Isabela Belei Delmaschio Produção de fitases por fermentação em estado sólido e imobilização das enzimas por spray drying São José do Rio Preto 2014 1 Isabela Belei Delmaschio Produção de fitases por fermentação em estado sólido e imobilização das enzimas por spray drying Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência da Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Área de Concentração – Microbiologia Industrial e Aplicada, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. João Cláudio Thoméo São José do Rio Preto 2014 2 Delmaschio, Isabela Belei. Produção de fitases por fermentação em estado sólido e imobilização das enzimas por spray drying / Isabela Belei Delmaschio. -- São José do Rio Preto, 2014 113 f. : il., tabs. Orientador: João Cláudio Thoméo Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Tecnologia de alimentos. 2. Enzimas de fungos – Aplicações industriais. 3. Enzimas de fungos – Armazenamento. 4. Fungos termofílicos. 5. Fitases. 6. Xilanases. 7. Secagem em spray. I. Thoméo, João Cláudio. II. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU – 663.15 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Câmpus de São José do Rio Preto 3 Isabela Belei Delmaschio Produção de fitases por fermentação em estado sólido e imobilização das enzimas por spray drying Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Área de Concentração – Microbiologia Industrial e Aplicada, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof. Dr. João Cláudio Thoméo UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez UNESP – São José do Rio Preto Profª. Drª. Izabela Dutra Alvin ITAL – Campinas São José do Rio Preto 03 de dezembro de 2014 4 “Põe no Senhor tuas delícias e ele te dará o que teu coração pede. Entrega ao Senhor o teu futuro, espera nele, que ele vai agir” Salmos 3 5 AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida e pelas infinitas graças derramadas no meu caminho. Ao meu orientador João Cláudio Thoméo pela confiança, paciência, sabedoria e compreensão durante todos os momentos. Aos meus pais Edmar e Marlene por todo apoio, incentivo, amor, dedicação e orgulho que têm por mim. Ao meu irmão Gustavo por ser meu companheiro e amigo. Ao meu namorado José Neto, por simplesmente existir na minha vida e pela cadeira emprestada para uma confortável elaboração dessa tese. À minha sobrinha Lara, que chegou num dia e momento muito esperado por mim, me ajudando e acalmando. Ao meu afilhado Nicolas, que me encanta e alegra. À minha avó amada Donira, por ser minha luz. A toda minha família Belei (Tios Marli e Adilson, Maureli e Célia, Márcio, Célia e Dito; primos: Nicolly, Polyani, Carlinho, Guilherme, Davi, Arthur, Murilo, Muriel, Vinícius, Amanda e Laurinha) e Delmaschio (Avós Maria e João, Tios Edson e Preta; primos: Leonardo e Uliana, Guilherme, Carol, Ana Júlia e Lorenzo), sem vocês eu não conseguiria! Obrigada por todos os momentos de amor, compreensão, risadas, lembranças e incentivos. Eu amo vocês infinitamente! À minha querida aluna de iniciação científica Renata, obrigada pela disposição, sem você esse trabalho se tornaria muito difícil. Aos meus companheiros de trabalho “Filhos do João Cláudio”: Priscila, Fernanda, Viviane, Eduardo, Caroli, Giuliana, Teresa, Juliana, Camila, Fabrício e Lina. Obrigada pelos momentos de auxílio, ajuda, solicitude e carinho! E também por todas as risadas, festas e comilanças. Aos meus companheiros de trabalho LBMA: Isabel, Gisele, Josiani, Rafaela, Fernando, Cissa e especialmente ao Diego e Pedro. Muito obrigada pelos auxílios, conselhos, companhia e partilhas. Às melhores amigas que existe, Lívia, Loyane, Tássia, Didi, Larissa e Gabriela pela convivência deliciosa, por me apontarem a melhor direção e por todos os momentos vividos e compartilhados. À FAPESP, pela oportunidade e suporte financeiro. A todos os professores do grupo da Pós-Graduação da Microbiologia, pela atenção e sabedoria concedidas. A todos que de alguma forma contribuíram para a elaboração desse trabalho. MUITO OBRIGADA! 6 RESUMO Este trabalho visou à produção de fitases por fungos termofílicos em cultivo em estado sólido (CES), utilizando resíduos agroindustriais como substratos, e secá-las, juntamente com xilanases, por spray drying. Após a secagem, os pós foram armazenados e a redução da atividade enzimática com o tempo de armazenamento foi avaliada. Para a produção das fitases foram testados 13 fungos pertencentes do Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada do IBILCE/UNESP, sendo o termotolerante Lichtheimia ramosa escolhido para seguir com os experimentos. A xilanase foi metabolizada pelo fungo Myceliophtora thermophila I-1D3b. O fungo L. ramosa foi cultivado em bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo, enquanto que M. thermophila foi cultivado em bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, ambos a 45 oC. Os ensaios de secagem foram divididos entre discriminação do adjuvante que proporcionasse maior proteção às enzimas, otimização das condições de secagem e armazenamento dos pós secos. Para os ensaios de discriminação de adjuvante, foram escolhidas como variáveis o adjuvante e a temperatura de saída do ar do spray dryer, Os adjuvantes empregados foram farelo de trigo, farelo de milho e farelo de soja, sendo que este último forneceu os melhores resultados. A temperatura não foi um fator significativo na análise de variância. Para os ensaios de otimização das condições de secagem foi empregada a técnica de superfície de resposta, sendo usadas variáveis preditoras a temperatura de saída do ar, a vazão de alimentação de suspensão e a concentração de sólidos. Os resultados indicaram a vazão e concentração de sólidos como variáveis significativas. A suspensão na condição ótima de secagem continha 7,5% e a vazão foi de 3 mL/min, sendo a temperatura escolhida de 83 oC. O ensaio realizado nestas condições proporcionou retenção 83% de atividade de fitase e de 85% xilanase. Os pós produzidos na condição ótima de secagem foram armazenados à temperatura ambiente e sob refrigeração, juntamente com amostras de extrato enzimático bruto misturadas a farelo de soja e liofilizadas e com extrato enzimático bruto líquido. Para as amostras em pó houve boa retenção da atividade enzimática, sendo as amostras obtidas por spray dryer mais ativas. As enzimas do extrato líquido perderam rapidamente a atividade. Palavras-chave: Spray drying. CES. Fitase. Xilanase. Adjuvantes. Armazenamento. 7 ABSTRACT This work aimed to produce phytases by thermophilic molds in solid state cultivation, using solid agro-industrial by-products as substrates, and dry the enzymes, along with xylanases, by spray-drying. Following the drying, the powders were storage and the reduction of the enzyme activities was evaluated. For the phytase production, 13 fungi were tested, and Lichthemia ramose was chosen. Xylanase was metabolized by Myceliophtora thermophila I-1D3b. All tested microorganisms belonged to the Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada. L. ramose was cultivated in sugar cane bagasse, Orange pulp and peel and wheat bran, while M. thermophila was cultivated in sugar cane bagasse and wheat bran, both at 45 o C. Drying experiments were done to discriminate the adjuvant able to provide the best protection to the enzymes. The tested variables were the adjuvants (brans of wheat, corn and soybean) and the air temperature at the spray dryer outlet. The temperature was not a statistically significant factor and soybean bran provided the best protection. Experiments to optimize the drying conditions for soybean bran were carried out following a response surface approach, having the outlet air temperature, the suspension flow rate and the total solid concentration as the controlled variables. The results showed that the flow rate and the solid concentration were the significant variables. The estimated optimum condition had 7,5% of solids and the flow rate was 3 mL/min. The experiment carried at this condition, at 83 o C showed 83% of retention for phytase and 85% xylanase. The powders obtained at the optimum condition were storage at room temperature and under refrigeration, along with freeze-dried samples of raw enzymatic extract mixed with soybean bran and with liquid samples of raw enzymatic extract. The powder samples retained high enzymatic activities, being the spray-dried samples more active than the freeze-dried ones. The liquid samples retained little activities after 15 days of storage. Keywords: Spray drying. SSF. Phytase. Xylanase. Adjuvants. Storage. 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1.1. Estrutura do mio-inositol, pertence à família dos inositóis e é o estereoisômero mais abundante na natureza. 21 Figura 1.2. Ácido fítico na conformação de cadeira (energeticamente mais estável) mostrando um grupo fosfato em posição axial (C2) e cinco grupos fosfatos equatoriais. 21 Figura 1.3. Exemplos de possíveis ligações entre o ácido fítico e alguns nutrientes em diferentes pH. 22 Figura 1.4. Representação do fitato complexado com proteína, cálcio e aminoácido. 23 Figura 1.5. pH do alimento (ração farelada) nos diferentes segmentos do trato digestório do frango de corte alimentado, ad libitum, durante 6 semanas. 24 Figura 1.6. Esquema do ácido fítico complexado com vários minerais bivalentes. 25 Figura 1.7. Hidrólise do fitato pela fitase em inositol, fosfato, e outros elementos divalentes. O fitato é mio-inositol-1,2,3,4,5,6-di-hexaquis fosfato que contem aproximadamente de 14 a 28% de fósforo e 12-20% de cálcio. 32 Figura 1.8. Reação de hidrólise do fitato pela fitase. 35 Figura 1.9. Representação esquemática da estrutura da xilana vegetal e enzimas atuantes. 38 Figura 1.10. Representação esquemática de alguns processos de micro-escala que ocorre durante a CES. 42 Figura 1.11. Diagrama esquemático da secagem por atomização em mini spray dryer. 46 Figura 3.1. Embalagem de polipropileno para CES antes do cultivo (A) e após o período de incubação de 96 h a 45ºC. 52 Figura 3.2. Equipamento spray dryer MSD 0,5. 60 Figura 3.3. Equipamento liofilizador modelo ThermoScientific RVT4104. 61 Figura 4.1. Atividade das fitases por CES após 96 horas, utilizando proporção 1:2:2 para bagaço de cana de açúcar, farelo de trigo e bagaço de laranja, respectivamente. 66 Figura 4.2. Atividade das fitases produzidas pelo fungo Lichtheimia ramosa, por CES pelo período de 96 horas e variação da proporção dos substratos bagaço de cana de açúcar, farelo de trigo e bagaço de laranja, respectivamente. 67 Figura 4.3. Atividade das fitases produzidas pelo fungo Lichtheimia ramosa, por CES, na proporção de substrato de 1:2:2 para bagaço de cana de açúcar, farelo de trigo e bagaço de laranja, respectivamente, com variação do período de cultivo. 68 Figura 4.4. Atividade das fitases produzidas pelo fungo Lichtheimia ramosa, por CES, por 96 horas, na proporção de substrato de 1:2:2 para bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo (FT)/farelo de soja (FS); em diferentes pH da solução nutriente de cultivo. 68 9 Figura 4.5. Atividade de fitases para os fatores analisados nos ensaios de otimização do CES. 72 Figura 4.6. Atividade relativa (AR) das atividades de fitases dos extratos brutos armazenados por um mês sob refrigeração, congelamento e congelamento intermitente. 73 Figura 4.7. Atividade de fitases dos extratos brutos armazenados com glicerol e PMSF, por um mês sob congelamento. 75 Figura 4.8. Dependência da atividade enzimática da fitase com o pH (A) e temperatura (B) de reação. 76 Figura 4.9. Dependência da atividade enzimática da xilanase com o pH (A) e temperatura (B) de reação. 78 Figura 4.10. Média das atividades residuais de fitases para os fatores adjuvantes (Adj) e temperatura de saída do gás (Tsaída) nos ensaios de discriminação dos adjuvantes. 84 Figura 4.11. Média das atividades residuais de xilanases para os fatores adjuvantes (Adj) e temperatura de saída do gás (Tsaída) nos ensaios de discriminação dos adjuvantes. 