Teses - Biofísica Molecular - IBILCE

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https://hdl.handle.net/11449/77107

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Pivot-SAXS: desenvolvimento de uma nova metodologia para caracterização estrutural e conformacional de macromoléculas combinando SAXS e simulações computacionais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-24) Ferreira, Carolina Tatiani Alves [UNESP]; Oliveira, Leandro Cristante de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A comunidade científica já se utiliza da combinação de técnicas experimentais e computacionais em suas investigações, especialmente para sistemas biológicos complexos devido à dinâmica das macromoléculas em solução e mudanças conformacionais. No entanto, a predição da estrutura de moléculas biológicas em solução é um problema desafiador para teóricos e experimentalistas, dada a falta de técnicas disponíveis para observar esses sistemas. O espalhamento de raios-X de baixo ângulo (SAXS) é uma técnica experimental que fornece informações quantitativas, como raio de giro e distância entre pares, mas não informações estruturais precisas. No entanto, combinado com uma técnica computacional, SAXS já é capaz de analisar estruturalmente estes sistemas gerando o "envelope", por exemplo. Assim, foi desenvolvido o programa Pivot-SAXS para ampliar as possibilidades de estudos conformacionais. O programa usa uma estrutura inicial e informações de estrutura secundária para criar um potencial baseado em um fator de esfera rígida, que proíbe choques estéricos e minimiza o espaço conformacional. O programa gera novas conformações usando um algoritmo de pivot e avalia a similaridade entre as curvas de espalhamento teórica e experimental, completando o potencial usando o critério de Metropolis. O código está disponível em Github. Os resultados obtidos pelo Pivot-SAXS foram satisfatórios e congruentes com outras metodologias, o que indica sua aplicabilidade em estudos futuros.
Estudo das propriedades elétricas e morfológicas de transistores de filme fino de óxido de zinco processados por solução
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-04-20) Braga, João Paulo; Santos, Lucas Fugikawa [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Esta tese de doutorado é o resultado de alguns trabalhos realizados em estudos de dispositivos eletrônicos à base de óxidos metálicos processados por solução. O primeiro trabalho apresenta um estudo comparativo de como o método de deposição (spray-pirólise e spin-coating) da camada ativa de transistores de filme fino (TFT) afeta as propriedades físicas e o desempenho dos dispositivos. As propriedades dos filmes foram analisadas através de técnicas de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS), análise termogravimétrica (TG), microscopia eletrônica de varredura (MEV), difração de raio-x (DRX), espectroscopia UV-Vis e Elipsometria, enquanto as propriedades elétricas foram analisadas através das curvas características de um TFT, analisando a mobilidade dos portadores de carga, tensão limiar e da resistência elétrica dos filmes. O segundo trabalho apresentado nessa tese analisa os efeitos de defeitos intrínsecos na interface entre o semicondutor/isolante em TFT nas propriedades elétricas dos dispositivos através da variação da espessura da camada dielétrica (100, 200 e 300 nm) e da temperatura (80 – 350k). A influência de parâmetros como a estrutura e temperatura permitiram uma análise mais detalhada do transporte de carga de dispositivos TFT, fornecendo, dessa forma, um maior conhecimento das propriedades físicas dos materiais estudados.
Desenvolvimento e caracterização de etiquetas de identificação por radiofrequência utilizadas como sensores físico-químicos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-28) De Lima, Guilherme Rodrigues; Santos, Lucas Fugikawa [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Neste trabalho, desenvolvemos e caracterizamos etiquetas (“tags”) de identificação por radiofrequência (RFID) para a utilização como sensores físico- químicos. Em uma primeira etapa, trabalhamos com tags passivas de alta frequência (HF) comerciais (Texas CI) acopladas a sensores de filme fino de diferentes materiais manipulados e depositados em nosso laboratório. Foram utilizados filmes de óxidos metálicos (ZnO, IZO, AZO e ITO) depositados por pulverização catódica (RF sputtering) sobre eletrodos interdigitados com o intuito de demonstrar uma resposta diferenciada para cada material quando expostos à radiação ultravioleta (UVA). Filmes de polianilina (Pani), depositados por drop casting, foram utilizados acoplados às tags RFID para demonstrar a viabilidade de utilização como sensor químico (HCl) em ambiente aquoso. Foi desenvolvido todo um sistema de detecção sem-fio por radiofrequência na faixa de operação das tags (em torno de 13,56 MHz), assim como foi realizada uma comparação com a detecção por conexão de campo próximo (near field connection – NFC) utilizando um smartphone. Foram também desenvolvidas tags tanto sobre placas de circuito impresso (PCBs) quanto sobre substratos flexíveis, para a manufatura de conjuntos (“arrays”) de quatro antenas operando a frequencias ligeiramente diferentes (no intervalo de 10 MHz a 18 MHz), acoplados a diferentes filmes orgânicos/híbridos (Pani:pTSA, PEDOT:PSS, MWCNT:P4VP e MoS2:P4VP:PSS), com o intuito de realizar uma detecção multivariada de diferentes compostos orgânicos voláteis (VOCs). O resultado é um espectro em frequência que permite determinar o tipo de composto volátil e sua concentração sem a necessidade de conexão por fios. A tecnologia nesse trabalho fornece um método barato e simples para a detecção tanto de substâncias químicas quanto a de medida de grandezas físicas sem a necessidade de sistemas complexos de medida, podendo utilizar protocolos disponíveis em dispositivos como tablets e smartphones.
Estudo sobre moléculas diatômicas em regime de confinamento
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-03) Batael, Hugo de Oliveira; Drigo Filho, Elso [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Nesse trabalho a curva de potencial do estado fundamental para pequenas moléculas diatômicas homonucleares em regime de confinamento é calculada usando o método variacional. A abordagem proposta aqui usa o determinante de Slater como função de teste, sendo os orbitais moleculares dados pelas autofunções obtidas para a molécula de hidrogênio ionizada confinada. As moléculas são confinadas em uma caixa elipsoidal impenetrável. Como uma primeira aproximação esse tipo de geometria pode ser usada para simular moléculas dentro de cavidades proteicas. Os orbitais moleculares são construídos através de sugestões inspiradas em funções usadas em trabalhos prévios, encontradas via método de fatorização da equação de Schrödinger, e impondo que a condição de ortogonalidade entre as funções seja satisfeita. Os resultados encontrados indicam que a barreira de confinamento muda as características da curva de potencial para as moléculas estudadas. Em regime de confinamento forte (cavidade pequena) o mínimo dessa curva é mais evidente quando comparado com o sistema livre. Também é notado que a densidade eletrônica entre os núcleos, sob o eixo internuclear, aumenta em regime de confinamento. Esses resultados indicam que a barreira de potencial pode aumentar a interação entre os núcleos.
