Teses - Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

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  • ItemTese de doutorado
    Avaliação da influência dos micronutrientes metálicos Ferro e Zinco na formação do biofilme e na virulência de Histoplasma capsulatum
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-01) Pires, Ana Carolina Moreira da Silva; Fusco-Almeida, Ana Marisa; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Histoplasmose é uma doença fúngica ocasionada pela inalação de microconídios do fungo Histoplasma capsulatum presentes em solos contaminados. Após a inalação, para que o fungo se instale dentro dos macrófagos do hospedeiro são necessários mecanismos de virulência e adesão. Estudos mostram alguns mecanismos utilizados pelo fungo como a formação de biofilme e a utilização de adesinas. Mais recentemente, estudos têm mostrados a habilidade do fungo capturar íons metálicos essenciais que auxiliam na sua multiplicação no interior da célula. Dentre os íons requisitados, o ferro e o zinco são metais que influenciam em diversas atividades celulares de organismos eucarióticos. A partir disso, o objetivo do trabalho foi avaliar a influência dos íons metálicos ferro e zinco em células planctônicas, bem como na formação e nos mecanismos de virulência do biofilme de H. capsulatum. As cepas utilizadas para o trabalho foram a Panamense G186A (ATCC 26029) e a oriunda de morcego EH-315 (BAC1). Os quelantes TPEN e DTPA foram selecionados para mimetizar ambientes com escassez de íons, e as soluções de sulfato ferroso e sulfato de zinco para adição de mais íons ao meio HAM-F12. Os resultados mostraram que na presença dos quelantes tanto as células planctônicas quanto a formação do biofilme foram prejudicadas. Na presença do zinco, a cepa G186A teve um aumento na sua atividade metabólica e densidade celular no crescimento planctônico, ao contrário da EH-315 que não teve esses parâmetros alterados em relação ao crescimento controle. Na presença do ferro ambas as cepas apresentaram aumento de atividade metabólica e densidade celular. Em relação a formação do biofilme, na presença do zinco só a cepa G186A mostrou maior atividade metabólica, enquanto na presença do ferro ambas as cepas tiveram esse parâmetro aumentado. Não houve influência na formação de biomassa e da matriz extracelular para as duas cepas na presença dos íons ou dos quelantes. As microscopias eletrônicas de varredura e confocal mostraram que na presença dos íons foram formados biofilmes mais densos e robustos após 144 horas para ambas as cepas, sendo que com o ferro foram formados biofilmes predominantemente de hifas. O quelante TPEN, principalmente, inibiu a formação de aglomerados celulares tanto em 24 quanto em 144 horas de cultivo. Os ensaios com o corante congo red mostraram que na presença dos quelantes houve maior susceptibilidade das cepas ao corante, principalmente a cepa EH-315, indicando possíveis alterações na parede celular fúngica. Para análise da virulência, o modelo animal alternativo Galleria mellonella foi utilizado. Não houve maior sobrevivência das larvas infectadas após crescimento em meios com quelantes em comparação com as larvas infectadas com leveduras da condição controle. Entretanto, as larvas infectadas com as leveduras oriundas dos biofilmes inicial e maduro cultivados em meio com zinco e ferro da cepa G186A apresentaram menor sobrevivência. A cepa EH-315 não apresentou diferenças estatísticas na sobrevivência das larvas infectadas com leveduras oriundas dos meios com os íons. De maneira geral, os resultados trazem informações inéditas em relação a morfologia e a influência de íons em biofilmes do fungo Histoplasma spp. A adição dos íons metálicos influenciou na atividade metabólica e na viabilidade celular das cepas, principalmente para a cepa G186A. Os biofilmes mostraram maior robustez na presença de mais íons metálicos além de mudanças morfológicas em ambas as cepas. Além disso, a cepa G186A mostrou-se mais virulenta na presença dos íons indicando que os íons contribuem para seus mecanismos de virulência. O uso de quelantes podem contribuir para novas opções terapêuticas anti- H. capsulatum, visto que podem diminuir a viabilidade e a formação dos biofilmes do fungo.
  • ItemTese de doutorado
    Determinação estrutural e busca por inibidores da enzima desoxi-hipusina sintase de organismos eucarióticos causadores de doenças negligenciadas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-27) Klippel, Angélica Hollunder; Zanelli, Cleslei Fernando; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em eucariotos e essencial para a proliferação celular. eIF5A é modificado pós-traducionalmente através de uma reação muito específica, chamada hipusinação, a qual é necessária para sua função. A hipusinação ocorre em duas etapas, envolvendo as enzimas desoxi-hipusina sintase (DHPS) e desoxi-hipusina hidroxilase (DOOH). Considerando a essencialidade da hipusinação e de eIF5A, a DHPS e a DOOH correspondem a alvos interessantes para o desenvolvimento de fármacos para inibir a proliferação de vários organismos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é determinar a estrutura tridimensional e buscar inibidores para as DHPSs dos seguintes organismos causadores de doenças tropicais negligenciadas: Paracoccidioides brasiliensis (Pb), Histoplasma capsulatum (Hc), Brugia malayi (Bm) e Leishmania sp. (duas isoformas: A e B). Para tanto, foram padronizadas as condições de clonagem, produção em Escherichia coli e purificação dessas proteínas. Isso possibilitou o estabelecimento de um ensaio bioquímico fácil de ser miniaturizado para a HcDHPSA, BmDHPSA e PbDHPSA, e a determinação da estrutura cristalográfica da BmDHPSA e da HcDHPSA. No entanto, essas estruturas apresentam uma arquitetura muito similar à da enzima humana (HsDHPS), o que dificulta o desenvolvimento de inibidores seletivos para as DHPSs desses patógenos. Portanto, novos esforços foram direcionados para a obtenção das Leishmania sp. DHPSs na forma solúvel a partir de E. coli, visto que essas enzimas provavelmente formam um heterocomplexo, diferentemente da HsDHPS. Após combinar uma série de estratégias, as DHPSs de L. donovani (LdDHPSAB) e de L. major (LmDHPSAB) foram produzidas na forma solúvel e ativa a partir de E. coli, o que permitiu a realização de um high-throughput drug screening in vitro com a LdDHPSAB, empregando a reação parcial das DHPSs acoplada ao ensaio NAD+/NADH-Glo™. Dos 26771 compostos testados inicialmente a 10 μM, 44 compostos (hits) inibiram a atividade da LdDHPSAB em mais de 60%. Uma triagem secundária confirmou que 24 (57%) dos hits exibiram efeitos inibitórios consistentes (maior do que 60%) sobre a atividade da LdDHPSAB. Depois de excluir os hits que também inibiram a atividade das enzimas do ensaio NAD+/NADH-Glo™, os 13 compostos restantes foram analisados quanto à concentração-resposta empregando o mesmo ensaio acoplado. Nove desses 13 compostos apresentaram um IC50 contra a atividade da LdDHPSAB na faixa micromolar baixa. Dentre esses, os compostos MMV1674024 e MMV904563 apresentaram um maior potencial para futuras otimizações com o intuito de melhorar a potência de inibição sobre a atividade das Leishmania sp. DHPSs. Além disso, os dados de inibição in vitro sugerem que a inibição das Leishmania sp. DHPSs sem afetar a atividade da HsDHPS corresponde a uma tarefa viável, confirmando a hipótese de que a DHPS é um alvo interessante para ser explorado em Leishmania sp. Ainda, empregando o ensaio baseado na detecção da fluorescência do NADH, foi possível determinar que o composto MMV1674024 exerce uma inibição sobre a atividade da LmDHPSAB do tipo mista em relação ao NAD+ e à espermidina. Finalmente, foram obtidos cristais para a LmDHPSAB preparada na presença de NAD+ e do composto MMV1674024. Entetanto, esses cristais não difrataram durante a coleta de dados de difração por raios X, mesmo após tentativas de otimização das condições de cristalização.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação do potencial de filmes bioadesivos contendo piperina encapsulada em nanopartículas poliméricas no tratamento de doenças inflamatórias cutâneas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-09) Politi, Flávio Augusto Sanches; Chorilli, Marlus; Favorin, Leila Aparecida C.; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A piperina é um alcaloide encontrado nos frutos de diversas espécies do gênero Piper, e seu potencial anti-inflamatório tem sido amplamente explorado pela medicina tradicional. Entretanto, suas aplicações terapêuticas ainda necessitam serem melhor exploradas devido à sua baixa solubilidade em água. Neste sentido, o foco deste trabalho foi avaliar a eficiência da nanoencapsulação deste composto bem como sua incorporação em biomembranas sintetizadas a partir de polímeros de origem natural, em ordem a contornar a limitação de uso devido sua hidrofobicidade, e assim, testar sua ação anti-inflamatória contra um modelo de edema de orelha utilizando camundongos albinos Swiss. Para a síntese das nanopartículas, a técnica de nanoprecipitação foi empregada, obtendo-se nanopartículas esféricas com diâmetro médio de 122,1 ± 2,0 nm, distribuição estreita de tamanho (índice de polidispersividade 0,266 ± 0,044) e eficiência de encapsulação de 76,2 ± 0,102%, as quais permaneceram estáveis por até 60 dias após seu preparo. Entre as diferentes membranas sintetizadas, foi escolhida aquela que demonstrou possuir boa resistência e maleabilidade e que apresentou taxa de permeabilidade ao vapor d’água e porcentagem de intumescimento favoráveis à liberação controlada da piperina. Através dos ensaios de liberação in vitro, verificou-se que tanto o filme sintetizado com a piperina (FPip) quanto o filme sintetizado com as nanopartículas (FNPPi) apresentaram modelo de cinética não Fickiano. A respeito da permeação, uma taxa de passagem lenta foi observada até as 14 horas iniciais, quando um aumento exponencial na concentração da droga recuperada começou a ocorrer. Isto é uma característica farmacocinética positiva quando pensamos na aplicação local de um anti-inflamatório, desde que sua taxa de penetração nas camadas da pele é bastante lenta, evitando assim uma ação sistêmica. O ensaio in vivo mostrou uma redução na inflamação de cerca de 43,6%, e nenhuma citotoxicidade contra fibroblastos foi observada.
