Estudo in vitro de infecção das membranas corioamnióticas com espécies bacterianas de difícil cultivo detectadas no trato genital inferior: modulação da resposta imune na interface materno-fetal
Carregando...
Arquivos
Data
2017-08-28
Autores
Nicolau, Nathália Mayumi Noda [UNESP]
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
Introdução: A infecção da cavidade amniótica e inflamação são associadas com o parto pré-termo espontâneo. Em geral, essas infecções são polibacterianas e causadas principalmente pela ascensão bacteriana do trato genital inferior. Dessa forma, a invasão microbiana da cavidade amniótica e o risco do parto pré-termo estão frequentemente relacionados à colonização vaginal por diferentes espécies bacterianas, incluindo aquelas de difícil cultivo, como micoplasmas genitais. Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis são as principais bactérias isoladas no líquido amniótico de gestações complicadas por parto pré-termo com membranas íntegras ou na presença de rotura prematura de membranas pré-termo. Além dos micoplasmas genitais, Gardnerella vaginalis merece destaque por ser a principal bactéria do core patológico da vaginose bacteriana e por estar associada ao risco de parto pré-termo. Dessa forma, considerando que a infecção da cavidade amniótica é de natureza polibacteriana, mimetizar esse cenário em membranas fetais in vitro se torna ferramenta importante para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos no parto pré-termo. Objetivo: Avaliar a modulação da resposta imune induzida pela interação entre micoplasmas genitais e G. vaginalis nas membranas corioamnióticas in vitro. Material e Métodos: Para a estimulação da cultura in vitro, foram coletadas 8 membranas corioamnióticas de gestantes que tiveram a resolução da gestação por cesárea eletiva de termo (≥ 37 semanas de gestação), na ausência de trabalho de parto e/ou rotura prematura de membranas. As culturas das membranas corioamnióticas foram estimuladas com 106 ou 103 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de suspensão bacteriana, inativada pelo calor, diluída em meio de cultura de tecidos com U. urealyticum, M. hominis e G. vaginalis isolados ou em combinação. Amostras de membranas corioamnióticas, apenas com o meio de cultura, sem estímulo bacteriano foram usadas como controle negativo. Como controle positivo foi utilizado o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. Os sobrenadantes obtidos das culturas de membranas corioamnióticas, após 24 horas de estimulação bacteriana, foram avaliados pela tecnologia Luminex® xMAPTM utilizando um painel para as seguintes citocinas e receptores: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. Além disso, pela técnica de ELISA foi avaliado o receptor solúvel sgp130, e por imunohistoquímica, a imunomarcação dos receptores de membrana mIL-6R e gp130 nas células coriônicas e no epitélio amniótico. A análise estatística para os dados de citocinas e receptores solúveis foi feita utilizando modelos de feitos mistos lineares usando a biblioteca Ime4 da linguagem de programação R. Os dados de imunohistoquímica foram avaliadas usando a análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, em que, o valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significante. O software empregados nessas análises foi o GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Resultados: A estimulação das membranas por micoplasmas genitais não aumentou a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), exceto a estimulação com U. urealyticum que aumentou os níveis de IL-8. No entanto, a estimulação com U. urealyticum e M. hominis aumentaram significativamente os níveis de IL-10 e IL-13. A estimulação das membranas corioamnióticas por G. vaginalis isoladamente ou em combinação com micoplasmas genitais resultou em aumento de citocinas pró e anti-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Quanto a produção de IL-6, todos os grupos aumentaram significativamente com relação ao controle não estimulado, com exceção ao estímulo com M. hominis isolado. Já os níveis de sIL-6R aumentaram significativamente somente com estímulo por U. urealyticum isolado ou em combinação com M. hominis. Além disso, o receptor solúvel sgp130 se apresentou em níveis elevados em todos os tratamentos, com exceção do tratamento com G. vaginalis isolada ou na combinação das três espécies bacterianas em cargas iguais. A análise imunohistoquímica mostrou maior imunorreatividade do receptor de membrana mIL-6R apenas nas células do âmnio na presença de LPS e G. vaginalis em comparação com o controle (p <0,0001), mas não para os grupos de M. hominis, U. urealitycum e estimulações polibacterianas. Além disso, o gp130 aumentou estatisticamente nas células do âmnio e cório estimuladas com LPS, G. vaginalis e todos os tratamento polibacterianos. Conclusões: Membranas corioamnióticas in vitro produzem perfil distinto de citocinas e receptores pró e anti-inflamatórios em resposta à estimulação por micoplasmas genitais e G. vaginalis isolados ou em combinação. G. vaginalis estimula resposta pró-inflamatória nas membranas fetais in vitro, que após 24 horas é regulada pela atividade anti-inflamatória da IL-6 através da via de sinalização clássica. Micoplasmas genitais induzem controle da resposta inflamatória pela produção de IL-13, IL-10 e sTNF-R2 favorecendo sua sobrevivência na cavidade amniótica. Além disso, o aumento de IL-6 por si só pode não ser indicativo de qualquer função, uma vez que a sua atividade é controlada por diferentes receptores de membrana e solúveis, sendo que sua produção pelas membranas fetais não deve ser mediador funcional das vias indutoras de trabalho de parto. A tentativa de correlacionar o risco de desfecho gestacional adverso baseado exclusivamente nos níveis de IL-6 em fluidos biológicos, sem considerar os receptores de IL-6, podem ser ineficazes.