Mudanças conformacionais e modificações pós-traducionais: um estudo estrutural de mecanismos e comportamentos de sistemas proteico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-27) Dias, Raphael Vinicius Rodrigues; Oliveira, Leandro Cristante de [UNESP]; Melo, Fernando Alves de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O estudo de mecanismos no enovelamento de proteínas permite extrair importantes informações sobre o funcionamento de sistemas biológicos, assim como prospectar condições anômalas devido modificações como mutações e glicosilações. Neste trabalho, utilizamos modelos simplificados para estudar dois problemas diferentes envolvendo o enovelamento de proteínas: (I) a indicação de estados metaestáveis da proteína GRB2, apontados por meio de avaliações experimentais e (II) a influência das modificações pós-traducionais (glicosilações) no perfil de enovelamento. A GRB2 é uma proteína multidomínios relacionada com interações e regulação de vias dentro da célula, estruturalmente é formada por dois domínios SH3s flanqueados por um domínio SH2. Os estudos computacionais permitem descrever possíveis caminhos para o enovelamento, inclusive com a diferenciação na ordem de formação dos domínios. Complementarmente, mostramos a relação entre deleção do domínio SH3 N-terminal para com o seu relevo e funil de energia, validando e linkando com resultados de estabilidade térmica já estabelecidos previamente. Ao analisar as diferenças entre o enovelamento de cada domínio separadamente e constituindo a proteína completa, foi verificado pequenas diferenças no processo onde os efeitos da comunicação entre domínios fica evidenciada. No estudo da influência das modificações pós-traducionais (glicosilações) no perfil de enovelamento para proteínas depositadas no PDB, modelamos as glicosilações de acordo com nossos parâmetros de ajuste, simulamos o processo de enovelamento e calculamos aspectos termodinâmicos estatísticos como Calor Específico e Perfil de Energia Livre para cada sistema. Dentre seus resultados, notamos que a presença da glicosilação pode influenciar diretamente no enovelamento em alguns casos específicos, alterando graus de flexibilidade, estabilidade térmica e a importância de alguns resíduos para construção do “ensemble” de transição. Descrever esses mecanismos é um ponto de partida para diversos outros estudos e metodologias que interfiram diretamente nos problemas relacionados com essas proteínas, como por exemplo transporte e desenho racional de fármacos, mutações para especificidade de interação e estabilidade.
Estudo estrutural do domínio SH3-like ligado em tandem da proteína KIN humana e sua interação com ácido nucleico utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear e caracterização físico-química por técnicas espectroscópicas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-27) Lourenço, Isabella Otenio de; Caruso, Icaro Putinhon [UNESP]; Souza, Fátima Pereira de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A proteína KIN atua como reguladora de danos no DNA e está envolvida na replicação desse ácido nucleico. Seu gene, localizado no cromossomo 10 em células humanas, é filogeneticamente conservado e ubiquamente expresso em eucariotos. Em humanos, essa proteína possui 45 kDa e é estruturalmente composta por quatro domínios, sendo: domínio dedo de zinco do tipo C2H2, domínio central homólogo à proteína RecA de E. coli, domínio de sinal de localização nuclear e domínio SH3-like em tandem (dSH3thKIN) formado por dois subdomínios SH3. Estudos mostraram que o dSH3thKIN apresenta em sua estrutura um motivo de ligação a RNA conhecido como motivo KOW e, portanto, esse domínio é considerado como o principal mediador de interação da proteína KIN com RNA. Essa interação dSH3thKIN/RNA é fundamental para o desempenho das atividades biológicas da KIN. Entretanto, há uma escassez de informações estruturais e de interação do dSH3thKIN na literatura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo realizar o assinalamento das ressonâncias 1H, 15N e 13C do domínio, determinar sua estrutura tridimensional em solução, caracterizar a estabilidade térmica, química e de pH desse domínio e investigar sua interação com RNA de levedura e homopolímeros de RNA e DNA. Um total de 98,4% das ressonâncias do domínio foram assinaladas e a resolução de sua estrutura tridimensional apresentou dois subdomínios com arranjos de barris-β formados por cinco fitas-β cada um. A análise de movimentos térmicos da cadeia principal do dSH3thKIN mostrou que esse domínio apresenta uma flexibilidade interna reduzida apesar de ser formado por dois subdomínios. A caracterização da estabilidade térmica e de pH do domínio revelou uma temperatura de desenovelamento de aproximadamente 59 oC, com uma tendência de agregação que leva a formação de estruturas como amiloides, e uma estabilidade das estruturas secundárias entre pH 5,5 e 9,5. O processo de desenovelamento químico do dSH3thKIN ocorreu de modo reversível, sugerindo que esse domínio apresenta um enovelamento independente no contexto da proteína KIN. As medidas de interação do domínio com ácidos nucleicos mostraram a seguinte ordem de afinidade: poli(rG) > poli(rC) > RNA de levedura > poli(rU) > poli(rA) > poli(A) DNA, indicando que o dSH3thKIN apresenta uma maior afinidade pelas bases de guaninas e citosinas e RNA de levedura. A análise dos parâmetros termodinâmicos da ligação dSH3thKIN/RNA sugere que a maior contribuição para a formação do complexo é a interação eletrostática. Detalhes estruturais sobre o sítio de ligação de ácido nucleico no dSH3thKIN revelou que embora a associação tenha uma contribuição devido a interações eletrostáticas, há um caráter de estabilização por interações de curta distância, ligações de H e interações de Van der Waals. Sendo A72 e E96, que estão localizados no motivo KOW, e lisinas (K31, K34, K35, K36, K75 e K125) são importantes para a formação e estabilização do complexo. Em conclusão, o presente trabalho apresenta um conjunto de resultados estruturais e de interação com ácido nucleico para o dSH3thKIN que podem contribuir para um melhor entendimento do papel da proteína KIN nos processos de replicação, transcrição e tradução de DNA.
