Dissertações - Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) - IBRC

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    Utilização de xilose para a produção de ácido lático por isolados de Weizmannia sp. e abordagem da evolução adaptativa laboratorial
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-20) Santos, Larissa Provasi [UNESP]; Contiero, Jonas [UNESP]; Andrade, Fernanda Batista de; Coelho, Luciana Fontes [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O ácido lático é um ácido orgânico de grande ocorrência, utilizado em diferentes setores industriais, como farmacêutico, alimentício, cosmético e têxtil, ganhando destaque também por atuar como monômero na síntese de biopolímeros. Há duas formas de se obter o ácido lático, através da utilização de produtos de origem petrolífera, ou por meio de bioprocessos. Esse último já ocupa a maior parte do mercado produtor, mas ainda há obstáculos a serem superados, como a produção da biomolécula a partir de substratos de baixo custo, utilizando materiais lignocelulósicos que é um dos maiores desafios. Outro obstáculo é a purificação do ácido lático, pois os microrganismos produtores desse composto não toleram faixas muito baixas de pH, tornando-se indispensável o uso de agentes neutralizantes, como por exemplo, o carbonato de cálcio que podem gerar resíduos como o gesso. Com isso, o objetivo desse estudo foi isolar Weizmannia sp. produtora de ácido lático a partir de bagaço de cana-de-açúcar, e utilizar o planejamento experimental para otimizar a produção do metabólito. Adicionalmente realizar uma evolução adaptativa laboratorial (ALE) para obtenção de cepas resistentes a concentração do ácido no meio durante seu crescimento e produção da biomolécula. Os experimentos foram conduzidos em frascos Erlenmeyers e os isolados foram cultivados em meio xilose- extrato de levedura- peptona (XYP), contendo 20 g/L da fonte de carbono. A identificação dos isolados foi dada através da técnica de PCR do 16S rDNA, seguido de sequenciamento. O delineamento composto central rotacional (DCCR) foi realizado com os componentes do meio de cultivo, como fonte de carbono (xilose), fonte de nitrogênio (peptona e extrato de levedura) e acetato de sódio. A quantificação do ácido lático e o consumo da fonte de carbono foi realizada em HPLC. Dos isolados selecionados dois foram considerados promissores para a produção de ácido lático, sendo que Weizmannia coagulans BLMI apresentou maior produção de ácido lático em anaerobiose, chegando a 21,93±0,9 g/L e rendimento de 69,18 %, e a cepa Weizmannia ginsengihumi BMI foi capaz de produzir 19,79±0,8 g/L com um rendimento de 70,46 %. Por W. ginsengihumi ser uma espécie sem registros na literatura até o momento para a produção de ácido lático, o DCCR foi realizado com essa cepa. O DDCR mostrou que as variáveis fonte de carbono e nitrogênio tanto na forma linear quanto quadrática apresentaram influência na resposta, mas as interações das variáveis não tiveram significância (p < 0,05). E a variável que apresentou maior influência foi a xilose em nível linear. A análise de superfície de resposta indicou que as concentrações ótimas de fonte de carbono e fonte de nitrogênio foram 32,5 e 3,5 g/L, respectivamente, sem a necessidade de adicionar acetato de sódio ao meio de cultivo, levando à produção de 20,02±0,19 g/L e produtividade de 0,55 g/L/h após 36 horas de fermentação, e uma concentração de açúcar residual de 12,59±0,51 g/L. A fermentação utilizando os hidrolisados da semente de goiaba e bagaço de cana-de-açúcar apresentaram uma produção de ácido lático de 0,18±0,02 e 1,26±0,37 g/L, respectivamente, uma produção extremamente baixa quando comparado com a literatura. Nos ensaios da ALE, a bactéria W. coagulans BLMI passou por 71 transferências, totalizando 280 gerações, sendo capaz de suportar uma concentração de 90 mM de ácido lático com um pH do meio em 4,65. Nas fermentações com a cepa selvagem e a cepa evoluída, W. coagulans BLMI 171, sem a presença de agente neutralizante produziram 7,70±0,43 e 6,47±0,9 g/L, respectivamente após 48 horas de fermentação. Quanto a produção de ácido acético foi maior mesmo os ensaios sendo conduzidos em anaerobiose, BLMI produziu 7,96±0,35 g/L e BLMI 171 produziu 8,11±0,08 g/L após 48 horas de fermentação. Dessa forma, Weizmannia sp. foi capaz de fermentar a xilose para a produção de ácido lático em anaerobiose, apesar da cepa BMI não ser capaz de crescer e nem produzir o ácido lático a partir dos resíduos. BLMI demonstrou boa resistência cultivada em meio com pH de 4,65, mas para a produção de ácido lático são necessárias intervenções moleculares.
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    Produção e purificação da proteína recombinante humana SLPI a partir da microalga Chlamydomonas reinhardtii
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-28) Silva, Bárbara Luísa Chagas da; Luchessi, Augusto Ducati [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O inibidor de protease secretado por leucócitos (SLPI) foi primeiramente descrito em 1986. Desde então, é alvo de diversos estudos devido às suas variadas funções. A proteína SLPI desempenha diversos papeis no organismo humano, sendo que a principal é sua ação inibidora de serina – proteases. Devido à essa função, a SLPI têm um importante papel na manutenção da homeostase entre proteases e antiproteases no trato respiratório humano e na pele, agindo principalmente em respostas anti-inflamatórias contra agentes danosos ao tecido. Adicionalmente, a proteína SLPI também já foi caracterizada em mecanismos de cicatrização, metabolismo ósseo, câncer e apresenta propriedades antimicrobianas, antifúngicas e antivirais. Por ser uma proteína multifuncional, o potêncial terapeutico da SLPI é bastante explorado por pesquisadores e vem sendo testado em diferentes campos da ciência, como doenças respiratórias, neuroregeneração, cicatrização de feridas, e cardioproteção em situações de isquemia/reperfusão. Devido ao crescente interesse em pesquisas biotecnológicas visando a proteína SLPI como um bioproduto, diversas empresas passaram a produzir e comercializar a proteína em diferentes sistemas de expressão e produção. Porém, a SLPI ainda é vendida somente para fins de pesquisa científica à um custo muito alto. O mercado biotecnológico de produção e expessão de proteínas recombinantes têm avançado bastante nos últimos anos, e diversas plataformas estão sendo desenvolvidas, como plantas, animais transgênicos, células humanas e microalgas. As microalgas vem sendo muito utilizadas em pesquisas para biorremediação, desenvolvimento de ração e suplemento alimentar, e não há muito tempo, ganharam notável evidência como promissoras plataformas para produção de proteínas recombinantes. Esses organismos apresentam grande potencial como plataformas biotecnológicas para desenvolvimento de bioprodutos, pois são seres eucariotos, unicelulares, de rápido crescimento e com baixo custo de meio de cultura. À vista disso, o presente projeto teve como objetivo a produção e purificação da proteína recombinante humana SLPI a partir da microalga Chlamydomonas reinhardtii.
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    Um passo à frente no conhecimento do genoma da mosca praga Drosophila suzukii: identificação de novo e citogenômica comparativa de DNAs satélites em Drosophila suzukii
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-04) Silva, Rhavenna Thais Alves Gomes da; Cabral-de-Mello, Diogo Cavalcanti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A mosca Drosophila suzukii é uma espécie praga com grande importância econômica devido a sua distribuição mundial e ao seu hábito de oviposição que lhe permite atacar uma grande variedade de frutos. No contexto de DNA repetitivo e da contribuição e importância dessas repetições na evolução e compreensão da constituição genômica das espécies, os estudos voltados a essa fração de DNA em D. suzukii são escassos e restritos à descrição de alguns elementos transponíveis. Com o objetivo de aumentar as informações sobre a organização cromossômica e genômica de D. suzukii com foco na fração do DNA repetido em tandem, caracterizamos os cromossomos de D. suzukii através da análise convencional e bandeamentos cromossômicos. Identificamos DNAs satélites (DNAsat) através das ferramentas RepeatExplorer2 e TAREAN com dados de sequenciamento e utilizamos a Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) para caracterizar a distribuição de sequências repetidas em tandem (microssatélites, DNAs satélites, DNA ribossomal 18S e histona H4). Nossos resultados demonstram uma amplificação de heterocromatina no cromossomo II de D. suzukii e revelam uma heterocromatina enriquecida em microssatélites e conteúdo A+T sugerindo que microssatélites podem estar desempenhando um papel na expansão de heterocromatina nessa espécie, exceto no cromossomo Y. Nossos dados utilizando microssatélites e DNAsat demonstram que o cromossomo Y em D. suzukii deve ser constituído majoritariamente por sequências derivadas de elementos transponíveis. No total, foram identificados 15 DNAs satélites que representam cerca de 7.27% do genoma da espécie. A análise desses DNAs satélites revelou que outros elementos de DNA repetitivos como as famílias multigênicas e elementos transponíveis estão envolvidos na origem de DNAs satélites em D. suzukii e reforçou a conservação de DNAs satélites dentro do gênero Drosophila, como o DNAsat 1.688. A distribuição cromossômica de DNAsat, evidenciada por FISH, foi bastante variável tanto na heterocromatina e eucromatina, assim como nas diferentes regiões cromossômicas e no número de cromossomos. Esses dados fornecem a primeira descrição mais detalhada do genoma de D. suzukii e demonstram uma evolução genômica bastante heterogênea para essa espécie envolvendo repetições em tandem.
