O papel do hormônio da tireoide 3,3',5 – Triiodotironina (T3) na expressão de Lipocalina 2 (LCN2) e sua possível contribuição em mecanismos fisiológicos de ingesta alimentar.

Abstract

O hormônio tireoidiano 3,3',5 – Triiodotironina (T3) atua nas principais vias metabólicas, sendo sua ação mais representativa no aumento do metabolismo celular basal, que pode ocorrer de forma direta ou indireta através do estímulo de outras moléculas tróficas associadas em mecanismos fisiológicos. Desta forma, a compreensão da sua homeostase faz-se necessária considerando também condições de hipo e hipertireoidismo. Considerando esta perspectiva, tem sido mostrado que o tecido ósseo possui uma estreita relação que leva ao controle do metabolismo energético, sendo a molécula Lipocalina 2 considerada em aspectos centrais no controle do apetite. Neste contexto, com o intuito de melhor descrever possíveis vias metabólico-fisiológicas e seu comportamento através da exposição ao T3, o objetivo desse trabalho é avaliar o papel do hormônio T3 na expressão de Lipocalina 2 (LCN2) e sua possível contribuição em mecanismos fisiológicos de ingesta alimentar através do metabolismo de osteoblastos e adipócitos. Para isso, nossa proposta está dividida em 2 etapas, uma in vitro e outra in vivo. Nesta primeira etapa realizamos estudos in vitro, utilizando dois tipos celulares, pré-osteoblastos (MC3T3-E1) e pré-adipócitos (3T3-L1), submetidas a 2 tempos de tratamentos, 24h e 72h, em diferentes concentrações do hormônio T3, considerando: 1. Células sem tratamento (controle); 2. Eut: concentração fisiológica (1,5nM); 3. Hypo: concentração hipotireoidica (1nM); 4. Hyper: concentração hipertireoidica (2,0nM). As amostras foram apropriadamente coletadas e destinadas às diferentes metodologias. Nossos resultados mostraram que o T3 estimula um fenótipo de osteodiferenciação através de remodelamento de matriz extracelular (MEC) em todas as condições principalmente através da ativação dos biomarcadores clássicos desse fenótipo: genes RUNX2, OTX, BMP2-7 e metaloproteinases de matriz (MMPs)-2 e -9. Além disso, observamos que o T3 age em sinergismo a ativação dos genes LCN2 e OCN nas condições Hipo e Hipertireoidicas, por fim favorecendo processo de osteoclastogênese, destacado pela investigação do complexo RANKL/OPG, o qual apresenta papel central nesse mecanismo necessário ao remodelamento da matriz óssea. Ademais, o hormônio T3 promove significante atividade das MMPs nessas células. Em adição, estes resultados também trazem importante comportamento de adipócitos na expressão gênica de LCN2, OCN e RANKL nas condições Hipo e Hipertireoidicas. Soma-se aos resultados a modulação do perfil transcricional dos genes relacionados à reprogramação epigenética em osteoblastos e adipócitos, como TETs, DNMTs, e enzimas de processamento de miRNA (Dicer, Drosha e XPO5) e potenciais miRNAs (mir-143, 485, 23a/b e 335), sendo importantes para a compreender o envolvimento epigenético associado ao modelo proposto. Resultados mostram que T3 estimula a expressão de lipocalina 2 e sua liberação na matriz extracelular nos fenótipos de osteoblastos e adipócitos indicando atuação concomitante na indução de osteoclastogênese através do aumento significante de RANKL em concentrações não fisiológicas. Além disso, após realizarmos análises de bioinformática, através da ferramenta String, a qual utilizamos enriquecimento de redes PPI, observamos que as possíveis vias de sinalização que conectam Thrα e Lcn2 são vinculadas, também, à processos osteoclastogênicos, além de processos angiogênicos. Na etapa “in vivo” (n=5) foram considerados 5 grupos: Controle, Sham, Hypo, Veh e Hyper, os quais foram monitorados durante 21 dias, após esse período as amostras foram coletadas e destinadas a diversos ensaios e análises. Observou-se que ocorreu modulação na ingesta alimentar e aumento de peso, principalmente, no grupo Hyper, bem como alterações moleculares a partir do tecido adiposo, mostrando uma regulação positiva da LCN2 e MC4R no grupo Hypo. Já as análises histomorfométricas não mostraram diferenças significativas, assim, o T3 regula expressão de LCN2 em nível molecular, principalmente, em condições fisiopatológicas como o Hipotireoidismo. Logo, temos que compreensão em torno da sinalização endócrina e integração tecidual é um grande desafio nas áreas básicas, no âmbito molecular e fisiológico, neste contexto, nossos resultados elucidaram o sinergismo entre o hormônio tireoidiano T3 e a LCN2, e os destacam como potenciais alvos capazes de conectar o tecido ósseo e adiposo através da regulação endócrina e também, epigenética, facilitando assim, o rastreamento de alvos bioquímicos em disfunções metabólicas.