Estudo computacional da interação da curcumina com bicamadas de fosfatidilcolina (POPC): Efeitos da variação da razão curcumina/lipídios
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-28) Camilo, Carlos Roberto de Souza [UNESP]; de Araujo, Alexandre Suman [UNESP]; Ruggiero, José Roberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A curcumina é um composto ativo da Curcuma longa, amplamente utilizada na culinária e medicina asiáticas. Seu espectro de ação terapêutica abrange efeitos antioxidantes, atividades anticancerígenas e antimicrobiana, sendo associada também a processos de apoptose celular. O mecanismo de ação molecular entretanto é pouco conhecido, sendo proposto desde a interação superficial com a região hidratada da membrana celular, até o enterramento de suas moléculas no núcleo hidrofóbico, produzindo alterações nas propriedades da estrutura lipídica. Utilizando simulações por dinâmica molecular de bicamadas fosfolipídicas, este trabalho avalia a interação entre moléculas de curcumina e bicamadas compostas por palmitoiloleilfosfatidilcolina (POPC). As simulações, à volume de água constante, revelam que as moléculas de curcumina, inicialmente inseridas dispersas na fase aquosa, a partir de certa razão curcumina/lipídio, se agregam e absorvem na bicamada, avançando sobre o núcleo hidrofóbico e estabelecendo uma estrutura transmembrânica. Numa longa dinâmica de interação, o cluster perde moléculas, resultando na dispersão da estrutura para a região definida pelo glicerol dos fosfolipídios, com a estabilização da curcumina ocorrendo na interface entre as regiões hidrofóbica e hidrofílica. Este processo resulta na redistribuição das moléculas de curcumina entre as duas monocamadas da estrutura lipídica. Utilizando um método de construção alternativo, com inserção progressiva e gradual de moléculas, é observado que a adsorção e estabilização da curcumina de fato se dá na condição dispersa, mas a continuação do processo com a inserção de cada vez mais moléculas também leva à formação de uma estrutura transmembrânica. Os dois estados de interação são, portanto, possíveis e a transição entre eles depende da razão curcumina/lipídio e do tamanho do cluster que as moléculas de curcumina estabelecem, seja na fase aquosa, antes da adsorção, ou a partir da agregação de moléculas já adsorvidas na membrana com novas moléculas sendo internalizadas do meio. Em ambos os estados, a ação da curcumina resulta na perturbação local da estrutura, com diminuição da espessura da bicamada, alterações no ordenamento das caudas dos fosfolipídios, e aumento da permeabilidade da bicamada à moléculas de água. Tais alterações indicam que a curcumina aumenta a fluidez da bicamada, apresentando uma ação muito mais efetiva enquanto estrutura transmembrânica. A saturação temporária de moléculas na bicamada resulta portanto na formação de um microdomínio onde a curcumina assume uma estruturação transmembrânica que consiste também num mecanismo para redistribuição de moléculas entre as duas monocamadas da membrana.
Desenvolvimento e caracterização tromboelastrográfica de novos agentes hemostáticos baseados em Pectinas com potencial para aplicações em uso cirúrgico e odontológico visando tratamento anti-hemorrágico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-28) Niño Santisteban, Oscar Antônio; Nery, José Geraldo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Apesar dos avanços na intervenção médica, as complicações hemorrágicas continuam a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo. Assim, o desenvolvimento de métodos eficazes para o tratamento de hemorragias descontroladas tornou-se uma das prioridades em vários centros de pesquisa médica. Por definição um agente hemostático ideal deve ter a capacidade de interromper o sangramento arterial e venoso, estar disponível para uso imediato, ser funcional e de fácil aplicação, leve, durável, estável e, seguro e de baixo custo. Atualmente existem no mercado agentes hemostáticos feitos à base de materiais inorgânicos e orgânicos, ou mesmo compósitos. Entre os materiais orgânicos destaca-se o grupo de agentes hemostáticos elaborados a partir de biopolímeros naturais tais como quitosana e celulose. O conjunto de certas características inerentes à esses biopolímeros tais como o tamanho de suas cadeias moleculares, a possibilidade e facilidade de modulação da densidade de cargas dessas cadeias, controle do grau de cristalinidade, da área superficial externa, do grau de hidrofobicidade/hidrofobicidade, e biocompatibilidade favorecem o seu uso como matéria-prima para a produção de agentes hemostáticos tópicos. Embora, os biopolímeros quitosana, celulose, e alginato tenham encontrados aplicações como agentes hemostáticos não híbridos, o mesmo não ocorre com um outro biopolímeros abundante na biomassa brasileira: a pectina. Os esforços dessa pesquisa de doutorado foram voltados ao desenvolvimento de vários agentes hemostáticos à base de pectinas na forma de hidrogeis reticulados com íons de cálcio (Ca2+) e polietilenoglicol, resultando em 4 diferentes tipos de agentes hemostáticos denominados de PEC-PEG, PEC-PEG-Ca-0.5, PEC-PEG-Ca-3.0, PEC-PEG-Ca-5.0 . Os agentes hemostáticos poliméricos foram caracterizados por técnica de Difração de raios-x (DRX), Espectroscopia no infravermelho (FT-IR), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Ressonância Magnética Nuclear no Estado Solido ( NMR-MAS), Espectroscopia por dispersão de energia (EDS) evidenciando as ligações cruzadas (crosslinked) entre as unidades de acido D-galacturônico da pectina e os cátions de cálcio, resultando na estrutura denominada de “ egg-box”. O potencial hemostático dos filmes de pectina PEC-PEG, PEC-PEG-Ca-0.5, PEC-PEG-Ca-1.5, PEC-PEG-Ca-3.0, PEC-PEG-Ca-5.0 foram estudados in vitro usando sangue humano e sangue de carneiro (Santa Inês Ovis aires) através de ensaios tromboelastograficos. As principais parâmetros tromboelastograficos estudados foram : a) parâmetro R que é o tempo de reação para de formação de um coágulo de com tamanho de aproximadamente 2 mm, que caracteriza o início da produção de fibrina, b) o parâmetro K que é o tempo de formação de um coágulo firme de 20 mm e a taxa de geração de trombina e a conversão de fibrinogênio em fibrina, c) o parâmetro ou ângulo α (alfa): que é a inclinação entre os parâmetros R e K, representando a taxa de geração de trombina e a conversão de fibrinogênio em fibrina, demonstrando a rapidez ou cinética de formação de fibrina, ou de um coágulo sólido d) o parâmetro MA que descreve a propriedade elástica da fibrina formada e adesão plaquetária. Os valores de R, K e MA obtidos para os materiais PEC-PEG, PEC-PEG-Ca-0.5, PEC-PEG-Ca-3.0, PEC-PEG-Ca-5.0. Os agentes hemostáticos que mais se destacaram em comparação com os demais agentes hemostáticos foram os materiais PEC-PEG-Ca-3.0 e PEC-PEG-Ca-5.0 apresentaram valores para o parâmetro R entre 5.1- 6.9 min, e parâmetro MA entre 59-62 mm. Estes valores estão de acordo com valores relatados para agentes hemostáticos a base de quitosana, agentes hemostáticos compósitos (quitosana-zeolitas, pectina-alginatos) e agentes hemostáticos inorgânicos como zeólita Faujasita (FAU) e zeólita A (LTA). No decorrer deste estudo foi observado um “swelling effect” não homogêneo para todos os materiais relatados neste estudo e foi estudado com mais detalhes para a amostra PEC-PEG-5. Neste caso, foi observado que a estabilidade morfológica dos filmes reticulados com cátions Ca2+, induz os filmes a voltarem a sua forma morfológica original após um certo tempo, o que leva a conclusão que o aumento da viscosidade ao longo da linha simétrica dos filmes aumenta o fator de absorção e, portanto, a ação hemostática do materiais PEC-PEG-Ca-0.5, PEC-PEG-Ca-3.0, PEC-PEG-Ca-5.0.