85 Figura 4.12. Agregação de proteínas em superfície sólida em alta temperatura. 89 Figura 4.13. Superfície de resposta para atividade enzimática de xilanase para o pós obtidos em spray dryer nos ensaios de otimização das condições de secagem, empregando o adjuvante farelo de soja. 92 Figura 4.14. Retenção da atividade xilanase (A) e fitase (B) dos pós obtidos por spray drying e liofilização na condição ótima, armazenados sob refrigeração (4º) e no ambiente (25º). 94 10 LISTA DE TABELAS Tabela 1.1. Teor de fósforo dos principais alimentos utilizados nas rações de aves. 18 Tabela 1.2. Teor de polissacarídeo não amiláceos dos principais alimentos utilizados nas rações de aves. 20 Tabela 1.3. Duração média do tempo de trânsito da ingesta nos diferentes compartimentos do trato gastrointestinal do frango. 33 Tabela 1.4. Fitases comerciais encontradas no mercado mundial. 36 Tabela 1.5a. Exemplos na literatura de produção de fitases fúngica por CES. 40 Tabela 1.5b. Exemplos na literatura de produção de xilanases fúngica por CES. 41 Tabela 1.6. Composição química do farelo de trigo (FT), farelo de soja (FS) e farelo de milho (FM), expressos na matéria natural. 48 Tabela 3.1. Planejamento estatístico fatorial multiníveis para a otimização do cultivo em estado sólido que proporcione melhor produção de fitases. 53 Tabela 3.2. Planejamento estatístico fatorial multiníveis para a discriminação do adjuvante que proporcione maior retenção da atividade enzimática. 63 Tabela 3.3. Planejamento estatístico fatorial multiníveis para os ensaios de otimização das condições de secagem. 63 Tabela 4.1. Planejamento estatístico para otimização da produção de fitases. 69 Tabela 4.2. Análise de variância para a atividade enzimática de fitases. Apenas os fatores principais e os termos de interação de primeira ordem foram incluídos na análise. 70 Tabela 4.3. Valores codificados (Psub e Tcult) e respostas da atividade enzimática da fitase nos ensaios de otimização das condições de cultivo em estado sólido. 71 Tabela 4.4. Análise de variância para resposta de atividade de fitases nos ensaios de otimização de CES. 71 Tabela 4.5. Quantidade de proteína, fitases e proteases no EEB e atividade de fitase e protease. 74 Tabela 4.6. Exemplos na literatura de pH e temperatura ótimos de fitases. 76 Tabela 4.7. Exemplos na literatura de pH e temperatura ótimos de xilanases. 78 Tabela 4.8. Atividades relativas das suspensões de secagem em relação ao EEB. 79 Tabela 4.9. Quantificação enzimática de fitases e xilanases dos farelos de soja, trigo e milho, e do extrato enzimático bruto. 80 Tabela 4.10. Avaliação do melhor tempo de extração dos pós obtidos em secagem por spray dryer. 81 Tabela 4.11. Parâmetros operacionais e resultados obtidos nos ensaios discriminativos de secagem em spray dryer de extrato enzimático bruto acrescido de adjuvante. 83 11 Tabela 4.12. Análise de variância para resposta da atividade de fitase, nos ensaios de discriminação dos adjuvantes. 84 Tabela 4.13. Análise de variância para resposta da atividade de xilanase, nos ensaios de discriminação dos adjuvantes. 85 Tabela 4.14. Valores codificados e respostas da atividade residual da fitase e xilanase e umidade final dos pós nos ensaios de otimização das condições de secagem. 87 Tabela 4.15. ANOVA para atividade enzimática de fitase para os ensaios de otimização das condições de secagem empregando-se o adjuvante farelo de soja. 90 Tabela 4.16. ANOVA para atividade enzimática de xilanase para os ensaios de otimização das condições de secagem empregando-se o adjuvante farelo de soja. 91 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS PNA polissacarídeos não amiláceos P fósforo PB proteína bruta HFA histidina fosfatase ácida FBH fitase β-hélice FAP= fosfatase ácida “purple” PTP= proteína tirosina fosfatase CES= cultivo em estado sólido BDA batata dextrose ágar Psub proporção de substrato Tcult tempo de cultivo T temperatura de cultivo Umid umidade Adj adjuvante Tsaída temperatura de saída Qalim vazão de alimentação ST sólidos totais EEB extrato enzimático bruto BC bagaço de cana de açúcar FT farelo de trigo BL bagaço de laranja FS farelo de soja FM farelo de milho U/gss unidade/grama de sólido seco PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonila AR atividade relativa A.Re atividade residual Mist mistura líquida dos adjuvantes com extrato enzimático bruto 13 SUMÁRIO INTRODUÇÃO 14 1 REVISÃO BILIOGRÁFICA 17 1.1 Alimentação Animal 17 1.2 Fitato 21 1.3 Aditivos Alimentares 25 1.3.1 Enzimas exógenas utilizadas na alimentação dos animal 28 - Carboidrases 30 - Proteases 31 - Lipases 31 1.3.1.1 Fitases 32 1.3.1.2 Xilanases 36 1.4 Cultivo em Estado Sólido na Produção de Enzimas 40 1.5 Aporte Tecnológico às Enzimas 44 2 OBJETIVOS 49 3 MATERIAIS E MÉTODOS 50 3.1 Materiais 50 3.2 Produção de Fitases 51 3.2.1 Seleção de fungos 51 3.2.2 Cultivo em estado sólido (CES) 51 3.2.2.1 Ensaios de análises 51 3.2.2.2 Otimização de cultivo 53 3.2.2.3 Obtenção de EEB para processo de secagem 53 3.2.3 Determinação de atividade enzimática 54 3.2.4 Caracterização físico-química das enzimas 55 3.2.5 Ensaios de armazenamento do EEB 55 3.2.5.1 Determinação de atividade enzimática de proteases 56 3.2.5.2 Quantificação do teor de proteína no EEB 56 3.3 Produção de Xilanases 57 3.3.1 Seleção de fungos 57 3.3.2 Cultivo em estado sólido (CES) 57 3.3.3 Determinação das atividades enzimáticas 58 3.4 Ensaios de Secagem 59 3.4.1 Determinação do teor de sólidos 59 3.4.2 Secagem das enzimas por spray drying 59 3.4.3 Secagem das enzimas por liofilização 61 3.4.4 Extração enzimática dos pós 61 14 3.5 Planejamento Estatístico 62 3.5.1 Discriminação dos adjuvantes 62 3.5.2 Ensaios de otimização das condições de secagem 63 3.6 Ensaios de Armazenamento 63 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 65 4.1 Seleção dos Microrganismos Produtores de Fitases 65 4.2 Otimização da Produção de Fitases 65 4.3 Ensaios de Armazenamento do Extrato Enzimático Aquoso Bruto 72 4.4 Caracterização Físico-química das Enzimas 76 4.4.1 Fitases 76 4.4.2 Xilanases 77 4.5 Ensaios de Secagem 79 4.5.1 Ensaios preliminares 79 4.5.2 Ensaios de discriminação dos adjuvantes 82 4.5.3 Ensaios de otimização das condições de secagem 86 4.6 Ensaios de Armazenamento dos Pós 93 5 CONCLUSÕES 97 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 99 15 INTRODUÇÃO A necessidade de melhoria na produtividade e a crescente preocupação ambiental tem incentivado o uso de enzimas na alimentação de animais voltados para produção em larga escala. Segundo pesquisas de empresas como Companies and Markets em 2012, e The Freedonia Group (2014), o mercado mundial de enzimas movimentará em torno de US$3,74 bilhões até 2015, e crescerá 6,4% ao ano até 2017, resultado da soma de diversos setores econômicos, como de detergentes, alimentos, farmacêuticos, biocombustíveis, rações para animais e têxtil, dentre outros (PANDEY et al. 2011). As hidrolases, enzimas que catalisam a quebra dos substratos na presença de moléculas de água, representam 75% das enzimas industriais, sendo uma parcela de 20% representada pelas celulases (SHINGHANIA et al. 2010). Espera-se que até 2019, o mercado de carboidrases, entre elas as xilanases, mobilize US$3,8 milhões (COMPANIES AND MARKETS, 2014). Deste total, as enzimas usadas como aditivos de ração animal são responsáveis por quase 16% do total (THAKORE, 2008). Haifeng et al. (2007), afirmaram que a venda anual de fitases, especialmente as produzidas por Aspergillus niger e Escherichia coli, foi estimada em US$ 500 milhões, compreendendo cerca de um terço do mercado total de enzimas alimentares. Alimentos de origem vegetal contem polissacarídeos não amiláceos (PNA) que além de serem açúcares simples de baixa digestibilidade, causam transtornos no trânsito intestinal dos animais monogástricos. Os PNA além de aumentarem a viscosidade da ingesta, dificultam a ação de enzimas endógenas, pois atuam como barreira física, reduzindo o aproveitamento dos nutrientes dos grãos (CONTE et al. 2003). Outro fator antinutricional é o ácido fítico, principal forma de armazenamento de fósforo nos alimentos vegetais. Este composto tem capacidade de complexar com outros nutrientes, 16 causando perdas endógenas e prejudicando o desempenho zootécnico dos animais (LEI e PORRES, 2003; COSTA et al. 2007). As enzimas são adicionadas na alimentação animal com a finalidade de melhorar o seu desempenho metabólico. As aves não sintetizam ou produzem em quantidades insuficientes certas enzimas endógenas, utilizadas para a digestão dos vários componentes químicos encontrados nos alimentos de origem vegetal ou para atuarem em alguns processos antinutricionais (COSTA et al. 2007). No entanto, as enzimas apresentam especificidade quanto à sua ação catalítica. Sendo assim, pesquisas mostram que a utilização de mais de uma enzima, como fitases e xilanases surge como alternativa para que animais monogástricos possam melhorar seu desempenho e digestibilidade alimentar (TEIXEIRA, 2013). Uma alternativa para a redução dos custos da produção das enzimas está na possibilidade de usar resíduos agroindustriais por cultivo em estado sólido. O Brasil devido as suas características climáticas dispõe de grande variedade de resíduos agroindustriais e agrícolas utilizados nos cultivos microbianos para a produção de enzimas (PALMA, 2003). Apesar dos avanços alcançados nos processos de obtenção de enzimas, a consolidação de sua aplicação em processos tecnológicos depende dos produtos apresentarem-se ativos e estáveis por longos períodos, mesmo quando não armazenadas nas condições ideais (SAMBORSKA et al. 2005). Soluções de proteínas são facilmente desnaturadas em decorrência de efeitos adversos como aquecimento, agitação, mudanças de pH, exposição a agentes desnaturantes, além das degradações por reações químicas como hidrólise ou deamidação, mediadas pela água. Com isso, se a estabilidade da enzima não for mantida durante o acondicionamento e transporte, esta não será de grande aplicabilidade. 17 Frente a estas dificuldades intrínsecas às formulações líquidas, a secagem por spray driyng representa uma alternativa satisfatória, visto que esta técnica já foi aplicada à desidratação de materiais termosensíveis e resulta em grande redução de volume, facilitando transporte e armazenamento (CARPENTER et al. 1997). Diante disso, o presente trabalho objetivou-se na produção das enzimas fitases e xilanases produzidas por fungos termofílicos através do cultivo em estado sólido de resíduos agroindustriais, com posterior aplicação da técnica de spray drying. 18 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1 Alimentação Animal A nutrição animal adequada visa atender todos os nutrientes que os animais exigem para que expressem todo o seu potencial produtivo. O mercado nacional de alimentação animal movimenta R$ 16 bilhões e mobiliza quase 2.500 empresas para produzir 70 milhões de toneladas. Dentre essa quantidade fabricada, 70% correspondem à produção de ração para suínos e aves (MATSUDA, 2013). A produção industrial de aves e suínos assumiu caráter de importância fundamental para a economia de nosso país nos últimos anos. Grande parte deste crescimento está associada ao conhecimento do valor nutricional dos ingredientes das rações e das exigências nutricionais dos animais nas diferentes fases produtivas. Na elaboração de rações para animais monogástricos é de fundamental importância o conhecimento do valor nutricional dos alimentos, deste modo a otimizar o aproveitamento dos nutrientes pelos animais, evitando deficiências ou excesso destes, o que tanto auxilia na diminuição de custos, quanto na excreção de nutrientes no ambiente (ARAUJO, 2005; ROSTAGNO et al. 2007). Na criação de animais monogástricos a alimentação representa cerca de 70% do custo de produção (ARAUJO, 2005, FERREIRA et al. 2013). Os alimentos comumente utilizados na nutrição dos animais monogástricos são legumes, sementes e grãos, dentre os quais destacam-se o milho e farelo de soja. O fitato é a principal forma de armazenamento de fósforo (P) nesses alimentos. Segundo Ravindran et al. (1995), as dietas das aves contêm de 2 a 4 g de fósforo fítico/kg de ração, como pode ser visto na Tabela 1.1 A variabilidade no teor de fósforo fítico (P fítico) da ração é devida a variações no clima, solo/adubação, idade e estágio de 19 maturação do vegetal, cultivar, grau de processamento, melhoramento genético, dentre outros fatores. Tabela 1.1. Teor de fósforo dos principais alimentos utilizados nas rações de aves. % de fósforo (P)* Alimentos P total P disponível1 P fítico Farelo de arroz 1,67 0,24 1,43 Farelo de amendoim 0,63 0,21 0,42 Polpa cítrica 0,20 0,07 0,13 Milho 0,25 0,06 0,19 Farelo de soja (45% de PB2) 0,56 0,22 0,34 Soja integral tostada 0,52 0,19 0,33 Sorgo baixo tanino 0,26 0,08 0,18 Farelo de trigo 0,97 0,33 0,64 Farinha de vísceras de aves 2,54 2,54 - Fosfato bicálcico 18,5 18,5 - Farinha de carne e ossos (41% de PB2) 6,53 5,88 - Farinha de carne e ossos (46% de PB2) 5,97 5,37 - *Em matéria natural. 