Síntese e avaliação in vitro do peptídeo antimicrobiano Ctx(Ile21)-Ha microencapsulado e revestido como aditivo zootécnico contra Clostridium perfringens em frangos de corte

Abstract

Diante do crescimento e alarmantes projeções quanto à resistência microbiana, a busca por alternativas que possam substituir antibióticos convencionais vem ganhando notoriedade, principalmente na produção animal. Nesta área, comumente utiliza-se antibióticos como aditivos zootécnicos promotores de saúde para prevenção de doenças em sistemas de produção intensivos. Assim, o uso de antibióticos naturais, eficientes e que não causam resistência bacteriana possibilita que granjas com milhares de aves não corram risco de infecções gastrointestinais, nocivas a este sistema de produção. Desta forma, o presente trabalho consiste em analisar in vitro a viabilidade da utilização da formulação do peptídeo antimicrobiano (PAM) Ctx(Ile21)-Ha contra a bactéria Gram-positiva Clostridium perfringens causadora da enterite necrótica em frangos de corte. Para isso, o peptídeo antimicrobiano Ctx(Ile21)-Ha foi sintetizado manualmente pelo método de síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS), realizando-se vários ciclos de síntese. Após isto, o peptídeo foi purificado via cromatografia líquida em alta performance (HPLC) e caracterizado via espectrometria de massas, obtendo-se uma massa de aproximadamente 600 mg do peptídeo purificado, com teor de pureza maior que 95%. O peptídeo foi então microencapsulado em duas massas diferentes (100 mg e 200 mg) duas vezes cada, com o polímero alginato de sódio através da técnica gelificação iônica e, em seguida, foram revestidas com ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP), o qual é resistente ao pH ácido do estômago de monogástricos. Assim, foram realizadas as análises de eficiência da microencapsulação e diversas análises físico-químicas para caracterização das microcápsulas contendo o peptídeo, como Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Análise Termogravimétrica (TGA), Espectroscopia por Dispersão de Energia de Raios X (EDX) e Difração de Raios X (DRX), além do perfil de liberação do peptídeo na microcápsula em soluções gástrica e intestinal simuladas. Diante disso, foram realizados os ensaios in vitro para obtenção da Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Bactericida Mínima (CBM) contra Clostridium perfringens e atividade hemolítica do peptídeo Ctx(Ile21)-Ha. O PAM Ctx(Ile21)-Ha demonstrou potente CIM e CBM contra C. perfringens, respectivamente, 4 μg/mL e 32 μg/mL, e atividade hemolítica (IC50) de 64 µg/mL. As microcápsulas revestidas contendo o peptídeo, nas massas de 100 mg e 200 mg, demonstraram eficiência de encapsulação, respectivamente, de 73,48% e 70,23%; as análises das caracterizações físico-químicas das micropartículas indicaram estabilidade, preservação térmica e uma estrutura semi-amorfa do microencapsulado. Por fim, as simulações garantiram uma liberação in vitro do peptídeo Ctx(Ile21)-Ha em pH alcalino, o que indica uma possível liberação na luz intestinal, onde os patógenos se encontram. Em conclusão, o PAM Ctx(Ile21)-Ha possui grande potencial para aplicação como novo aditivo benéfico à saúde do trato gastrointestinal e no desempenho produtivo de frangos de corte.

Given the growth and alarming projections regarding microbial resistance, the search for alternatives that can replace conventional antibiotics has been gaining notoriety, especially in animal production. In this area, antibiotics are commonly used as health-promoting zootechnical additives to prevent diseases in intensive production systems. Thus, the use of natural, efficient antibiotics that do not cause bacterial resistance means that farms with thousands of birds are not at risk of gastrointestinal infections, which are harmful to this production system. Therefore, the present work consists of analyzing in vitro the feasibility of using the antimicrobial peptide (AMP) formulation Ctx(Ile21)-Ha against the Gram-positive bacterium Clostridium perfringens, which causes necrotic enteritis in broiler chickens. For this, the antimicrobial peptide Ctx(Ile21)-Ha was manually synthesized using the solid phase peptide synthesis (SPFS) method, carrying out several synthesis cycles. After this, the peptide was purified via high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterized via mass spectrometry, obtaining a mass of approximately 600 mg of purified peptide, with a purity content greater than 95%. The peptide was then microencapsulated in two different masses (100 mg and 200 mg) twice each, with the polymer sodium alginate using the ionic gelation technique and then coated with hydroxypropylmethylcellulose phthalate (HPMCP), which is resistant to the acidic pH of the monogastric stomach. Thus, microencapsulation efficiency analyzes and several physicochemical analyzes were carried out to characterize the microcapsules containing the peptide, such as Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), Hard Scan-ning Electron Microscopy (SEM), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Thermo-gravimetric Analysis (TGA), X-ray Energy Dispersive Spectroscopy (EDX) and X-ray Diffraction (XRD), in addition to the release profile of the peptide in the microcapsule in simulated gastric and intestinal solutions. Therefore, in vitro tests were carried out to obtain the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Bactericidal Concentration (MBC) against Clostridium perfringens and hemolytic activity of the Ctx(Ile21)-Ha peptide. AMP Ctx(Ile21)-Ha demonstrated potent MIC and MBC against C. perfringens, respectively, 4 μg/mL and 32 μg/mL, and hemolytic activity (IC50) of 64 μg/mL. The coated microcapsules containing the peptide, in masses of 100 mg and 200 mg, demonstrated encapsulation efficiency, respectively, of 73.48% and 70.23%; analyzes of the physicochemical characterizations of the microparticles indicated stability, thermal preservation and a semi-amorphous structure of the microencapsulated material. Finally, the simulations guaranteed an in vitro release of the Ctx(Ile21)-Ha peptide at alkaline pH, which indicates a possible release into the intestinal lumen, where the pathogens are found. In conclusion, AMP Ctx(Ile21)-Ha has great potential for application as a new additive beneficial to the health of the gastrointestinal tract and the productive performance of broiler chickens.