The thyroid hormone 3,3',5 - Triiodothyronine (T3) acts in the main metabolic pathways, its major action being in basal cell metabolism, which can occur directly or indirectly through the stimulation of other trophic molecules associated in physiology. Thus, the understanding of its homeostasis is necessary considering the both hypo and hyperthyroidism conditions. From this, it has been identified that the bone tissue has a close relationship that leads to the control of energy metabolism, being a molecule Lipocalin 2 considered playing a pivotal role in appetite controlling. In order to better describe the metabolic-physiological pathways and their behavior through exposure to T3, the aim of this work is to evaluate the role of the hormone T3 in the expression of Lipocalin 2 (LCN2) and its possible contribution to physiological mechanisms of food intake considering the metabolism of osteoblasts and adipocytes. To better address this issue, our proposal was divided into 2 steps, one in vitro and another in vivo. In this first stage, we carried out in vitro studies, using two cell types, pre-osteoblasts (MC3T3-E1) and pre-adipocytes (3T3-L1), submitted to 2 times of treatments, 24h and 72h, in different concentrations of the T3 hormone, as follows: 1. Untreated cells (control); 2. Eut: physiological concentration (1.5nM); 3. Hypo: hypothyroid concentration (1nM); 4. Hyper: hyperthyroid concentration (2.0nM). The samples were properly collected to allow the performing of different methodologies. Our data shows that T3 stimulates an osteodifferentiation phenotype through extracellular matrix (ECM) remodeling in all conditions, mainly through the activation of classical biomarkers of this phenotype: RUNX2, OTX, BMP2-7 and matrix metalloproteinases (MMPs) 2 and -9 genes. In addition, we observed that T3 acts in synergism with the activation of the LCN2 and OCN genes in both Hypo and Hyperthyroid conditions, ultimately favoring the osteoclastogenesis process, highlighted by the investigation of the RANKL/OPG complex, which plays a central role in this mechanism necessary for the remodeling of the bone matrix. Furthermore, the T3 hormone promotes significant activity of MMPs in these cells. In addition, these results also bring important expression of LCN2, OCN and RANKL in adipocyte behavior considering both Hypo and Hyperthyroid conditions. Additionally, we have also investigated the profile of genes related to epigenetic reprogramming in osteoblasts and adipocytes, such as TETs, DNMTs, and miRNA processing enzymes (Dicer, Drosha and XPO5) and potential miRNAs (mir-143, 485, 23a /b and 335). Our data shows that T3 stimulates the expression of lipocalin 2 and its release in the extracellular matrix in osteoblast and adipocyte phenotypes indicates a concomitant role in the induction of osteoclastogenesis through a significant increase in RANKL at non-physiological concentrations. Furthermore, after performing bioinformatics analysis, through the String tool, which uses enrichment of PPI networks, we observed that the possible signaling pathways connecting Thrα and Lcn2, which are also, link to osteoclastogenic processes, beside to angiogenic processes. In the “in vivo” stage (n=5), 5 experimental groups were considered, as follows: Control, Sham, Hypo, Veh and Hyper, which were monitored up to 21 days, when the samples were properly harvested to allow further analyses. It was observed that there was modulation in food intake and weight, mainly in the Hyper group, as well as molecular changes from the adipose tissue, conversely showing an up-regulation of LCN2 and MC4R in the Hypo group. The histomorphometric analyzes did not show significant differences inter-groups. Thus, we conclude that T3 regulates LCN2 expression at the molecular level, mainly in pathophysiological conditions such as hypothyroidism. Therefore, we have to understand around endocrine signaling and tissue integration is a major challenge in the basic areas, in the molecular and physiological ambit, in this context, our results elucidated the synergism between thyroid hormone T3 and LCN2, and highlight them as potential targets capable of connecting bone and adipose tissue through endocrine and also epigenetic regulation, facilitating the tracking of biochemical targets in metabolic dysfunctions.