1Valores calculados ou estimados. 2PB=proteína bruta. Extraído e modificado de Rostagno et al. (2011). Conforme a Tabela 1.1, o ingrediente vegetal com a maior quantidade de P disponível é o farelo de soja com 39,28%, e o que contem a menor quantidade é o farelo de arroz com somente 14,37%, seguido pelo milho com apenas 24%. Estes dados corroboram os do National Research Council - NRC (1994), para quem apenas 30% do P de origem vegetal está na forma disponível, sendo os 70% restantes correspondentes 20 ao fósforo fítico. Já as farinhas de carne e ossos e a farinha de vísceras de aves contribuem com, respectivamente, 90% e 100% de P disponível. No entanto, há limitações para o seu uso em rações, sendo que determinados países, em destaque os europeus, não importam carnes provenientes de animais alimentados com fontes de P de origem animal (BELLAVER, 2002, LIMA et al. 2007). Já o fosfato bicálcico é considerado uma fonte inorgânica de P 100% disponível, embora sua digestibilidade para aves seja de apenas 70% (ROSTAGNO et al. 2011). No entanto, é importante considerar que trata-se de um ingrediente caro, além de ser um recurso mineral não renovável o que tem provocado a preocupação de uma crise futura no seu suprimento. Como a molécula de ácido fítico tem alto conteúdo de fósforo (282 g de fósforo/kg de ácido fítico), justifica-se a necessidade de um maior aproveitamento deste elemento pelos animais monogástricos, com a adição de fitases exógenas, diminuindo o preço das rações, melhorando o aproveitamento dos nutrientes pelos animais, além da produção animal de forma mais responsável devido a redução da excreção de fósforo (NAVES, 2012). Outro fator antinutricional presente nos alimentos vegetais são os polissacarídeos não amílaceos (PNA). Os PNA são componentes da parede celular vegetal e são geralmente a celulose, hemicelulose, quitina e pectinas, os quais podem interferir no desempenho zootécnico. Por não poderem ser degradados por enzimas endógenas, estes elementos ocasionam problemas como a modificação no tempo de permanência e viscosidade do alimento no trato digestivo dos animais monogástricos (CAMPESTRINI et al. 2005). Os PNA são divididos em fração solúvel e insolúvel. A fração solúvel em água, composta principalmente pela hemicelulose, aumenta a viscosidade do alimento ingerido, o que diminui a digestibilidade dos nutrientes (CARRÉ et al. 2004). A fração 21 insolúvel, devido ao caráter indigestível, atua como barreira entre a enzima e o nutriente (WYATT et al. 2008). A Tabela 1.2 apresenta o teor de PNA de ingredientes utilizados na nutrição animal. O milho, principal elemento utilizado nas formulações de rações para animais monogástricos no Brasil, não apresenta alta quantidade de PNA, portanto, não apresenta muitos problemas com digestibilidade causados por esses compostos. Já o farelo de soja, principal fonte proteica dessas dietas, pode conter quantidades consideráveis de PNA (CHOCT, 1997; SORBARA, 2008). Tabela 1.2. Teor de polissacarídeo não amiláceos dos principais alimentos utilizados nas rações de aves. Polissacarídeos não amiláceos (%) Alimentos Solúvel Insolúvel Total Milho 0,1 8,0 8,1 Trigo 2,4 9,0 11,4 Soja 2,7 16,5 19,2 Sorgo 0,2 4,6 4,8 Centeio 4,6 8,6 13,2 Cevada 4,5 12,2 16,7 Farelo de arroz 0,5 21,3 21,8 Extraído e modificado de Choct et al. (1997). Smith e Annison (1996) citam que o milho possui aproximadamente 8% de PNA, sendo que 6% na forma insolúvel. O farelo de soja possui em torno de 27% de PNA, sendo esses compostos em sua maioria encontrados na forma de pectinas, hemiceluloses e oligassacarídeos (rafinose e estaquiose) (CHARLTON, 1996). Essa quantidade de compostos é suficiente para causar efeitos adversos nos animais que ingerirem rações formuladas com esses ingredientes. Diante disso, a utilização de enzimas exógenas, como as xilanases, tem sido adotada para reduzir os efeitos negativos dos polissacarídeos não amiláceos. 22 1.2 Fitato Há vários nomes e símbolos usados na literatura para referir-se à molécula de fitato, tais como: ácido fítico, hexafosfato de mio-inositol, IP6, InsP6 ou Ins(1,2,3,4,5,6)P6 (ALMEIDA et al. 2003). Para Selle e Ravindran (2007), o termo fitato refere-se quimicamente ao sal do ácido fítico, que é uma estrutura de baixo peso molecular, formada por seis grupos fosfatos ligados a uma molécula com seis carbonos. Segundo Almeida et al. (2003), o fitato é sintetizado a partir da fosforilação completa do mio-inositol, visto na Figura 1, que, por sua vez, tem a glicose como precursora. Figura 1.1. Estrutura do mio-inositol, pertence à família dos inositóis e é o estereoisômero mais abundante na natureza (ALMEIDA et al. 2003). Segundo a nomenclatura oficial, o único grupo hidroxila axial do mio-inositol ocupa a posição C2 na estrutura (Figura 1.1), consequentemente, o único grupo fosfato do fitato disposto axialmente será aquele ligado ao C2, demonstrado na Figura 1.2. Figura 1.2. Ácido fítico na conformação de cadeira (energeticamente mais estável) mostrando um grupo fosfato em posição axial (C2) e cinco grupos fosfatos equatoriais (QUIRRENBACH et al. 2009). 23 A posição C2 no fitato tem função particular, pois as fitases são estereoespecíficas e apresentam forte preferência pelos grupos fosfatos ligados equatorialmente ao anel de mio-inositol, sendo o grupo fosfato disposto axialmente no C2 resistente à hidrólise enzimática (LEI e PORRES, 2003). O ácido fítico pode complexar-se com nutrientes da dieta, durante a digestão, diminuindo a biodisponibilidade desses e podendo comprometer o desempenho zootécnico dos animais. O fitato pode ter até 12 cargas negativas, sendo 2 cargas localizadas em cada um dos 6 grupos fosfatos da molécula (QUIRRENBACH et al. 2009). O número de cargas iônicas no fosfato de mio-inositol influencia sua habilidade complexante e a desprotonação dos grupos fosfatos depende do pH no qual a molécula se encontra. Tais complexos são formados principalmente em pH neutro e básico, pois em pH ácido a protonação parcial ou total do ácido fítico diminui sua capacidade de ligar-se a nutrientes catiônicos. Em contrapartida, o fitato carregado negativamente pode complexar-se com minerais catiônicos sendo que os divalentes (Ca2+, Zn2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+) são mais susceptíveis (MAGA, 1982; KORNEGAY, 2001). Há também a possibilidade da ligação do fitato com moléculas de amido e proteína como demonstra a Figura 1.3. Figura 1.3. Exemplos de possíveis ligações entre o ácido fítico e alguns nutrientes em diferentes pH (THOMPSON, 1988). pH baixo pH alto 24 Para Cousins (1999), a interação com a proteína é dependente das condições de pH, pois esta se dá por ligação iônica. Essa informação deve ser levada em consideração na formulação de rações, pois há mudanças de pH ao longo do trato gastrointestinal dos animais. Complexos fitato-mineral-proteína, Figura 1.4, são de difícil digestão o que dificulta a assimilação da proteína. Vários estudos demonstraram que proteínas da soja, milho, trigo, farelo de girassol e de arroz formam complexos com ácido fítico (RAVINDRAN et al. 1999). Figura 1.4. Representação do fitato complexado com proteína, cálcio e aminoácido (SALMON, 2011). Quanto maior o grau de fosforilação do mio-inositol, maior é o seu poder de complexar. É essencial citar que o cálcio dietético pode ligar-se ao fitato formando complexos ou ligar-se ao P inorgânico formando fosfatos de cálcio como o Ca3(PO4)2 (TAMIM et al. 2004). As concentrações molares relativas de fósforo inorgânico e fitato podem influenciar a espécie química que vai ser formada, entretanto, sabe-se que o Ca2+ tem maior afinidade pelo fitato do que pelo ortofosfato (NAVES, 2012). Segundo Selle et al. (2009), é provável que o cálcio não esteja complexado com o fitato nos ingredientes que compõem a ração porque eles possuem baixa concentração desse mineral. Sendo assim, a maior taxa de formação dos complexos se dá no trato digestório das aves e é de relevância nutricional, pois estima-se que aproximadamente um terço do 25 cálcio dietético forme complexos com o fitato durante a passagem da ração pelo intestino. O pH do trato gastrointestinal do frango, ilustrado na Figura 1.5, é alterado ao longo do seu comprimento, o que irá influenciar diretamente na contribuição de formação dos complexos fitato-nutrientes. Figura 1.5. pH do alimento (ração farelada) nos diferentes segmentos do trato digestório do frango de corte alimentado, ad libitum, durante 6 semanas (GAUTHIER, 2002). Em pH neutro ou básico, a desprotonação dos grupos fosfatos do fitato aumenta sua afinidade por cátions metálicos divalentes (ex: Ca2+ e Mg2+), causando a formação de complexos fitato-metal, demonstrados na Figura 1.6. Oh et al. (2001) relatam que o complexo fitato-Ca é formado principalmente em pH de 5,0 a 8,5 sendo que a afinidade do fitato pelo Ca2+ aumenta com o aumento do pH. Portanto, teoricamente, esse tipo de complexo pode ser formado apenas no proventrículo e moela devido ao forte caráter ácido desses segmentos. Até o momento, as fitases comercializadas atuam de modo eficiente apenas sobre o “fitato não complexado”, portanto, são suplementadas na ração no sentido de reduzir a formação de complexos pelo fitato, consequentemente aumentando a biodisponibilidade de nutrientes da dieta. Diante disso, tem-se ressaltado as fitases que atuam em baixo pH. 26 Figura 1.6. Esquema do ácido fítico complexado com vários minerais bivalentes (COUSINS,1999). O fósforo é um nutriente que desempenha várias funções fisiológicas incluindo aquelas responsáveis pelo crescimento e manutenção metabólica dos animais (ASSUENA et al. 2009). Vários são os parâmetros empregados para avaliar sua utilização no organismo dos animais, destacando-se: ganho de peso, resistência à quebra dos ossos, fósforo no soro, atividade da fosfatase alcalina, fósforo e cinza nos ossos, anormalidades no esqueleto, densidade dos ossos, distribuição do fósforo em tecidos, digestibilidade aparente e verdadeira (VITTI, 1989; BARBOSA et al. 1992; GOMES et al. 1992). 1.3 Aditivos Alimentares Segundo o comitê de Especialistas em Aditivos Alimentares da Organização Mundial da Saúde (OMS)/Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) [The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives – JECFA], aditivo alimentar é definido como qualquer substância que não se consome normalmente na nutrição, nem se utiliza como ingrediente básico desta, tendo ou não valor nutritivo, e cuja adição intencional ao alimento, com fins tecnológicos em sua fase de fabricação, resulte ou possa resultar em produtos ou subprodutos, que melhorem as características nutritivas e/ou sensoriais do alimento. 