  • ItemTese de doutorado
    Oportunidades de controle das leishmanioses: planejamento, síntese, caracterização e bioconjugação de peptídeos a agentes leishmanicidas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-18) Coelho, Natália Caroline Costa; Graminha, Márcia Aparecida Silva; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As leishmanioses correspondem a um grupo de doenças causada por protozoários do gênero Leishmania. O controle das leishmanioses depende de intervenção quimioterápica, com destaque para a anfotericina B, objeto de estudo deste trabalho. A anfotericina B é tóxica e causa severos efeitos colaterais nos pacientes. Dentro deste cenário, parte de nossos objetivos visa a modificação da anfotericina B via acoplamento de peptídeos antimicrobianos, em um processo chamado bioconjugação terapêutica. Neste estudo, peptídeos leishmanicidas das classes temporinas e histatinas foram exploradas para desenvolvimento de novos bioconjugados. Para isso os peptídeos TSHa (IC₅₀ama=5µmol L -1 e IS>200), TSHd (IC₅₀ama=7,2µmol L -1 e IS=14) e Hist 5 (IC₅₀ama=8 µmol L -1 e IS>125) foram funcionalizados à anfotericina B (IC₅₀ama=0,63 e IS= 38), gerando os derivados Anf B*-TSHa (IC₅₀ama=1,6 µmol L -1 e IS>645), Anf B (RC)-TSHa ( IC₅₀ama=0,31 µmol L -1 e IS>3225), Anf B *-TSHd ( IC₅₀ama=0,95 µmol L -1 e IS>1052), Anf B-Hist 5 (IC₅₀ama=0,4 µmol L -1 e IS>2500) foram sintetizados com alto grau de pureza. Dentre os principais achados, destaca-se a alta seletividade (IS) dos bioconjugados, os quais são pelo menos 600 vezes mais seletivos para o parasita quando comparados à célula do hospedeiro, o que pode ser atribuído a uma possível ação dos peptídeos temporinas TSHa e TSHd na membrana do parasita, quer seja pela formação de poros ou por interações do tipo detergente (carpet like), o que pode estar facilitando a permeação da anfotericina B nos macrófagos, promovendo sua atividade anti-amastigota. Diferentemente para o bioconjugado Anf B-Hist 5, verificou-se que houve menor permeabilização desses na membrana do parasita, isto foi observado através dos ensaios de citometria de fluxo e de microscopia de fluorescência. Os dados de microscopia de fluorescência confocal indicaram uma melhor compartimentalização do peptídeo Anf B-Hist 5 na mitocôndria, sugerindo um mecanismo de ação dual inerente de cada molécula associado à atividade biológica aqui caracterizada: a ação da anfotericina B na membrana do parasita facilitando a entrada do peptídeo Anf B-Hist 5 e assim atividade do mesmo sobre a mitocôndria. Adicionalmente, a fim de sintetizar novos peptídeos leishmanicidas, foi planejado e sintetizado um dímero composto pelos peptídeos TSHa, denominado (TSHa)₂K (IC₅₀ ama=0,58 µmol L -1 e IS>1724), cuja potência e seletividade aumentou cerca de dez vezes em relação ao peptídeo TSHa. Paralelamente, a partir de estudos de modelagem molecular para obtenção da estrutura do canal mitocondrial de cálcio MCU de Leishmania, estudos de docagem molecular foram realizados para planejamento de peptídeos inéditos capazes de interferir seletivamente no influxo de cálcio para a mitocôndria do parasita com base na interação destes com a região do filtro de seletividade DIME, os quais deverão ser sintetizados e validados em estudos no parasita Leishmania.Com a presente pesquisa podemos concluir a bioconjugação com Anf B e o design racional de peptídeos são estratégias interessantes para o desenvolvimento de novas moléculas para o tratamento da leishmaniose, focando no aumento da seletividade e diminuição da toxicidade.
