Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 141 FUNÇÕES SIGMOIDAIS APLICADAS NA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE METANOGÊNICA ESPECÍFICA - AME Helenice de Oliveira FLORENTINO1 Adriana de Fátima Vilela BISCARO2 José Raimundo de Souza PASSOS1 � RESUMO: O sucesso de um processo anaeróbio em reatores, depende fundamentalmente da manutenção de uma biomassa com elevada atividade microbiológica e resistente a choques. Para que essa biomassa possa ser preservada e monitorada, foram desenvolvidas técnicas para a avaliação da atividade microbiana, como por exemplo, o teste da Atividade Metanogênica Específica (AME), cujo propósito consiste em avaliar a capacidade das bactérias metanogênicas em converter substrato orgânico em metano e gás carbônico. O objetivo deste trabalho, para auxiliar o teste da AME, é determinar a taxa máxima de variação de produção de metano através da estimativa do ponto de inflexão de modelos de regressão não-linear ajustados aos dados observados, pelo método dos mínimos quadrados. � PALAVRAS-CHAVE: Digestão anaeróbia; modelagem matemática; potencial da biomassa. 1 Introdução A digestão anaeróbia é um processo biológico natural que ocorre na ausência de oxigênio molecular. Neste processo, as populações bacterianas interagem para promover a fermentação estável e auto-regulada da matéria orgânica, em que resulta o biogás - constituído, na maior parte, de metano e dióxido de carbono. As relações entre os diversos grupos de microorganismos envolvidos na digestão anaeróbia são muito complexas e, portanto, avaliações mais profundas deste processo em geral são caras e sofisticadas e muitas vezes consomem um tempo de ensaio muito grande. A busca de um parâmetro que pudesse fornecer informações a respeito da biomassa ativa metanogênica de lodos anaeróbios, levou a proposição de um teste para avaliar a Atividade Metanogênica Específica - AME (Bertolino et al. (2008), Aquino et al. (2007), Penna (1994) e Soto et al. (1993), ). A avaliação da AME é feita por meio de um ensaio em laboratório e consiste em avaliar a capacidade das bactérias metanogênicas em converter substrato orgânico em biogás, medindo a taxa máxima de conversão de substratos específicos em metano por unidade de biomassa. 1 Universidade Estadual Paulista – UNESP, Instituto de Biociências, Departamento de Bioestatística, Caixa Postal 510, CEP: 18618-000, Botucatu, SP, Brasil. E-mail: helenice@ibb.unesp.br / jrpassos@ibb.unesp.br 2 Universidade Estadual Paulista – UNESP, Faculdade de Ciências Agráris, Programa de Pós-Graduação em Energia na Agricultura, Caixa Postal 237, CEP: 18610-307, Botucatu, SP, Brasil. E-mail: adrianafvb@hotmail.com Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 142 O teste da AME, além de ser utilizado para quantificar a atividade metanogênica específica de lodos anaeróbios, também tem sido utilizado em diversas aplicações: para obtenção de informações sobre a digestão anaeróbia (Alves ET al. (2005), Aquino ET al. (2003), Mosey(1989) e De Zeeuw (1984)), para avaliação de inóculos para partida de reatores (Etchebehere et al. (2002)), para estimar porcentagem de biomassa acetoclástica em lodos anaeróbios (Valcke&Verstraete (1983)), estimar os diferentes grupos fisiológicos presentes nos lodos (Dolfing&Bloemen (1985)), avaliação de toxidade por produtos químicos na digestão anaeróbia (Cohen (1992), Sanz et al. (1997) e Colleran et al. (1992)), investigar a distribuição da atividade bacteriológica em reatores anaeróbios (Etchebehere et al. (2002) e Soto et al. (1992)), entre outras. Neste trabalho, propomos a utilização de modelos de regressão não-linear para determinação da AME, através da obtenção do ponto de inflexão das curvas obtidas. 