Introduction: The intraamniotic infection and inflammation are associated with spontaneous preterm birth (PTB). In general, such infections are polybacterial and caused mainly by ascending bacteria from the lower genital tract. Thus, the microbial invasion of the amniotic cavity (MIAC) and risk of preterm birth is often cervicovaginal colonizers such as genital mycoplasmas, in which Mycoplasma hominis (MH) and Ureaplasma urealyticum (UU) are the most commonly isolated bacteria in the amniotic fluid in both PTB with intact membranes and in preterm premature rupture of membranes (pPROM). In addition, Gardnerella vaginalis, the main microorganism of the pathological core of bacterial vaginosis is also closely associated with the risk of preterm birth. Thus, considering that the infection of the amniotic cavity is polybacterial, mimic this scenario in fetal membranes in vitro becomes an important tool for a better understanding of the mechanisms that trigger preterm delivery. Objective: To evaluate the modulation of the immune response induced by the interaction between genital mycoplasmas and G. vaginalis in chorioamniotic membranes in vitro. Material and methods: For the in vitro culture stimulation, 8 chorioamniotic membranes of pregnant women in term elective cesarean section (≥ 37 weeks gestation) were collected, in the absence of labor and/or premature rupture of membranes. Chorioamniotic membrane cultures were stimulated with 106 or 103UFC of heat inactivated bacterial suspension diluted in tissue culture medium with U. Urealyticum, M. hominis and G. vaginalis alone or in combination. Unstimulated samples were used as control in which was included only culture media without bacteria, and as positive control was used Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli. The supernatants obtained from the chorioamnionic membrane cultures after 24 hours were evaluated by Luminex xMAP technology using a panel for the following cytokines and receptors: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. In addition, the soluble receptor sgp130 was evaluated by the ELISA technique, and by immunohistochemistry we identified membrane receptors, mIL-6R and gp130, in the amnion and chorion cells. Statistical analysis for cytokine and soluble receptors data were performed using linear mixed-effects models using the lme4 library of the R statistical language. Immunohistochemistry data were evaluated using one-way (ANOVA) followed by Tukey's test, in which the value of p <0.05 was considered statistically significant and the software used was GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Results: The stimulation of genital mycoplasmas did not increase the proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), except U. urealyticum that increased IL-8 levels. However, U. urealyticum and M. hominis significantly increased IL-10 and IL-13 levels. G. vaginalis alone or in combination with genital mycoplasmas showed an increased pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Considering the IL-6 production, all groups increased significantly compared to the control, except M. hominis isolated. Moreover, sIL-6R levels increased significantly only in the presence of U. urealyticum alone or in combination with M. hominis. In addition, the soluble sgp130 receptor was elevated in all treatments, except for the treatment with G. vaginalis alone or in combination of the three bacteria in equal loads. Immunohistochemistry analysis showed greater intensity of mIL-6R only in amnion cells in the presence of LPS and G. vaginalis compared to control (p <0.0001) but not for M. hominis, U. urealitycum and polybacterial treatments. In addition, gp130 increased statistically in amnion cells stimulated with LPS, GV and all polybacterial treatments. Conclusions: Chorioamniotic membranes in vitro produce a distinct cytokine and pro- and anti-inflammatory profile in response to stimulation by genital mycoplasmas and G. vaginalis alone or in combination. G. vaginalis sustain a proinflammatory response in the fetal membranes in vitro, in which after 24 hours is regulated by the anti-inflammatory activity of IL-6 through the classical signaling pathway. While genital mycoplasmas induce a control of the inflammatory response, by the production of anti-inflammatory cytokines (IL-13, IL-10, sTNF-R2), favoring their survival in the amniotic cavity. Furthermore, the increase of IL-6 alone may not be indicative of any function, since its activity is controlled by different membrane and soluble receptors, since its production by fetal membranes could not be a functional mediator of the labor-inducing pathways. In summary, the attempt to correlate the risk of adverse gestational outcome based exclusively on IL-6 levels in biological fluids without considering IL-6 receptors may be ineffective.