  • ItemTese de doutorado
    Estabelecimento de um modelo tridimensional para determinação da eficácia e segurança farmacológica de derivados de nitrofuranos e indólicos e avaliação da infecção de Histoplasma capsulatum
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-11-29) Vaso, Carolina Orlando; Fusco-Almeida, Ana Marisa; Orlandi, Caroline Barcelos Costa; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As culturas tridimensionais (3D) são um tipo de cultivo celular que têm o propósito de simular mais fidedignamente o tecido in vivo. As doenças fúngicas afetam mais de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo. A crescente evolução da resistência microbiana e os efeitos adversos dos antifúngicos atuais auxiliam no surgimento de novos medicamentos. Esse estudo teve o objetivo de estabelecer esferoides de células pulmonares para avaliar a toxicidade de derivados de nitrofuranos e indólicos e explorar a interação H. capsulatum-hospedeiro. Além disso, objetivou-se estudar a toxicidade desses compostos in vivo utilizando animais alternativos, bem como averiguar o(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação. Esferoides das linhagens pulmonares A549 e MRC-5 foram caracterizados pelo método de azul de Trypan, resazurina e iodeto de propídeo. O tamanho, a forma e densidade celular foram avaliados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e confocal. Testes de sensibilidade foram conduzidos de acordo com o documento M27-A3, proposto pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), com pequenas modificações nos ensaios com H. capsulatum. A citotoxicidade foi avaliada em esferoides e em monocamada, por meio da adição de resazurina. A toxicidade in vivo foi avaliada no modelo de Caenorhabditis elegans, Galleria mellonella e Zebrafish. Foi verificada ação antibiofilme dos compostos mais potentes para H. capsulatum, pelo método de redução do sal tetrazólico (XTT). Os danos nos biofilmes maduros, foram visualizados por MEV e confocal. O mecanismo de ação foi averiguado pela quantificação do ergosterol da membrana, verificação de danos de parede com Calcofluor White, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) utilizando 2,7-dichlorodihydrofluoresceina, morte celular pelo ensaio de iodeto de propídeo (IP)/Anexina e técnica de PCR em tempo real. As interações entre células planctônicas e de biofilme maduro de H. capsulatum foram realizadas nos esferoides e comparadas às infecções nas mesmas condições em monocamadas, por PCR em tempo real. Os esferoides apresentaram diâmetros entre 370-600 μm e viabilidade maior que 80% após 10 dias de formação. A MEV e confocal mostraram uma arquitetura esferoidal íntegra e constituída por células interconectadas entre si. Dos compostos testados contra H. capsulatum, 18 foram mais eficazes com valores de CIM90 de 0,122 a 61,25 μg/mL. No geral, os compostos testados foram menos tóxicos nos esferoides comparativamente à monocamada. Dentre os compostos testados o L7CF 166 (derivado de nitrofurano), o L7CF 197 (derivado indólico) e L7CF 219 (derivado nitrofurano/indólico) foram os mais específicos para o H. capsulatum. Nos modelos alternativos C. elegans, G. mellonella e zebrafish a toxicidade dos compostos foi baixa, mesmo em concentrações elevadas. Os compostos inibiram o biofilme inicial e maduro na concentração igual ou duas vezes a requerida para as células planctônicas. As micrografias mostraram uma redução na atividade metabólica, na espessura e na matriz extracelular dos biofilmes. Os três compostos reduziram a quantidade do ergosterol presente na membrana fúngica. Dois compostos L7CF 166 e L7CF 219 foram capazes de causar deformações na parede celular. Já os L7CF 197 e L7CF 219 foram capazes de induzir EROs nas células. Além disso, os três compostos provocaram morte celular por via necrótica. Os esferoides infectados com a forma planctônica obtiveram uma modulação negativa para o gene CBP1. Já os esferoides infectados com biofilme, apresentaram modulação positiva para o gene CBP1 e a GAPDH e, modulação negativa para gene DDR8. Adicionalmente, foram testados a série de derivados de nitrofuranos contra diferentes espécies de fungos. A citotoxicidade foi avaliada utilizando os cultivos em monocamada e esferoides de A549 e MRC-5 e toxicidade in vivo no modelo alternativo de C.elegans. A maioria dos compostos apresentou baixa atividade inibitória. Os valores mais potentes de CIM90 foram de 0,48 μg/mL contra Paracoccidioides brasiliensis (L7CF 182), 0,98 μg/mL contra Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (L7CF 193) e 3,9 μg/mL contra cepas de Candida e Cryptococcus neoformans (L7CF 113 e L7CF 181, respectivamente). Além disso, todos os compostos apresentaram baixa toxicidade quando testados in vitro e in vivo. Baseado nesses resultados, os esferoides mostram-se viáveis para o estudo de toxicidade de fármacos e para experimentos de infeção. No geral, os resultados sugerem que derivados de nitrofuranos e indólicos são compostos promissores para o tratamento de infecções fúngicas.
  • ItemTese de doutorado
    Análise da atividade in vitro, in vivo e do mecanismo de ação de compostos benzofuroxanos frente à Mycobacterium tuberculosis.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-27) Campos, Débora Leite; Pavan, Fernando Rogério; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A importância do estudo de novos fármacos para o tratamento da tuberculose se justifica por essa ser uma das doenças infecciosas mais mortais no mundo. O aparecimento de cepas resistentes aos fármacos é uma preocupação constante que apenas pode ser diminuída por meio do estudo de novas moléculas e melhores esquemas terapêuticos. Neste projeto avaliamos 18 novos compostos benzofuroxanos com potencial inibitório contra o Mycobacterium tuberculosis. Dos 18 inicialmente avaliados, 11 foram selecionados por apresentarem valores de concentração inibitória mínima (CIM90) < 5 M e índices de seletividade > 10. Esses 11 compostos foram avaliados frente 10 isolados clínicos resistentes de M. tuberculosis, bactérias em estado intramacrofágico e quanto ao espectro de atividade. Todos os benzofuroxanos foram ativos contra isolados clínicos resistentes, apresentaram boa atividade frente bactérias intramacrofágicas e foram classificados como compostos de espectro de ação estreito. Os 2 melhores compostos selecionados de acordo com o potencial frente a isolados resistentes (TBs 10 e 13) foram avaliados em experimento de infecção e tratamento in vivo com camundongos Balb/c. Os resultados obtidos foram promissores, demonstrando efeito inibitório sobre o crescimento bacteriano além da comprovação da não-toxicidade e biodisponibilidade. Também apresentaram efeito sinérgico in vitro quando associados com a rifampicina (fármaco da terapia de TB). Finalmente, o composto líder selecionado no experimento in vivo (TB 10) foi avaliado quanto ao seu potencial inibitório frente bombas de efluxo, não sendo um inibidor dessa classe de proteínas. Efeitos da exposição do M. tuberculosis ao TB 10 também foram morfologicamente observados por meio de microscopia eletrônica de varredura, observando-se alterações de parede características de estresse celular e um mutante resistente foi identificado para posterior análise genotípica por meio de sequenciamento. Concluímos que a síntese dessa nova série de compostos culminando na escolha do benzofuroxano TB 10 foi significativa visto que conseguimos encontrar uma nova molécula com forte atividade inibitória in vitro e in vivo, alta segurança e biodisponibilidade além de potencial sinérgico com outros fármacos da terapia já utilizados o que aponta para um potencial novo composto indicado para o tratamento da tuberculose.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação da atratividade de hamster dourado (Mesocricetus auratus) infectado com Leishmania (Leishmania) amazonensis para Lutzomyia longipalpis (Diptera:Psychodidae)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-30) da Rocha Silva, Flávia Benini [UNESP]; Pinto, Mara Cristina; Miguel, Danilo Ciccone; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As leishmanioses são zoonoses causadas por protozoários flagelados do gênero Leishmania e transmitidas por insetos hematófagos denominados flebotomíneos. Clinicamente se apresentam como visceral e tegumentar. A leishmaniose visceral tem como agente etiológico a Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e principal vetor nas Américas os flebotomíneos da espécie Lutzomyia longipalpis. Além disso, Lu. longipalpis é considerado como vetor permissivo para L. (L.) amazonensis, um dos agentes etiológicos da leishmaniose tegumentar americana. Para localização dos hospedeiros e realização do repasto sanguíneo, os insetos hematófagos utilizam compostos orgânicos voláteis (COV) liberados pelos mesmos, denominados cairomônios. Alguns estudos demonstram que hospedeiros infectados por parasitas podem liberar compostos diferentes dos não infectados e influenciar na atratividade de tais hospedeiros para os insetos hematófagos vetores. O presente estudo buscou investigar se hamsters não infectados e infectados com L. (L.) amazonensis apresentavam diferença na atratividade para Lu. longipalpis; além da diferença de atratividade, buscou avaliar o volume de sangue ingerido pelos flebotomíneos e os COV emitidos pelos diferentes grupos de hamsters. Complementar a isso, também foram avaliados os COV liberados in vitro em cultura de macrófagos infectados ou não com