Detecção e caracterização dos gêneros de coronavírus (Delta e Gammacoronavírus) em aves selvagens no litoral paranaense

Abstract

O grupo dos coronavírus (CoV) está associado a importantes doenças aviárias. As aves silvestres são hospedeiras potenciais e amplamente distribuídas desses vírus. Entre os animais que habitam ambientes aquáticos, as aves representam o grupo com a maior diversidade de CoVs, com múltiplas variedades já identificadas geneticamente. Embora o Brasil concentre cerca de 18% da diversidade global de espécies aviárias, os estudos sobre os tipos de CoV em aves silvestres na América do Sul continuam escassos. Diante disso, o objetivo geral deste projeto é detectar e caracterizar molecularmente os gêneros de CoV - Gamma e/ou Delta - em aves silvestres provenientes do litoral paranaense. Nesse contexto, amostras de swabs, constituídas principalmente por material proveniente da coana e da cloaca, foram coletadas, e o RNA total foi extraído pelo método Trizol. Posteriormente, o RNA foi utilizado como molde na reação de transcrição reversa, empregando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. O material obtido foi submetido à técnica de Nested-PCR, realizada no equipamento Veriti Thermal Cycler. Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,4%. O sequenciamento foi conduzido pela técnica de Sanger, na qual os amplicons positivos foram preparados utilizando o BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit e os primers da nPCR (N2-F e N2-R), sendo posteriormente lidos no sequenciador capilar Spectrum Compact CE System. Foram analisadas 626 amostras, das quais as coletas e testagens foram realizadas em 2024 e incluíram predominantemente indivíduos juvenis, além de alguns adultos, filhotes e indivíduos de idade indeterminada. A maioria dos indivíduos (n = 301) contribuiu com mais de uma amostra, enquanto 24 indivíduos forneceram apenas uma amostra, totalizando 325 indivíduos incluídos no estudo. As amostras foram compostas por 313 swabs orais (50,0%), 292 swabs cloacais (46,6%), 19 swabs anais (3,0%), um swab retal (0,1%) e um swab intestinal (0,1%). As ordens de aves amostradas foram: Procellariiformes (52; 16,0%), Charadriiformes (73; 22,4%), Suliformes (89; 27,3%), Pelecaniformes (5; 1,5%) e Sphenisciformes (106; 32,6%). Interessantemente, no total nove amostras foram positivas para CoV, sendo cinco (55,6%) provenientes de Charadriiformes, três (33,3%) de Suliformes e um (11,1%) de Procellariiformes. Entre as espécies positivas, destacam-se Larus dominicanus (Charadriiformes – gaivotão), Sula leucogaster (Suliformes – atobá-pardo) e Thalassarche melanophris (Procellariiformes – albatroz-de-sobrancelha). Das amostras positivas, oito (88,9%) foram obtidas da cloaca e apenas uma (11,1%) da cavidade oral. De nota, o sequenciamento revelou que quatro amostras apresentaram alta similaridade com delta CoV previamente descritos na literatura. Considerando o hábito migratório das aves e o contato frequente que têm com outras espécies, se faz necessário ampliar estudos de monitoramento epidemiológico, sobretudo na América do Sul. Dessa forma, é possível elucidar aspectos da epidemiologia viral, compreender rotas migratórias e avaliar a proximidade das aves com áreas urbanas, pois podem apresentar potencial risco a saúde humana.

The coronavirus (CoV) group is associated with important avian diseases. Wild birds are potential and widely distributed hosts of these viruses. Among animals that inhabit aquatic environments, birds represent the group with the greatest diversity of CoVs, with multiple genetically identified varieties. Although Brazil encompasses about 18% of the global diversity of bird species, studies on the types of CoV in wild birds in South America remain scarce. In light of this, the overall objective of this project is to detect and molecularly characterize the CoV genera—Gamma and/or Delta—in wild birds from the coast of Paraná. In this context, swab samples, consisting mainly of material from the choana and cloaca, were collected, and total RNA was extracted using the Trizol method. Subsequently, the RNA was used as a template in the reverse transcription reaction, employing the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. The resulting material was subjected to the Nested-PCR technique, performed in a Veriti Thermal Cycler. The amplified products were analyzed by electrophoresis on a 1.4% agarose gel. Sequencing was carried out using the Sanger technique, in which positive amplicons were prepared with the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit and the nPCR primers (N2-F and N2-R), and were subsequently read in the Spectrum Compact CE System capillary sequencer. A total of 626 samples were analyzed, collected and tested in 2024, predominantly from juvenile individuals, as well as some adults, chicks, and birds of undetermined age. Most individuals (n = 301) contributed more than one sample, whereas 24 individuals provided only a single sample, totaling 325 individuals included in the study. The samples consisted of 313 oral swabs (50.0%), 292 cloacal swabs (46.6%), 19 anal swabs (3.0%), one rectal swab (0.1%), and one intestinal swab (0.1%). The bird orders sampled were: Procellariiformes (52; 16.0%), Charadriiformes (73; 22.4%), Suliformes (89; 27.3%), Pelecaniformes (5; 1.5%), and Sphenisciformes (106; 32.6%). Interestingly, a total of nine samples tested positive for CoV, with five (55.6%) originating from Charadriiformes, three (33.3%) from Suliformes, and one (11.1%) from Procellariiformes. Among the positive species, noteworthy examples include Larus dominicanus (Charadriiformes – kelp gull), Sula leucogaster (Suliformes – brown booby), and Thalassarche melanophris (Procellariiformes – black-browed albatross). Of the positive samples, eight (88.9%) were obtained from the cloaca and only one (11.1%) from the oral cavity. Notably, sequencing revealed that four samples showed high similarity to deltaCoV previously described in the literature. Considering the migratory habits of birds and their frequent contact with other species, it is necessary to expand epidemiological monitoring studies, particularly in South America. This would make it possible to elucidate aspects of viral epidemiology, understand migratory routes, and assess the proximity of birds to urban areas, as they may pose a potential risk to human health.