27 Os aditivos são utilizados na produção animal com os objetivos de aumentar as taxas de crescimento e sobrevivência, melhorar a saúde e a eficiência alimentar, reduzir as cargas patogênicas e a transmissão de patógenos via alimentos, reduzir a produção de dejetos, minimizando o impacto ambiental (GODOI et al. 2008). Um dos fatores que contribuíram para a obtenção da alta produtividade apresentada pela indústria avícola foi a utilização de aditivos nas dietas, aliando a capacidade de melhorar o desempenho animal com as características físicas dos alimentos. O uso de aditivos é, hoje, motivo de discussão devido à pressão do público consumidor exacerbado por matérias sensacionalistas veiculados pela imprensa por demanda de produtos naturais. Sugerem, ainda, novas regulamentações sobre a alimentação animal, como a proibição do uso de subprodutos da mesma espécie e de restos de cozinha, e a obrigatoriedade de identificação de origem dos componentes do alimento. Com isso, é cada dia mais comum a utilização de aditivos na dieta dos animais monogástricos, entre eles, probióticos, prebióticos, simbióticos, antibióticos e enzimas exógenas, que podem auxiliar de forma direta e/ou indiretamente a utilização eficaz dos nutrientes pelo animal (SCHWARZ, 2002). No Brasil, desde janeiro de 2006 existem restrições ao uso de antibióticos nas rações, pois esses são acusados de deixar resíduos na carne e proporcionar resistência aos microrganismos, prejudicando a saúde humana. Com isso, o uso de probióticos, prebióticos e simbióticos se tornam uma alternativa na para que os índices de produção sejam alcançados. Probióticos são microrganismos vivos podendo conter bactérias totalmente conhecidas e quantificadas ou culturas bacterianas não conhecidas. Os principais microrganismos bacterianos considerados probióticos são aqueles dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, além de Escherichia, Enterococcus e Bacillus 28 (MORAIS e JACOB, 2006). Os probióticos promovem o equilíbrio da microbiota intestinal e melhoram o ganho de peso e a eficiência alimentar dos animais, justamente por competirem com os patógenos no intestino, minimizando infecções intestinais e lesões do vilo, permitindo a regeneração da mucosa intestinal (SATO et al. 2002). Os prebióticos proporcionam efeito benéfico ao hospedeiro por estimular seletivamente o crescimento e/ou metabolismo de um limitado grupo de bactérias no cólon, como os probióticos (GIBSON et al. 1995). Eles atuam estimulando o crescimento da microbiota benéfica, propiciando o desenvolvimento de uma flora e mucosa instestinal saudáveis. Os prebióticos mais estudados como aditivos na alimentação animal são os oligossacarídeos, especialmente os mananoligossacarídeos, os frutoligossacarídeos e os glucoligossacarídeos (GODOI et al. 2008). Simbiótico é o termo utilizado para a associação de probiótico e prebiótico, ou seja, componentes da microbiota intestinal e substâncias prebióticas específicas fornecidos em um só produto, estimulando o desenvolvimento e a atividade desta mesma microbiota, permitindo potencializar o efeito de ambos os componentes (PELÍCIA et al. 2004). Para Lima et al. (2007), o uso de enzimas exógenas para reduzir os custos das rações, representa, sem dúvida, uma das alternativas mais versáteis para auxiliar na melhoria da rentabilidade da produção. As pesquisas com enzimas têm demonstrado a importância dessas substâncias para reduzir o efeito negativo dos fatores antinutricionais e melhorar a eficiência alimentar. Durante o processo de conversão dos nutrientes da dieta em produtos animais ocorrem perdas consideráveis, mesmo os animais estando em condições ideais de produção, com alimentação de qualidade e manejo adequado. É possível lançar mão de diversas manipulações nutricionais no sentido de reduzir a excreção de nutrientes, sendo que as medidas mais eficientes 29 incluem o balanceamento das rações de maneira que atenda mais precisamente às exigências do animal, a adição de aminoácidos puros, reduzindo simultaneamente o nível de proteína bruta da dieta e, por fim, a adição de enzimas à dieta. Em trabalho, Garcia (2003) cita que em torno de 25% das necessidades diárias de nitrogênio podem ser utilizadas para a síntese de enzimas endógenas. 1.3.1 Enzimas exógenas utilizadas na alimentação animal Enzimas são proteínas com capacidade catalítica de alta especificidade, podendo ser obtidas através de várias fontes, sendo a mais utilizada industrialmente as produzidas por microrganismos (HANNAS e PUPA, 2007). Com o auxílio de bactérias e fungos, é produzida uma grande quantidade de enzimas que degradam várias formas de amido, açúcares, proteínas, fósforo e celulose para uma absorção mais eficiente no trato digestivo (CAMPESTRINI et al. 2005) Segundo Zanella (2001), no mercado de nutrição animal existem três tipos de enzimas: 1. Enzimas para alimentos com baixa viscosidade (milho, sorgo e soja), como as amilases, α-galactosidases, pentosanases e pectinases (EMBRAPA, 1999); 2. Enzimas para alimentos de alta viscosidade (trigo, centeio, cevada, aveia, triticale e farelo de arroz) como as xilanases e arabinoxilanases (EMBRAPA, 1999; CAMPESTRINI et al. 2005; OLIVEIRA e MORAES, 2007; TAVERNARI et al. 2008); 3. Enzimas para degradar o ácido fítico dos grãos vegetais, como as fitases (EMBRAPA, 1999; PANDEY et al. 2001). Quanto ao mecanismo de ação das enzimas exógenas, Soto-Salanova et al. (1996) relatam através de estudos quatro modos principais: 30 1. Provocando a ruptura das paredes celulares das fibras, exemplo: arabinoxilanases, xilanases e outras hemicelulases (OLIVEIRA e MORAES, 2007; TAVERNARI et al. 2008; PALOHEIMO et al. 2011); 2. Reduzindo a viscosidade, devido à fibra solúvel, na digesta do intestino proximal, exemplo: xilanases, β-glucanases e pectinases (COWIESON, 2005; OLIVEIRA e MORAES, 2007; TAVERNARI et al. 2008); 3. Degradando proteínas e reduzindo os efeitos dos fatores antinutricionais, tais como proteases e fitases (EMBRAPA, 1999; PANDEY et al. 2001); 4. Suplementando a produção de enzimas endógenas do animal, cuja ação é mais importante em animais jovens, exemplo: amilases (EMBRAPA, 1999; PANDEY et al. 2001). É importante ressaltar que, independente de qual seja o mecanismo catalítico, depois de ocorrida a reação do substrato com a enzima, esta se separa do alvo, tornando- a livre para novas reações. Todas as enzimas aplicadas na nutrição animal são hidrolases, que são usadas diretamente como aditivos alimentares, com o objetivo de suplementar a atividade digestiva endógena do animal hospedeiro (CAMPESTRINI et al. 2005). As hidrolases utilizam água para fragmentar a molécula alvo em outras duas (UENOJO e PASTORE, 2007), sendo que um dos fragmentos resultantes da reação receberá um grupo OH- enquanto o outro receberá um próton de hidrogênio (H+) que serão agregados a suas estruturas químicas. Para Slominski (2011), entre os benefícios para utilização de enzimas nas formulações de rações estão: a liberação de fósforo disponível a partir da hidrólise do fitato, visto que o fósforo é um mineral não renovável e que vincula custos à alimentação; a degradação da parede celular e dos PNA com consequente 31 aproveitamento de energia; bem como a eliminação de fatores antinutricionais dos componentes da dieta. - Carboidrases Os polissacarídeos não amiláceos, ou simplesmente fibras, principais constituintes da parede celular dos alimentos de origem vegetal, não podem ser digeridos ou são com baixa eficiência pelos monogástricos, devido à natureza de suas ligações, sendo resistentes à hidrólise no trato digestivo. A dificuldade na digestão da fibra, além de reduzir a energia do alimento, pode prejudicar a utilização do todos os outros nutrientes. Isto ocorre principalmente quando o tipo de fibra do alimento é solúvel, ou seja, tem grande capacidade de absorver água e formar substância gelatinosa no trato intestinal. A fibra solúvel é composta pela hemicelulose, a qual é feita, principalmente, pelos β-glucanos na cevada e aveia e arabinoxilanos no trigo, centeio e farelo de arroz, e pela pectina nas frutas e hortaliças (EMBRAPA, 1999; COWIESON, 2005; BERNAUD e RODRIGUES, 2013). As carboidrases, principalmente as xilanases, têm sido utilizadas na alimentação animal para hidrolisar os polissacarídeos não amiláceos, aumentando a digestibilidade de alimentos como a cevada, o trigo, o centeio, a aveia e o triticale (CONTE et al. 2003). Bactérias, fungos e algumas leveduras são capazes de sintetizar enzimas para a hidrólise de materiais lignocelulósico, podendo estes ser aeróbios ou anaeróbios, mesófilos ou termófilos (HÖLKER e LENZ, 2005). Trabalhos recentes têm demonstrado respostas positivas quanto à digestibilidade de nutrientes e ao desempenho de suínos e aves alimentados com rações à base de milho e soja, quando estas foram suplementadas com enzimas pectinases e α-galactosidases. 32 A produção de amilases pelo pâncreas nas primeiras fases dos animais monogástricos é baixa, dificultando o desenvolvimento satisfatório destes, que tem a digestão do amido prejudicada. Essa informação deve ser levada em consideração já que a base da alimentação desses animais de produção em qualquer idade é o milho e este possui alto teor de amido (LIMA et al. 2007; PIOVESAN et al. 2011). - Proteases Nos últimos anos, com o aumento constante do preço do farelo de soja, utilizado como fonte proteica na alimentação das aves, houve a necessidade de alternativas que melhorem seu valor nutricional. Além do mais, a proteína é considerada o ingrediente mais caro da ração. Com isso, a adição de proteases exógenas na dieta pode melhorar o valor nutricional através da hidrólise de certos tipos de proteínas que resistem ao processo digestivo (TORRES et al. 2003). Com isso, há a melhora no desempenho e rendimento da carcaça, sendo seus efeitos mais evidentes quando as dietas são formuladas com baixas taxas de aminoácidos essenciais ou de proteína total, de forma a minimizar as excreções de nitrogênio (WANG et al. 2006). Os alimentos alvos dessas enzimas são os subprodutos da soja e glúten. - Lipases As lipases, igualmente chamadas de triacilglicerol lipase, são enzimas que fazem parte do grupo das serina hidrolases, tendo como substrato, triglicerídeos. Essas enzimas agem na hidrólise das ligações ésteres-carboxílicas de acilgliceróis, formando ácidos graxos e glicerol. Estas enzimas são produzidas em quantidades satisfatórias pelo pâncreas dos animais, porém a inclusão de enzimas exógenas em dietas para animais 33 monogástricos reduz a síntese de enzimas endógenas, conseqüentemente, o organismo teria uma maior quantidade de aminoácidos para a síntese tecidual (LIMA et al. 2007). 1.3.1.1 Fitases Como já mencionado anteriormente, os alimentos vegetais, que constituem a base da ração dos animais monogástricos, contém baixa quantidade de P disponível para a absorção, estando grande parte desse elemento na forma de fitato, que é eliminado nas fezes. Sendo assim, se faz necessária a suplementação de fósforo inorgânico na dieta dos animais, aumentando o custo da ração. Diante disso, a adição de fitases exógenas na alimentação animal surge como alternativa para esses percalços. As fitases (hexafosfato de mio-inositol fosfohidrolases) são amplamente difundidas na natureza podendo ser derivadas de animais, plantas e microrganismos. No entanto, a maioria dos trabalhos científicos tem sido focados em fitases microbianas, especialmente as produzidas por fungos filamentosos (SHIEH e WARE, 1968; PAIK, 2003; VATS e BANERJEE, 2004; BHAVSAR et al. 2011). As fitases catalisam a reação de desfosforilação do ácido fítico (fitato) em ésteres de fosfato de mio-inositol menores e fósforo inorgânico, como mostra a Figura 1.7 (LEI e PORRES, 2003). Figura 1.7. Hidrólise do fitato pela fitase em inositol, fosfato, e outros elementos divalentes. O fitato é mio-inositol-1,2,3,4,5,6-di-hexaquis fosfato que contem aproximadamente de 14 a 28% de fósforo e 12- 20% de cálcio (LEI e PORRES, 2003). 