L. (L.) amazonensis e de amastigotas livres dessa espécie. A atratividade dos animais foi avaliada por meio de testes realizados em gaiolas, onde se contabiliza a taxa de alimentação das fêmeas dos flebotomíneos. As fêmeas alimentadas foram então individualizadas em microtubos, maceradas e homogeneizadas para leitura da absorbância a 540nm. Tal leitura permite estimar o volume de sangue ingerido por cada fêmea, a partir de curva padrão de absorbância versus volume de sangue obtida previamente. Os COV liberados pelos diferentes grupos de animais foram obtidos por meio de uma fibra de microextração em fase sólida (SPME) e analisados por meio de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Após algumas etapas de desenvolvimento da metodologia, ficou estabelecida extração dos voláteis com uso de fibra de SPME revestida por polidimetilsiloxano/divinilbenzeno e com a amostra aquecida em banho-maria a 90°C por um período de 50 minutos. Os testes de atratividade foram realizados com um total de 10 hamsters – antes e após a infecção – onde foi possível observar uma taxa média de alimentação das fêmeas de 64,25% antes da infecção e de 64,75% após a infecção. Na avaliação do volume de sangue ingerido por fêmea, foram obtidas médias de 0,98μL e 1,10μL antes e após a infecção, respectivamente. Os voláteis extraídos a partir de amostras de pelos dos animais utilizados nos testes de atratividade e das culturas in vitro foram identificados com auxílio de biblioteca de espectros e cálculo dos índices de retenção. Os COV identificados foram submetidos à análise de componentes principais para verificar possíveis correlações com os animais e o status da infecção. A partir dos resultados obtidos para os testes in vivo, não foi possível observar uma influência da infecção por L. (L.) amazonensis na taxa de alimentação das fêmeas de Lu. longipalpis em hamsters e no perfil de COV liberados por esses animais. Para os COV identificados a partir dos testes in vitro com culturas infectadas com L. (L.) amazonensis, foi possível observar a presença de undecan-2-ona exclusivamente nas formas amastigotas-like livres; octan-1-ol e 2-feniletanol nas formas amastigotas (independente da maneira de obtenção); e de 4-fenilciclohexeno em todas as amostras, porém em maior teor nas amastigotas livres de lesão. Tais compostos podem ser estudados futuramente quanto à sua atratividade para flebotomíneos.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação do efeito da 2-chalcona mediada pela terapia fotodinâmica nos biofilmes mono e dual-espécies de Candida spp. e dermatófitos e mecanismos de interação desses microrganismos no biofilme misto
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-23) Bila, Níura Madalena [UNESP]; Mendes-Giannini, Maria José Soares; Costa Orlandi, Caroline Barcelos; Martinez, Luis R.; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As dermatomicoses são causadas por uma variedade de fungos, sendo os dermatófitos e as leveduras os de maior prevalência, na forma isolada ou associada. Os fungos dermatófitos e as espécies de Candida são capazes de formar biofilmes, que são associados ao aumento da virulência, da resistência aos fármacos e, consequentemente, da persistência da infecção. Assim, há necessidade de estudos de biofilmes com estes fungos e ampliação do arsenal terapêutico. O estudo pretendeu aprofundar o conhecimento sobre os biofilmes mono e dual espécies de Candida e dermatófitos e avaliação da acao antifúngica da 2-hidroxichalcona (2-chalcona), sua toxicidade e mecanismo de ação. Para tal, foi estudada a formação de biofilmes de Microsporum canis, e a capacidade antibiofilme da 2-chalcona no escuro e mediada por terapia fotodinâmica (PDT), a sua toxicidade in vitro em modelo de monocamada celular (2D) e em modelo tridimensional (3D) em linhagens de queratinócitos de pele humana (HaCat) e fibroblasto dérmico humano (HDFa) e, in vivo em larvas de Caenorhabditis elegans e Galleria mellonella. Além disso, foram estudados os fatores que promovem a inibição na interação dos dermatófitos e C. albicans/C. parapsilosis nos biofilmes. Os biofilmes de M. canis foram caracterizados por meio de quantificação da atividade metabólica, biomassa, estruturas polissacarídicas e matriz extracelular em RPMI 1640, caldo BHI, DMEM e HAM-F12. Os testes de sensibilidade foram conduzidos em isolado clínico de M. canis e cepas de referência de Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, C. albicans e C. parapsilosis frente à 2-chalcona e aos antifúngicos convencionais. A 2-chalcona (no escuro e mediada pela PDT) e antifúngicos convencionais foram avaliados quanto à capacidade de inibir as células planctônicas (106 cel/ml) e os biofilmes, mono e dual-espécies, no estágio inicial e maduro. Os danos causados pela 2-chalcona nos biofilmes foram documentados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal (MC). Foram quantificados os esteróis da membrana, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), os danos causados na parede celular e mecanismo de morte em células tratadas com 2-chalcona no escuro e fotoexcitada. Foi também avaliada o efeito do sobrenadante livre de células dos biofilmes de T. rubrum, C. albicans ou de C. parapsilosis quanto a capacidade de inibir os biofilmes e a filamentação de C. albicans por meio de redução de XTT, MEV e MC. M. canis foi capaz de formar biofilmes robustos em 96 horas de incubação nos meios BHI, DMEM e HAM-F12 e em menor escala no meio RPMI-1640. A 2-chalcona inibiu os biofilmes no estágio inicial e maduros de dermatófitos em concentrações superiores ou igual a 31,25 mg/L. Quando a 2-chalcona foi mediada pela PDT, houve redução das concentrações de inibição nas células planctônicas e nos biofilmes em quatro vezes quando comparada com a 2-chalcona no escuro. Os resultados de imagem por MEV e MC mostraram um total colapso das células com expressiva redução da espessura dos biofilmes. Já nos biofilmes de Candida e biofilmes dual-espécies, a 2-chalcona mostrou-se menos potente, embora a fotoexcitação tenha reduzido a sua concentração inibitória mínima. Os biofilmes de dermatófitos foram resistentes ao fluconazol e à terbinafina, assim como nos biofilmes mono e dual espécies frente ao itraconazol, fluconazol e caspofungina. Toxicidade da 2-chalcona no escuro e fotoexcitada foi observada em concentrações acima de 125 mg/L nos modelos 2D e 3D de células e C. elegans. Em G. mellonella, a 2-chalcona não mostrou toxicidade até em concentrações de 200 mg/kg. O tratamento com a 2-chalcona causou deformidade na parede celular fúngica, redução de esteróis da membrana citoplasmática e promoveu a geração de ROS, resultando, por conseguinte, em morte celular por apoptose e necrose. Os sobrenadantes livres de célula não reduziram as atividades metabólicas dos biofilmes, no entanto, houve redução de sua espessura. Verificou-se ainda que a inibição da filamentação de C. albicans nos biofilmes mistos de T. rubrum e C. albicans foi influenciada pela interação direta entre os microrganismos. Sendo assim, este estudo abre portas para desvendar a os mecanismos de interação entre microrganismos no biofilme misto e aponta a 2-chalcona mediada por PDT como uma alternativa terapêutica potente para o tratamento das dermatofitoses.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação da terapia fotodinâmica contra biofilmes acneicos polimicrobianos: um estudo pré-clínico
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-25) De Annunzio, Sarah Raquel; Fontana, Carla Raquel; Carmello, Juliana Cabrini; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A acne vulgar é uma das doenças dermatológicas mais comuns encontradas na prática clínica. As opções de tratamento para esta dermatose são diversas, porém nem sempre são efetivas. A resistência microbiana frente aos antibióticos e os efeitos adversos das terapias convencionais têm feito pesquisadores investigarem tratamentos alternativos. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo avaliar a ação da terapia fotodinâmica (TFD) mediada por curcumina, azul de metileno e clorina-e6 sobre biofilmes de bactérias provenientes de pacientes com acne vulgar. Foram realizadas de uma a quatro aplicações fotodinâmicas nos biofilmes e a identificação dos microrganismos presentes nas amostras foi realizada por PCR convencional, por amplificação de genes com primers espécie-específicos. A biocompatibilidade dos tratamentos foi avaliada em um modelo de co-cultura em três dimensões (3D) de pele. Os microrganismos identificados nas amostras clínicas foram Cutibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus. Os resultados mostraram que a TFD mediada por azul de metileno foi capaz de eliminar completamente as células dos biofilmes acneicos após três aplicações, enquanto que a TFD mediada por curcumina e clorina-e6, embora tenham apresentado reduções significativas, não eliminaram totalmente as células dos biofilmes, mesmo após quatro aplicações fotodinâmicas. Dessa forma, o sucesso das aplicações consecutivas pode ser dependente do fotossensibilizador. Os ensaios de biocompatibilidade mostraram que a TFD mediada pelos três fotossensibilizadores reduziram significativamente a viabilidade das células no modelo de cultivo 3D de pele e esse efeito pode ser dependente da fluência utilizada. Tomados em conjunto, os resultados obtidos nesse estudo revelaram que os três fotossensibilizadores estudados podem ser promissores para o desenvolvimento de protocolos clínicos eficientes no tratamento da acne vulgar.