  • ItemDissertação de mestrado
    Avaliação morfológica e bioquímica em abelhas recém emergidas da espécie Scaptotrigona postica, Latreille 1807 (Hymenoptera, Apidae), expostas a clotianidina durante a fase larval
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-26) Camargo, Isabella Fernanda; Nocelli, Roberta Cornélio Ferreira [UNESP]; Rosa-Fontana, Annelise de Souza; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O Brasil é o país com maior biodiversidade de abelhas sem ferrão do mundo. Dentre as espécies, Scaptotrigona postica desempenha papel fundamental nos serviços de polinização de plantas nativas e cultivadas. No entanto, a saúde das populações desses polinizadores está sendo ameaçada devido a múltiplos fatores, dentre eles, o uso intensivo de agrotóxicos. Esses compostos químicos chegam à colmeia por meio de abelhas forrageiras e, uma vez lá, podem ser ingeridos pelas larvas durante a alimentação. No Brasil são utilizados diferentes grupos de agrotóxicos, entre eles a clotianidina, um ingrediente sistêmico, cujos efeitos são desconhecidos em larvas e adultos de abelhas S. postica. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo compreender os possíveis impactos da clotianidina por meio da: (I) investigação dos efeitos de concentrações realísticas de campo, na sobrevivência e desenvolvimento de larvas e adultos de abelhas S. postica; (II) avaliação da toxicidade deste inseticida na morfologia de tecidos de órgãos de metabolização de substâncias (intestino e túbulos de Malpighi) de recém emergidas; e (III) análise da atividade de enzimas relacionadas a desintoxicação (Carboxilesterase 3 – CaEs-3 e Glutationa-S-transferase - GST) e enzimas antioxidantes (Glicose-6-fosfato desidrogenase – G6PD e Glutationa peroxidase - GPx), nos órgãos supracitados de abelhas recém emergidas. Para que os objetivos fossem alcançados, foram realizadas sucessivas diluições no alimento para atingir as concentrações de clotianidina a serem oferecidas às larvas: 1 ng i.a./μL (concentração de campo) e 0,1 ng i.a./μL (concentração de campo/10), o alimento puro foi oferecido ao grupo controle. Após a distribuição do alimento (25 μL/larva) em placas de acrílico, larvas de primeiro instar foram coletadas e transferidas. Para os bioensaios in vitro, os efeitos foram observados de acordo com a progressão das fases de desenvolvimento: 5ª instar larval; defecação; taxa de mortalidade; taxa de pupação; taxa de emergência; mudança na coloração de olhos das pupas e; tempo em cada fase de desenvolvimento. Para as análises de alterações morfológicas, lâminas contendo secções dos órgãos sob coloração de hematoxilina e eosina foram analisadas. Para cada alteração observada foi levado em consideração o índice de relevância dos danos patológicos nos órgãos. Já para as análises de modulação da atividade das enzimas, os grupos expostos foram individualmente comparados com o grupo controle e diferenças significativas foram consideradas. Os dados obtidos foram submetidos a análises estatísticas no software RStudio. Os resultados demonstraram que a clotianidina afetou significativamente as taxas de sobrevivência, pupação e emergência das abelhas em ambos os grupos expostos, quando comparados ao controle. O tempo em cada fase de desenvolvimento apresentou significância estatística para o 5ª instar larval e defecação. Não houve diferença no tempo entre os grupos no período pupal, apenas em pupa de olho marrom, demonstrando que a clotianidina foi mais tóxica no período larval do que pupal. Os resultados das alterações morfológicas demonstraram que a clotianidina danificou severamente os órgãos analisados nos grupos expostos. Foram observadas alterações como perda de material citoplasmático; perda de borda em escova; aumento da eliminação de células para o lúmen; perda de ninhos de células regenerativas; inchaço celular e picnose. Já com relação aos resultados de atividade enzimática, a concentração de campo de clotianidina modulou diferencialmente a atividade das enzimas CaEs-3, GST e G6PD, com exceção da GPx. Os resultados obtidos são inéditos e contribuem para o desenvolvimento de medidas protetivas para a conservação da S. postica, uma vez que este estudo é o primeiro a avaliar os efeitos da exposição larval a clotianidina para essa espécie de abelha. Desse modo, esse trabalho fornece dados relevantes a serem incluídos nas investigações do IBAMA e nos esquemas de avaliação de risco ambiental de agrotóxicos para abelhas sem ferrão.
  • ItemDissertação de mestrado
    Estudo de mecanismos evolutivos envolvendo sequências repetitivas presentes no genoma de espécies de proceratophrys (amphibia, odontophrynidae
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-23) Destro, Raquel Fogarin; Parise-Maltempi, Patricia Pasquali [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Estudos recentes têm mostrado que DNAs satélites exercem importantes papéis biológicos, como a participação na organização dos centrômeros e na modulação da expressão gênica, em diversos organismos. O avanço e a modernização de tecnologias de sequenciamento genômico junto com ferramentas de bioinformática têm fornecido um aumento de informações sobre a organização, localização, número de cópias, tamanho de repetições, variabilidade de repetição, papel funcional e evolução de sequências repetitivas. Trabalhos que combinam essas análises com técnicas de biologia molecular vêm contribuindo para a compreensão de mecanismos evolutivos que possam estar ocorrendo dentro de grupos filogeneticamente relacionados. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo investigar se sequências de DNAs satélites, previamente encontradas no genoma de Proceratophrys boiei são compartilhadas entre espécies filogeneticamente relacionadas desse gênero e em caso afirmativo, se seguiam mecanismos evolutivos propostos para este tipo de sequência. As análises foram realizadas com base no sequenciamento genômico e análises de bioinformática visando a caracterização, mapeamento e análises de sequências em três espécies do gênero: Proceratophrys schirchi, Proceratophrys melanopogon e Proceratophrys laticeps. Como resultado, este estudo mostrou a presença do DNA satélite PboSat2-173 nas três espécies de Proceratophrys, com variação quanto à abundância e divergência de sequência nas diferentes espécies e com localização centromérica em todos os cromossomos de P. melanopogon e P. laticeps e nenhum sinal de hibridização para P. schirchi. O satélite PboSat3-189 também se mostrou presente nas espécies estudadas, no entanto, com localização espécie-específica e variação quanto à abundância e divergência de sequência. O resultado para ambos os satélites estudados corrobora então com o proposto pela hipótese da biblioteca para evolução de sequências de DNAs satélites Estudos recentes têm mostrado que DNAs satélites exercem importantes papéis biológicos, como a participação na organização dos centrômeros e na modulação da expressão gênica, em diversos organismos. O avanço e a modernização de tecnologias de sequenciamento genômico junto com ferramentas de bioinformática têm fornecido um aumento de informações sobre a organização, localização, número de cópias, tamanho de repetições, variabilidade de repetição, papel funcional e evolução de sequências repetitivas. Trabalhos que combinam essas análises com técnicas de biologia molecular vêm contribuindo para a compreensão de mecanismos evolutivos que possam estar ocorrendo dentro de grupos filogeneticamente relacionados. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo investigar se sequências de DNAs satélites, previamente encontradas no genoma de Proceratophrys boiei são compartilhadas entre espécies filogeneticamente relacionadas desse gênero e em caso afirmativo, se seguiam mecanismos evolutivos propostos para este tipo de sequência. As análises foram realizadas com base no sequenciamento genômico e análises de bioinformática visando a caracterização, mapeamento e análises de sequências em três espécies do gênero: Proceratophrys schirchi, Proceratophrys melanopogon e Proceratophrys laticeps. Como resultado, este estudo mostrou a presença do DNA satélite PboSat2-173 nas três espécies de Proceratophrys, com variação quanto à abundância e divergência de sequência nas diferentes espécies e com localização centromérica em todos os cromossomos de P. melanopogon e P. laticeps e nenhum sinal de hibridização para P. schirchi. O satélite PboSat3-189 também se mostrou presente nas espécies estudadas, no entanto, com localização espécie-específica e variação quanto à abundância e divergência de sequência. O resultado para ambos os satélites estudados corrobora então com o proposto pela hipótese da biblioteca para evolução de sequências de DNAs satélites