34 A teoria mais aceita atualmente é que as fitases exógenas hidrolisam o fitato em segmentos anteriores ao duodeno, resultando em fosfatos de mio-inositol menores, os quais têm uma capacidade reduzida (em relação ao IP6) para quelar e indisponibilizar o Ca2+. Esse mecanismo, então, permitiria que maiores concentrações de Ca e P estejam possivelmente disponíveis para serem absorvidas ao passar pelo intestino delgado (LUTTRELL, 1993). Partindo das informações demonstradas na Tabela 1.3 e que as fitases ácidas agem com máxima eficiência catalítica no papo, proventrículo e moela, essas dispõem de em torno de 55% do tempo total de permanência da digesta no trato digestório para atuar no fitato proveniente da dieta. Tabela 1.3. Duração média do tempo de trânsito da ingesta nos diferentes compartimentos do trato gastrointestinal do frango. Segmento do trato digestório Tempo* de permanência da digesta Papo 50 Proventrículo e moela 90 Duodeno 5 a 8 Jejuno 20 a 30 Íleo 50 a 70 Reto 25 *Tempo em minutos, Extraído de GAUTHIER, (2002). No entanto, não se pode ignorar a possibilidade de formação de complexos durante a passagem da ingesta pelo papo, pois é provável que o pH 5,5 admita certa condição de ação antinutricional do fitato, podendo diminuir, no proventrículo e moela, a eficiência das fitases ácidas suplementadas na ração. 35 Segundo o site Brenda (2014) as fitases são classificadas em 3-fitases (EC 3.1.3.8), 5-fitases (EC 3.1.3.72) e 6-fitases (EC 3.1.3.26), baseadas na posição específica da hidrólise inicial do fitato (KONIETZNY e GREINER, 2002). As fitases podem ser divididas em ácidas (com pH ótimo entre 2,5 e 6,0) e alcalinas (com pH ótimo entre 6,0 e 8,0) (GREINER et al. 2001). Baseado nas suas diferenças estruturais e catalíticas, as fitases foram subdivididas em classes: histidina fosfatase ácida (HFA), fitase β-hélice (FBH), fosfatase ácida “purple” (FAP) e proteína tirosina fosfatase (PTP) (LEI e PORRES, 2003; MULLANEY e ULLAH, 2003). A classe HFA é a que possui maior número de representantes, sendo caracterizada pela presença de uma sequência conservada de aminoácidos no sítio ativo (RHGXRXP) e dois resíduos cataliticamente ativos (His361Asp362). As demais classes (FBH, FAP e PTP) não possuem a sequência conservada no sítio ativo e/ou o dipeptídeo cataliticamente ativo (LEI e PORRES, 2003). A FBH tem sido isolada principalmente de microrganismos do gênero Bacillus e tem sua atividade máxima em pH de 6,0 a 8,0 (FU et al. 2008). Esse tipo de fitase tem substrato o complexo fitato de cálcio, ou seja, são capazes de hidrolisar o Ca ligado ao fitato (SHIN et al. 2001). Greiner et al. (2002), citam que a hidrólise do fitato pela fitase é um processo em série, portanto, cada intermediário fosfatado do mio-inositol é liberado do sítio ativo da enzima mas pode ser substrato para a hidrólise seguinte. Teoricamente, a hidrólise enzimática completa do fitato gera uma série de fosfatos de mio-inositol menores (IP6 → IP5 → IP4 → IP3 → IP2 → IP1), por meio de uma cadeia de reações de desfosforilação, para produzir o mio-inositol e seis P inorgânicos, demonstrada na Figura 1.8. Entretanto, o mecanismo de catálise e o grau de 36 desfosforilação do ácido fítico são variáveis, pois dependem de tipos de fitases diferentes (GREINER et al. 2002). Figura 1.8. Reação de hidrólise do fitato pela fitase (Brenda Enzymes, 2014). Greiner et al. (2002) relatam que a via de hidrólise completa do fitato foi elucidada apenas em casos raros, por fitases isoladas de vegetais como centeio, cevada, aveia, trigo, arroz, tremoço, broto de feijão, pólen de lírio e as produzidas pelos microrganismos Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas, Paramecium, Escherichia coli e Bacillus subtilis. De acordo com Lei e Porres (2003), as fitases têm sido principalmente, se não exclusivamente, utilizadas como suplemento alimentar em dietas para aves, suínos e em certa medida, para os peixes. Vários experimentos laboratoriais e pesquisas de campo mostraram que 500 a 1000 unidades de fitases podem substituir aproximadamente 1 g de suplemento de fósforo inorgânico e reduzir a excreção de fósforo total em 30 a 50%. Os autores citam também relatos do potencial de fitases na melhora da nutrição mineral dos seres humanos. No entanto, há a necessidade de novas pesquisas para determinar a dose adequada de administração de fitases para nutrição humana. Além disso, Greiner e Konietzny (1996) citam que as fitases podem ser utilizadas para produzir novos derivados de ácido fítico e também melhorar a fertilidade do solo e absorção de nutrientes pelas plantas (LEI e PORRES, 2003). Mio-inositol hexakifosfato + H2O ID-mio-inositol 1.2.3.5.6-pentakisfosfato + fosfato 37 A produção comercial de fitases, Tabela 1.4, para uso na alimentação animal é mais facilmente obtida através do uso de cultura de microrganismos, principalmente fungos do gênero Aspergillus (SEBASTIAN et al. 1998), através de técnicas de recombinação de DNA. Este processo envolve fermentação, extração, separação e purificação do produto. NELSON et al. (1968) foram os primeiros a adicionar fitases produzidas por uma cultura de Aspergillus ficuum a uma ração líquida à base de soja, em dietas de frango de corte, obtendo um aumento linear no ganho de peso e no conteúdo de cinzas nos ossos, concluindo que as aves conseguiram utilizar o fósforo fítico tão bem quanto o fósforo inorgânico. Apesar disso, somente no final da década de 80 a produção de fitases atingiu escala comercial, reduzindo seu custo e tornando viável sua utilização nas dietas de animais monogástricos (CONTE et al. 2002). Tabela 1.4. Fitases comerciais encontradas no mercado mundial. PRODUTO MICRORGANISMO CULTIVO EMPRESA Natuphos A.niger Líquido BASF Allzyme phytase A.niger Sólido Alltech Phyzyme A.oryzae Líquido Fermic Ronozyme A.oryzae Líquido Novozymes Amaferm A.oryzae Líquido Biozyme Finase A.awamori Líquido AB Enzymes Bio-Feed Phytase P.lycii Líquido DSM (STEFAN et al. 2005; CAO et al. 2007; SINGH et al. 2011) 1.3.1.2 Xilanases As hemiceluloses são heteropolissacarídeos ramificados, formados principalmente por pentoses (xilose, raminose e arabinose), hexoses (glicose, manose e galactose), ácidos urônicos (ácidos 4-O-metilglucurônico e galacturônico) e radicais 38 acetila (DEMIRBAS et al. 2011). Representam de 15 a 35% da biomassa vegetal e tem como função unir quimicamente a celulose e a lignina, além de interagir covalentemente com a pectina, resultando em um material flexível, porém altamente resistente a espécies químicas (GIRIO et al. 2010). As hemiceluloses podem representar até 40% do peso seco de resíduos lignocelulósicos e estão presentes em todas as camadas da parede celular das plantas. Sua degradação é realizada por hemicelulases como as xilanases, que hidrolisam estes heteropolissacarídeos. As hemiceluloses são divididas em xilanas, mananas, galactanas e galacturonanas (AWAFO, 1997), que apresentam suas unidades monoméricas unidas por ligações do tipo 1,3, 1,4 e 1,6 (SZENGYEL, 2000). As maiores proporções ficam a cargo das xilanas, que consistem em moléculas de xilose unidas por ligação β-1,4 (DAMASO et al. 2004). A xilana é o principal componente das hemiceluloses e o segundo mais abundante polissacarídeo natural existente, perdendo apenas para a celulose (WOODWARD, 1984; COLLINS et al. 2005; SARATALE et al. 2012). Encontra-se localizada entre a molécula de lignina e o conjunto de fibras de celulose e é um polímero linear com a cadeia principal composta por resíduos de β-xilopiranose unidos através de ligação glicosídica do tipo β (1-4), podendo apresentar várias substituições. Assim, xilanas, galactomananas, arabino-xilanas, arabinoglucurono-xilanas, arabino-4- metil-glucurono-xilana, 4-metil-glucurono-xilanas, galactosanas, galacto-arabino- glucurono-xilana, são diferentes denominações das hemiceluloses em função da estrutura química que as compõem (BIELY, 1985; DA SILVA et al. 1997; POLIZELI et al. 2005). A completa hidrólise requer a ação de um sistema de enzimas com diferentes especificidades e modos de ação denominado sistema xilanolítico. A heterogeneidade e complexidade da xilana resultam em uma abundância de xilanases, diferindo quanto as 39 propriedades físico-química, como pH e temperatura ótimos de atuação, e especificidade pelo substrato, dependendo do microrganismo produtor (HALTRICH et al. 1996; COLLINS et al. 2005). Em trabalho, Palma (2003) explica que as endo β-1,4 xilanases (EC 3.2.1.8) formam o principal grupo de enzimas envolvidas na degradação da xilana. Essas endo-enzimas são responsáveis por degradarem, de forma aleatória, a cadeia principal de xilana, liberando xilo-oligossacarídeos (HALTRICH et al. 1996 ; KULKARNI et al. 1999). A hidrólise completa desta cadeia principal ocorre pela ação sinergística de endo e exo-xilanases (β-xilosidases ou β-D-xilosídeo xilohidrolases), que hidrolisam os xilo-oligômeros de baixa massa molecular resultantes. De acordo com Biely (1985), as enzimas do complexo xilanolítico podem ser divididas em enzimas que hidrolizam a cadeia principal (endo-β-1,4 xilanase e β-xilosidase) e enzimas que hidrolizam as cadeias laterais (α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase e acetilesterase), representadas na Figura 1.9. Figura 1.9. Representação esquemática da estrutura da xilana vegetal e enzimas atuantes (BIELY, 1985). 40 A produção de xilanases por microrganismos é principalmente, por bactérias e fungos filamentosos, havendo poucos relatos sobre a utilização de leveduras. De uma forma geral, as xilanases de origem microbiana possuem uma composição proteica simples e massa molecular entre 8 e 145 kDa. A faixa ótima de temperatura para produção de endo-xilanases, por bactérias ou fungos, varia de 40 a 60ºC, sendo as bactérias mais conhecidas por produzirem xilanases termoestáveis. Em geral, as xilanases, provenientes de diferentes microrganismos são estáveis na faixa de pH de 3 a 10, apresentando melhor produção enzimática obtida em pH entre pH 4 e 7 (KULKARNI et al. 1999). Os fungos filamentosos destacam-se na secreção dessas enzimas no meio em que estão inseridos e seus níveis de secreção são elevados quando comparados aos de outros microrganismos (BISWAS et al. 2010; POLIZELI et al. 2005). O interesse na produção de xilanases deve-se a sua grande potencialidade de aplicação industrial, com diversidade na indústria de alimentos, como no beneficiamento da qualidade de produtos de padaria como massas, pães, biscoitos e tortas; como espessantes, substituintes de gorduras e aditivos. Ainda participam na extração de café, pigmentos e óleos, assim como na fabricação de sucos, vinhos e cervejas. Xilanases também estão envolvidas produção de biocombustíveis, indústrias de celulose e papel, têxtil e na produção de fármacos (WOODWARD, 1984; WONG et al. 1988; DA SILVA et al. 1997; KULKARNI et al. 1999; COLLINS et al. 2005; FLANDER et al. 2008). Além disso, as xilanases são componentes de formulação de ração animal, juntamente com glucanases, pectinases, celulases, proteases, amilases, fitases, galactosidases e lipases (POLIZELI et al. 2005). 