  • ItemTese de doutorado
    Identificação, caracterização e síntese peptídica associada à enolase de Sporothrix schenckii: aplicação em plataforma imunossensora eletroquímica portátil para o diagnóstico da Esporotricose Felina.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-22) Castilho, Bruna Mateus de; Costa, Paulo Inácio da; Carlos, Iracilda Zeppone; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A esporotricose é uma infecção causada por fungos de espécies pertencentes ao gênero Sporothrix, afetando humanos e animais. Esta infecção apresenta ampla distribuição mundial, mas no Brasil é considerada emergente e representa importante agravo à saúde humana e animal. O diagnóstico laboratorial precoce e com maior acurácia torna-se imprescindível como medida epidemiológica de controle de novas infecções e disseminação da doença nas populações humana e animal. Para medidas de controle eficazes é fundamental métodos de diagnóstico acurados e precoces. Nesse contexto, com grande potencial para aplicação em diagnósticos, os imunossensores eletroquímicos são vistos como ferramentas inovadoras. Assim, o objetivo desta tese foi desenvolver uma plataforma imunodiagnóstica a partir da proteína enolase do Sporothrix schenckii (EnoSs), usando sensor eletroquímico, para o diagnóstico da esporotricose felina. Com base em estudos prévios sobre o potencial imunogênico da proteína recombinante enolase do Sporotrhix schenckii (rSsEno), determinamos a imunorreatividade da rSsEno frente a amostras de soros de gatos positivos (n=20) e negativos (n=6) para esporotricose, aplicando o ensaio imunoenzimático indireto (ELISA). A SsEno demonstrou atividade com concentrações de 1µg. A partir desses resultados com a rSsEno, propomos o emprego deste antígeno em um novo método sorológico para esporotricose. A predição de epítopos mais imunogênicos e antigênicos da EnoSs em célula B foi realizada com o propósito de diminuir possíveis reações inespecíficas da proteína recombinante em plataforma mais sensível baseada em sensor eletroquímico. Os servidores web de predição utilizados foram: BEPIpred 2.0, DLBEtope, IBCEL-EL e Lbtope. O melhor epítopo da EnoSs obtido foi sintetizado por Síntese Química em Fase Sólida usando a estratégica Fmoc/tBut, posteriormente caracterizado por Espectrometria de Massas ms/ms e analisado e purificado por HPLC. A plataforma diagnóstica com sensor eletroquímico foi desenvolvida empregando o sensor DRP-220AT da Metrohm/DropSens, pela imobilização do peptídeo em monocamada organizada, sobre o eletrodo de trabalho, com cistamina (20 mM) e glutaraldeído (5 mM). As reações imunoquímicas ocorreram com os soros positivos e negativos previamente analisados pelo método de ELISA, observando redução da corrente entre 0 e -0,5 mA e com o Potencial/V entre 0,0 e 0,15V da transdução do sinal eletroquímico. A plataforma eletroquímica desenvolvida é promissora como novo método imunodiagnóstico para a esporotricose felina.
  • ItemTese de doutorado
    O papel da sinalização química via sensor histidina quinase QseC na virulência de Escherichia coli enteroagregativa Stx+
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-30) Machado Ribeiro, Tamara Renata; Moreira, Cristiano Gallina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) está envolvida em casos de diarreia aguda e persistente (≥14 dias) em crianças e adultos de países desenvolvidos e em desenvolvimento. Possui um padrão de adesão exclusivo em cultivo de células epiteliais, denominado adesão agregativa (AA). São descritas adesinas e toxinas nos mecanismos de patogenicidade de EAEC. A formação de um espesso biofilme, mediada principalmente por fímbrias de adesão agregativa (AAF), é característica marcante desse patótipo. A EAEC O104:H4 Stx+ foi responsável por um grande surto de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU) em 2011, na Alemanha. A cepa foi considerada um híbrido EAEC/EHEC, pois havia sido lisogenizada com um fago que codifica para a toxina de Shiga, comumente encontrada em EHEC (Escherichia coli enterohemorrágica). Foi evidenciada uma combinação altamente patogênica a humanos, devido ao seu elevado potencial de causar SHU. As bactérias utilizam sinalização química mediada por sistemas de 2 componentes para se comunicarem com o hospedeiro e sua respectiva microbiota, de modo a regularem seus mecanismos de sobrevivência. O sistema QseBC encontra-se diretamente relacionado, em enterobactérias, com a regulação da expressão de fatores de virulência em importantes patógenos humanos. Sua sinalização ocorre via Autoindutor-3 (AI-3), produzido por bactérias, Epinefrina (Epi) e Norepinefrina (NE), hormônios adrenérgicos do hospedeiro. Trabalhos anteriores evidenciaram que o bloqueio da via de sinalização do sistema QseBC por LED209 diminui a expressão de genes de virulência em bactérias Gram-negativas. Essa molécula atua especificamente em QseC, não interfere no crescimento dos patógenos e não apresenta toxicidade para modelos animais. O objetivo deste estudo foi investigar a sinalização química na virulência de EAEC O104:H4 Stx+ e Stx- via sensor histidina quinase QseC in vitro e in vivo. Foram realizados nocautes gênicos via vetor suicida pJP5603 para caracterização fenotípica e de expressão gênica, bem como ensaios in vivo para avaliar a cinética da infecção na ausência e presença de LED209. A interrupção dessa via mediada por QseC resultou na redução da formação de biofilme e de adesão em células Caco-2, na alteração de expressão de importantes fatores de virulência, bem como na menor eficiência na colonização in vivo para a cepa C227-11 (Stx+). Por outro lado, as mesmas diferenças não foram observadas para a cepa BA3826 (Stx-). Além disso, foi evidenciado um importante papel de QseC para a cepa C227-11 (Stx+) na diminuição da captação de vesículas de membrana externa por células intestinais, assim como na modulação da microbiota intestinal humana. Desta forma, conclui-se que QseC é um excelente alvo para o desenvolvimento de terapias, assim como o uso de LED209, para a cepa C227-11 (Stx+).
