A proteína espermática EPPIN como alvo para contracepção masculina: efeito de um ligante experimental sobre a capacitação e motilidade espermática em murinos.
Carregando...
Arquivos
Data
Autores
Orientador
Silva, Erick José Ramo 
Coorientador
Mariani, Noemia Aparecida Partelli
Pós-graduação
Curso de graduação
Botucatu - IBB - Ciências Biológicas
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
No momento da ejaculação ocorre a interação dos espermatozoides com diversas proteínas do plasma seminal, um evento importante para a formação do coágulo de sêmen e regulação da função espermática. Dentre estas, destacamos a Semenogelina 1 (SEMG1), capaz de inibir temporariamente a motilidade espermática via interação com a proteína EPPIN (do inglês Epididymal protease inhibitor protein), presente nas regiões da cabeça e flagelo dos espermatozoides de humanos e primatas não humanos. A interação entre EPPIN e SEMG1 inibe a motilidade hiperativada e previne a capacitação precoce dos espermatozoides, garantindo a preservação de energia, sua viabilidade e sobrevivência durante a jornada através do ambiente uterino. A capacitação espermática é associada a diversos eventos, como a ativação da via AC/AMPc/PKA (adenilil ciclase/adenosina monofosfato cíclico/proteína quinase A), responsável pela ativação de, dentre outras moléculas sinalizadoras, proteínas quinases que catalisam a transferências de grupos fosfatos para resíduos de tirosina ou serina/treonina, sendo considerada um evento marcador molecular. O composto orgânico triazínico análogo à SEMG1, EP055, demonstrou inibir reversivelmente a motilidade do espermatozoide humano e de primatas não-humanos, exibindo alto potencial como contraceptivo masculino não hormonal. No entanto, seus efeitos sobre eventos relacionados à capacitação e motilidade espermática ainda não foram explorados. Neste estudo, investigamos o efeito in vitro do EP055 sobre o perfil de motilidade e os eventos moleculares marcadores da capacitação espermática, a saber, fosforilação de substratos da PKA e de resíduos de tirosina. Para tal, utilizamos espermatozoides de camundongos C57Bl6 machos adultos coletados em meio HTF e induzimos a capacitação espermática in vitro (em meio HTF suplementado com NaHCO3 20 mM e BSA 0,75% (m/v)) na presença de EP055 em diferentes concentrações ou DMSO (seu solvente) por 30 e 120 min. Analisamos o efeito do composto sobre o perfil de motilidade espermática e viabilidade celular pelo método computadorizado (CASA) na presença do EP055 e sobre o perfil de fosforilação de substratos da PKA e de resíduos de tirosina induzida pela capacitação por ensaios de Western blot. Nossos resultados confirmaram que a capacitação in vitro na presença do EP055 reduziu a motilidade espermática total e hiperativada sem efeito tóxico aparente. Além disso, a capacitação espermática in vitro induziu aumento da fosforilação de substratos da PKA e de resíduos de tirosina de forma dependente do tempo. A presença do EP055 não modulou significativamente os níveis de fosforilação de substratos da PKA após 30 min de capacitação, mas aumentou a abundância desses substratos fosforilados após 120 min, sugerindo um efeito estimulador da atividade da PKA ou inibidor de serina/treonina fosfatases. Por outro lado, o EP055 induziu redução dos níveis de fosforilação de resíduos de tirosina após 120 min de capacitação, sugerindo um desacoplamento da via AC/AMPc/PKA com a fosforilação de tirosinas. Dessa forma, concluímos que o EP055 altera eventos relacionados à capacitação espermática em camundongos, o que indica a existência de mecanismos adicionais de inibição da função espermática, além da modulação da motilidade. Esses dados sugerem que o EP055 pode exercer efeito contraceptivo masculino por múltiplos mecanismos.
Resumo (inglês)
At the time of ejaculation, sperm interacts with various seminal plasma proteins, an important event for semen coagulum formation and the regulation of sperm function. Among these, Semenogelin 1 (SEMG1) stands out, as it is capable of temporarily inhibiting sperm motility through interaction with EPPIN (Epididymal Protease Inhibitor Protein), located in the head and flagellar regions of sperm in humans and non-human primates. The interaction between EPPIN and SEMG1 inhibits hyperactivated motility and prevents premature sperm capacitation, ensuring energy preservation, viability, and survival during the journey through the uterine environment. Sperm capacitation is associated with several events, such as the activation of the AC/cAMP/PKA pathway (adenylyl cyclase/cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A), which activates various signaling molecules, including protein kinases that catalyze phosphate group transfers to tyrosine or serine/threonine residues, a process considered a molecular marker event. The SEMG1 analog organic compound EP055, a triazine derivative, has been shown to reversibly inhibit sperm motility in humans and non-human primates, demonstrating high potential as a non-hormonal male contraceptive. However, its effects on events related to capacitation and sperm motility remain unexplored. In this study, we investigated the in vitro effect of EP055 on the motility profile and molecular markers of sperm capacitation, namely the phosphorylation of PKA substrates and tyrosine residues. To this end, we used sperm from adult male C57Bl6 mice collected in HTF medium and induced in vitro capacitation (in HTF medium supplemented with 20 mM NaHCO₃ and 0.75% (w/v) BSA) in the presence of EP055 at different concentrations or DMSO (its solvent) for 30 and 120 minutes. We analyzed the compound's effect on sperm motility and cell viability profiles using a computer-assisted sperm analysis (CASA) system in the presence of EP055, as well as the phosphorylation profiles of PKA substrates and tyrosine residues induced by capacitation using Western blot assays. Our results confirmed that in vitro capacitation in the presence of EP055 reduced total and hyperactivated sperm motility without apparent toxic effects. Additionally, in vitro capacitation induced a time-dependent increase in the phosphorylation of PKA substrates and tyrosine residues. The presence of EP055 did not significantly modulate PKA substrate phosphorylation levels after 30 minutes of capacitation but increased the abundance of phosphorylated PKA substrates after 120 minutes, suggesting a stimulatory effect on PKA activity or an inhibitory effect on serine/threonine phosphatases. Conversely, EP055 induced a reduction in tyrosine phosphorylation levels after 120 minutes of capacitation, suggesting a decoupling of the AC/cAMP/PKA pathway from tyrosine phosphorylation. In conclusion, EP055 alters events related to sperm capacitation in mice, indicating the existence of additional mechanisms for the inhibition of sperm function beyond motility modulation. These findings suggest that EP055 may exert its male contraceptive effect through multiple mechanisms.
Descrição
Palavras-chave
Contracepção masculina, EPPIN, EP055, Capacitação espermática, Male contraception, EPPIN, EP055, Sperm capacitation
Idioma
Português
Citação
CALDERARO, Giulia. A proteína espermática EPPIN como alvo para contracepção masculina: efeito de um ligante experimental sobre a capacitação e motilidade espermática em murinos. 2024. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Ciências Biologicas)- Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2024.