41 1.4 Cultivo em Estado Sólido na Produção de Enzimas O cultivo em estado sólido (CES) envolve o crescimento de microrganismos, geralmente fungos filamentosos em meio sólido insolúvel, o qual age como suporte físico e/ou fonte de nutrientes. A quantidade de água no sistema é suficiente para garantir o desenvolvimento e as atividades metabólicas do microrganismo. Os espaços entre as partículas sólidas contem uma fase gasosa contínua e um mínimo de água, podendo haver gotículas, e películas na superfície destas. Porém a fase aquosa entre as partículas é descontínua e a maior parte do inter-espaço é preenchido pela fase gasosa. A maior parte da água no sistema é absorvida no interior das partículas sólidas (DURAND et al. 1988; PANDEY, 1992; PANDEY et al. 2000; MITCHELL et al. 2005; RODRIGUEZ e SAROMÁN, 2005; RANI et al. 2009). Na Tabela 1.5 podem-se visualizar alguns exemplos de fitases e xilanases de origem microbianas produzidas por CES. Tabela 1.5a. Exemplos na literatura de produção de fitases fúngica por CES. MICRORGANISMO SUBSTRATO ATIVIDADE FITASE (U/g)* REFERÊNCIAS Aspergillus niger FS3 Polpa cítrica 93 Spier et al. 2011 Aspergillus niger Farelo de trigo 154 Bhavsar et al. 2010 Pseudomonas AP-MSU Farinha de mandioca 73 Esakkiraj et al. 2010 Aspergillus ficuum Resíduo de canola 56,43 Costa et al. 2009 Malbranchea sulfurea Farelo de trigo 2,84 El-Gindy et al. 2009 Aspergillus niveus Farelo de trigo 3,4 El-Gindy et al. 2009 Sporotrichum thermophile TLR50 Resíduo de gergelim 180 Singh e Satyanarayana 2008 Aspergillus niger Resíduo de oliveira 58 Vassilev et al. 2007 Aspergillus oryzae Soja e arroz 16 Chantasartrasamee et al. 2005 Rhizomucor pusillus Farelo de trigo 9,18 Chadha et al. 2004 Rhizopus oligosporus Resíduo de coco 14,29 Sabu et al. 2002 Aspergillus niger W2 Polpa Cítrica 7,74 Silva et al. 2003 *U/g de sólido seco, Extraído e modificado de SALMON, (2011). 42 Tabela 1.5b. Exemplos na literatura de produção de xilanases fúngica por CES. MICRORGANISMO SUBSTRATO ATIVIDADE XILANASE (U/g)* REFERÊNCIAS Aspergillus awamori Bagaço de cana 2.500 Lemos et al. 2001 Aspergillus fischeri Farelo de trigo 1.024 Senthilkumar et al. 2005 Aspergillus niger Farelo de trigo e Palha de trigo 2.500 Deschamps et al. 1985 Aspergillus niger LPB 326 Bagaço de cana e Farelo de soja 3.099 Maciel, 2006 Aspergillus ochraceus Palha de trigo 428 Biswas et al. 1988 Thermoascus aurantiacus Bagaço de cana 2.700 Souza et al. 1999 Melanocarpus albomyces IIS-68 Palha de trigo 7.760 Narang et al. 2001 Thermomyces lanuginosus D2W3 Palha de sorgo 48.000 Sonia et al. 2005 *U/g de sólido seco, Extraído e modificado de MACIEL, (2006). Uma alternativa para a redução dos custos é a utilização de resíduos agroindustriais como substratos na CES para a produção da enzima. No Brasil, é produzida diariamente uma grande variedade de resíduos agroindustriais e agrícolas, como os provenientes da indústria de papel e celulose, derivados da madeira (serragem), usinas de açúcar e álcool (bagaço de cana e palha) e, os gerados pelas culturas de trigo (palha e farelo de trigo), de milho (casca e sabugo), arroz (cascas), laranja (bagaço), dentre outros (RAMOS, 2003). O cultivo em estado sólido se sobressai quando comparado com o cultivo submerso, devido à possibilidade do uso de resíduos agroindustriais e agrícolas, os quais baixam o custo do sistema. Além disso, destaca-se por eficiente produção de enzimas, reduzido consumo de água, o que permite um menor volume de cultivo no reator, e a simulação do habitat natural dos microrganismos, principalmente dos fungos filamentosos. Porém, a heterogeneidade da composição do substrato e a dificuldade de 43 controle do processo, principalmente quanto à remoção do calor metabólito gerado pelo crescimento do microrganismo, são algumas das desvantagens. Segundo Mitchell et al. (2005) a temperatura interna do biorreator pode apresentar-se em até 20°C acima da temperatura de incubação; o que pode desnaturar as enzimas ao final do processo de cultivo. Outro fator refere-se à formação de gradientes de umidade e concentração de metabólitos, fatores estes que implicam diretamente na ampliação de escala (COUTO e SANROMÁN, 2006; SINGHANIA et al. 2009). A produção de enzimas fúngicas por CES se mostra mais vantajosa pela facilidade de extração da enzima do ponto de vista industrial, já que os fungos sintetizam enzimas extracelulares, que são lançadas em um substrato externo e, portanto, elimina-se a etapa de rompimento celular para extração de enzimas intracelulares. As hifas são capazes crescerem na superfície das partículas e penetrar nos espaços entre elas, colonizando os substratos sólidos (HÖLKER e LENZ, 2005). Na Figura 1.10, estão representados esquematicamente alguns dos processos que ocorrem durante a CES por fungos filamentosos. Figura 1.10. Representação esquemática de alguns processos de micro-escala que ocorre durante a CES (HÖLKER e LENZ, 2005). 44 Após a germinação de esporos, há o desenvolvimento do micélio, onde são produzidas hifas, podendo essas ser aéreas ou penetrativas em relação ao substrato. Os espaços formados entre o micélio e o substrato são tomados pelo líquido e água, e os espaços entre as hifas aéreas com ar e vapores metabólitos. O pH do meio pode sofrer influência da liberação de ácidos carbônicos e troca de amônia. As enzimas hidrolíticas, produzidas pelo micélio, difundem para a matriz sólida e catalisam a degradação das macromoléculas em unidades menores, que são absorvidas pelo fungo servindo como nutrientes; o O2 é consumido e CO2, H2O, calor e importantes metabólitos são produzidos durante o cultivo (HÖLKER e LENZ, 2005). Dentre os fungos filamentosos, os termofílicos têm se destacado na produção de enzimas, uma vez que as enzimas sintetizadas têm boa estabilidade térmica, atividade ótima a altas temperaturas e taxas de hidrólises. Geralmente apresentam-se mais resistentes a agentes detergentes e às enzimas proteolíticas; são estáveis em amplas faixas de pH, podendo ser usadas em diferentes tipos de materiais e processos (HAKI, 2003; GOMES et al. 2007). Também há vantagens durante o processo fermentativo, como redução da contaminação por microrganismos mesófilos indesejáveis, possibilidade de trabalhar em temperaturas mais elevadas, favorecendo a solubilidade de substratos e produtos, e aumentando as taxas de reação por redução da viscosidade e por aumento do coeficiente de difusão dos substratos (GOMES et al. 2007). A adaptação de um determinado microrganismo à termofilia envolve o ajuste da membrana citoplasmática, das proteínas e do DNA às temperaturas acima da faixa mesofílica (GOMES et al. 2007). As enzimas produzidas por estes microrganismos apresentam características de grande importância industrial, como resistência a solventes orgânicos e a temperaturas 45 mais altas, sendo estáveis e ativas em temperaturas superiores à temperatura ótima para o crescimento do microrganismo (SABOTO et al. 1999). 1.5 Aporte Tecnológico às Enzimas O principal desafio na produção de proteínas e enzimas comerciais é o de proteger a sua estabilidade em solução aquosa. A água presente nos extratos enzimáticos aquosos brutos, além de ocupar espaço, facilita uma variedade de inconvenientes como a possibilidade de contaminação por microrganismos e degradações químicas e físicas durante as etapas de purificação, transporte, armazenamento e aplicação (NAMALDI et al. 2006; COSTA-SILVA, 2010). Sendo assim, formulações enzimáticas desidratadas apresentam vantagens em relação aos extratos enzimáticos aquosos, proporcionando aumento da vida útil e praticidade no manuseio, mesmo à temperatura ambiente (LIAO et al. 2003), pois a remoção de água fracamente ligada reduz o movimento livre das proteínas, minimizando mudanças conformacionais e desnaturação (BELGHITH et al. 2001; SAMBORSKA et al. 2005; NAMALDI et al. 2006 ANANDHARAMAKRISHNAN et al. 2007; SLOTH et al. 2008). Quanto mais uma enzima consegue manter o balanço iônico correspondente ao seu pH ótimo, melhor a preservação de suas funções biocatalíticas, sendo assim, a desidratação é considerada satisfatória quando as moléculas de água são retiradas de maneira que a estrutura tridimensional das moléculas permaneça a mais intacta possível (AEHLE, 1990; Ó’FAGÁIN, 1997). Neste contexto, as técnicas de secagem por liofilização e spray drying têm sido estudadas. A liofilização é um método clássico de elaboração de proteínas desidratadas, sendo considerada uma operação branda, resultando em um produto de alta qualidade e baixa deterioração. O material, previamente congelado, é desidratado por sublimação, seguida pela dessorção, empregando-se baixas temperaturas de secagem a pressões 46 reduzidas. No entanto, a desvantagem da liofilização está associada ao elevado custo da técnica, devido ao congelamento, à redução da pressão, e à longa duração do processo, e só é aconselhável a produtos com alto valor agregado. Além disso, o custo do equipamento e dos acessórios é alto (LOMBRAÑA e IZKARA, 1996; RATTI, 2001; SCHERSCH et al. 2010). A secagem por atomização, mais conhecida por spray drying, surge como alternativa à liofilização, sendo uma operação amplamente utilizada em diversas aplicações, tais como na indústria de alimentos, para produção de proteína de leite, ovos, sucos, café instantâneo, sopas e aromas em pó, e na indústria farmacêutica, na produção de antibióticos, enzimas, vitaminas e suspensões sólidas, bem como na encapsulação de aromas e sabores voláteis, dentre várias outras aplicações (ESTEVES, 2006; ANANDHARAMAKRISHNAN et al. 2007). Spray drying é uma técnica através da qual um produto líquido é atomizado numa corrente controlada de gás quente que promove a evaporação do solvente, obtendo-se pó em curtos intervalos de tempo. O gás usado é geralmente ar ou, mais raramente, um gás inerte como o nitrogênio. O líquido inicial de alimentação do pulverizador pode ser uma solução, uma emulsão ou uma suspensão. Os pós obtidos apresentam-se sem aglomerados, geralmente esféricos, e dependendo do material inicial e das condições operacionais de alimentação, variam de muito fino (10-50 µm) até partículas de grande tamanho (2-3 mm) (MASTERS, 1996; GHARSALLAOUI et al. 2007). A secagem por pulverização é um processo contínuo de etapa única, podendo ser resumido em quatro estágios: atomização (com bocal estacionário ou rotativo); contato do líquido pulverizado e o gás (nos sentidos co- corrente, contra-corrente ou misto); evaporação do solvente (formação do produto, secagem) e recuperação do produto (coletor) (MASTERS, 1980). 47 A atomização ou sistema de pulverização pode ser realizada por pressão ou por energia centrífuga e é responsável por determinar a distribuição do tamanho de partícula, área de troca térmica, trajetória e velocidade da partícula, sendo desejável uma elevada área superficial da gotícula, pois a associação da alta diferença de temperatura entre o ar quente e a gotícula resulta numa secagem muito rápida o que, juntamente com o resfriamento causado pela evaporação da água, evita o superaquecimento do interior das gotículas (GHARSALLAOUI et al. 2007; ROUSTAPOUR et al. 2009). A Figura 1.11 ilustra esquematicamente o processo de secagem em spray dryer. Figura 1.11. Diagrama esquemático da secagem por atomização em mini spray dryer. Extraído e adaptado de BÜRKI et al. 2011. Na câmara de secagem, apenas uma boa área de contato não é suficiente para assegurar uma secagem eficiente, fazendo-se necessário fornecer energia para vaporização do líquido e também ar suficiente para vaporizar toda a umidade. Sendo assim, o material a ser seco entra em contato direto com o ar quente, sendo o diâmetro da câmara um parâmetro importante do processo, uma vez que diâmetros muito 48 reduzidos afetam a atomização, devido a deposição de produto nas paredes. Geralmente, sistemas de pulverização por bocal requerem diâmetros reduzidos em comparação aos sistemas de pulverização por disco (PERRY e GREEN, 1997; ROSA et al. 2003). O sistema de separação gás-sólido é responsável por captar o pó, sendo em geral utilizado ciclones. A técnica de spray drying, devido à sua versatilidade operacional, permite a produção desde escalas laboratoriais da ordem de mililitros até dezenas de toneladas por hora, na indústria. Também devido à versatilidade, tornou-se o principal equipamento para a secagem de materiais que apresentam sensibilidade ao calor, como alimentos e materiais de origem biológica, em decorrência da rápida evaporação do solvente, baixo tempo de residência no equipamento e baixa temperatura da gota (ROSA et al. 2003; SAMBORSKA et al. 2005). Além disso, segundo Elversson e Millqvist-Fureby (2005), o método de secagem spray drying oferece algumas vantagens