  • ItemTese de doutorado
    Desenvolvimento, síntese e caracterização de lipossomas conjugados com análogos de sideróforos e estudo in vitro como estratégia terapêutica para tuberculose
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-18) Ribeiro, Camila Maringolo [UNESP]; Pavan, Fernando Rogerio; Chorilli, Marlus; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa que afeta milhões de pessoas anualmente, é necessário um longo tratamento para a cura, especialmente para os casos de resistência a antibióticos. Outra particularidade de Mycobacterium tuberculosis, principal agente etiológico de TB, é a sua habilidade de sobreviver dentro de macrófagos, células imunológicas que são a primeira defesa no tecido pulmonar. Em uma busca de um tratamento eficaz, seguro, que promova uma entrega do antibiótico no local da infecção e, possivelmente, contribua para a adesão ao tratamento, propusemos uma abordagem nanotecnológica baseada em lipossomas funcionalizados, ou seja, com a superfície modificada com um análogo de sideróforo (Sid) para carrear moxifloxacino (Mox) para tratar TB para uma administração intrapulmonar. Os sideróforos são a principal estratégia das bactérias para captar ferro, um metal essencial para seu metabolismo. Foram desenvolvidos com fosfatidilcolina de soja, colesterol e ácido oleico, quatro lipossomas: lipossoma vazio (LipV); lipossoma contendo Mox (LipMox); lipossoma funcionalizado com Sid e sem fármaco (LipS) e lipossoma funcionalizado com Sid e contendo Mox (LipSMox). A caracterização dos lipossomas foi feita pela técnica de espalhamento de luz dinâmica (DLS), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Por todos os métodos, observamos partículas esféricas e de aproximadamente 200 nm. O potencial zeta foi a principal diferença entre eles, e foi aproximadamente -40mV para LipV e LipMox e +15mV para LipS e LipSMox. A NTA mostrou a concentração de ~1011 partículas/mL. Um método de quantificação de Mox em cromatografia líquida de alta eficiência foi desenvolvido e validado para determinar a eficiência de encapsulação (EE) e o perfil de liberação (RP). A EE foi 51,31% para LipMox e 45,76 % para LipSMox e a RP seguiu o modelo proposto por Korsmeyer-Peppas, comum para lipossomas. A concentração inibitória mínima (MIC) frente a M. tuberculosis foi determinada em condições padrão (pH 6,6 e [Fe] = 0,04 µg/mL), com acréscimo de ferro (múltiplos de 2x, 5x e 10x em relação ao meio comercial), pH 7,4 e acréscimo de 10% de soro fetal bovino (FBS). A alteração de pH do meio para 7,4 não afetou a MIC. A MIC de LipMox e LipSMox foram na maioria das vezes menor que 0,5%. Já LipS teve MIC próxima a 10% em todas as condições, exceto na presença de FBS (MIC >25%), em que há ferro ofertado, mas de não livre e sim complexado com ferritina. O ensaio de time-kill não mostrou diferença significativa entre Mox livre e encapsulada, a ação bactericida foi concentração-dependente. O ensaio de citotoxicidade foi realizado para quatro linhagens celulares: macrófagos (J774A.1), fibroblastos (MRC-5), células hepáticas (HepG-2) e células intestinais (Caco-2) e observou-se uma heterogeneidade nos resultados de índice de citotoxicidade (IC50) com maior toxicidade com lipossomas contendo Sid. A atividade frente a M. tuberculosis intramacrofágico apresentou reduções de mais de 90% dos bacilos intracelulares (LipMox 1 e 5%; Mox 1 e 5% e LipSMox 1%). A microscopia eletrônica de varredura e transmissão confirmaram a fagocitose das vesículas lipossomais pelos macrófagos, confirmando a possibilidade de um direcionamento natural dos lipossomas para células fagocíticas. Embora a funcionalização com Sid não trouxe melhora na atividade biológica dos lipossomas, ainda houve um direcionamento natural para os macrófagos, células de extrema importância na patogênese de TB. Diante das vantagens de drug delivery dos lipossomas, propõe-se uma administração intrapulmonar in vivo deste sistema para o tratamento de TB.
  • ItemTese de doutorado
    Prospecção de proteínas em cepas de Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) por meio de Shotgun
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-17) Falcone, Rossana [UNESP]; Rosa, João Aristeu da [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A tripanossomíase americana foi descrita em 1909, por Carlos Ribeiro Justiniano Chagas, essa zoonose é considerada uma das seis doenças negligenciadas mais prevalentes no mundo, estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas por T. cruzi. A diversidade biológica, bioquímica e genética entre cepas de T. cruzi é reconhecida há tempos, a análise genética de T. cruzi é complexa, seu genoma possui um total de 22 570 genes codificantes de proteínas e em seu proteoma foram identificados um total de 2 784 proteínas, dentre essas enzimas proteolíticas. As metaloproteinases compreendem uma família de endopeptidases zinco dependentes associadas a degradação de membranas em pH fisiológico, que variam quantitativa e qualitativamente em diferentes cepas e formas de T. cruzi. As enzimas proteolíticas parecem ter papel em diversos aspectos na interação parasito hospedeiro. Estudos sugerem que as proteases podem ser um fator adaptativo importante para T. cruzi e possivelmente atuarem como fator de virulência. Neste trabalho foi realizada a avaliação e comparação do perfil proteico das cepas Bolívia, Rm e Y de T. cruzi, assim como a caracterização de suas metaloproteinases por meio de shotgun. Para tanto executou-se análise por espectrometria de massas com a utilização de um sistema electrospray - Ion trap (ESI/IT), modelo Amazon SL (Bruker Daltonics, Bremen, Germany), acoplado a um sistema Ultra Fast liquid Chromatography (UFLC) (Nexera- Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan). Por meio de banco de dados específicos para T. cruzi foram identificadas 106 proteínas para a cepa Y, sendo 62 exclusivas. Para a cepa Rm foram identificadas 134 proteínas no total e 95 exclusivas. Para a cepa Bolívia foram identificadas 50 proteínas, dentre essas 33 foram consideradas exclusivas (Sugiro colocar na ordem alfabética, Bolivia, Rm, Y). As três cepas apresentaram oito proteínas em comum, entre as cepas Y e Rm observou-se vinte proteinas em comum, entre Rm e Bolívia foram encontradas apenas duas em comum. Seis são comuns a Y e Bolívia, o que mostra uma maior proximidade no perfil proteico entre Y e Rm, se comparadas a Bolívia. Tais proteínas puderam ser classificadas como responsáveis por atuar no metabolismo de T. cruzi, como chaperonas, no ciclo celular, na resposta ao stress, na interação entre o parasita e o hospedeiro e/ou como fatores de virulência. Foi possível notar maior presença de proteínas consideradas como possíveis fatores de virulência em Y e Rm quando comparado à Bolívia, o que poderia sugerir uma maior propensão das cepas Y e Rm apresentarem um perfil mais virulento em infecções. Foi possível identificar e classificar uma proteína como metaloprotease, a Glutamamyl carboxipeptidase, a proteína se mostrou comum as três cepas estudadas, foi identificada atuando no crescimento e 8 diferenciação do parasito. Conclui-se que foi possível a avaliação e comparação do perfil proteico das cepas Bolívia, Rm e Y de T. cruzi. Segundo os resultados obtidos há uma maior proximidade entre os perfis proteicos das cepas Y e Rm quando comparados à cepa Bolívia. A caracterização das metaloproteases por meio de shotgun se mostrou possível, apesar da baixa quantidade encontradas nas amostras analisadas.
  • ItemTese de doutorado
    Sensibilidade de biofilmes de Cryptococcus VNI e VGII à Anfotericina B e Maitenina
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2013-08-30) Benaducci, Tatiane [UNESP]; Mendes-Giannini, Maria José Soares; Fusco-Almeida, Ana Marisa [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os patógenos fúngicos mais comumente encontrados em infecções do sistema nervoso central, causando risco de vida por meningoencefalite e seus agentes podem crescer na forma de biofilme. No tratamento desta doença há poucas opções, além da problemática de resistência que pode estar também associada à formação de biofilmes. A procura por novos agentes antifúngicos, com reações adversas reduzidas, é necessária e os produtos naturais e seus derivados podem ser opções no tratamento das principais infecções fúngicas. Os objetivos deste estudo foram analisar isolados ambientais e clínicos de C. neoformans e C. gattii na forma planctônica e de biofilme, por diferentes técnicas de microscopia. Avaliar a sensibilidade a anfotericina B (AMB) e maitenina, molécula gerada a partir da planta Maytenus ilicifolia, bem como determinar a prevenção da formação de biofilmes, com base na análise de redução do 2,3-bis (2metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5 - [carbonilo (fenilamino)]-2H-tetrazólio-hidróxido (XTT) e na determinação da contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Foi analisada ainda, a virulência dos isolados ambientais e clínicos de C. neoformans e C. gattii, em um modelo alternativo, a Galleria mellonella, e, realizada a quantificação relativa dos genes LAC1, URE1 e CAP59, envolvidos na virulência, pelo método de PCR em tempo real. As atividades metabólicas dos biofilmes de C. neoformans e C. gattii foram reduzidas cerca de 50% após o tratamento com 32,0 mg/L de ambos os antifúngicos, AMB e maitenina, para todos os micro-organismos testados. Por outro lado, as formas planctônicas tiveram concentração inibitória mínima (CIM) entre 0,5-4,0 mg/L de maitenina para os isolados de Cryptococcus spp., e para AMB todos permaneceram na faixa de concentração entre 0,5-1,0 mg/L. As concentrações de maitenina encontradas neste estudo (32,0 mg/L) não foram tóxicas para células de queratinócitos (NOK). Os isolados de C. neoformans e C. gattii que passaram pela formação de biofilme se mostraram mais virulentos que as planctônicas em G. mellonella. Para os genes LAC1 e URE1, C. gattii apresentou níveis mais elevados de expressão (p<0,001) que C. neoformans (p<0,05), sugerindo que C. gattii exibiu fatores de virulência que poderiam contribuir para seu fenótipo de patógeno primário mais virulento e a condição de biofilme poderia contribuir com esse perfil. Desta maneira, nossos resultados contribuem para o melhor entendimento dos agentes da criptococose quanto aos aspectos da interação levedura-hospedeiro-antifúngico.
