Efeitos de diferentes tensões de oxigênio na eficiência da reprogramação e manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas de equino

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Data

2020-07-15

Autores

Castro, Raquel Vasconcelos Guimarães de [UNESP]

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Resumo

Células tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são uma ferramenta promissora para o tratamento de doenças, seja através de seu uso na medicina regenerativa, com estudos clínicos in vitro, ou ainda em estudos na área básica para desvendar mecanismos fisiológicos e patológicos. No entanto, algumas limitações, como a idade avançada do doador, o estado de senescência celular ou até mesmo as condições da atmosfera gasosa utilizadas no cultivo in vitro podem diminuir a eficiência da reprogramação à pluripotência. Dessa forma, a presente tese teve como objetivo estudar os efeitos do oxigênio no cultivo de células iPSC de equino (eiPSC), sendo na reprogramação à pluripotência ou nas iPSC originadas. No capítulo 1 uma revisão de literatura foi realizada a fim de sustentar a hipótese e justificar o estudo. No capítulo 2, o efeito das diferentes tensões de oxigênio (tensão de oxigênio atmosférica – aproximadamente 20% O2; tensão de oxigênio reduzida - 5% O2; ou a mudanças da atmosfera gasosa de aproximadamente 20% O2 para 5% O2) foi estudado durante o processo de reprogramação celular à pluripotência. Para tanto, a eficiência de reprogramação em cada grupo foi considerada, e uma avaliação seriada, a cada 3 dias, da expressão de genes chave de pluripotência (OCT4, SOX2, REX-1 e NANOG), genes relacionados ao metabolismo da glicose (GAPDH, e PFKM), genes relacionados aos processos de fusão e fissão mitocondriais (MFN1 e DNM1L), e genes relacionados a resposta da célula à baixa tensão de oxigênio (HIF1α, HIF2α, e VEGFA), foram realizadas, através de uma análise descritiva. A eficiência de reprogramação encontrada foi maior para o grupo cultivado em baixo oxigênio (grupo B). A alta eficiência de reprogramação do grupo B teve aparente correlação com uma maior expressão de OCT4 e NANOG e menor expressão de MFN1. Por outro lado, os resultados encontrados para o GAPDH sugeriram uma correlação negativa com a eficiência de reprogramação, e os genes HIF1α e HIF2α apresentaram expressão com menores valores no grupo B do que nos demais. Os resultados encontrados comprovam a hipótese de que a tensão de oxigênio influenciou na reprogramação das células eiPSC, já que observamos mudanças na expressão gênica entre os grupos ao longo da reprogramação. Além disso, a eficiência de formação de colônias eiPSC em baixo oxigênio foi maior que em alto oxigênio. No capítulo 3, eiPSC de um animal de mais de 20 anos de idade foram obtidas e o efeito das mesmas diferentes tensões de oxigênio propostas no capítulo 2 foi estudado nessas células. A reprogramação das células do animal idoso foi possível, como demonstrado pela coloração positiva para fosfatase alcalina; expressão endógena de mRNA de genes relacionados à pluripotência (OCT4, SOX2, REX-1 e NANOG) em todas as colônias avaliadas; coloração positiva no ensaio de imunofluorescência para OCT4 e NANOG (todos os grupos), SOX2 (grupo 5% O2 e 20% para 5% O2) e TRA-1-60, TRA-1-81 e SSEA-1 (somente em 20% O2), demonstrando diferenças entre os grupos; a formação de corpos embrióides; e diferenciação celular espontânea nas três camadas germinativas embrionárias mesoderme, endoderme e ectoderme. Diferenças na morfologia das colônias de eiPSC geradas foram observadas, sendo que as células do grupo cultivado em 20% O2 apresentaram maior similaridade com células “naïve” e as células dos grupos cultivados em 5% O2 e 20% para 5% O2 maior similaridade com a morfologia de células “primed”. Diferenças significativas foram também observadas na expressão dos genes GAPDH, GLUT3, MFN1, HIF1α e HIF2α, relacionados ao metabolismo da glicose, fissão mitocondrial, e hipóxia, respectivamente, após a reprogramação. Nossos resultados demonstram que a derivação de eiPSC não foi prejudicada pela idade avançada do animal. Além disso, esse estudo é o primeiro a comparar o cultivo de iPSC de equino em alto e baixo oxigênio e a demonstrar que o oxigênio influencia no processo de reprogramação nesses animais, como indicado pela geração de células pluripotentes com diferentes perfis; nas condições testadas, a tensão de oxigênio mais baixa foi responsável por uma maior eficiência de reprogramação, em acordo com o demonstrado no capítulo 2, mas não favoreceu a pluripotência das eiPSC.