Estudos estruturais e computacionais de proteínas alvos de doenças negligenciadas para a descoberta de novos fármacos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-31) Hernández Alvarez, Lilian; Souza, Fátima Pereira de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As doenças tropicais negligenciadas (NTDs) são infecções prevalentes em áreas remotas e rurais de países pobres da África Subsaariana, Ásia e América, que têm sido historicamente desatendidas e representam o mercado de menor prioridade das grandes indústrias farmacêuticas. As NTDs causadas por parasitas protozoários apresentam altos índices de morbilidade e mortalidade, e os tratamentos disponíveis são tóxicos e ineficientes. Neste estudo, técnicas experimentais e computacionais foram utilizadas para contribuir ao conhecimento das bases moleculares de diversos alvos proteicos dessas doenças com vistas ao desenvolvimento de futuros fármacos. Estratégias computacionais foram empregadas com o objetivo de identificar novos inibidores competitivos da cruzaína, a maior cisteíno protease do Trypanosoma cruzi. A avaliação experimental nos permitiu descobrir um novo inibidor competitivo desta protease com um IC50 inferior a 15 μM. Além disso, foi determinada a estruturas de raios-X do complexo cruzaína-gallinamida A e métodos computacionais nos permitiram identificar os determinantes atômico-estruturais subjacentes na inibição seletiva desta série de compostos. Por outro lado, as bases moleculares da modulação alostérica exercida sobre fator de iniciação de tradução eucariótica 4E 1 (LmIF4E-1) em Leishmania major pela proteína 4E-IP1 (Lm4E-IP1) foram desvendadas utilizando métodos in silico. Nesse sentido, foram determinadas as diferenças nos movimentos internos das formas apo e complexadas com Lm4E-IP1 e com cap da LmIF4E-1. Este estudo permitiu detalhar as perturbações dinâmicas ocorridas no sítio principal de ligação da LmIF4E-1 desencadeadas pela união com Lm4E-IP1. Esta analise contribuiu à compreensão do processo da expressão gênica nos tripanossomatídeos e revelou informações cruciais da regulação alostérica nas eIF4Es. Por fim, foi realizada a modelagem computacional do homodímero da esterol 14alfa-desmetilase (AcCYP51) de Acanthamoeba castellani inserido numa bicamada lipídica. Nosso modelo revelou que o dímero permanece estável, interagindo com a bicamada ao longo do tempo de simulação. Esses resultados também nos forneceram informações sobre a potência superior do isavuconazol contra esse parasita comparados com outros do mesmo gênero.
Abordagem físico-química da interação da piperlongumina com alvos farmacológicos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-01-28) Povinelli, Ana Paula Ribeiro; Cornélio, Marinônio Lopes [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A busca por metabólitos com potencial farmacológico oriundos de plantas e de micro-organismos sempre foi uma área bastante explorada pela comunidade científica. Foi reportado que a piperlongumina (PPL), molécula extraída de espécies de pimenta, apresenta ação anti-inflamatória e por isso, o objetivo deste trabalho foi a descrição da interação da PPL com alguns alvos farmacológicos envolvidos no processo de transporte e de inflamação. A primeira etapa deste trabalho foi dedicada ao estudo da interação da PPL com a albumina de camundongo (RSA), pois entender a interação de pequenas moléculas com esta proteína contribui para compreensão da distribuição dos fármacos no organismo. Os resultados de supressão de fluorescência mostraram que a PPL se liga na RSA espontaneamente e que o processo é entropicamente dirigido. Também foi mostrado que a PPL acessa dois sítios cooperativos da RSA com constantes de ligação de (2.3±0.1)•105 e (1.3±0.1)•105 M-1. Com as ferramentas de docagem e dinâmica molecular verificou-se os sítios de interação como sendo ricos em resíduos apolares. Além disso, com a análise dos dados de supressão de fluorescência do sistema RSA-PPL, nós mostramos a necessidade da correção do efeito de filtro interno antes de associar os desvios no máximo de intensidade de fluorescência à mudanças de polaridade no ambiente da sonda fluorescente. Também mostramos a possibilidade de utilizar as áreas do espectro de emissão do Trp, em vez de um único comprimento de onda. A segunda etapa deste trabalho foi dedicada ao estudo da interação da PPL com o domínio NBD da HSP70. A análise dos dados de supressão de fluorescência mostrou o equilíbrio das componentes entrópicas e entálpica na interação da PPL com o NBD. Além disso, foi mostrado que a PPL acessa dois sítios do NBD com constantes de ligação equivalentes a (6.3 ± 0.2)•104 M-1 ,de modo cooperativo. Os ambientes de interação foram descritos com o uso do docagem molecular. Com a dinâmica molecular associada ao método de MMPBSA (Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area), a energia livre de interação foi estimada como sendo (-58 ± 3) e (-49 ± 3) kJ•mol-1 para os sítios 1 e 2. A terceira etapa deste trabalho foi dedicada à modificação de alguns grupos químicos da estrutura da PPL. As estruturas inspiradas na PPL foram submetidas aos cálculos de docagem molecular para a verificação na mudança de afinidade pela proteína NF-kB.