  • ItemDissertação de mestrado
    Características estruturais e ultraestruturais da língua de camundongos mdx
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-26) Tomiate, André Neri [UNESP]; Ciena, Adriano Polican [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A distrofia muscular de Duchenne (DMD) consiste em uma patologia ligada ao cromossomo X que acomete humanos e caracteriza-se por ciclo de degeneração e regeneração das fibras musculares, ocasionando na deposição de tecido conjuntivo e adiposo na musculatura. Nos estágios iniciais, o comprometimento motor é característico, entretanto outras regiões também apresentam alterações, como as musculaturas da cavidade oral. Associadas na deglutição alimentar, os diferentes músculos mastigatórios apresentam alterações que causam dificuldades na deglutição. Para o estudo da DMD, o modelo animal mais utilizado é o camundongo mdx, apesar de existir a caracterização da musculatura da língua, as repercussões na mucosa lingual ainda não foram evidenciadas. O objetivo do presente estudo consistiu em descrever as alterações morfológicas estruturais e ultraestruturais do epitélio, lamina própria e musculatura da língua de camundongos mdx. Foram utilizados 40 camundongos com 6 meses de idade organizados em dois grupos: Grupo Controle: n = 20 (C57BL/10) e mdx: n = 20 (C57BL/10mdx). As amostras foram processadas para análises estruturais, tridimensionais e ultraestruturais sob técnicas de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão. Estavam presentes papilas filiformes cônicas e triangulares, fungiformes, folhadas e valadas, e seus respectivos tecidos conjuntivos associados. As papilas triangulares filiformes apresentaram múltiplas pontas devido a maior desgaste. O epitélio foi caracterizado estratificado em camadas: córnea, granulosa, espinhosa e basal, o grupo mdx apresentou maior espessura nas diferentes regiões do corpo da língua. A lâmina própria possui composição de fibras de colágeno de coloração avermelhada e esverdeada, no grupo mdx, houve maior densidade de fibras colágenas. A região da submucosa apresentou glândulas mucosas e serosas com a presença de colágeno adjacente, aumento da área das glândulas mucosas e diminuição das serosas no grupo mdx. A musculatura dos camundongos mdx foi caracterizada pela grande deposição de colágeno entre as fibras, miocitólise e foco inflamatório. Em conclusão, a língua de camundongos mdx com 6 meses de idade teve os aspectos morfológicos, estruturais e ultraestruturais evidenciados, a distrofia proporcionou alterações indiretas na morfologia na espessura epitelial e desgaste das papilas, e direta na composição da lâmina própria, submucosa e musculatura dos camundongos mdx.
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    Uso sustentável do lodo de tratamento de água e esgoto: efeitos fitotóxicos, genotóxicos e possibilidade de uso antes e depois da biorremediação
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-01) Souza, Ana Cristina Zullo de; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Morales, Dânia Elisa Christofoletti Mazzeo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O crescimento da densidade populacional vem contribuindo, cada vez mais, para o aumento dos níveis da poluição dos recursos hídricos, o que vem causando severos danos aos ecossistemas associados. Como esses impactos podem atingir as águas utilizadas no abastecimento público, têm sido cobradas das Estações de Tratamento de Água (ETA) uma alta eficiência de seus processos, para que sejam atingidos os índices desejados de potabilidade da água. Do mesmo modo, as Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) devem remover, efetivamente, os poluentes orgânicos, inorgânicos e patógenos dos efluentes, antes dos mesmos serem descartados nos corpos receptores, visando a assegurar a qualidade ambiental. Embora a potabilidade da água seja obtida nas ETA e grande parte das partículas potencialmente tóxicas seja removida dos efluentes urbanos pelas ETE, estas estações de tratamento também produzem resíduos, como os lodos de ETA (LA) e de ETE (LE), que podem conter inúmeros contaminantes prejudiciais aos organismos, que coloca em risco tanto a biota exposta como a saúde humana. Desta forma, existe uma preocupação quanto a disposição desses lodos, que não devem ser descartados in natura, e sim submetidos a processo de detoxificação, antes de serem encaminhados ao seu destino final. Dentre as possíveis formas de detoxificação desses resíduos, destaca-se o processo de biorremediação, prática esta que pode ser ainda maximizada pela técnica de bioestimulação. Essa técnica pode ser implementada pela adição de subprodutos agroindustriais ao substrato a ser degradado, que promovam uma melhor aeração e também um maior aporte de nutrientes ao sistema que, consequentemente, levará a uma maior efetividade microbiana na degradação. Este estudo teve como objetivo monitorar a efetividade da detoxificação de LA e LE, associados a fibra de coco (FC) e ao composto exaurido (CE) do fungo lignolítico Pleorotus ostreatus (, em diferentes tempos de degradação (T1 = 0; T2 = 30; T3 = 90 e T4 = 150 dias), por meio de bioensaios ecotoxicogenéticos com Allium cepa e de fitotoxicidade com Lactuca sativa, bem como avaliar o potencial agronômico do composto biorremediado, após 150 dias, utilizando plântulas de L. sativa e Zea mays. As amostras estudadas foram LE; LA; LA+FC; LA+FC+CE; LA+FC+LE e LA+FC+LE+CE). Além disso, foi realizada uma revisão das informações sobre os aspectos ecotoxicológicos e implicações para o aproveitamento desses resíduos provenientes das estações de tratamento de água e esgoto. Os resultados mostraram que, para o teste de fitoxicidade, foi observado indução de toxicidade para o bioindicador L. sativa, para todas as associações testadas do T1 ao T3, exceto para LA+FC. Após 150 dias (T4), todas as amostras estimularam o crescimento de L. sativa. 17 Já, na avaliação do potencial agronômico pôde-se observar que as misturas foram mais satisfatórias para o cultivo de L.sativa quando comparadas a Z. mays. Os resultados referentes ao teste com A. cepa, demonstraram que, para o parâmetro de citotoxicidade, algumas amostras foram tóxicas ao bioindicador, apenas no tempo inicial de biorremediação, e que a mistura LA+FC apresentou citotoxicidade no T3 (90 dias). Quanto à genotoxicidade, os resultados apontam que nenhuma das amostras apresentou potencial genotóxico para a espécie A. cepa. N a avaliação do potencial mutagênico em células meristemáticas de A. cepa apontaram que as associações LA; e LA+FC+CE (T1); LA e LA+FC (T2); LA+FC e LA+FC+CE (T3) foram estatisticamente mutagênicas, quando comparadas ao CN. Já, para o potencial mutagênico em células da região F1 de A. cepa, os resultados demonstraram que os micronúcleos estatisticamente significativos encontrados nas células meristemáticas não prgrediram para as células da região F1 do vegetal. Para o uso das misturas aqui analisadas (LA, LA+FC, LA+FC+CE, LA+FC+LE e LA+FC+LE+CE), como condicionantes de solos agricultáveis, seria necessário monitorar, toxicologicamente, os produtos obtidos na biorremediação, para a certificação da sua adequação para o uso pretendido. Essa necessidade é justificada pelo fato de algumas misturas terem sido mais satisfatórias para o cultivo de L. sativa do que para Z. mays, uma vez que induziram a diminuição da biomassa seca radicular de Z. mays e que os resultados da análise química apontaram um aumento de concentração de metais, durante o processo de biorremediação.