Introduction: The intraamniotic infection and inflammation are associated with spontaneous preterm birth (PTB). In general, such infections are polybacterial and caused mainly by ascending bacteria from the lower genital tract. Thus, the microbial invasion of the amniotic cavity (MIAC) and risk of preterm birth is often cervicovaginal colonizers such as genital mycoplasmas, in which Mycoplasma hominis (MH) and Ureaplasma urealyticum (UU) are the most commonly isolated bacteria in the amniotic fluid in both PTB with intact membranes and in preterm premature rupture of membranes (pPROM). In addition, Gardnerella vaginalis, the main microorganism of the pathological core of bacterial vaginosis is also closely associated with the risk of preterm birth. Thus, considering that the infection of the amniotic cavity is polybacterial, mimic this scenario in fetal membranes in vitro becomes an important tool for a better understanding of the mechanisms that trigger preterm delivery. Objective: To evaluate the modulation of the immune response induced by the interaction between genital mycoplasmas and G. vaginalis in chorioamniotic membranes in vitro. Material and methods: For the in vitro culture stimulation, 8 chorioamniotic membranes of pregnant women in term elective cesarean section (≥ 37 weeks gestation) were collected, in the absence of labor and/or premature rupture of membranes. Chorioamniotic membrane cultures were stimulated with 106 or 103UFC of heat inactivated bacterial suspension diluted in tissue culture medium with U. Urealyticum, M. hominis and G. vaginalis alone or in combination. Unstimulated samples were used as control in which was included only culture media without bacteria, and as positive control was used Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli. The supernatants obtained from the chorioamnionic membrane cultures after 24 hours were evaluated by Luminex xMAP technology using a panel for the following cytokines and receptors: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF, sIL-1R1, sIL-1R2, sIL-6R, sTNF-R1, sTNF-R2. In addition, the soluble receptor sgp130 was evaluated by the ELISA technique, and by immunohistochemistry we identified membrane receptors, mIL-6R and gp130, in the amnion and chorion cells. Statistical analysis for cytokine and soluble receptors data were performed using linear mixed-effects models using the lme4 library of the R statistical language. Immunohistochemistry data were evaluated using one-way (ANOVA) followed by Tukey's test, in which the value of p <0.05 was considered statistically significant and the software used was GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Results: The stimulation of genital mycoplasmas did not increase the proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-8, TNF-α, GM-CSF), except U. urealyticum that increased IL-8 levels. However, U. urealyticum and M. hominis significantly increased IL-10 and IL-13 levels. G. vaginalis alone or in combination with genital mycoplasmas showed an increased pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, GM-CSF). Considering the IL-6 production, all groups increased significantly compared to the control, except M. hominis isolated. Moreover, sIL-6R levels increased significantly only in the presence of U. urealyticum alone or in combination with M. hominis. In addition, the soluble sgp130 receptor was elevated in all treatments, except for the treatment with G. vaginalis alone or in combination of the three bacteria in equal loads. Immunohistochemistry analysis showed greater intensity of mIL-6R only in amnion cells in the presence of LPS and G. vaginalis compared to control (p <0.0001) but not for M. hominis, U. urealitycum and polybacterial treatments. In addition, gp130 increased statistically in amnion cells stimulated with LPS, GV and all polybacterial treatments. Conclusions: Chorioamniotic membranes in vitro produce a distinct cytokine and pro- and anti-inflammatory profile in response to stimulation by genital mycoplasmas and G. vaginalis alone or in combination. G. vaginalis sustain a proinflammatory response in the fetal membranes in vitro, in which after 24 hours is regulated by the anti-inflammatory activity of IL-6 through the classical signaling pathway. While genital mycoplasmas induce a control of the inflammatory response, by the production of anti-inflammatory cytokines (IL-13, IL-10, sTNF-R2), favoring their survival in the amniotic cavity. Furthermore, the increase of IL-6 alone may not be indicative of any function, since its activity is controlled by different membrane and soluble receptors, since its production by fetal membranes could not be a functional mediator of the labor-inducing pathways. In summary, the attempt to correlate the risk of adverse gestational outcome based exclusively on IL-6 levels in biological fluids without considering IL-6 receptors may be ineffective.
Descrição
Palavras-chave
Parto pré-termo, Micoplasmas genitais, Infecção polibacteriana, Membranas corioamnióticas in vitro, Preterm delivery, Genital mycoplasmas, Polybacterial infection, Chorioamniotic membranes in vitro