Estudos biofísicos moleculares e celulares na presença do composto anticâncer (Piperlongumina) utilizando microscopia de força atômica e técnicas espectroscópicas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-16) Contessoto, Nayara Sousa de Alcântara [UNESP]; Cornélio, Marinônio Lopes [UNESP]; Kiang, Ching-Hwa; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Compostos naturais apresentam grande potencial na pesquisa anticâncer, pela inibição do crescimento do tumor, pelas propriedades anti-metastáticas e anti-inflamatórias. A piperlongumina (PL) é um dos compostos naturais que tem se destacado. PL apresenta informações físico-químicas propícias que sugerem a possibilidade de ser carreada até seu alvo, através do plasma sanguíneo pela proteína HSA (albumina do soro humano). No presente estudo, investigamos as influências biofísicas deste composto em dois níveis: molecular e celular. Nas análises de biofísica molecular, monitoramos a supressão do espectro de emissão de fluorescência do peptídeo Ac2−26 da proteína Anexina A1, a qual atua como um mediador endógeno anti-inflamatório, durante titulações com PL. Entender como os componentes envolvidas em processos inflamatórios atuam e se interagem, a fim de potencializar seus efeitos, é importante dado que a inflamação crônica contribui para um microambiente suscetível à tumorigênese, favorecendo o desenvolvimento e progressão do câncer. Nesta parte do trabalho foram obtidas informações energéticas, as quais indicaram a interação espontânea entre o peptídeo Ac2−26 e PL, a qual é dirigida por forças não-específicas. Tal informação motivou a colaboração para investigar os efeitos na proliferação e migração celular (células HUVEC e HEp-2) e na expressão gênica de mediadores inflamatórios. Nas análises de biofísica celular, utilizando espectroscopia de força de célula única baseada em Microscopia de Força Atômica (AFM), caracterizamos as propriedades de células HeLa em tratamento com PL. Estudos anteriores mostraram efeitos anticâncer nas células HeLa por PL. No entanto não se sabe dos efeitos mecânicos deste sistema (PL-HeLa). Utilizamos AFM e obtivemos as curvas força-distância que mostraram padrões graduais. Analisamos a força do passo (SF) e observamos que as células tratadas com PL apresentam um valor maior de SF em comparação com as células controle. Este aumento de SF também foi observado em experimentos realizados em substratos com rigidez crescente. Portanto, os efeitos de PL nas propriedades mecânicas das células HeLa podem ser refletidos no parâmetro mensurável SF. Tais fatores mecânicos podem estar relacionados à tensão e flexibilidade da membrana. A compreensão da influência de fármacos nas propriedades mecânicas das células pode ajudar no rastreamento de drogas terapêuticas eficazes contra o câncer.
Estudo da interação dos peptídeos antimicrobianos MP1 e H-MP1 com modelo de membranas bacterianas por dinâmica molecular
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-28) Martins, Ingrid Bernardes Santana; de Araujo, Alexandre Suman [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
PeptÍdeos antimicrobianos (PAMs) são parte do sistema imune de muitas espécies e, devido ao seu modo de ação, dificultam o desenvolvimento de cepas de bactérias resistentes promovidas por antibióticos convencionais, sendo assim compostos que têm potencial de aplicação antibiótica. Os PAMs são, geralmente, ricos em resíduos de aminoácidos catiônicos e hidrofóbicos e agem diretamente na fase lipídica da membrana celular. O peptídeo Polybia-MP1 é um peptídeo extraído da vespa Polybia paulista e possui amplo espectro bactericida em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e não e hemolítico nem citotóxico. O H-MP1 é um análogo sintético em que as lisinas do MP1 são substituídas por histidinas, para que a carga líquida possa responder as mudanças no pH da solução. Nesse trabalho usamos técnicas biofísicas computacionais para investigar o efeito do pH da solução nas propriedades estruturais desses peptídeos e na sua interação com a bicamada lipídica que mimetiza a membrana celular de bactérias Gram-negativas. Os resultados indicam que a adsorção do H-MP1, sensível ao pH, aumenta com um ambiente acido se assemelhando ´ ao MP1, que não é influenciado pela pequena variação de pH da solução. As simulações de Dinâmica Molecular mostraram que o processo de adsorção de ambos os peptídeos se inicia pela interação do N-terminal com a bicamada, seguido por uma completa adsorção do peptídeo paralelo ao plano da bicamada, induzindo aumento no conteúdo helicoidal o que intensificou o contato do peptídeo com a fase hidrofóbica da bicamada. As simulações ainda mostraram uma desestabilização do empacotamento lipídico da bicamada caracterizada pela diminuição do parâmetro de ordem calculado para as cadeias acílicas. Simulações de Dinâmica Molecular a pH Constante, que foram realizadas a partir das estruturas dos peptídeos adsorvidos obtidas por Dinâmica Molecular convencional, foram capazes de elucidar detalhes da eletrostática envolvida no processo de adsorção. Elas mostraram que a adsorção desses peptídeos na bicamada lipídica aumenta em aproximadamente duas unidades os valores de pKa calculados para os resíduos ionizáveis. Com isso, esses peptídeos apresentam carga mais positiva quando estão na presença da bicamada do que quando estão apenas em solução aquosa. Dessa forma, a magnitude da atração eletrostática dos mesmos ´ pela bicamada aniônica é aumentada, evidenciando a seletividade que tais peptídeos possuem pela bicamada mimética de bactérias.