em comparação a outros métodos, como o controle do tamanho da partícula do pó em uma única etapa, e o domínio da morfologia e a densidade das partículas a serem formadas. No entanto, a secagem pode trazer estresse térmico e cisalhante sobre a enzima, dependendo das condições operacionais, que podem provocar danos às estruturas secundárias (alfa- hélice e beta-folha) e terciárias da cadeia peptídica, levando inclusive ao desenovelamento da enzima (MILLQVIST-FUREBY et al. 1999; DePAZ et al. 2002; NALMANDI et al. 2006). A desidratação das enzimas pode romper as ligações de hidrogênio que ligam cadeias peptídicas adjacentes. Como alternativa de minimizar os efeitos indesejáveis da secagem, faz-se necessário o controle de parâmetros operacionais como temperatura de entrada e/ou saída do ar, concentração de sólidos e vazão do líquido. Visando a proteção da enzima também se faz o uso de aditivos. Os aditivos podem ser divididos entre protetores e 49 estabilizadores. Os protetores evitam a degradação das enzimas durante a secagem, enquanto que os estabilizadores mantem as condições ideais para a manutenção da atividade enzimática durante a estocagem (BELGHITH et al. 2001). Além disso, Wang e Langrish (2007) citam que os aditivos utilizados como auxiliares na secagem por spray dryer têm, frequentemente, uma elevada temperatura de transição vítrea em relação ao material a ser secado, reduzindo, assim, a viscosidade do produto final. Encontra-se na literatura a aplicação de diversos aditivos como a maltodextrina, os açúcares (celobiose, glicose, lactose, sucrose e trealose), os polímeros (carboximetilcelulose, celulose micro-cristalina, dextrana e goma arábica), os polióis (glicerol, manitol, propileno glicol, sorbitol e xilitol) e o dióxido de silício coloidal (Aerosil® 200), comumente aplicado na indústria farmacêutica (BELGHITH et al. 2001; DePAZ et al. 2002; SELIVANOV, 2005; NAMALDI et al. 2006; DOMINGUES et al. 2008; SLOTH et al. 2009; COSTA-SILVA, 2010). Em recente trabalho, Sato et al. (2013) utilizaram adjuvantes não convencionais tais como farelo de milho e farelo de soja, para a secagem de fitases. Assim, testes específicos acerca dos aditivos adequados a cada função devem ser realizados para o extrato enzimático a ser seco, para haver agregação de valores, evitar alterações nas propriedades do produto, bem como a diminuição do custo do mesmo. Os adjuvantes utilizados no presente estudo não foram convencionais, sendo farelo de trigo, farelo de soja e farelo de milho, observados na Tabela 1.6. Tabela 1.6. Composição química do farelo de trigo (FT), farelo de soja (FS) e farelo de milho (FM), expressos na matéria natural. MS(%) PB(%) EE(%) MM(%) P(%) FB(%) FT 89,19 15,28 2,32 4,67 0,84 8,45 FS 87,45 44,38 1,3 5,01 0,35 6,20 FM 88,63 8,87 4,14 1,15 0,23 2,06 Zambom et al. (2001); Mello et al. (2009).*Matéria seca (MS) Proteína bruta (PB) Extrato etéreo (EE) Matéria mineral (MM) Fósforo (P) Fibra bruta (FB) 50 2. OBJETIVOS O objetivo geral deste trabalho foi o de obter fitases e xilanases por cultivo em estado sólido e dar-lhes tratamento tecnológico por secagem em spray dryer, visando a manutenção de atividade das enzimas por tempo prolongado. Os objetivos específicos são: a) Dentro do conjunto de fungos termofílicos da coleção do LBAM/UNESP, encontrar um que produza fitases com alta atividade por cultivo em estado sólido; b) Otimizar as condições de cultivo de um meio sólido composto por bagaço de cana de açúcar, farelo de trigo e bagaço de laranja, para produção de fitases; c) Analisar a viabilidade do uso de diferentes adjuvantes durante o processo de secagem do extrato bruto de fitases e xilanases em spray dryer; d) Selecionar os melhores adjuvantes e analisar como as condições operacionais no spray dryer afetam as atividades enzimáticas dos pós secos; f) Secar o extrato bruto em liofilizador e comparar com o extrato seco em spray dryer; g) Estudar a estabilidade da enzima seca em diferentes condições de armazenamento; 51 3. MATERIAIS E MÉTODOS As atividades experimentais deste trabalho foram efetuadas no Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos e no Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada (LBMA), ambos no IBILCE/UNESP. 3.1 Materiais Para a produção das enzimas fitases os fungos testados foram os termofílicos Rhyzopus sp. e Scopulariopsis sp., isolados de compostagem na Controeste Ambiental, localizada em São José do Rio Preto-SP; Chaetomium sp. N13, Humicola grisea var. thermoidea, Myceliophthora thermophila F214, Myceliophthora thermophila I-1D3b, Myceliophthora thermophila M77, Rhizomucor pusillus e Thermomucor indicae- seudaticae N31 isolados de pilhas de bagaço de cana de açúcar e o isolado de solo da Chácara Jatai, localizada em Adolfo-SP, Lichtheimia ramosa, Thermomyces lanuginosus FZ e Thermomyces lanuginosus SER, e também o fungo mesofílico Aspergillus niger. Como substratos para o cultivo em estado sólido foram utilizados bagaço de cana de açúcar, proveniente da usina Virgolino de Oliveira, localizada em José Bonifácio-SP, farelo de trigo, adquirido no mercado local, e bagaço de laranja, fornecido pela indústria Citrosuco, localizada em Catanduva-SP. O bagaço de cana de açúcar e o bagaço de laranja foram lavados em água corrente para a retirada da terra e açúcares residuais. Após a lavagem, os bagaços foram secos a 60 ºC em estufa de convecção forçada, até a obtenção de peso constante. Em seguida, o bagaço de cana de açúcar foi passado em peneira de 3 mm de abertura, para a retirada de material grosseiro. O bagaço de laranja foi triturado em moedor de disco no diâmetro de 3,5 mm. 52 O farelo de trigo também foi lavado em água corrente e seco em estufa a 60°C até peso constante. Para a produção das enzimas xilanases, o microrganismo utilizado foi o fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b, empregado em trabalho anteriores do grupo e reconhecido bom produtor destas enzimas. Para o cultivo em estado sólido foram utilizados bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, seguindo-se procedimento descrito anteriormente. 3.2 Produção de Fitases 3.2.1 Seleção de fungos Para encontrar um fungo com boa produção de enzimas fitases foram testados treze fungos isolados pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada (LBMA) do IBILCE/UNESP. O meio de cultura utilizado nessa etapa foi o ágar fitato, composto por (g/L): ácido fítico 10; NaNO3 2; NH4NO3 2; MgSO4.7H2O 0,5; KCl 0,5; ZnSO4.7H2O 0,1; FeSO4 0,05; ágar 19. Os microrganismos foram inoculados neste meio por picadura com auxílio de alça de platina. 3.2.2 Cultivo em estado sólido (CES) 3.2.2.1 Ensaios de análises Para os ensaios de produção de fitases em cultivo em estado sólido, os microrganismos utilizados foram mantidos em ágar Batata Dextrose Ágar (BDA) à temperatura ambiente, imerso em água estéril e óleo mineral. A primeira etapa do ensaio de cultivo consistiu no repique para reativação da cepa armazenada, com auxílio de alça de platina. Em câmara de fluxo laminar, a cepa 53 armazenada foi repicada para placas contendo meio de aveia e incubada a 45 °C por 48 horas. Após a formação do micélio, a superfície do meio de cultivo foi raspada com alça de platina, e os esporos transferidos da mesma forma que na etapa anterior para erlenmeyers contendo 50 mL de meio BDA inclinado e incubados a 45 °C por 48 horas, etapa esta denominada pré-inóculo. Posteriormente, os esporos foram suspendidos com auxílio de alça de platina em solução nutriente, descrita a seguir, contados em câmara de Neubauer e inoculados à concentração de 107 esporos/grama de substrato seco. Utilizou-se como substrato sólido a mistura (5,0 g em peso seco) de bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo, na proporção 1:2:2 respectivamente (p/p), à umidade de 70% (b.u.) e temperatura de 45 °C, com cultivo de 96 horas em câmara DBO. O meio de cultivo foi acondicionado em embalagens de polipropileno, com dimensões de 12 cm x 20 cm, (Figura 3.1a) e esterilizados a 121 °C por 20 minutos. A solução nutriente utilizada foi a descrita por Spier et al. (2010): citrato de sódio, 0,3 M contendo 0,5% de citrato de amônio, KCl 2 mM, MgSO4.7H20 5 mM, ZnSO4.7H2O 5 mM e 0,1% de Tween, a pH 5,0. Após o período de incubação de 96 horas, a amostra foi retirada da câmara DBO (Figura 3.1b) e adicionado 20 mL de tampão acetato de sódio a 0,05 M contendo 0,01M de NaOH e pH 5,0/grama de substrato seco, seguido por agitação por 30 minutos em agitador orbital, a 100 rpm, na temperatura de 45 ºC. A suspensão foi então filtrada e centrifugada a 10000 x g por 15 minutos a 5 ºC, e o sobrenadante utilizado como solução enzimática bruta. (A) (B) Figura 3.1. Embalagem de polipropileno para CES antes do cultivo (A) e após o período de incubação de 96 horas a 45 °C (B). 54 3.2.2.2 Otimização de cultivo Os ensaios de otimização do cultivo para a produção de fitases por CES seguiu Planejamento Fatorial Multiníveis com quatro fatores: proporção de substratos (Psub), tempo de cultivo (Tcult), temperatura de cultivo e umidade (Umid). Os fatores Psub e Tcult seguiram três níveis e temperatura de cultivo e umidade dois níveis, apresentados na Tabela 3.1. A obtenção do EEB se deu como descrito no item anterior. Tabela 3.1. Planejamento estatístico fatorial multiníveis para a otimização do cultivo em estado sólido para a produção de fitases. Variáveis Níveis A B C Psub 1:2:1 (BC:FT:BL) 1:1:2 (BC:FT:BL) 1:2:0 (BC:FT:BL) Níveis -1 0 1 Tcult (horas) 84 96 108 TºC 40 50 Umid 70 75 BC= bagaço de cana de açúcar; FT= farelo de trigo; BL= bagaço de laranja. Psub= proporção de substrato; Tcult= tempo de cultivo; TºC= temperatura de cultivo; Umid= umidade. 3.2.2.3 Obtenção de EEB para o processo de secagem Após a seleção do fungo, os cultivos em estado sólido para a etapa de secagem foram baseadas nas condições otimizadas e foram conduzidos em embalagens de polipropileno com dimensões de 25 cm x 30 cm, com 25,0 g substrato sólido da mistura de bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo na proporção 1:2:2 (p/p), à umidade de 70% (b.u.) e temperatura de 45 °C, por 96 horas em câmara DBO. A solução nutriente foi a mesma descrita anteriormente. Após o período de incubação de 96 horas, a amostra foi retirada do climatizador DBO e adicionado 350 mL de tampão acetato de sódio 0,05 M contendo 0,01 M de NaOH, pH 5,0 por 25 grama de substrato seco, seguido por agitação por 30 minutos em agitador orbital, a 100 rpm, na temperatura de 45 ºC. A suspensão resultante foi filtrada em tecido voil, congelada em 55 freezer doméstico na temperatura de -12 ºC e utilizada como extrato enzimático bruto (EEB). 3.2.3 Determinação de atividade enzimática A atividade das fitases foi determinada pelo método colorimétrico que fornece o fosfato liberado de fitato devido à atividade enzimática (TAUSSKY e SHORR, 1953; HEINONEN e LAHTI, 1981). Neste método, 250 µL de tampão acetato de sódio a 100 mM e pH 5,0 foi adicionado a 100 µL de ácido fítico a 10 mM, preparado em tampão acetato de sódio a 100 mM e pH 5,0 e 50 µL do extrato enzimático. A mistura foi aquecida a 37 ºC por 30 minutos, em seguida, 1,5 mL de solução de parada foi adicionado. Esta solução é composta por ácido sulfúrico (5 N), molibdato de amônio a 10 mM, e acetona, na proporção volumétrica 1:1:2. Após isso, 100 µL de ácido cítrico a 1 M foi adicionado e a mistura centrifugada a 13000 x g por 5 minutos na temperatura de 5 ºC, sendo a seguir realizada leitura em espectrofotômetro a 355 nm. Para as amostras em branco, o extrato enzimático foi adicionado após a adição da solução de parada. Uma unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzimas necessárias para liberar 1 µmol de fosfato inorgânico por minuto de reação nas condições do ensaio. Posteriormente os resultados foram convertidos para U/gss (gramas de sólido seco). A avaliação da atividade enzimática após a secagem em spray dryer foi realizada reconstituindo-se a suspensão a partir do pó seco, com base no teor de sólidos totais da formulação líquida. Os ensaios foram realizados em triplicata. 