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    Evolution of multigene families in species with large genomes using Schistocerca grasshoppers as models
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-04) Martí, Emiliano; Cabral-de-Mello, Diogo Cavalcanti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As famílias multigênicas são componentes essenciais dos genomas eucarióticos e desempenham papéis-chave tanto estrutural como funcional. Seus modos de evolução permanecem elusivos mesmo na era da genômica, pois múltiplas sequências de famílias multigênicas coexistem em genomas, particularmente em grandes genomas repetitivos. Aqui, eu estudo os padrões de evolução das famílias multigênicas 18S rDNA, U2 snDNA, e histona H3 em dez espécies de Schistocerca, um gênero de gafanhotos com genomas grandes e repetitivos. Usando genomas sequenciados e mapeamento com FISH, encontrei diferenças substanciais entre as famílias multigênicas, incluindo o número de grupos cromossômicos, alterações na abundância e composição de nucleotídica, pseudogenização e associação com elementos transponíveis (TEs). A análise intragenômica de S. gregaria empregando sequenciamento de long-reads e montagem do genoma revela alta conservação na histona H3, assim como recorrente pseudogenização nas famílias genicas 18S rDNA e U2 snDNA, provavelmente promovida pela associação com TEs. Notavelmente, os TEs que estavam associados frequentemente com cópias truncadas revelaram características de atividade recente. Nossos resultados sugerem um efeito combinado dos modelos de evolução concertada e de nascimento e morte na evolução de famílias multigênicas em Schistocerca nos últimos oito milhões de anos, e a ocorrência de rearranjos intra e intercromossômicos modificando os padrões de distribuição cromossômica. Apesar do cariótipo conservado em Schistocerca, nossa análise destaca a extensa reorganização dos DNAs repetitivos no genero, contribuindo para o avanço da genômica comparativa para este importante gênero de gafanhotos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Avaliação da eficiência do processo de tratamento convencional utilizado em uma ETA e os impactos promovidos pelos seus efluentes sobre os rios receptores
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-31) Gigeck, Letícia de Souza; Morales, Maria Aparecida Marin [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os recursos hídricos vêm sofrendo diferentes ameaças, a contaminação por uma infinidade de compostos com potencial tóxico. Assim, antes da água ser distribuída para a população, a água bruta precisa ser submetida a um processo de tratamento realizado pelas Estações de Tratamento de Água (ETA). As ETA utilizam etapas, os quais são utilizados compostos químicos, realizados os processos de filtração e desinfecção, para assegurar a qualidade da água a ser distribuída para a população. Contudo, durante o tratamento da água bruta, são gerados resíduos advindos da lavagem dos filtros e dos decantadores, que devem ser tratados, antes de serem descartados em recursos hídricos. A ETA localizada no município de Rio Claro (SP) lança seus resíduos sem tratamento prévio no Córrego Santo Antônio, afluente do Ribeirão Claro. Portanto, o presente estudo avaliou a qualidade da água bruta, captada pela ETA, as águas dos corpos hídricos receptores (pós descarte dos efluentes da ETA), da água destinada ao consumidor. A avaliação da qualidade das águas dos pontos analisados foi baseada em ensaios ecotoxicológicos, e em análises físico-químicos e microbiológicos. Foram realizados ensaios in vivo de fitotoxicidade, com Lactuca sativa e de citogenotóxico e potencial mutagênico com o Allium cepa; ensaios in vitro de citotoxicidade (MTT); genotóxico (ensaio do Micronúcleo com Bloqueio de Citocinese e ensaio do Cometa) com cultura de células HepG2/C3A. Foram realizadas três amostragens de diferentes pontos (duas no período de seca e uma no chuvoso) nos seguintes pontos: água de captação da ETA (CAP); água do Córrego Santo Antônio sem o lançamento do efluente da ETA (SAS); água do Córrego Santo Antônio com o lançamento do efluente da ETA (SAE); amostra a montante do recebimento do efluente da ETA no Ribeirão Claro; (RCM); amostra a jusante do lançamento do efluente da ETA coletada no Ribeirão Claro no ponto de mistura completa (RCJ); água do cavalete do consumidor (AAP). No Córrego Santo Antônio foram observados elevados níveis de pH e condutividade, baixa concentração de oxigênio, aumento da turbidez e salinidade, elevação da concentração de nitrogênio total, elevado valor de DBO, uma maior presença de coliformes totais e Escherichia coli. Nenhuma das amostras de água foram fitotóxicas para o L. sativa, com exceção da RCM, para a primeira coleta. A amostra APP foi genotóxica para A. cepa, para a primeira e as amostras SAS, RCM, RCJ e APP para a terceira coleta; todas as amostras foram não citotóxicas para as células HepG2/C3A; o SAS apresentou potencial genotóxico pelo ensaio do Micronúcleo com as células HepG2/C3A na segunda e terceira coleta. O Córrego Santo Antônio mostrou ser extremamente vulnerável a ação antrópica e pelo lançamento do efluente da ETA. O Ribeirão Claro não foi afetado drasticamente pelo lançamento do resíduo da ETA. A água de abastecimento público ficou dentro da maioria dos padrões físico-químicos estabelecidos pela legislação, sendo que o flúor ficou um pouco abaixo da legislação, na primeira coleta. O APP também apresentou potencial genotóxico, na segunda coleta, para o ensaio do Micronúcleo e na primeira coleta no ensaio do Cometa. Assim, o processo de tratamento da água não se mostrou eficiente, e apresentou um potencial genotóxico, provavelmente, relacionado com a formação de subprodutos da desinfecção por cloro.
  • ItemDissertação de mestrado
    Understanding the evolution of satellite DNAs at intraspecific level by analysis of the library in the holocentric pest aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-29) Santos, Lucas Albuquerque dos; Mello, Diogo Cavalcanti Cabral de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A evolução da biblioteca de DNA satélite é um campo de pesquisa muito relevante, pois a composição e o arranjo dessas sequências têm impacto na arquitetura do genoma e seu papel funcional ainda é pouco conhecido. Existe uma dificuldade em estudar esse tipo de material genético. Devido às limitações tecnológicas, o sequenciamento genômico moderno tende a subestimar a quantidade de DNA repetitivo e isso desafia uma análise mais precisa. No entanto, um excelente trabalho tem sido desenvolvido com a disseminação de sequenciamentos de alta cobertura, permitindo uma investigação mais aprofundada das espécies e comparação entre os grupos. Este trabalho propõe uma contribuição envolvendo a investigação da hipótese da biblioteca de DNA satélite e sua evolução em concerto em nível intraespecífico usando 16 populações da espécie de pulgão praga agrícola Acyrthosiphon pisum. Esta espécie, que carrega cromossomos holocêntricos, é caracterizada por sua especialização em diferentes plantas hospedeiras, tornando-se um modelo chave para análise populacional e diferenciação genética. Aqui, usamos a plataforma RepeatExplorer para prospectar famílias de DNA de satélite em genomas de A. pisum disponíveis no banco de dados NCBI. Construímos uma biblioteca com sequências confiáveis e comparamos a abundância e divergência dessa biblioteca em cada genoma e também em 3 outras espécies de afídeos com o software RepeatMasker. Descobrimos que a maioria das famílias de satélites são compartilhadas entre os biótipos e espécies irmãs, mas com variedade marcada em abundância e homogeneização. Também analisamos a abundância desta biblioteca em montagens cromossômicas de leitura longa de uma linhagem e encontramos um maior acúmulo de famílias de satélites no cromossomo X. Nossos resultados contribuem com a literatura recente no entendimento da evolução da biblioteca de DNA satélite em geral e neste importante modelo. Palavras-chave: DNA repetitivo, diferenciação genômica, cromossomo holocêntrico, bioinformática
  • ItemDissertação de mestrado