Estudo da interação da piperina com potenciais alvos moleculares de interesse farmacológico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-17) Zazeri, Gabriel; Cornélio, Marinônio Lopes [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O estudo de produtos naturais com propriedades farmacológicas é uma área de interesse para a comunidade científica. Estudos recentes mostraram que a piperina, uma molécula extraída de diversas espécies de pimenta, é um agente anti-inflamatório que atua inibindo a cascata de ativação da proteína NF-κB em várias etapas desta via, ocasionando o bloqueio da transcrição de genes de citocinas e outras proteínas pró-inflamatórias. Devido a este fato, o objetivo deste trabalho foi a caracterização biofísica a nível molecular da piperina e seus derivados com proteínas envolvidas neste processo, nunca antes reportados na literatura. A caracterização dos complexos piperina-proteína, foi feita por meio da técnica de espectroscopia de fluorescência de modo a determinar o número de sítios de ligação, a descrição dos parâmetros termodinâmicos de interação, bem como, as constantes e os modos de ligação dos complexos. Além disto, o dicroísmo circular foi empregado de modo a entender as mudanças conformacionais que as proteínas sofreram devido às interações com as moléculas. As técnicas computacionais de docagem e dinâmica molecular foram utilizadas para encontrar os prováveis sítios de interação e para descrever o microambiente de interação dos ligantes. A primeira etapa deste trabalho foi dedicada ao estudo da interação da piperina com as proteínas interleucina-1β (IL-1β), domínio NBD da proteína de choque térmico 70 (Hsp70) e albumina sérica de camundongo (RSA). Os resultados experimentais mostraram que a piperina se liga as proteínas espontaneamente e que o processo é entropicamente dirigido para as proteínas IL-1β e NBD e entalpicamente dirigido para a RSA. Além disto, os dados experimentais revelaram a constante de afinidade das interações, o número de sítios e o modo de interação (cooperativo ou não). Com as ferramentas de docagem molecular e dinâmica verificaram-se os sítios de interação, as interações envolvidas e a energia livre de ligação teórica. A segunda etapa deste trabalho foi dedicada à síntese e à caracterização de moléculas inspiradas na estrutura da piperina e ao estudo computacional dos efeitos das modificações estruturais na interação com as proteínas envolvidas nos processos inflamatórios IL-1β e NF-κB. O conjunto de resultados adquirido permitiu uma avaliação espectroscópica auxiliada por modelagem computacional que elucidou em detalhes as interações entre a piperina e derivados com as proteínas IL-1β, NBD e RSA que servirá como base para futuros estudos na linha de descoberta de fármacos.
Estudo das interações não-nativas, eletrostáticas e hidrofóbicas, no processo de enovelamento de proteínas utilizando modelos minimalistas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-20) Silva, Fernando Bruno da; Leite, Vitor Barbanti Pereira [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O estudo do enovelamento proteína nesse trabalho tem como base o uso do modelo baseado em estrutura, modelo no qual apenas as interações nativas são consideradas como favoráveis durante o enovelamento. Entretanto, as interações ditas como não favoráveis são consideradas pelo modelo. Dessa forma, o objetivo geral desse trabalho buscou averiguar os efeitos das interações não-nativas durante o processo enovelamento. Os potencias não-nativos adotados são: potencial eletrostático (Elec), hidrofóbico (HP) e de dessolvatação (db ou dsb). Esses potenciais foram combinados de diferentes formas e adicionados no modelo SBM-Cα. Portanto, o trabalho desenvolvido buscou compreender como as interações não-nativas e os estados metaestáveis podem estar correlacionados. O primeiro trabalho desenvolvido envolve a proteina CI2, onde foram analisados diferentes grupos mutacionais para obter uma proteína mais termoestável. O modelo computacional adotado foi o SBM-Cα + Elec + HP. O segundo trabalho foi com os domínios R15, R16 e R16M5 da α-espectrina, esse estudo é continuação dos trabalhos realizadas anteriormente com os domínios R15, R16 e R17. O modelo computacional utilizado foi o mesmo proposto para CI2 e tem como objetivo analisar os fatores mutacionais envolvidos na redução do tempo de enovelamento devido a um grupo mutacional específico. Além disso, por meio do método ELViM, foram averiguados os perfis energéticos dessas proteínas. Por fim, no terceiro trabalho foi investigado os estados intermediários das proteínas Im7 e Im9, pois em diferentes valores de pH, esses estados apresentam diferentes comportamentos. Portanto, o modelo computacional adotado foi o SBM-Cα + Elec + HP + db. Afim de reproduzir o sistema em diferentes valores de pH, foram alterados os valores de carga dos resíduos ionizáveis.
Síntese e caracterização de materiais zeolíticos e sua aplicação como agentes de contraste para exames de imagem por ressonância magnética
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-12-10) Contro, Janine; Nery, José Geraldo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O objetivo do presente trabalho é a síntese e caracterização de materiais zeolíticos com potencial de serem aplicados como agentes de contraste em exames de Imagem por Ressonância Magnética (MRI). Os materiais estudados foram a zeólita Faujasita (FAU), Zeólita A (LTA), zeólita Beta (BEA), Zeólita ZSM-5 (MFI) e zeólita Mordenita (MOR), estes materiais foram trocados ionicamente com metais lantanídeos, como o gadolínio Gd3+. Os materiais foram caracterizados por difração de raios-x (DRX) e então foram submetidos a estudos relaxométricos, nos quais foram calculados os tempos de relaxação T1 e T2 utilizando técnicas como inverse recovery e saturation recovery. Estes estudos foram realizados na Universidade do Texas – Health Science Center em Houston sob a orientação do Prof. Dr. Ponnada A. Narayana. Os estudos in vivo também foram realizados na Universidade do Texas, para isso os potenciais novos agentes de contraste foram administrados a ratos Sprague Dawley, que foram então submetidos ao exame de Imagem por Ressonância Magnética de seu cérebro e abdômen. Estudos comparativos de desempenho das zeólitas e dos agentes de contraste comerciais foram realizados utilizando o Gd-DOTA (ácido gadotérico – Dotarem). A zeólita Faujasita apresentou valores de relaxividade muito maiores que o Dotarem chegando a apresentar valores de relaxividade 10x maiores. Nos testes preliminares as imagens utilizando a mFAU-1 apresentaram muito mais detalhes que as imagens utilizando o Dotarem. Porém no estudo comparativo o mesmo não foi observado, provavelmente por causa da sobreposição do efeito de T2 sobre T1 nas concentrações utilizadas. Os agentes de contraste a base de zeólitas se mantém mais tempo na corrente sanguínea possibilitando exames dependentes de contraste mais longos. Mas ainda assim, em dois dias, como é o caso do Dotarem, todo o contraste já foi expelido pelo corpo do animal. Os resultados obtidos até o momento são muito iniciais para o desenvolvimento de um novo agente de contraste, porém se mostram promissores. Possivelmente um ajuste na concentração de contraste a ser administrada ao objeto de estudo pode melhorar o contraste nas imagens obtidas por Ressonância Magnética.