  • ItemTese de doutorado
    Estudo do sensor quinase QseC de Salmonella Typhimurium com análise transcriptômica e sequenciamento de inserção de transposon (TraDIS)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-08) Manieri, Fernanda Zani; Moreira, Cristiano Gallina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Sinalização química em bactérias patogênicas é um mecanismo empregado para interagir com o hospedeiro e sua respectiva microbiota. Através desta interação patógeno-hospedeiro ocorre a regulação da virulência em bactérias. Salmonella Typhimurium é uma bactéria de grande importância clínica muito utilizada no estudo da interação patógeno-hospedeiro. O estudo da sinalização química via QseBC e demais sistemas de dois componentes é essencial na compreensão das vias regulatórias que compõem o processo patogênico. O objetivo do trabalho é investigar o papel do sensor quinase QseC e demais mecanismos moleculares na regulação da virulência de S. Typhimurium, e elucidar o conjunto de genes essenciais para a sobrevivência de Salmonella ao estresse ácido. Desta forma, análises transcriptômica (RNA-seq) e computacionais foram direcionadas para análise da expressão de genes alvos via qRT-PCR, mutagênese via Lambda Red, ensaio de estresse ácido, sequenciamento via inserção de transposon dirigida (TraDIS), ensaio de motilidade, ensaio de resistência a peptídeos antimicrobianos e análise da eficácia do composto LED209 em camundongos. O RNA-seq evidenciou a alteração na expressão de 1371 genes após a deleção de qseC (cerca de 29% do genoma), sendo que 766 genes tiveram sua expressão reduzida e 605 genes tiveram expressão aumentada. Entre os principais resultados estavam processos de regulação de genes de virulência, metabolismo anaeróbico, modificações de membrana, montagem flagelar e secreção das flagelinas, motilidade, resistência a polimixina B, além de evidências de sua interação com o sistema de dois componentes PmrAB. A motilidade swarming apresentou redução na cepa mutante, apesar do aumento da secreção de flagelina detectada via Western blot. Também foi detectada a interação da proteína QseB com sua própria região regulatória e do gene ygiV. A análise via TraDIS revelou um conjunto de genes essenciais de resistência ao estresse ácido de Salmonella distinto dos descritos previamente para Escherichia coli, com destaque para genes que participam da resposta ao estímulo de temperatura. Desse modo, é notável a participação do sistema QseBC na regulação do metabolismo e virulência em S. Typhimurium, bem como a utilização de análises robustas têm sido promissoras para investigação de novos alvos e terapias anti-virulência.
  • ItemTese de doutorado
    Estudos moleculares e comportamentais do processo de olfação em Lutzomyia longipalpis (Diptera:Psychodidae)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-29) Machado, Vicente Estevam; Pinto, Mara Cristina; Thiemann, Otavio Henrique; Ignell, Rickard (exterior); Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Flebotomíneos são insetos transmissores de vírus, bactérias e protozoários, sendo a Leishmania spp. o de maior importância. Esses insetos utilizam sinais químicos na busca de alimentos, cópula e em outras fases da vida, e a ecologia química estuda esses sinas. Atualmente, têm se ampliado o número de estudos com ecologia química de vetores, ou seja, estudos que visam encontrar compostos voláteis que sejam atrativos ou repelentes para esses insetos, porém de forma geral a busca por esses compostos é realizada de maneira aleatória. A percepção dos compostos voláteis ocorre nas antenas e palpos dos insetos, onde proteínas ligam-se a compostos odorantes e os direcionam para os neurônios sensoriais olfativos, desencadeando respostas comportamentais. Por essa razão, o entendimento do processo de olfação mostra-se interessante para os estudos de ecologia química reversa, pois conhecendo os alvos desses atrativos/repelentes, é possível predizer quais classes de compostos são favorecidos para essa ligação. Outra abordagem, mais clássica, é a identificação dos cairomônios, compostos liberados por hospedeiros que desencadeiam respostas comportamentais em insetos. Para o grupo dos flebotomíneos, os estudos de ecologia química clássica são ainda incipientes, e a abordagem utilizando ecologia química reversa é praticamente nula. Com essa perspectiva, o presente estudo teve como objetivos: i) expressar proteínas de odor da espécie Lutzomyia longipalpis; ii) avaliar a atratividade de uma mistura de compostos desenvolvida através do odor humano em laboratório, por meio de túnel de vento para Lu. longipalpis, e em armadilhas colocadas em área com a presença dessa espécie. Com relação às proteínas de odor, foi possível a expressão de duas proteínas ligadoras de odorantes (10 e 14), que futuramente serão caracterizadas. A mistura de compostos apresentou atratividade tanto para fêmeas como para os machos de Lu. longipalpis em túnel de vento, apresentando uma resposta dose dependente. Os dados de campo indicaram uma tendência de efetividade da mistura na atração de Lu. longipalpis, principalmente a dosagem de 1:1000, e 1:10. Os resultados dos testes de atratividade em campo foram de uma região com baixa densidade de insetos, sendo necessário repetições futuras, e também em áreas com uma maior densidade de insetos.
