Estudo do impacto da função do Fator de Início de Tradução de Eucariotos (eIF5A) no perfil proteômico celular utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae
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Data
2019-09-13
Autores
Barbosa, Natália Moreira [UNESP]
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A sofre uma modificação pós-traducional exclusiva e essencial para sua função, em que um resíduo específico de lisina é convertido em uma hipusina. Apesar eIF5A já ter sido relacionado com o início da tradução, uma quantidade crescente de estudos recentes têm estabelecido sua função na etapa de elongação da tradução, mais especificamente na elongação de sequências que são capazes de induzir um stalling (atraso ou parada) do ribossomo. Entretanto, existem ainda poucos trabalhos realizados com perfil proteômico na ausência de função de eIF5A, de maneira que atualmente pouco se sabe sobre as proteínas que têm sua tradução dependente de eIF5A. Desta forma, o presente projeto visa a busca de proteínas que têm sua tradução dependente de eIF5A através da comparação de perfil proteômico entre linhagens selvagens e mutantes de eIF5A em Saccharomyces cerevisiae. Para isto, utilizamos neste trabalho uma estratégia de perfil proteômico celular in vivo por fluorescência de GFP utilizando uma coleção de 4.156 linhagens, cada uma contendo uma ORF diferente em fusão com GFP no C-terminal, e uma proteína RFP (variante E2Crimson) constitutivamente produzida como normalizador, tanto no background selvagem (HYP2) como mutante para eIF5A (hyp2-3). Esta tese apresenta a análise dos dados de GFP/RFP e a validação desta análise utilizando-se western blot. Os resultados demonstram um grupo de proteínas diferencialmente menos produzidas, das quais a maioria se relaciona com processos mitocondriais. Para confirmar o envolvimento de eIF5A com função mitocondrial, caracterizou-se a fisiologia mitocondrial em mutantes de eIF5A. Revelou-se a incapacidade de crescimento do mutante de eIF5A em fontes de carbono não fermentáveis, ou seja, que dependem da mitocôndria para sua oxidação. O mutante de eIF5A também apresentou atividade respiratória reduzida, aumento no potencial de membrana e na quantidade de DNA mitocondrial, embora a morfologia não pareça estar afetada. Majoritariamente, as proteínas mitocondriais são codificadas no núcleo, traduzidas no citoplasma e importadas para mitocôndria como um polipeptídio desenovelado ou então são translocadas de maneira cotraducional para mitocôndria, e, de alguma maneira, eIF5A pode estar regulando a tradução dessas proteínas especificamente. Interessantemente, a desaceleração das taxas de elongação da tradução por códons raros ou outras sequências causadoras de parada ou atraso na tradução podem facilitar a ligação de Partícula Reconhecedora de Sinal (SRP) ao ribossomo, o que pode interferir com o direcionamento ao RE. Assim, existem diferentes caminhos pelos quais eIF5A poderia interferir com a tradução de proteínas direcionadas à mitocôndria ou ao RE e trabalhos futuros são necessários para abordar os mecanismos subjacentes ao papel de eIF5A na célula.
The translation factor 5A (eIF5A) is conserved and essential for cell viability. This is the only protein known to contain the amino acid residue hypusine, essential for eIF5A function, generated by a post-translational modification. Although it was initially suggested a function for eIF5A in the translation initiation, eIF5A has been demonstrated to have a role in translation elongation. More recent studies have established that eIF5A is necessary for the elongation of specific sequences, which are able to induce a ribosome stalling. Still, there are few studies with proteomic profile in the absence of eIF5A function and the proteins which syntheses are dependent on eIF5A are not well known. Thus, the present study aims to search for the proteins which syntheses are dependent on eIF5A by proteomic profile comparison between wild-type strains and eIF5A mutants in Saccharomyces cerevisiae. We present a proteomic profile for GFP fluorescence using a 4156 collection of strains, each one containing a different ORF fused to the C-terminal GFP and a protein RFP constitutively produced as normalizing, both in the wild and eIF5A mutant background. This thesis presents GFP / RFP data analysis and data validation using western blot. Our data using an in vivo proteome profile of the ORFs-GFP collection in a hyp2-3 mutant background demonstrating that yeast eIF5A shows several mitochondrial proteins downregulated in the eIF5A mutant. To confirm eIF5A involvement with mitochondrial function, we characterized mitochondrial physiology in eIF5A mutants. We revealed the inability of the eIF5A mutant to grow in non-fermentable carbon sources, where they depend on mitochondria for its oxidation. eIF5A mutant also showed reduced respiratory activity, increased membrane potential and mitochondrial DNA amount, although morphology does not appear to be affected. Mostly, mitochondrial proteins are either coded into the nucleus, translated into the cytoplasm and imported into mitochondria as an unfolded polypeptide, or are translocated in a conventional manner to mitochondria, and somehow eIF5A may be regulating the translation of these proteins specifically. Interestingly, the slowdown of translation elongation rates by rare codons or other translation stalling motifs can facilitate binding of the Signal Recognition Particle (SRP) to the ribosome, which may interfere with ER targeting. Thus, there are different ways by which eIF5A could interfere with translation of proteins targeted to the mitochondria or the ER and further work are necessary to address the mechanisms underlying this role of eIF5A in the cell.
The translation factor 5A (eIF5A) is conserved and essential for cell viability. This is the only protein known to contain the amino acid residue hypusine, essential for eIF5A function, generated by a post-translational modification. Although it was initially suggested a function for eIF5A in the translation initiation, eIF5A has been demonstrated to have a role in translation elongation. More recent studies have established that eIF5A is necessary for the elongation of specific sequences, which are able to induce a ribosome stalling. Still, there are few studies with proteomic profile in the absence of eIF5A function and the proteins which syntheses are dependent on eIF5A are not well known. Thus, the present study aims to search for the proteins which syntheses are dependent on eIF5A by proteomic profile comparison between wild-type strains and eIF5A mutants in Saccharomyces cerevisiae. We present a proteomic profile for GFP fluorescence using a 4156 collection of strains, each one containing a different ORF fused to the C-terminal GFP and a protein RFP constitutively produced as normalizing, both in the wild and eIF5A mutant background. This thesis presents GFP / RFP data analysis and data validation using western blot. Our data using an in vivo proteome profile of the ORFs-GFP collection in a hyp2-3 mutant background demonstrating that yeast eIF5A shows several mitochondrial proteins downregulated in the eIF5A mutant. To confirm eIF5A involvement with mitochondrial function, we characterized mitochondrial physiology in eIF5A mutants. We revealed the inability of the eIF5A mutant to grow in non-fermentable carbon sources, where they depend on mitochondria for its oxidation. eIF5A mutant also showed reduced respiratory activity, increased membrane potential and mitochondrial DNA amount, although morphology does not appear to be affected. Mostly, mitochondrial proteins are either coded into the nucleus, translated into the cytoplasm and imported into mitochondria as an unfolded polypeptide, or are translocated in a conventional manner to mitochondria, and somehow eIF5A may be regulating the translation of these proteins specifically. Interestingly, the slowdown of translation elongation rates by rare codons or other translation stalling motifs can facilitate binding of the Signal Recognition Particle (SRP) to the ribosome, which may interfere with ER targeting. Thus, there are different ways by which eIF5A could interfere with translation of proteins targeted to the mitochondria or the ER and further work are necessary to address the mechanisms underlying this role of eIF5A in the cell.
Descrição
Palavras-chave
eIF5A, Tradução de mRNA, Ribossomos, Mitocôndria, mRNA translation, Ribosomes, Mitochondria