Staphylococcus coagulase negativo produtores de coagulase isolados de leite bubalino e ambiente de ordenha podem ser confundidos com Staphylococcus aureus por métodos fenotípicos e por biologia molecular

Abstract

Assim como nos bovinos, a búfala pode ter mastite, sendo o Staphylococcus aureus o principal causador desta enfermidade. No entanto, é possível que sua prevalência possa estar superestimada. Este estudo objetivou comparar métodos fenotípico e genotípico na identificação de S. aureus em amostras de leite bubalino e ambiente de ordenha bem como propor uma nova PCR quantitativa em tempo real para identificação do mesmo. Para isso, de um total de 408 amostras obtidas de leite de búfalo, ambiente de ordenha e mãos de ordenhadores, 32 cepas presuntivas de S. aureus foram identificadas com base em seu crescimento fenotípico característico em ágar Baird Parker, reações positivas de Gram e catalase, capacidade de coagular plasma de coelho, e resultado positivo no ensaio de PCR Sa442 específico para a espécies. No entanto, testes adicionais revelaram que destas 32 estirpes, apenas 10 isolados apresentaram resultado positivo na aglutinação em látex, incluindo um S. chromogenes e um S. agentis. A análise de MALDI-TOF MS revelou que oito das 32 cepas eram S. aureus, 19 S. chromogenes, três S. agnetis e uma S. xylosus. Todas as oito cepas identificadas como S. aureus pela análise de MALDI-TOF e confirmadas pelo sequenciamento do 16S rRNA foram positivas na PCR do gene cydB específico para S. aureus. Além disso, foi encontrada uma cepa positiva para o gene sea, nove para o gene cna, uma para o gene sei, duas para o gene sem, uma para o gene seg, seis para o gene seh, 15 para o gene eno 11 para o gene ebps duas para o gene fib e 14 para o gene fnbA. Das cepas Isoladas, apenas uma apresentou resistência a clindamicina, uma a vancomicina, uma para a rifampicina, nove para a penicilina, 15 para a eritromicina, duas para a ciprofloxacina e três para o cotrimoxazole. Resistência a dois antimicrobianos foi observado em oito cepas, a três antimicrobianos em uma cepa e a quatro antimicrobianos em uma cepa. Finalmente, sete das oito cepas de S. aureus foram positivas para a nova PCR em tempo real do gene coa, duas das 19 cepas S. cromogenes e a única cepa de S. xylosus também foram positivas. Em conjunto, nossos achados sugerem que S. agentis e S. chromogenes podem ser identificados erroneamente como S. aureus pelos testes de aglutinação em látex, PCR para Sa442 PCR e Staphyclin latex enquanto MALDI-TOF MS e um teste de PCR cydB específico para S. aureus podem identificar com precisão S. aureus de leite de búfala e amostras ambientais e que estas cepas podem apresentar genes que codificam enterotoxinas e resistência aos antimicrobianos.

Like cattle, buffalo may have mastitis, with Staphylococcus aureus being its main cause. However, it is possible that its prevalence may be overestimated. This study aimed to compare phenotypic and genotypic methods for S. aureus identification in samples of buffalo milk and milking environment as well as to propose a new quantitative real time PCR for its identification. For this, a total of 408 samples obtained from buffalo milk, milking environment and milkers hand, 32 presumed S. aureus strains were identified based on their characteristic phenotypic growth in Baird Parker agar, positive reactions of Gram and catalase, ability to coagulate rabbit plasma, and positive result in the species-specific Sa442 PCR assay. However, additional tests revealed that of these 32 strains, only 10 isolates tested positive for latex agglutination, including a S. chromogenes and a S. agentis. Analysis of MALDI-TOF MS revealed that eight of the 32 strains were S. aureus, 19 were S. chromogenes, three were S. agnetis and one was S. xylosus. All eight strains identified as S. aureus by MALDI-TOF analysis and confirmed by 16S rRNA sequencing were positive in S. aureus specific cydB gene PCR. In addition, a positive strain was found for the sea gene, nine for the cna gene, one for the sei gene, two for the sem, one for the seg gene, six for the seh gene, 15 for the eno 11 gene for the gene ebps two for the fib gene and 14 for the fnbA gene. Of the isolates, only one showed resistance to clindamycin, one to vancomycin, one to rifampicin, nine to penicillin, 15 to erythromycin, two to ciprofloxacin and three to cotrimoxazole. Resistance to two antimicrobials was observed in eight strains, three antimicrobials in one strain and four antimicrobials in one strain. Finally, seven of the eight strains of S. aureus were positive for the new real-time PCR of the coa gene, two of the 19 S. chromogenes strains and the only strain of S. xylosus were also positive. Taken together, our findings suggest that S. agentis and S. chromogenes can be misidentified as S. aureus by the agglutination assays of Sa442 PCR and Staphyclin latex while MALDI-TOF MS and a cydB PCR test specific for S. aureus can identify with accurate S. aureus of buffalo milk and environmental samples and that these strains may have enterotoxin genes and antimicrobial resistance genes in buffaloes.