  • ItemTese de doutorado
    Geração de anticorpos monoclonais murinos dirigidos a células prostáticas metastáticas: confecção de imunossensores eletroquímicos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-24) Fontes, Marina de Lima; Moroz, Andrei; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
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  • ItemTese de doutorado
    Caracterização do biofilme de Histoplasma capsulatum em diferentes condições de crescimento in vitro e identificação de proteínas na interação desses biofilmes com macrófagos alveolares murinos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-07-27) Gonçalves, Larissa Naiara Carvalho; Fusco Almeida, Ana Marisa; Costa Orlandi, Caroline Barcelos; Martinez, Luis R; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A histoplasmose é uma micose sistêmica, causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. Biofilmes são comunidades sésseis de microrganismos, que se agrupam de maneira organizada a um substrato ou que se aderem uns aos outros, e estão envolvidos por uma matriz extracelular que eles mesmos produzem. A capacidade desses fungos em formar biofilmes, um fenótipo que pode induzir resistência e aumentar a virulência, foi descrita. Além disso, também foi estabelecida uma correlação entre o modo de infecção de H. capsulatum e a formação dessas comunidades. O presente estudo teve como objetivo aprofundar o estudo dos biofilmes formados por diferentes cepas de H. capsulatum (EH-315, G186A e G217B), por meio da verificação da influência de quatro meios de cultura (BHI, HAM-F12, DMEM e RPMI) e diferentes atmosferas de oxigênio (microaerofilia e aerobiose) no desenvolvimento dessas comunidades. Adicionalmente, também objetivou-se estudar a interação entre células planctônicas e derivadas de biofilme após a infecção em macrófagos alveolares, verificando seu comportamento e sua capacidade de infecção, bem como averiguar a formação de biofilme em ambiente ácido, mimetizando o ambiente intracelular no macrófago e realizando uma análise proteômica por técnica de shotgun, a fim de identificar proteínas exclusivas nessas condições para a futura busca de alvos antifúngicos. A padronização do crescimento fúngico foi conduzida a partir da construção de curvas de crescimento, por meio de contagem de colônias, verificação da viabilidade celular com azul de Tripan e densidade óptica. A formação dos biofilmes foi caracterizada utilizando técnicas de microscopia óptica, e colorimétricas, como o ensaio de redução de XTT, coloração por cristal violeta e safranina, além de microscopia eletrônica de varredura (MEV) para observação das topografias. A interação com os macrófagos alveolares foi observada por microscopia de fluorescência e confocal para posterior análise proteômica em espectrômetro de massas. Nos ensaios de caracterização dos biofilmes, verificou-se que, embora todos os meios de cultura tenham estimulado a maturação das comunidades, o HAM-F12 proporcionou o melhor desenvolvimento de biomassa e material polissacarídico. Em relação às atmosferas de O2, ambas estimularam um excelente desenvolvimento das comunidades, porém, em condições de baixo O2, foi observada uma quantidade exuberante de matriz extracelular quando comparada aos biofilmes formados em aerobiose, principalmente no meio HAM-F12. Nos biofilmes formados em BHI, RPMI e DMEM observou-se uma reversão significativa do fenótipo de levedura para hifa, exigindo uma investigação mais aprofundada. Na interação com macrófagos, observou-se a formação de aglomerados fúngicos em macrófagos. No entanto, a formação dos aglomerados, bem como a fluorescência da marcação com o anticorpo anti-Hsp60 e o sofrimento celular foram mais expressivos na infecção com as células derivadas de biofilme. Além disso, as células derivadas de biofilme exibiram maior taxa de infecção após 1, 5 e 24 horas comparada as células planctônicas. O ambiente ácido não foi impeditivo para a formação de biofilmes maduros. Nos ensaios de proteômica, observou-se diferentes perfis proteicos nas condições testadas, com 72 proteínas exclusivamente expressas pelo biofilme quando comparado ao crescimento planctônico. A grande maioria dessas proteínas é relacionada a funções citoplasmáticas. Os dados proteômicos das células derivadas de biofilme também revelaram um aumento de proteínas envolvidas no estresse, defesa, virulência e na obtenção de energia e uma redução de proteínas envolvidas na síntese proteica e no processo metabólico. No proteoma da infecção pelas células derivadas do biofilme foram identificadas 6 proteínas exclusivas comparada ao controle (biofilme), a maioria classificadas como nucleares, permitindo um entendimento parcial sobre as vias associadas à sobrevivência e adaptação do fungo ao ambiente do hospedeiro. Esses resultados apresentam avanços no campo dos biofilmes e contribuem para estudos futuros que podem provar o papel dessas comunidades na interação patógeno-hospedeiro. Além disso, abrem novas possibilidades para o estudo de alvos com o intuito de estabelecer novas estratégias terapêuticas para histoplasmose.
  • ItemTese de doutorado
    Estudo da regulação transcricional por YgiV e da interação proteica de VisP na sinalização química e montagem do LPS na patogênese de Salmonella enterica sorovar Typhimurium
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-06) Silva, Patrick da [UNESP]; Moreira, Cristiano Gallina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Bactérias patogênicas empregam proteínas para responder a estímulos externos e ativar a patogenicidade. Salmonella enterica serovar Typhimurium apresenta a proteína VisP, a qual possui papel importante na resposta a estresse e na ativação das ilhas de patogenicidade SPI-1 e 2 (Salmonella Patogenicity Island 1 and 2). O gene visP está contido em um operon o qual também apresenta ygiV, que codifica um regulador transcricional da família AraC. O presente estudo avaliou e investigou a regulação transcricional realizada por YgiV e sua correlação com o sistema de dois componentes QseBC no processo patogênico. Realizou-se análise transcriptômica do mutante ΔygiV identificando-se 379 genes diferencialmente expressos comparado com a amostra selvagem. Dentre os genes com aumento de expressão em ΔygiV, 33 pertencem a SPI-1 com função de invasão de células epiteliais. A maioria dos genes com expressão reduzida codificam proteínas de catabolismo em geral, de açúcares, aminoácidos e ácidos nucleicos. Foi realizada uma massiva análise in silico de predição da função de YgiV, assim como determinação de uma sequência consenso de reconhecimento e interação com o fator de transcrição. Determinou-se uma provável interação de YgiV com a molécula 1,2-propanodiol. Ademais, através da identificação da sequência consenso dos elementos cis que sofrem ação reguladora de YgiV, foi predito o provável regulon de YgiV. Corroborando os dados de análise transcriptômica, foram identificados genes de SPI-1 e a via de fermentação de fucose à propionato. Ensaios de análise de expressão gênica sob superexpressão de YgiV confirmaram os dados de predição in silico. Também foi avaliada a expressão gênica de alguns alvos de SPI-1 e do operon pdu, responsável pela degradação de 1,2- propanodiol à propionato. Os resultados mostraram que a atuação natural de YgiV é acentuada em ambiente anaeróbio e que a presença de fucose afeta fortemente o efeito de sua função. Por fim, ensaios de invasão de células HeLa demonstraram que YgiV pode apresentar papel de repressor transcricional, função esta que pode ser intensificada conforme a concentração de 1,2-propanodiol aumenta. Estes resultados demonstraram o papel de YgiV de regulação transcricional no processo patogênico de invasão de células epiteliais mediado por S. Typhimurium e sua relação com açúcares presentes no lúmen intestinal. E que a via de produção de propionato é imprescindível para uma colonização intestinal efetiva por S. Typhimurium, processo que depende da regulação por QseBC e YgiV.
  • ItemTese de doutorado
    Production of carotenoids by yeast Rhodotorula glutinis CCT-2186 and their extraction using alternative solvents
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-01-21) Mussagy, Cassamo Ussemane [UNESP]; Pereira, Jorge Fernando Brandão; Coutinho, João Araújo Pereira; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    This thesis consists of the investigation and optimization of sustainable strategies to enhance carotenoids production from yeast Rhodotorula glutinis CCT- 2186 (R. glutinis) and their extraction by means of ionic liquids (ILs) and bio-based solvents. The interest on carotenoids such as β-carotene, torulene and torularhodin relies on the plethora of relevant properties of these products and their commercial value for food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries. However, to make carotenoids more accessible in a sustainable way, their production from microbial sources is of paramount importance. Concerning the production of carotenoids from R. glutinis yeast there are still processual challenges, such as the improvement of production yields and development of efficient and sustainable extraction platforms. Initially, different statistical experimental designs were applied to improve carotenoids production and the best bioprocess was scaled-up to a 5 L stirred-tank bioreactor. Since the carotenoids are produced intracellularly, requiring appropriate cell-disrupting and extraction methodologies for their recovery, subsequently, the development of more benign and effective extraction/purification platforms was evaluated. A comprehensive study using aqueous solutions of ionic liquids (ILs) for solid-liquid extraction (SLE) processes was carried out, following the carotenoids purification using a three-phase partitioning system composed of aqueous solutions of ILs and inorganic salts. To gather additional information on the phase separation mechanisms, aqueous biphasic systems (ABS) composed of ILs and inorganic salts were determined and characterized. Afterward, the potential of bio-based solvents was evaluated, with the purpose of designing a more efficient and ecofriendly extraction process for recovery of the intracellular carotenoids from R. glutinis. In this study it was designed and optimized an integrated downstream platform using a ternary mixture of bio-based solvents (ethyl acetate/ethanol/water) with isolation and polishing of carotenoids as well as the recycling of the solvents. The overall sustainability of the proposed technology was assessed in terms of solvents recyclability and carotenoids polishing, and the environmental impact of the platform through a life cycle assessment (carbon footprint). This thesis demonstrates the importance of combined organic and inorganic nitrogen sources to supplement the nutritional media for cultivation of R. glutinis and production of carotenoids, and that ILs and mixed bio-based solvents can be used to design simple, efficient and sustainable platforms for the recovery of intracellular carotenoids from microbial biomass.