2 Materiais e métodos O teste da AME A avaliação da atividade microbiana de lodos anaeróbios é importante para caracterizar o potencial da biomassa na conversão de substratos solúveis em metano e gás carbônico. Uma maneira de caracterizar este potencial é utilizar o teste da Atividade Metanogênica Específica – AME. Este teste quantifica, por meio de um ensaio em escala de bancada de laboratório, a taxa máxima de conversão de substratos específicos em metano por unidade de biomassa presente em um lodo anaeróbio. A literatura apresenta diferentes formas de se proceder ao desenvolvimento do teste da AME. No entanto, a precisão de várias metodologias existentes é considerada duvidosa ou demasiadamente sofisticada e cara para a reprodução em laboratório (Aquino (2008), Chernicharo (1997), Penna (1994)). Para amenizar tais problemas, foi estabelecido no âmbito da PROSAB (Programa de pesquisa em saneamento básico) um protocolo a ser seguido para realização deste teste. Segundo Chernicharo (1997), para o teste da AME considera-se conhecida a quantidade de biomassa, expressa em gramas de Sólidos Voláteis Totais (gSVT) e de substrato, expressa em gramas de Demanda Química de Oxigênio (gDQO). Definidos os parâmetros preparatórios e seguido o protocolo do PROSAB, pode-se avaliar a produção de metano ao longo do período do teste. O monitoramento contínuo da produção de metano nos frascos utilizados no teste possibilita a obtenção de dados que correlacionam tempo (t), em horas, e produção cumulativa de metano (PCM), em 4CHmL - como representado graficamente na Figura1. A avaliação da AME, em 4CHmL /gSVTh, é feita determinando-se a razão entre a taxa máxima de produção de metano, em 4CHmL /h, e a quantidade inicial de biomassa, em gSVT, presente no frasco de reação. A obtenção da taxa máxima de produção de metano, em 4CHmL /h, pode ser feita de maneira empírica - como descrito por Penna (1994) e Chernicharo (1997). Este método tem como base a escolha, de maneira subjetiva, de pontos da porção central da referida curva típica; ajustando-se posteriormente um modelo de regressão linear a esses pontos, cuja inclinação é a estimativa da taxa máxima de produção de metano. Esta metodologia Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 143 permite que o valor da taxa máxima varie segundo a escolha que é feita do conjunto de pontos – sendo pois um método empírico. Figura 1 - Curva típica de produção cumulativa de metano (mL) na avaliação Atividade Metanogênica Específica de lodos anaeróbios (Penna (1994). Para determinação da AME em sua unidade usual, em gDQOCH4/gSVTd, uiliza-se a conversão de mL CH4 em gDQOCH4/d através da seguintes equações: K(T) DQO V 4 4 CH CH = e T)R(273 PK K(t) + = (1) em que, 4CHV é o volume de metano produzido, em L; T é a tempartura operacional do reator, em oC; K(T) é o fator de correção para a temperatura operacional do reator, em gDQO/L; P é a pressão atmosférica, em atm; K é a DQO correspondente a um mol de CH4 (64 gDQO/mol); R é a constante dos gases (0,08206 atmL/moloK). Penna (1994) desenvolveu um teste da AME de um lodo anaeróbio com 25,16 gSVT/L, usando um frasco de 0,650 L, a concentração de sólidos voláteis no substrato foi de 2,47 gSTV/L e a concentração de DQO testada foi 2,64 gDQO/L (Tabela 1). Funções sigmoidais As funções sigmoidais, em forma de “S”, podem ser usadas para descrever a produção cumulativa de metano na avaliação da Atividade Metanogênica Específica de lodos anaeróbios. 0 100 200 300 400 500 600 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Tempo (dias) Pr od uç ão c um ul at iv a de C H 4 (m L ) Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 144 Tabela 1 - Produção cumulativa de metano (mL) na avaliação Atividade Metanogênica Específica de lodos anaeróbios (Penna (1994) Dias Metano acumulado (mL) Dias Metano acumulado (mL) Dias Metano acumulado (mL) 0,000 0,0 0,963 81,5 2,480 303,5 0,021 0,0 1,005 86,5 2,911 347,5 0,042 0,0 1,078 97,5 3,036 365,5 0,083 1,5 1,120 102,5 3,161 385,5 0,125 3,5 1,169 109,5 3,349 401,5 0,170 6,0 1,211 116,5 3,453 412,0 0,208 8,0 1,253 121,5 3,880 434,5 0,250 10,5 1,295 126,5 3,932 440,5 0,295 14,5 1,395 140,5 4,015 