Nanozeólitas como suporte para imobilização de lacases: aplicação dos biocatalisadores na reação de oxidação mediada do glicerol
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-09-24) Miller, Alex Henrique; Nery, José Geraldo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A oxidação do glicerol tem sido objeto de diversos estudos no mundo todo; em geral, o principal objetivo destes trabalhos é o encontro de um catalisador apropriado para converter, seletivamente, esta molécula bloco em produtos de alto valor agregado. Lacases imobilizadas em suportes sólidos são catalisadores heterogêneos não prejudiciais ao meio ambiente, que podem ser aplicados para a oxidação do glicerol num sistema lacase-mediador. Estas enzimas contêm átomos de cobre em sua estrutura e catalisam a oxidação de muitos compostos fenólicos com a concomitante redução de água a oxigênio molecular. Apesar da sua especificidade, quando apropriadamente combinada com mediadores, as lacases podem também agir na oxidação de compostos não fenólicos. Este trabalho abordou a síntese e caracterização de zeólitas em nano escala – morfologias FAU, BEA, LTA e MFI –, a aplicação destes materiais como suporte para a imobilização de diferentes lacases comerciais – dos organismos A. bisporus, Aspergillus sp. e P. ostreatus –, e o uso dos complexos obtidos para oxidação do glicerol mediada pelo composto N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMPO). Todas as zeólitas foram sintetizadas de acordo com a literatura, e a forma sódica da zeólita FAU modificadas por troca iônica com Cu2+ para geração de um suporte extra. Os materiais sintetizados foram amino-funcionalizados para permitir a imobilização das lacases covalentemente. Os suportes foram caracterizados por XRD, SEM-EDX, HRTEM, FTIR, e as enzimas livres ou complexos espectroscopicamente avaliados através da oxidação do composto 2,2´-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS). Com base nas atividades de oxidação do composto ABTS, os complexos FAU/Cu2+/APTMS/GA/LPO, FAU/Cu2+/APTMS/ GA/LAB, FAU/Cu2+/APTMS/GA/LAsp, e BEAc/APTMS/GA/LAsp foram selecionados para aplicação nas reações de oxidação do glicerol. Para comparação, as enzimas LPO, LAB e LAsp na forma livre e os suportes FAU/Cu2+/APTMS/GA e BEAc/APTMS/GA foram aplicadas em condições reacionais similares. Todas as reações utilizando os complexos lacase/nanozeólitas apresentaram, após 48 h de reação, baixa conversão do glicerol – inferiores a 5%. No entanto, uma alta seletividade foi observada para gliceraldeído, acima de 88 % em todos os casos. Não houve conversão do glicerol utilizando apensas os suportes sem enzima. Por outro lado, quando as enzimas LPO e LAsp foram aplicadas nas suas formas livres, as conversões do glicerol obtidas foram significativamente superiores em comparação aos complexos – ~29% para a LAsp e mais de 80% para a LPO após 48 h de reação. Seletividades de 57,10% a gliceraldeído e 25,75% a ácido glicérico, foram quantificadas das reações com a enzimas livre LPO, enquanto da reação com LAsp, a seletividade a gliceraldeído foi de 78%, e o segundo produto mais obtido foi ácido glioxílico, 11,47%. A lacase LAB na forma livre apresentou conversão muito menor quando comparada as demais – ~3,2% após 48 h. Visando compreender quais razões levaram a redução da atividade enzimática após imobilização nos materiais nanozeolíticos, um estudo sistemático utilizando voltametria cíclica foi empregado para a LAsp. Este estudo apontou que o potencial de redução desta enzima é um fator limitante na sua aplicação, e que em meio ácido, a taxa de oxidação do mediador TEMPO é bastante reduzida. Com o uso de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), foi possível inferir que a imobilização enzimática causou distorções estruturais na LAsp, em específico, nos centros de cobre do seu sítio catalítico, pois variações significativas nos Hamiltonianos de spin (tensores g, e constantes de acoplamento hiperfino A) foram observadas quando comparadas enzimas em solução ou imobilizadas. Os espectros revelaram também uma alta dependência da acidez do meio na interação dos sítios de cobre com os ligantes de coordenação. Além disso, os Hamiltonianos de spin paralelos do cobre T2 da enzima imobilizada em zeólita BEAc/APTMS/GA (g|| = 2,275, A|| = 173,4x10-4cm-1) são mais próximos da enzima livre em pH 7 (g|| = 2,275, A|| = 170,1x10-4 cm-1) do que em pH 4 (g|| = 2,275, A|| = 220,2x10-4 cm-1). Isso indica que o pH dos microambientes enzimáticos após imobilização é neutro, e isso é a provável razão pela redução na atividade enzimática após imobilização nos suportes zeolíticos.
Computational strategies for selective inhibition of falcipain-2
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-14) Hernández González, Jorge Enrique; Leite, Vitor Barbanti Pereira [UNESP]; Pascutti, Pedro Geraldo; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A falcipaína-2 (FP-2) é uma hemoglobinase chave do Plasmodium falciparum, frequentemente selecionada como alvo para o planejamento de fármacos antimaláricos. Apesar dos esforços, nenhum inibidor da FP-2 tem entrado em fase de ensaios clínicos, pois a inibição cruzada de alvos humanos constitui um obstáculo. Neste trabalho, abordamos questões relacionadas à inibição seletiva da FP-2 através de diferentes técnicas computacionais, como simulações de dinâmica molecular, triagem virtual, ancoramento molecular, análise da comunidades e cálculos de volume de cavidades e energia livre. Ademais, realizamos ensaios de inibição in vitro para validar as predições. Apresentamos os compostos HTS07940 e HTS08262, que inibem a FP-2 e culturas de P. falciparum com boa seletividade respeito à catepsina K humana (hCatK) e à linha celular HeLa. Os inibidores foram identificados por meio de uma estratégia de triagem virtual que descartou ligantes com alta afinidade pela hCatK. Outras formas de atingir inibição seletiva são exploradas, como a busca por inibidores alostéricos, que ligam tipicamente sítios menos conservados. Analisamos uma região da FP-2 equivalente a um sítio alostérico da hCatK previamente caracterizado, o sítio 6, e predizemos vários ligantes potenciais. Após avaliação experimental, dois compostos, ZINC03225317 e ZINC72290660, são confirmados como inibidores não competitivos da FP-2, o que reforça a relevância deste sítio para o planejamento de fârmacos. A busca de cavidades alostéricas é expandida a outros sítios, baseada em informações experimentais prévias relacionadas a uma E-chalcona identificada acidentalmente como inibidor não competitivo da FP-2. Os resultados revelam a ocorrência de uma cavidade transiente numa região denominada sítio 3, que permanece maioritariamente ocluída pela cadeia lateral do resíduo K34. O modo de ligação predito da E-chalcona é consistente com os dados experimentais disponíveis e fornece informação sobre o mecanismo alostérico a nível molecular. Por fim, estudamos os determinantes moleculares da alta seletividade pela FP-2 de nitrilos que contêm substituintes de 3-piridina em P2, previamente estudados. Segundo as nossas predições, pontes de água envolvendo os resíduos I85 e D234 da FP-2 e o nitrogênio da piridina explicam os perfis experimentais de atividade. Portanto, inibidores seletivos da FP-2 podem ser planejados promovendo a formação de pontes de água no fundo do subsítio S2 e/ou introduzindo grupos químicos que substituem a molécula de água envolvida.