    Caracterização cromossômica de Diatraea saccharalis (Crambidae, Lepidoptera) com ênfase nos cromossomos sexuais e DNAs repetitivos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-08) Silva, Ana Elisa Gasparotto da; Cabral-de-Mello, Diogo Cavalcanti [UNESP]; Bardella, Vanessa Bellini [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A família de mariposas Crambidae incluem representantes que causam prejuízos econômicos às lavouras agrícolas, como a broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis. Embora espécies de Crambidae apresentem extensa radiação adaptativa e importância econômica, pouco se sabe sobre sua arquitetura genômica e evolução cromossômica. Neste trabalho, caracterizamos os cromossomos e DNAs repetitivos de D. saccharalis, através do sequenciamento genômico e associação de métodos citogenéticos e bioinformáticos, com ênfase nos cromossomos sexuais. O número diploide foi diferente entre os sexos, i.e., 2n = 33 (fêmeas) e 2n = 34 (machos), além disso, foi observado a ocorrência de um sistema sexual múltiplo WZ₁Z₂/Z₁Z₁Z₂Z₂. A sonda telomérica revelou um forte sinal intersticial no cromossomo W e este cromossomo foi associado a dois cromossomos Z (Z₁ e Z₂), confirmando a presença do trivalente sexual WZ₁Z₂ como resultado de uma fusão cromossômica. Acerca dos DNAs repetitivos, os Elementos de Transposição (TEs) representaram cerca de 39,18% (machos) a 41,35% (fêmeas) enquanto que os DNAs satélites (DNAsat) representaram apenas 0,214% do genoma de machos e 0,215% de fêmeas. O mapeamento por FISH revelou distinta organização cromossômica para os DNAsat, como único sinal clusterizado, sinais dispersos e repeats não clusterizados. Os dois TEs mapeados apresentaram sinais espalhados. Embora nota-se um pequeno enriquecimento de alguns DNAsat no genoma de fêmeas, eles não foram diferencialmente enriquecidos no cromossomo W. Entretanto, notamos o enriquecimento dos sinais de TEs no cromossomo W, sugerindo seu envolvimento na degeneração e diferenciação deste cromossomos. Esses resultados revelam o dinamismo da estrutura geral do cariótipo e DNAs repetitivos em D. saccharalis, principalmente como resultado de fusão cromossômica e disseminação ou amplificação local de DNAs repetitivos. Por fim, nossos dados contribuem para o entendimento geral do genoma das espécies que podem auxiliar em futuros estudos genômicos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Caracterização e avaliação dos aspectos fitotóxicos e citogenotóxicos do organofosforado clorpirifós, por meio de ensaios in vivo e in vitro
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-04) Costa, Mariana Santos; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os agrotóxicos são usados no Brasil como a principal estratégia para combater e/ou prevenir pragas agrícolas. O crescente uso desses químicos tornou o país um dos líderes mundiais no consumo dessa substância. O uso contínuo e irregular dos agrotóxicos pode gerar efeitos adversos tanto aos ecossistemas como uma ameaça à saúde pública. Dentre os agrotóxicos disponíveis para utilização, se destacam os pertencentes a classe dos organofosforados, considerados um dos principais responsáveis por intoxicações e óbitos por agrotóxicos registrados no Brasil. O organofosforado clorpirifós, que é muito utilizado no Brasil, exerce sua ação tóxica pela inibição da enzima acetilcolinesterase, o que resulta em excesso de acetilcolina nas sinapses colinérgicas, promovendo sinais e efeitos diversos. Tendo em vista o potencial que esse químico tem em causar alterações citogenotóxicas e mutagênicas, esse trabalho objetivou avaliar diferentes concentrações de clorpirifós, para investigar o seu potencial citogenotóxico e mutagênico, por testes com bioindicadores vegetais e com células de hepatoma humano (C3A). Os bioindicadores vegetais utilizados neste estudo foram Lactuca sativa, para avaliação do potencial fitotóxico (ensaios de germinação e de inibição do crescimento de radícula e hipocótilo), Allium cepa, para as avaliação dos potenciais tóxico e cito genotóxico (ensaios de germinação, de índice mitótico e de aberrações cromossômicas - AC) e investigação do potencial mutagênico (ensaio do micronúcleo – MN, em células F1). Para os ensaios com organismos vegetais, foram testadas seis concentrações do inseticida Clorpirifós: C1: 10 mg mL-1 (concentração de uso na agricultura), C2: concentração de 5 mg mL-1; C3: concentração de 2,5 mg mL-1; C4: concentração de 1, 25 mg mL-1 ; C5: concentração de 0,625 mg mL-1; C6: concentração de 0,3125 mg mL-1. Os resultados com Allium cepa mostraram potencial fitotóxico para C1, C2 e C3. Já os ensaios de avaliação dos potenciais genotóxico e mutagênico, que foram avaliado apenas com C3, C4, C5 e C6, mostraram resultados estatisticamente diferentes do controle negativo para C3, C4, C5. Os ensaios com células HepG2 foram primeiramente realizados com as concentrações acima citadas (C1 a C6), mas, como todas as concentrações foram citotóxicas, pelo ensaio do MTT, houve a necessidade de diminuir as concentrações (C7: 0,15625 mg mL-1; C8: 0,078 mg mL-1; C9: 0,039 mg mL-1 e C10: 0,019 mg mL-1). Essas concentrações foram então utilizadas tanto no teste de citotoxicidade do MTT como nos demais ensaios colorimétricos (do Azul de Tripan e Resazurina). O teste do MTT mostrou que, somente C9 e C10 não foram citotóxicas. Quanto aos ensaios de resazurina, todas as concentrações foram citotóxicas. Pelo ensaio do azul de tripan, somente a concentração C7 foi tóxica. Adicionalmente aos ensaios realizados com os bioindicadores, foi feita uma ampla revisão bibliográfica em bases de dados científicas disponíveis, sobre o potencial poluidor dos organofosforados, o uso do inseticida clorpirifós na agricultura brasileira e os bioensaios mais utilizados e indicados para a avaliação da toxicidade desse grupo. Os dados desta pesquisa realizada na literatura científica foram compilados em um artigo de revisão, que também faz parte do conteúdo dessa dissertação.
  • ItemDissertação de mestrado
    Citogenotoxicidade de solo contaminado por necrochorume e toxicidade de aminas biogênicas derivadas de processos putrefativos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-04) Souza, Letícia Rosa de; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O ritmo acelerado do crescimento demográfico vem contribuindo para para o aumento dos níveis de poluição ambiental. Uma das atividades humanas que vem se destacando como muito poluidora é a prática de sepultamento em cemitérios. Embora o ato de enterrar os corpos seja quase tão antigo quanto a própria humanidade, só recentemente os cemitérios têm sido considerados e discutidos como importantes fontes poluidoras. Apesar de existirem leis ambientais que regem a instalação e o funcionamento das necrópolis, esses ambientes continuam sendo grandes centros de contaminação química e biológica, com destaque aos compostos orgânicos, como as aminas biogênicas cadaverina (C5H14N2) e putrescina (C4H12N2). Essas aminas são encontradas naturalmente nas células, porém, quando elas estão presentes no meio ambiente em altas concentrações podem levar a problemas ambientais e também à saúde humana. O porco doméstico (Sus scrofa domesticus L.) é considerado um modelo animal com características de cadaverização semelhantes às humanas, por isso muito utilizado em experimentos que envolvem o processo de decomposição cadavérica. O solo desempenha um papel muito importante na filtragem de metais, micro-organismos e substâncias resultantes do processo de decomposição biológica, porém ainda existem poucos estudos que abordem os poluentes inerentes às atividades de decomposição cadavérica, comum em ambientes de cemitérios. Neste mesmo contexto, ainda são escassos os estudos sobre a real ação desses poluentes sob o meio biológico. Desta forma, pelo aumento constante das atividades cemiteriais e pela lacuna de informações sobre os efeitos de seus poluentes, existe uma necessidade urgente de se desenvolver estudos que possam melhor esclarecer os possíveis impactos, tanto ao ambiente como à saúde humana, das práticas de inumação dos corpos. O presente estudo realizou uma ampla revisão sobre aminas biogênicas associadas a processos putrefativos, que permitiu a elaboração de um artigo. Este trabalho também simulou uma contaminação de cemítério, por meio de inumação de uma carcaça suína, e avaliou os efeitos biológicos dos contaminantes derivados da decomposição cadavérica. A fitotoxicidade foi avaliada pelo índice de germinação de sementes e mensuração do eixo hipocótilo-radicular de Lactuca sativa. Os testes de citotoxicidade, genotoxicidade e potencial mutagênico foram realizados pelos parâmetreos de Índice Mitótico (IM), indução de Aberrações Cromossômicas (AC) e de Micronúcleo (MN), respectivamente, com a espécie Allium cepa, além de uma revisão das informações sobre a toxicidade de aminas biogênicas derivadas de processos putrefativos. Os nossos resultados mostraram que, os componentes do necrochorume interferiram no desenvolvimento das raízes e do hipocótilo e induziram aberrações cromossômicas e nucleares nos bioindicadores vegetais utilizados neste estudo. As informações obtidas nesse estudo podem dar um maior suporte aos órgãos competentes para elaboração de leis, além de alertar para as possíveis consequências dos impactos ambientais da atividade cemiterial e suas consequências para a saúde humana.