447,5 0,337 17,5 1,475 152,5 4,098 454,4 0,382 21,0 1,871 201,5 4,202 460,5 0,445 28,0 1,954 214,0 4,306 468,5 0,522 37,0 2,037 227,5 4,667 481,5 0,876 73,0 2,203 257,0 0,918 77,0 2,286 270,0 Fonte: Penna (1994) Como pode ser visto na Figura 2, a função sigmóide é crescente em todo intervalo de variação do tempo. Este tipo de função não possui pontos extremos – máximos e mínimos relativos, mas possui ponto de inflexão – ponto no qual ocorre a taxa máxima de variação da função. Até o ponto de inflexão, o gráfico representativo da função sigmoidal apresenta concavidade para cima – derivada segunda positiva; no ponto de inflexão a função apresenta derivada segunda nula; e daí em diante, apresenta concavidade para baixo – derivada segunda negativa, crescendo assintoticamente, segundo a assíntota horizontal, ou seja ( ) α=tf . Figura 2 - Representação de uma função sigmoidal ( )tf , de sua derivada ( ) dt tdf e do ponto de inflexão ( )( )ii tftP , - ponto no qual ocorre a maior taxa de variação da função sigmoidal. ( ) ( ) dt tdf tf ou t ( ) :sigmóide tf ( ) dt :derivada tdf inflexão de ponto it ( ) itf ( ) máxima dt tdf Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 145 As funções sigmoidais mais comumente utilizadas são: Logística, Gompertz, Richards, Morgan-Mercer-Flodin (MMF) e a função tipo Weibull. Suas expressões matemáticas e as características de cada uma podem ser vistas na Tabela 2. Tabela 2 - Algumas funções sigmoidais de crescimento e suas características Função Expressão matemática ( )tf , 0≥t Restrições para os parâmetros ( ) ( )tf dt d tf =′ Coordenadas do ponto de inflexão ( )( )tft, Logística �t�e � −+1 α>0, β>1 e γ>0 21 )�e( ���e �t �t − − + t= γ 1 lnβ, y= 2 α Gompertz t-�e��e− α>0, β>1 e γ>0 te� e���e t- γγ −− t= γ 1 lnβ, y=αe-1 Richards α>0, β>α, γ>0 e δ >0 t= γ 1 ln(β/δ), y= δδ α /1)1( + MMF � � t� �t�� + + 0<β<α, γ>0 e δ>1 � � �-�- t�L �t��N L L-N�-��t += += 2 11 1/� 1� 1)�(� t � � � � � � + −= , 2� 1)(1)(� y ++−= δβα Weibull ��t�)e(�� −−− 0<β<α, γ>0 e δ>1 1−−− ��t t�)e��(� � 1/� �� 1� t �� � � �� � � −= , � � � � � � −− −−= � 1� �)e(��y Boltzman � e � � �t + + − 1 α>0, β>0, γ>0, δ<0 e α>(-δ/(1+e-β/γ) 2 1 � � � � � � � � + − − − � �t � �t e� e� β=t , αδ += 2 y Modelo de regressão não-linear Um modelo de regressão não linear é composto de um componente determinístico, ou matemático, simbolizado pela ( )�;tf , que neste estudo será representados pelas funções sigmoidais descritas na Tabela 2, e por um componente aleatório, simbolizado por ie , equação (2). ( ) iii etfY += �; (2) /��t )�e( � 11 −+ �t /� �t/��( �eM )�(M e���M − −− += 1 21 11 Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 146 em que, i refere-se a i-ésima observação, Yi são os valores da variável aleatória resposta, ou seja da produção de cumulativa de metano (mL); � é o vetor de parâmetros, it são os valores conhecidos ou pré-fixados do tempo e não correlacionados entre si e os ie (componente aleatório) são variáveis aleatórias independentes e identicamente distribuídas de modo que ( )2,0~ σNei , com 2σ constante. Estudos mais detalhados deste assunto podem ser encontrados em Ratkowsky (1983), Ratkowsky (1989) e Seber&Wild (1989) entre outros. A proposta deste trabalho, para auxiliar o teste da AME, é determinar a taxa máxima de variação de produção de metano através da estimativa do ponto de inflexão de modelos de regressão não-linear ajustados aos dados observados, pelo método dos mínimos quadrados. Para o ajuste desses modelos foi utilizada a rotina PROC NLP do programa SAS. 3 Resultados e discussão A figura 3 apresenta os ajustes das citadas funções sigmoidais aos dados da tabela 1. Figura 3 - Ajuste dos modelos estudados aos dados observados. Na Tabela 3 são apresentadas, as estimativas e erros padrões aproximados para os parâmetros e soma dos quadrados dos resíduos para os modelos de regressão não-linear, ordenados segundo a soma de quadrados dos resíduos. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Tempo t (dias) Pr od uç ão c um ul at iv a d e m et an o (m L ) Logística Gompertz Richards MMF Weibull Boltzman CH4 Observado Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 147 Tabela 3 - Parâmetros e suas estimativas e erro padrão aproximado para os parâmetros e soma dos quadrados dos resíduos para os modelos de regressão não-linear, ordenados segundo a soma de quadrados dos resíduos Modelo Estimativa dos parâmetros Erro padrão aproximado Soma de quadrados dos resíduos Boltzman =α̂ 515,70 =β̂ 1,95 =γ̂ 0,99 =δ̂ - 593,50 3,98 0,01 0,02 8,24 399,3 Weibull =α̂ 532,40 =β̂ 2,79 =γ̂ 0,17 =δ̂ 1,72 7,30 1,40 0,00 0,03 577,2 Richards =α̂ 573,30 =β̂ -0,78 =γ̂ 0,60 =δ̂ -0,29 11,41 0,07 0,03 0,05 745,7 MMF =α̂ 685,00 =β̂ 4,29 =γ̂ 7,44 =δ̂ 1,90 20,36 1,80 0,20 0,05 960,10 Gompertz =α̂ 529,20 =β̂ 4,15 =γ̂ 0,80 5,91 0,08 0,02 1343,4 Logístico =α̂ 472,90 =β̂ 21,52 =γ̂ 1,47 7,32 1,83 0,06 7288,6 Tomou-se a soma dos quadrados dos resíduos como critério de decisão na escolha do melhor ajuste. Portanto, como pode ser observado na Tabela 3, a sigmoide que melhor se ajustou aos dados foi a de Boltzman, expressa por: ( ) � e � tf � �t + + = − 1 ;� ; [ ]δγβα=′� em que 50,593ˆ −=δ 95,1ˆ =β ; 99,0ˆ =γ e 70,515ˆ =α . Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010 148 O ponto de inflexão desta curva é (1,95 ; 218,95) ou seja : ti=1,95 d e mLy 95,218= . Portanto a máxima taxa de variação da produção de CH4, é mL dt dy 87,149= . Com isto pode-se estimar a AME em 4CHmL /gSVT.d: /gSVT.dmL 93,35AME 4CH= . Usando as equações em (1) pode-se fazer a conversão da unidade para gDQOCH4/gSVT.d: 0,240 gDQOCH4/gSVT.d . Uma das dificuldades amplamente discutida na literatura sobre a metodologia tradicional do teste de AME, reside na escolha de quais e quantos pontos que serão utilizados no ajuste do modelo de regressão linear, para o cálculo da taxa máxima de variação de produção de metano. Deste modo, a metodologia proposta por este trabalho apresenta uma técnica objetiva, que não leva em conta critérios puramente subjetivos. Agradecimentos Os autores agradecem ao apoio financeiro dos órgãos: FUNDUNESP (Fundação para o Desenvolvimento da UNESP), CAPES, CNPq, FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, 09/14901-4) e PROPe (Pró-Reitoria de Pesquisa da UNESP ). FLORENTINO, H. O.; BISCARO, A. F. V.; PASSOS, J. R. S. Sigmoidal functions applied in the determination of specific methanogenic activity - SMA. Rev. Bras. Biom., São Paulo, v.28, n.1, p.141-150, 2010. � ABSTRACT The success of any anaerobic process basically depends on maintaining, in the reactors, a biomass with elevated microbiological activity which is resistant to shocks. For this biomass to be maintained and monitored, techniques need to be developed to evaluate microbial activity. Several methods have already been developed starting with Specific Methanogenic Activity (SMA). Tests were proposed to evaluate the capacity of methanogenic bacteria to convert organic substrate into methane and carbon dioxide. However the importance of this type of test is its ability to evaluate and classify the potential of the biomass in converting soluble substrates into biogas. The objective of this study is to demonstrate the use of mathematical tools that can help SMA evaluation, using sigmoidal models. It is easy to determine inflection point in sigmoidal curves, and � from this estimate the temperature where maximum variation rate of methane production; this facilitates SME evaluation and helps resolve imprecision problems found in traditional methods. � KEYWORDS: Anaerobic digestion; mathematical model; potential of the biomass. Referências ALVES, L. C.; CAMMAROTA, M. C.; FRANÇA, F. P. Inibição de lodo biológico anaeróbio por constituintes de efluentes de laboratório de controle de poluição. Eng. Sanit. Ambient., Rio de Janeiro, v.10, n.3, p.236-242, 2005. Rev. Bras. 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