Induced pluripotent stem cells (iPSC) are a promising tool for treating diseases, through their use in regenerative medicine, clinical trials, and studies in the basic area for unveiling physiological and pathological mechanisms. However, there still are some barriers for the obtention of these cells by reprogramming them to pluripotency. Limiting factors for the reprogramming process may come from the cells itself, as the advanced cellular donor age, high passage number in culture and the cellular senescence state; or they can be due to the culture conditions in vitro, as the gas atmosphere in which the cells are being cultured. Thus, the present thesis has the objective of studying the oxygen effects in the iPSC culture, in reprogramming to pluripotency and in the maintenance of the equine iPSC (eiPSC) obtained. In chapter 1 a literature review was made to give support to the hypothesis and justify this work. In chapter 2, the effect of different oxygen tensions (atmospheric oxygen tension – 20% O2 approximately; reduced oxygen tension – 5% O2; or the change of gas atmosphere from 20% O2 to 5% O2) was studied during reprogramming to pluripotency process. Therefore, the reprogramming efficiency was determined, and a serial evaluation, each 3 days, of the expression of key pluripotency genes (OCT4, SOX2, REX-1 and NANOG), genes related to cellular metabolism (GAPDH and PFKM), genes related to mitochondrial fusion and fission processes (MFN1 and DNM1L), and genes related to cellular response to low oxygen tension (HIF1α, HIF2α, and VEGFA), were performed. The reprogramming efficiency was higher in group cultured in low oxygen tension (group B). The high reprogramming efficiency in group B correlates with higher expression of OCT4 and NANOG in this group and lower expression of MFN1. On the other hand, GAPDH showed a negative correlation with the reprogramming efficiency and HIF1α and HIF2α genes presented a lower expression in group B compared to the other groups. Based on these results it is possible to confirm the hypothesis that the oxygen tension influenced reprogramming of eiPSC, and the efficiency of reprogramming in low oxygen is higher than in high oxygen. In chapter 3 we aimed to generate and maintain eiPSC derived from fibroblasts of a horse older than 20 years and to evaluate the effect of the same oxygen conditions, already proposed in chapter 2, on these cells. Reprogramming of the aged animal cells was possible, as shown by positive alkaline phosphatase staining; endogenous expression of mRNA of pluripotency-related genes (OCT4, SOX2, REX-1 and NANOG) in all evaluated colonies; immunofluorescence positive staining for OCT4 and NANOG (all groups), SOX2 (groups 5% O2 and 20%-to-5% O2) and TRA-1-60, TRA-1-81 and SSEA-1 (only in 20% O2), showing differences between the groups; the formation of embryoid bodies; and spontaneous cell differentiation in mesoderm, endoderm and ectoderm embryonic germ layers. The eiPSC colonies generated at 20% O2 presented with a more naïve-like morphology, while groups cultured in 5% O2 or 20% to 5% O2 presented a more primed morphology. Significant differences were also observed in the expression of GAPDH, GLUT3, MFN1, HIF1α and HIF2α, genes related to glucose metabolism, mitochondrial fission, and hypoxia, respectively, after reprogramming. Moreover, fibroblasts of the old animal proliferated slowly, as detected by the population doubling time assay, and TERT expression was only increased after reprogramming, suggesting the fibroblasts were senescent before reprogramming and a reversion of this state occurred. Our results show that the derivation of iPSC from an adult equine was not impaired by aging. Additionally, this study is the first to compare high- and low-oxygen cultures of equine iPSC and to demonstrate that oxygen influences the reprogramming process, as indicated by the generation of pluripotent cells with different profiles; under the tested conditions, the lower oxygen tension was responsible for a higher reprogramming efficiency rate, according to the results described in chapter 2, but did not favor the pluripotency of eiPSC.

Descrição

Palavras-chave

Hipóxia, Células Metabolismo, Pluripotência, Reprogramação Celular, Senescência, Hypoxia, Cellular Metabolism, Pluripotency, Cellular reprogramming, Senescence

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