  • ItemDissertação de mestrado
    Potencial tóxico de tinturas capilares oxidativas e não oxidativas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-03) Lima, Maria Gabriela Franco de; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O cabelo humano, assim como qualquer outro pelo de mamíferos, tem como função a proteção e regulação da temperatura corporal, pela facilitação dos processos de transpiração e evaporação. Contudo, essa estrutura também é um importante elemento estético do indivíduo, pois dá forma ao rosto e contribui para a construção da identidade pessoal. Sabe-se que desde a antiguidade, os povos utilizavam diversos elementos naturais para tingir os cabelos, porém, foi só no início do século XX que a primeira tintura sintética foi produzida. Atualmente, as tinturas capilares sintéticas são amplamente utilizadas por homens e mulheres em todo o mundo. Diante desse contexto, surgiu a necessidade de conhecer os reais efeitos desses produtos sobre à saúde humana e também os possíveis impactos que possam causar ao meio ambiente, pois, esses compostos estão presentes em efluentes industriais e de estações de tratamento de esgoto urbano, podendo, assim, contaminar, inclusive recursos hídricos destinados ao consumo humano. Uma forma de se estudar os possíveis efeitos tóxicos das tinturas capilares é por meio de ensaios com bioindicadores, pois estes permitem entender os mecanismos de ação biológica de compostos químicos. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo estudar o potencial fitotóxico e citogenotóxico da tintura capilar oxidativa (permanente) de coloração castanha média (grupo colorimétrico de número 4), em três diferentes formulações: tinturas em pó e em creme, sendo a em creme testada com e sem associação com peróxido de hidrogênio (H2O2). A avaliação da fitotoxicidade das tinturas foi realizada por meio dos ensaios de germinação com Lactuca sativa e Allium cepa e crescimento radicular e do hipocótilo com L. sativa. A citogenotoxicidade, por sua vez, foi avaliada por meio do ensaio de aberrações cromossômicas e nucleares, realizados com o bioindicador A. cepa. Adicionalmente aos ensaios processados com os bioindicadores vegetais, foi também realizada uma ampla revisão sobre os efeitos tóxicos de azocorantes utilizados na formulação de tinturas capilares não oxidativas (do tipo temporárias e semipermanentes), que permitiu a elaboração de um artigo de revisão sobre o assunto. Os ensaios de fitotoxicidade mostraram que a reação da tintura capilar com H2O2 induziu diferenças nos parâmetros avaliados, mostrando que a tintura pode se tornar mais tóxica, após oxidação. Tanto a tintura associada com H2O2 como a em pó induziram diminuição do índice mitótico. Já a tintura não oxidada (sem H2O2) induziu aberrações cromossômicas e nucleares, indicando que os demais componentes presentes na formulação da tintura, como aminas aromáticas, já possuem potencial citogenotóxico. Os resultados encontrados nos ensaios com modelos vegetais expostos a tinturas oxidativas, bem como o que foi encontrado e reportado na revisão bibliográfica a respeito de tinturas não-oxidativas enfatizam que os componentes das tinturas capilares, seus produtos de oxidação e de metabolização apresentam efeitos nos organismos testados nos mais diversos níveis de toxicidade. Tal fato implica o risco que esses compostos apresentam tanto para seres humanos, que possuem contato direto com os produtos, quanto para o meio ambiente, uma vez que tanto os componentes das tinturas, quanto substâncias derivadas da sua oxidação e metabolização são encontrados em efluentes de indústrias e salões de beleza e podem, por consequência, atingir cursos d’água e contaminar e se bioacumular em outros organismos vivos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Os óleos essenciais de Egletes viscosa (Asteraceae) e Lippia schaueriana (Verbenaceae) e seus potenciais efeitos sobre a biologia reprodutiva e a morfologia (órgão de Gené, ovário e singânglio) de carrapatos Rhipicephalus sanguineus sensu lato (Acari: Ixodidae) e sobre o fígado e a tireoide de camundongos Mus musculus a eles expostos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-03) Pereira, Melissa Carolina [UNESP]; Camargo, Maria Izabel Souza [UNESP]; Anholeto, Luís Adriano; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os dados obtidos no presente trabalho comprovam o potencial acaricida dos óleos essenciais (OEs) de Egletes viscosa Less. e Lippia schaueriana Mart., nas concentrações de 12.5, 25 e 50 mg/mL, em fêmeas ingurgitadas do carrapato-do-cão Rhiphicephalus sanguineus sensu lato (s. l.). Ambos os OEs obtiveram um rendimento de 1.2% v/m e as análises químicas identificaram 27 componentes presentes em E. viscosa e 18 em L. schaueriana, sendo seus componentes majoritários o acetato de cis-isopinocarveíla (68.41%) e o óxido de piperitenona (64.36%), respectivamente. Estes compostos foram capazes de provocar alterações nas taxas de oviposição e viabilidade dos ovos nas concentrações de 25 e 50 mg/mL. O percentual de controle de E. viscosa foi de 58.9%, 70.8% e 92.7% nas concentrações de 12.5, 25 e 50 mg/mL, respectivamente. Nas mesmas concentrações, a eficácia de L. schaueriana foi de 39.3%, 53.4% e 84.6%. Ambos os OEs, em todas as concentrações e de maneira dose-dependente, provocaram severas alterações na morfologia dos ovos produzidos pelas fêmeas a eles expostas (ressecamento, escurecimento e desagregação). Quando expostas as concentrações de 12.5, 25 e 50 mg/mL dos OEs de E. viscosa e L. schaueriana, as fêmeas ingurgitadas mostraram alterações morfológicas nas glândulas tubulares e acessórias do órgão de Gené, sobretudo nas concentrações de 25 e 50 mg/mL, as quais induziram degeneração neste órgão. Os ovócitos das fêmeas aqui estudadas quando expostas as diferentes concentrações dos óleos também sofreram extensas alterações, sendo a exposição ao OE de L. schaueriana mais agressiva nos ovócitos em estágios iniciais (I a III) enquanto que todas as concentrações do OE de E. viscosa foram capazes de causar intensos danos aos ovócitos de I a V e ambos foram capazes de interferir na dinâmica da vitelogênese. Os OEs de E. viscosa e L. schaueriana apresentaram potencial altamente neurotóxico, visto que foram capazes de causar em todas as concentrações subletais aqui testadas a degeneração do tecido nervoso e de maneira dose-dependente. Ainda, os óleos aqui estudados provocaram severos danos tanto no tecido hepático quanto no tireoideano dos camundongos a eles expostos, na concentração de 50 mg/mL, induzindo degeneração em ambos os tecidos, danos estes que certamente prejudicaram a fisiologia destes órgãos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Efeitos do alérgeno rPoly p 5 do veneno de P. paulista (Hymenoptera, Vespidae) sobre a resposta inflamatória em macrófagos diferenciados de células da medula óssea
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-05) Assugeni, Isabela Oliveira Sandrini [UNESP]; Braga, Márcia Regina Brochetto [UNESP]; Fernandes, Luis Gustavo Romani; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae) é uma vespa social abundante no sul e sudeste brasileiro, bem como em outros países como Argentina e Paraguai. Esta espécie faz parte das muitas espécies de insetos da ordem Hymenoptera de importância médica. Há um elevado risco de acidentes com ferroadas, sendo que, dependo da quantidade de veneno e do grau de sensibilização do indivíduo, estes acidentes podem acarretar reações alérgicas sistêmicas com chance de evoluírem para o choque anafilático. Estudos com os alérgenos componentes deste veneno têm ganhado crescente interesse devido a resultados promissores de seu uso em diagnóstico laboratorial, bem como em protocolos clínicos de imunoterapia alérgeno específica. Dentre os componentes presentes no veneno de P. paulista, a proteína antígeno 5 (Poly p 5) tem sido considerada um dos principais alérgenos presentes nessa espécie. Todavia, são necessários estudos para esclarecer o papel biológico e funcional deste antígeno no contexto das reações de hipersensibilidade ao veneno. Assim, neste trabalho avaliamos o potencial efeito imunomodulador do alérgeno Antígeno 5 de P. paulista, expresso na forma recombinante (rPoly p 5) em levedura Komagataella phaffi, sobre macrófagos diferenciados de células precursoras, presentes na medula óssea de camundongos (BM-M), ativados e não ativados com estímulos pró-inflamatórios. Para isto foram analisadas, nestas células, alterações de viabilidade celular, capacidade fagocítica, produção de óxido nítrico (NO) e de citocinas pró-inflamatórias, além da expressão das moléculas coestimuladoras CD80 e CD86. Os resultados obtidos, indicam que rPoly p 5 não afeta significativamente a produção de NO em BM-M ativados ou não com estímulos pró-inflamatórios. Todavia, provocou redução na frequência de células expressando as moléculas coestimuladoras CD86 e CD80 em BM-M ativados e não ativados com estímulos próinflamatórios, respectivamente. Adicionalmente, rPoly p 5 induziu ao aumento de IL- 23 e IL-27 em BM-M não ativados e de GM-CSF em BM-M ativados, além de redução de MCP-1 em BM-M ativados. Estes achados podem indicar um papel importante deste alérgeno na polarização de fenótipos funcionais de macrófagos em diferentes estímulos, ativados e não ativados. Neste sentido, a partir das análises das respostas de BM-M quanto ao potencial pró ou anti-inflamatório do rPoly p 5, conclui-se que os resultados aqui obtidos poderão auxiliar na compreensão do potencial imunomodulador dessa proteína na imunidade inata.