Utilização do método Suvrel no ranqueamento de genes envolvidos em expressão diferencial e na análise de otimização de predição de epítopos lineares de células B
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-10-24) Tambonis, Tiago; Leite, Vitor Barbanti Pereira [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
RNA-seq. Na primeira parte desta tese, uma abordagem geométrica baseada no Método Suvrel (\Supervised Variational Relevance Learning") é comparada com pacotes R destinados a expressão diferencial. O método Suvrel procura determinar as relevâncias das características (por exemplo, genes ou transcritos) baseado em comparações de distâncias interclasses e intraclasses. A investigação foi realizada utilizando replicatas técnicas e biológicas. A análise utilizando replicatas técnicas foi realizada por meio de curvas ROC enquanto que as replicatas biológicas foram analisadas por meio de robustez. De forma geral, é mostrado que a análise proposta obteve melhores resultados na maioria dos casos. Além disso, é um método simples que não faz nenhuma suposição sobre a distribuição associada ao conjunto de dados de RNA-seq. Desta perspectiva, a relevância deste estudo foi mostrar que um método simples pode fornecer boa acurácia tanto quanto os métodos mais complexos. Otimização de predição de epítopos lineares de células B. Epítopos são definidos como fragmentos constituintes de um antígeno (substância que ao entrar em um organismo é capaz de iniciar uma resposta imune) que interagem com receptores de células B, T e anticorpos. Após a ativação da resposta imune adaptativa é possível que o sistema imune crie memória, onde uma outra invasão será respondida de forma mais rápida. A identificação de epítopos utilizando processos experimentais ainda permanece difícil. Devido ao potencial de aplicação de ferramentas preditivas que podem auxiliar a identificação, uma série de algoritmos foram propostos. Dado o panorama exposto, a proposta da presente tese é a análise de possível melhora da acurácia de predição de epítopos lineares de células B associada ao preditor LBTOPE por meio do método Suvrel. A metodologia apresentada melhorou consideravelmente medidas estatísticas em dados gerados pelos autores do preditor e também em dados gerados por outros autores.
Ação de aditivos moleculares em dispersões de vesículas e filmes de Langmuir de moléculas anfifílicas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-10-29) Lemos, Monique; Feitosa, Eloi da Silva [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A utilização de carreadores não virais de fármacos, de baixo custo comercial, requer estudo das propriedades físico-químicas e caracterização desses carreadores. Uma opção para carreador não viral são vesículas de lipídios sintéticos ou naturais, como os catiônicos brometo e cloreto de dioctadecildimetilamônio (DODAB e DODAC) e o zwitterionico dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) respectivamente. O presente estudo apresentam os efeitos dos sais NaCl e NaBr, e da glicose nas propriedades térmicas e estruturais desses lipídios organizados em monocamadas (filmes de Langmuir) ou em bicamadas (vesículas). Foi também investigada ação do copolímero Plurônico F127, como helper, na solubilização da molécula anticancerígena doxorrubicina nas vesículas investigadas, em soro fisiológico, glicosado e caseiro como solvente. A ação desses aditivos nas vesículas e monocamadas é investigada por calorimetria diferencial de varredura, espalhamento dinâmico da luz, espalhamento eletroforético da luz, espectrofotômetro-UV e medidas em cuba de Langmuir. Dentre os resultados obtidos destacam-se a formação e caracterização de vesículas em soro e na presença do copolímero F127 e DOX.
Efeito do pH e da composição lipídica na interação do peptídeo antimicrobiano MP1 e seu análogo H-MP1 com membranas modelo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-05-20) Viegas, Taisa Giordano; Ruggiero Neto, João [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Peptídeos líticos com propriedades antimicrobianas são catiônicos e atuam na membrana celular desestabilizando o empacotamento lipídico levando a célula à lise. Polybia-MP1 ou MP1 (IDWKKLLDAAKQIL-NH2) é um potente bactericida, não hemolítico e não citotóxico que também inibe a proliferação de células de câncer. Ambas as atividades, bactericida e inibitória, envolvem lipídios aniônicos e pH do ambiente diferente do fisiológico. O potencial eletrostático e o pH da solução podem modular a carga do peptídeo com presença simultânea de resíduos ácidos e básicos. Neste trabalho investigamos o efeito da modulação de carga na afinidade e na eficiência lítica em vesículas lipídicas. Para esta tarefa a eficiência do MP1 em vesículas lipídicas foi comparada com a do análogo H-MP1 em que as histidinas substituíram as lisinas. Dicroísmo circular, fluorimetria, potencial zeta e microscopia óptica foram usados para investigar a ação desses peptídeos em vesículas unilamelares grandes e gigantes (LUVs e GUVs) de diferentes composições lipídicas com o pH da solução fixado em 5,5, 6,5 e 7,4. A carga do MP1 foi menos sensível ao potencial da vesícula e ao pH da solução, enquanto a carga do H-MP1 foi fortemente modulada, sendo maior em solução ácida, mas ainda menor que MP1. A modulação da carga do H-MP1 conferiu maior afinidade e desempenho lítico em solução ácida, enquanto MP1 foi melhor em pH neutro. MP1 apresentou maior atividade de permeação nas vesículas lipídicas nos três pHs investigados em comparação ao H-MP1. O vazamento induzido em GUV única foi caracterizado por um tempo de retardo da ordem de minutos seguido pela liberação do conteúdo da GUV em alguns segundos. O tempo de retardo e a permeabilidade são dependentes do pH e da concentração de peptídeo. Os resultados confirmam que a inserção desses peptídeos na fase lipídica perturba o empacotamento de lipídios, levando à formação de poros.

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