56 3.2.4 Caracterização físico-química das enzimas Foram feitas avaliações do efeito do pH, temperatura sobre as atividades das enzimas fitases e xilanases do EEB. Para a determinação do pH ótimo a solução enzimática e o substrato foram incubados em tampões a 0,2 M de acetato de sódio (pH entre 1,0 e 5,5), citrato de sódio (pH entre 5,5 e 7,0), tris-HCl (pH entre 7,0 e 8,0), sendo as atividades da fitase e xilanase dosadas a 37 ºC e 60 ºC, respectivamente. A temperatura ótima para a atividade enzimática foi obtida incubando-se a mistura de reação em temperaturas de 25 a 70 ºC, nas condições de pH ótimo obtidas anteriormente. 3.2.5 Ensaios de armazenamento do EEB O extrato enzimático bruto aquoso obtido no CES foi dividido em 25 frascos, sendo 12 amostras armazenadas sob refrigeração (4 ºC), 12 congeladas (-12 °C) e 1 congelada de forma intermitente. A cada sete dias uma amostra congelada e uma refrigerada eram retiradas e a atividade das fitases determinadas. A amostra congelada de forma intermitente era descongelada para quantificação da atividade enzimática e retornada ao congelador ao final do teste, toda semana. Com o intuito de proteger as enzimas da ação do congelamento e de proteases durante o armazenamento foram adicionados glicerol e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF – sigla em inglês), respectivamente. O extrato enzimático bruto aquoso obtido no CES foi divido em 8 frascos mantidos em freezer doméstico na temperatura de -12 ºC, sendo que 6 desses frascos continham além do EEB, glicerol nas proporções de 5%, 10%, 20%, 30%, 40% e 50% cada, um deles continha EEB e PMSF a 1 mM e outro apenas o EEB. A atividade da fitase das amostras foi determinada antes do congelamento, e após quinze e trinta dias no freezer. 57 3.2.5.1 Determinação de atividade enzimática de proteases A atividade de proteases foi determinada de acordo com MERHEB et al. (2007), com modificações. A mistura da reação foi composta do substrato 0,4 mL de caseína (SIGMA-ALDRICH) 0,5% (p/v) em tampão acetato de sódio a 0,2 M e pH 5,0; 0,4 mL tampão acetato de sódio a 0,2 M e pH 5,0 e 0,2 mL de extrato enzimático. A mistura da reação foi incubada a 35 °C e ao final de 30 minutos a reação foi interrompida pela adição de 1 mL de TCA (ácido tricloroacético) 10%. As amostras foram centrifugadas a 2300 x g por 5 minutos. Um controle foi preparado, onde o TCA foi adicionado antes do extrato enzimático. Fez-se a leitura da absorbância a 280 nm. Uma unidade de atividade proteolítica (UAP) foi definida como a quantidade de enzima necessária para causar um aumento de 0,1 na absorbância a 280 nm, nas condições do ensaio. A atividade proteolítica foi calculada da seguinte maneira: UAP/mL = (∆ Abs 280nm x 10 x fator de diluição) / (E x t), onde E é o volume de enzima e t é o tempo da reação. 3.2.5.2 Quantificação do teor de proteína no EEB Para determinar a proteína celular das amostras foi utilizado o método de Lowry modificado por Hartree (1972). Primeiramente foram preparadas as seguintes soluções: Solução A: 2 g de tartarato de sódio e potássio tetra-hidratado (7 mM), 100 g de Na2CO3 (0,8 M), 500 mL NaOH 1N (0,5 M) e água destilada até completar 1 litro. Solução B: 2 g de tartarato de sódio e potássio tetra-hidratado (0,07 M), 1 g CuSO4.5H2O (0,04 M), 10 mL de NaOH 1N e 90 mL de água destilada. Solução C: diluído 1 mL de Folim-Ciocalteu em 15 mL de água destilada. Feito isso, em tubo de ensaio foi adicionado 1 mL do EEB (item 3.2.2.1) em 0,9 mL da solução A e incubado em banho termostático por 10 minutos a 50 °C. Esfriado em temperatura ambiente por 58 10 minutos. Então foi adicionado 0,1 mL da solução B ao tubo de ensaio e após 10 minutos em temperatura ambiente, 3 mL da solução C foram adicionados. Então após incubação por 10 minutos em banho termostático a 50 °C a amostra esfriou por 10 minutos em temperatura ambiente. A leitura da absorbância foi realizada em 650 nm. Foi preparada uma curva padrão de soroalbumina bovina nas concentrações de 0, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL. Seguiu-se o procedimento descrito anteriormente para cada uma das diluições e foi realizada a leitura da absorbância em 650 nm das mesmas. 3.3 Produção de Xilanases 3.3.1 Seleção do fungo Para a produção das xilanases, o fungo utilizado foi o termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b, microrganismo já empregado pelo grupo de pesquisa LBMA, e produtor dessas enzimas, já descrito anteriormente por Zanelato (2011) e Casciatori (2014). 3.3.2 Cultivo em estado sólido (CES) A primeira etapa da produção de xilanases consistiu no repique do fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b em ágar de aveia para reativação da cepa armazenada, como descrito anteriormente, incubada a 45 °C por 48 horas. Em seguida a superfície do meio de cultivo foi raspada com alça de platina e os esporos transferidos, como na etapa anterior, para erlenmeyers contendo 50 mL de meio Sabouraud inclinado e incubados a 45 °C por 48 horas, etapa esta denominada pré- inóculo. Posteriormente, os esporos foram suspendidos com auxílio de alça de platina 59 em solução nutriente, descrita a seguir, contados em Câmara de Neubauer e inoculados à concentração de 107 esporos por grama de substrato seco. Como substrato sólido para xilanases foi utilizado a mistura de (25,0 g de massa seca) de bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, na proporção 7:3 (p/p), à umidade de 75% (b.u.) e temperatura de 45 °C, por 96 horas em câmara DBO. O meio de cultivo foi acondicionado em embalagens de polipropileno, com dimensões de 25 cm x 30 cm e esterilizados a 121 °C por 20 minutos. A solução nutriente foi composta por: sulfato de amônio (1%, v/v); MAP (monofosfato de amônio) (3 g/L); cloreto de potássio (2 g/L); MgSO4 . 7H2O (0,5 g/L); CaCl2 (0.1 g/L) e Tween 80 (0,1%, v/v), ajustada a pH 5,0, sendo os três primeiros itens fertilizantes agrícolas adquiridos no comércio local. Após o período de incubação de 96 horas, a amostra foi retirada do climatizador DBO e adicionado 10 mL de tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,0 por grama de substrato seco, seguido por agitação por 30 minutos em agitador orbital, a 100 rpm, na temperatura de 45 ºC. A suspensão resultante foi filtrada em tecido voil, congelada em freezer doméstico a -12 ºC e utilizada como extrato enzimático bruto. 3.3.3 Determinação das atividades enzimáticas A atividade das xilanases foi determinada segundo Ghose (1987), com modificações, sendo os açúcares redutores, liberados pela ação enzimática a partir da reação entre 0,1 mL do extrato enzimático bruto e 0,9 mL de solução 1% (p/p) de xilana (de madeira de faia, SIGMA-ALDRICH), em solução tampão de acetato de sódio 0,1 M e pH 5,0. A reação foi mantida a 65 ºC por 10 minutos, sendo, interrompida pela adição de 1,0 mL do reagente DNS (ácido 3-5 dinitrosalicílico) para a quantificação dos açúcares redutores liberados, segundo Miller (1959). O açúcar redutor foi quantificado por espectrofotometria a 540 nm com base em uma curva padrão de 60 xilose. Uma unidade de atividade enzimática foi definida, como a quantidade de enzima requerida para liberar um μmol de açúcar redutor do substrato por minuto. A avaliação da atividade enzimática após a secagem em spray dryer foi realizada reconstituindo-se o pó, com base no teor de sólidos totais da formulação líquida. Essas avaliações enzimáticas foram feitas sempre no dia seguinte à secagem, tanto para as formulações líquidas como para os pós. 3.4 Ensaios de Secagem Os extratos enzimáticos brutos utilizados nesta etapa foram os descritos nos itens 3.3.2 e 3.2.2.2. Os EEB foram previamente descongelados e em seguida misturados em um mesmo béquer, para que então as próximas etapas descritas fossem feitas com EEB contendo fitases e xilanases. 3.4.1 Determinação do teor de sólidos As amostras foram analisadas em uma balança com lâmpada halogênia Ohaus MB- 45 (Toledo), onde o teor de umidade/sólidos foi mensurado por secagem em alta temperatura, que possui faixa de medição para umidade é de 0,01 a 100%, com precisão de leitura de 0,01%. O teor de sólidos do extrato enzimático bruto foi obtido logo após o descongelamento e a umidade dos pós imediatamente após a obtenção desses. 3.4.2 Secagem das enzimas por spray drying Os ensaios foram realizados no secador por nebulização, spray dryer, modelo MSD 0,5 (Labmaq do Brasil), mostrado na Figura 3.2 dotado de bico atomizador de duplo fluído com orifício de saída de 3,0 mm e câmara de secagem cilíndrica de vidro borossilicato, com 51 cm de altura e diâmetro interno de 13 cm, sendo a coleta dos pós 61 em um ciclone de alumínio. A temperatura de saída e a vazão de alimentação do líquido foram controladas. A operação foi iniciada com o aquecimento do gás de secagem, onde a temperatura de entrada do equipamento foi acondicionada à temperatura de saída. Após atingir temperatura desejada medida na saída da câmara de secagem, água destilada foi introduzida na alimentação do bico atomizador, na vazão pré-determinada para o experimento, até o equipamento entrar em estado permanente, sendo a água em seguida substituída pela amostra. Em todos os ensaios de secagem os parâmetros pressão do ar de atomização, vazão do ar de secagem e vazão do ar de atomização foram fixados em 6,5 Kgf/cm², 0,55 m³/min e 50 L/min, respectivamente. A suspensão de EEB e adjuvante foi mantida em constante agitação, à temperatura ambiente, com auxílio de um agitador magnético. Figura 3.2. Equipamento spray dryer MSD 0.5. 62 O efeito da secagem por spray dryer sobre as enzimas foi analisado através da atividade residual de atividade enzimática obtida após a secagem e a umidade dos pós imediatamente após o processo. 3.4.3 Secagem das enzimas por liofilização A suspensão de EEB e adjuvante foi congelado a -80 ºC por 24 horas antes do processo. O ensaio foi realizado em liofilizador modelo ThermoScientific RVT4104, Figura 3.3, que possui bomba de vácuo e duas armadilhas calibradas na temperatura de - 50 ºC e -105 ºC e pressão de 0,49 mbar. Figura 3.3. Liofilizador modelo ThermoScientific RVT4104. 3.4.4 Extração enzimática dos pós A fim de encontrar a melhor forma para a extração das enzimas após as secagens, foi adicionado tampão acetato de sódio a 0,05 M e pH 5,0 às amostras pulverulentas e o teor de sólidos das formulações foram reconstituídos. Então essas 63 foram mantidas sob agitação constante com auxílio de agitador magnético na temperatura de 4 ºC, por 3, 4, 5 e 6 horas. Após o tempo de extração, a suspensão foi centrifugada a 10000 x g, na temperatura de 5 ºC por 30 minutos e o sobrenadante utilizado como extrato enzimático. 3.5 Planejamentos Estatísticos 3.5.1 Discriminação dos adjuvantes Os adjuvantes escolhidos foram os produtos agroindustriais farelo de soja (FS), farelo de trigo (FT) e farelo de milho (FM), todos adquiridos no comércio local. Os farelos foram triturados em moinho de facas e posteriormente peneirados nos diâmetros 0,149 mm (FT e FM) e 0,50 mm (FS). Os adjuvantes foram imersos em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,0 por 1 hora e posteriormente, submetidos à ação de mixer industrial por 15 minutos. Após essas etapas, o adjuvante processado foi misturado com o EEB e a suspensão foi mantida em constante agitação, à temperatura ambiente, com auxílio de um agitador magnético, por 30 minutos, antes de ser submetida ao spray dryer. Uma alíquota da suspensão foi armazenada à temperatura de 4 ºC. O teste discriminativo seguiu um Planejamento Fatorial Multiníveis, com dois fatores: tipo de adjuvante (Adj) e temperatura de saída do ar de secagem (Tsaída). O fator adjuvante foi estudado em três níveis e a temperatura de saída em dois níveis, como pode ser visto na Tabela 3.2. A vazão de alimentação foi fixad