  • ItemDissertação de mestrado
    Perfilagem fosfoproteômica das glândulas produtoras de seda da aranha Trichonephila clavipes
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-07) De-Souza, Caroline Lacerra; Palma, Mario Sergio [UNESP]; Santos-Pinto, Jose Roberto Aparecido dos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Apesar do grande interesse pelas propriedades mecânico-elásticas das fibras da seda produzida pelas aranhas, visando o seu uso em aplicações biomédicas e biotecnológicas devido as suas propriedades de resistência, elasticidade e biocompatibilidade, pouco se conhece sobre os detalhes das glândulas produtoras de seda e o processo de fiação que ocorre para a produção das fibras. Dessa forma, alguns estudos têm demonstrado que as glândulas produtoras de seda apresentam diversas proteínas relacionadas com o envolvimento na secreção das proteínas da seda, transporte, regulação de atividades proteolíticas e preservação das proteínas da seda contra o estresse oxidativo e degradação, durante todo o processo de fiação; além disso, estudos também já demonstraram nas fibras de seda da teia, a presença de toxinas de ação geral e de neurotoxinas, comuns em venenos animais, sugerindo que essas toxinas/neurotoxinas contribuem para a paralisia e captura de presas. Porém, esses estudos não têm considerado a possível presença de modificações pós-traducionais (PTMs) que podem atuar sobre a atividade biológica e função dessas moléculas. A determinação de PTMs é fundamental para a elucidação de processos que controlam os eventos celulares, como crescimento, divisão e diferenciação celular, incluindo a interação entre proteínas. Portanto, no presente estudo adotamos o uso da cromatografia de afinidade com TiO2 como método de enriquecimento de fosforilação, combinados com a abordagem proteômica livre de gel - shotgun, utilizando ténicas avançadas de espectrometria de massas in tandem (µLC-ESI-micrOTOF-Q-III-CID) a fim de identificar o perfil fosfoproteômico das glândulas que secretam a seda da aranha Trichonephila clavipes. Os resultados obtidos com a análise fosfoproteômica do conjunto de glândulas produtoras de seda da ranha T. clavipes, mostrou a identificação de 1316 proteínas fosforiladas sendo que 155 foram identificadas na glândula agregada, 580 na ampulada maior, 143 na flageliforme e 438 na ampulada menor. Estas fosfoproteínas foram classificadas de acordo com a sua função geral e subdividas em sete diferentes grupos de proteínas: (i) proteínas estruturais que compõem as fibras da seda – as espidroínas; ii) proteínas relacionadas com o transporte de íons e oxigênio nas glândulas para manter a estabilidade das espidroína; (iii) proteínas relacionadas com o dobramento/conformação e modificação das espidroínas; (iv) proteínas relacionadas com a preservação das espidroínas contra o estresse oxidativo; (v) proteínas relacionadas com a preservação das características fibrilares das espidroínas no meio ambiente; (vi) proteínas housekeeping e (vii) proteínas relacionadas com a captura e pré-digestão de presas. Para o último grupo, foram identificadas 284 proteínas semelhantes a toxinas, neurotoxinas, enzimas proteolíticas, e defensinas em sua forma fosforilada. O enriquecimento funcional destas proteínas nos permitiu avaliar a contribuição de suas funções às caracteríticas fisico-químicas das proteínas estruturais da seda, bem como a interação entre os grupos funcionais das proteínas listadas envolvidas com o processo de fiação da seda; assim como também a influência sobre a atividade tóxica das toxinas. Os resultados também permitiram identificar uma série de sequências peptídicas fosforiladas que não apresentaram resultados de Identificação com proteínas depositadas nos bancos de dado e foram obtidas utilizando da abordagem de sequenciamento de novo e submetidas a um alinhamento de sequencias utilizando a ferramenta BLASTP. O ensaio de inseto-toxicidade realizado ao final do estudo, nos permitiu verificar a toxicidade do extrato bruto fosforilado das glândulas ampulada maior e agregada, que apresentaram os valores de dose letal, DL50=28,40 ng/mg de inseto (A. mellifera) para a glândula ampulada maior e DL50=23,07 ng/mg de inseto (A. mellifera) para a glândula agregada. Dessa forma, demonstramos que a combinação do uso de métodos baseados em cromatografia de afinidade, como a estratégia de enriquecimento de proteínas/peptídeos fosforilados, e o uso de uma abordagem proteômica com estudos de PTMs se mostrou uma estratégia eficiente na investigação de amostras complexas, como as glândulas produtoras de seda da teia de aranhas. Um estudo com modificações pós-traducionais das proteínas presentes nas glândulas produtoras de seda da aranha T. clavipes, como demonstrado no presente trabalho, nos possibilitou obtermos informações biológicas e químicas das características dessas moléculas, contribuindo para uma melhor compreensão sobre o perfil fosfoproteômico das glândulas analisadas.
