcriptome construction. Nevertheless, many native species still require specific adjustments to protocols due to their metabolic particularities.