Padronização e validação da técnica de pcr em tempo real para detecção de Mycobacterium bovis e Mycobacterium tuberculosis em linfonodos de bovinos

Abstract

Um protocolo de coleta, extração e amplificação de ácidos nucléicos (ANs) utilizando a técnica de PCR em tempo real para detecção de Mycobacterium bovis (M. bovis) e/ou Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) foi testado em 60 linfonodos provenientes de bovinos. Desses 60, 30 foram provenientes de bovinos suspeitos de tuberculose bovina (TBb), outros 30 apresentavam lesões nodulares classificadas como adenite pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF), na linha de abate. Os resultados obtidos demonstraram que dos 30 linfonodos coletados suspeitos de TBb, 24 (80%) foram confirmados positivos para M. bovis e/ou M. tuberculosis e seis (20%) foram confirmados negativos. Dos 30 linfonodos com a presença de lesões nodulares do tipo adenite, 13 (43,33%) foram positivos para TBb e 17 (56,66%) foram negativos para TBb. Não há um teste diagnóstico rápido e preciso para detecção da TBb, diante disso o presente estudo desenvolveu um método de diagnóstico para a TBb baseado em PCR em tempo real com análise da fluorescência do corante SYBR Green. Estes resultados indicaram que o PCR em tempo real foi específico e sensível para a detecção e identificação dos dois alvos selecionados para detectar a TBb, com melhores resultados para o DNA genômico, quando comparado com o RNA ribossômico. O teste padronizado de qPCR para o diagnóstico da TBb permitiu uma maior acurácia e significativa redução do tempo de diagnóstico em relação aos métodos tradicionais de identificação da TBb.

A protocol for the collection, extraction and amplification of nucleic acids (ANs) using a PCR technique for detection of Mycobacterium bovis (M. bovis) and / or Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) was tested on 60 bovine-derived lymph nodes. . Of these 60, 30 were included in cattle suspected of having bovine tuberculosis (TBb), another 30 had sclerias classified as adenites by the Federal Inspection Service (SIF), at the slaughter line. The results showed that the 30 lymph nodes with suspected TBb, 24 (80%) were confirmed positive for M. bovis and / or M. tuberculosis and six (20%) were confirmed negative. Of the 30 lymph nodes with adenitis nodular lesions, 13 (43.33%) were positive for TBb and 17 (56.66%) were negative for TBb. TBB, together with the present study for a diagnostic method for TBB, is a real-time test with SYBR Green dye fluorescence analysis. Results compared with real-time PCR were specific and sensitive for the identification and identification of the two targets selected to detect a TBb, with samples obtained for genomic DNA, when observed with ribosomal RNA. The standardized qPCR test for the diagnosis of tuberculosis allowed for greater accuracy and a significant reduction in diagnosis time in relation to TBb identification parameters.