  • ItemDissertação de mestrado
    Plasticidade das junções comunicantes no músculo bíceps braquial em modelo experimental de hipertrofia muscular: análises morfológicas, moleculares e funcionais
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-26) Pimentel Neto, Jurandyr [UNESP]; Ciena, Adriano Polican [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A junção neuromuscular (JNM) e a junção miotendínea (JMT) compreendem um sistema de junções comunicantes que por meio de diferentes estímulos se adaptam, alteram a sua morfologia e consequentemente a estrutura muscular. Um dos principais estímulos que contribuem com tais adaptações é o exercício físico em diferentes modalidades e aplicações para cada grupamento muscular. É comprovado que o exercício físico promove benefícios ao músculo estriado esquelético e particularmente as ultraestruturas da JMT, a morfologia da JNM e consequentemente aos sarcômeros. Desta forma os diferentes protocolos de escada vertical, que representam o modelo experimental de hipertrofia muscular, podem contribuir com as adaptações nas junções comunicantes e quando associados seus efeitos podem ser potencializados. O objetivo do presente estudo consistiu em descrever as adaptações morfométricas e moleculares das junções comunicantes do músculo bíceps braquial de ratos Wistar adultos, em protocolos experimentais de escada vertical. Foram utilizados 60 ratos divididos em 4 grupos: Sedentário (S) - não participou de nenhum protocolo experimental; Escalada (E) - sem sobrecarga adicional; Escalada Sobrecarga (ES) - com sobrecarga adicional progressiva; Escalada/Escalada Sobrecarga (EES) - combinação dos protocolos em dias intercalados. Os protocolos (E, ES, EES) foram realizados em 24 sessões, 3x/semana por um período de 8 semanas. Estes grupos foram submetidos durante o período pré (T1) e pós (T2) protocolo a testes funcionais. A massa corporal foi avaliada em 3 períodos (P1, P2 e P3) e ao término dos protocolos amostras do músculo bíceps braquial foram dissecadas para as técnicas microscópicas e morfométricas. Em relação à massa corporal, os Grupos experimentais apresentaram aumento da massa, porém não significativo. Em relação à massa muscular, houve aumento em E, ES e EES. Os animais dos grupos E, ES e EES apresentaram melhor rendimento no desempenho funcional, no período pós protocolo, diante do aumento do teste de carga máxima carregada e no número de escaladas realizadas e redução do tempo das escaladas. Por meio da microscopia de luz foi possível revelar aumento da área nuclear e da dimensão fractal no Grupo E e ES e redução no Grupo EES. Em relação à área de colágeno observou-se aumento nos Grupos E, ES e EES. A análise de ATPase miofibrilar demonstrou aumento da área de secção transversa (AST) das fibras: Tipo I nos Grupo E, ES e EES; Tipo II em E e ES e redução em EES; Tipo IIx aumento nos Grupos E, ES e EES. Os comprimentos dos sarcômeros do ventre muscular revelaram aumento nos Grupos E e ES e redução em EES. Nos sarcômeros proximais aumentos no Grupo E, com redução nos Grupos ES e EES. Os sarcômeros distais apresentaram aumento nos Grupos E e EES e redução em ES. Em relação ao comprimento das invaginações sarcoplasmáticas observou-se aumento nos Grupos E, ES e EES, assim como sua interface miotendínea já em relação a espessura,observou-se aumento em E e EES com redução em ES. Nos comprimentos das evaginações sarcoplasmáticas houve aumento nos Grupos E, ES e EES e nas espessuras redução em E, ES e EES. A Lâmina Basal (LB) apresentou espessamento nos Grupos E e ES e redução no Grupo EES. A Camada de Suporte de Colágeno (CSC) e as fibras colágenas transversais apresentaram aumento principalmente nos Grupos E e EES. Na região pós-sináptica (JNM) a área corada apresentou redução nos Grupos E, ES e EES, a área total demonstrou redução em ES e aumento em E e EES. O perímetro corado, perímetro total e dispersão reduziram nos Grupos E, ES e EES, com aumento no diâmetro máximo nos Grupos E e EES e redução em ES. Na JMT foram imunomarcados os telócitos (CD34+) em todos os Grupos com sua ampla disposição em suas margens. Concluímos que os diferentes protocolos experimentais contribuíram com aumento da massa muscular e desempenho funcional, além de promoverem adaptações morfológicas nas junções comunicantes, principalmente no grupo sem sobrecarga (E) e no grupo de protocolos associados (EES). As alterações refletiram no sistema unidirecional da JNM até a JMT e em suas estruturas, além da associação com o nicho de telócitos e sua íntima relação com a JMT em todos os grupos.
  • ItemDissertação de mestrado
    Alterações na junção neuromuscular e ventre muscular de ratos Wistar submetidos ao alongamento estático associado às modalidades de escada vertical
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-01) Barbosa, Gabriela Klein [UNESP]; Ciena, Adriano Polican [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A contração do músculo estriado esquelético depende da relação entre a junção neuromuscular (JNM) e o músculo alvo. A morfologia da JNM e as características do ventre e das fibras musculares apresentam plasticidade tecidual derivada do estímulo. Com o protocolo proposto ocorreram adaptações na JNM e no ventre muscular. O objetivo do presente estudo consistiu em descrever as alterações morfológicas na JNM e ventre do músculo gastrocnêmio de ratos Wistar submetidos ao alongamento estático prévio às modalidades de escada vertical. Foram utilizados ratos Wistar com 60 dias de idade (n = 10): Sedentário (S); Alongado (A); Escada vertical sem carga extra (EC); Escada vertical com sobrecarga (ES); Alongado e escada vertical sem carga extra (AEC); e Alongado e escada vertical com sobrecarga (AES). Os animais foram submetidos aos protocolos 3x por semana por oito semanas. A relação das massas do S, EC, ES e A não demonstraram diferença, enquanto que AEC e AES resultaram em menores valores. Os grupos EC e ES apresentaram aumento da placa motora e redução da compacidade, com destaque para o grupo EC e, ainda, revelaram maior número de clusters e fragmentação. O grupo A apresentou redução da placa motora, com aumento da compacidade e manutenção do número de clusters e fragmentação. Os grupos de alongamento prévio às modalidades de escada vertical (AEC e AES) revelaram aumento da placa motora, com destaque para AES, menor número de clusters e menor índice de fragmentação; entretanto, a compacidade apresentou aumento para AEC e redução para AES. Houve aumento da área de secção transversa das miofibras Tipo IIa para EC e ES, e do Tipo IIx para AES, e redução dos tipos miofibrilares para A e AEC. Houve predominância do Tipo IIx nos grupos EC, A, AEC e AES, e de IIa no grupo ES. Além disso, os grupos AEC e AES apresentaram aumento da quantidade total de miofibras. Os grupos ES e AEC apresentaram maior complexidade mionuclear, os grupos EC e AES revelaram menor complexidade intersticial, e o grupo A mostrou redução das complexidades mionuclear e intersticial. Nos grupos EC, ES, A, AEC e AES houve redução da área intersticial. A análise funcional mostrou a redução do tempo para EC, ES, AEC e AES, e dos movimentos para EC, ES e AEC. O teste de carga máxima carrega (TCMC) revelou aumento de trabalho para ES e AES, com destaque para ES. Concluímos que o alongamento estático prévio às modalidades de escada vertical apresentou aumento da placa motora e menor fragmentação; no entanto, a ocupação dos clusters de receptores de acetilcolina demonstrou diferentes adaptações frente à AEC e AES. Em ambos, ocorre o aumento da quantidade total de miofibras. O alongamento prévio à escada vertical sem carga extra reduz o diâmetro miofibrilar, acarreta maior complexidade mionuclear e reduz a área intersticial. Por outro lado, a modalidade com sobrecarga propicia o aumento do diâmetro miofibrilar do Tipo IIx, menor complexidade e área intersticiais, e apresenta aumento da capacidade de carga.
  • ItemDissertação de mestrado
    DNAs satélites e evolução do sistema sexual neo-XY do gafanhoto Ronderosia bergii: uma abordagem citogenômica
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-17) Ferretti, Ana Beatriz Stein Machado [UNESP]; Cabral-de-Mello, Diogo Cavalcanti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Uma característica comum da evolução dos cromossomos sexuais é a acumulação de DNAs repetitivos, que estão envolvidos em sua diversificação e degeneração. Em gafanhotos o sistema ancestral dos cromossomos sexuais é o XO, mas em algumas espécies os cromossomos sexuais neo-XY surgiram por translocação Robertsonian entre o X ancestral e um par autossômico. Esse é o caso do Ronderosia bergii (Acrididae: Melanoplinae) que adicionalmente também apresentou uma grande inversão pericentrica no neo-Y, fazendo com que essa seja uma espécie singular para o entendimento da evolução dos cromossomos sexuais. Nesse estudo foi caracterizado os DNA satélites e Elementos de Transposição da espécie, com enfoque no entendimento das diferenças entre macho e fêmea e que estão putativamente associados aos cromossomos sexuais. Foi encontrado um total de 54 famílias de DNAs satélites e 56 famílias de TEs. Os DNAsat foram 13,5% mais abundantes no genoma do macho, enquanto os TEs foram apenas 1,02% mais abundantes no genoma da fêmea, evidenciando alta amplificação dos DNAsat no cromossomo neo-Y e menor envolvimento dos TEs na diferenciação dos cromossomos sexuais. A alta diferenciação entre os cromossomos sexuais é observada pela amplificação de múltiplos DNAsat no neo-Y com ocorrência de famílias exclusivamente mapeadas nesse cromossomo, entretanto, algum grau de homologia foi observado. Os dados do mapeamento dos DNAsat evidenciou um alto turnover dos neo-cromossomos sexuais em R.bergii em nível intrapopulacional, causados por múltiplas inversões paracentricas e outros rearranjos como amplificações e transposições. Finalmente, a espécie é um exemplo experimental de como após a supressão da recombinação, os DNAs repetitivos podem estar envolvidos na geração de variabilidade dos cromossomos sexuais e é um modelo útil no entendimento da evolução dos cromossomos sexuais em nível intrapopulacional.