UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Thiago Henrique Meinicke Vieira Estudo da matriz na Leucemia Mieloide Crônica: Análise da expressão do Hialuronano (HA), das enzimas hialuronano sintases e do CD44 para predição de casos resistentes ao Imatinibe (IMB) Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Ciências – Área de Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Custódio Domingues Coorientador: Prof. Dr. Lucas Tadeu Bidinotto Botucatu 2025 Thiago Henrique Meinicke Vieira Estudo da matriz na Leucemia Mieloide Crônica: Análise da expressão do Hialuronano (HA), das enzimas hialuronano sintases e do CD44 para predição de casos resistentes ao Imatinibe (IMB) Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Ciências - Área de Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Custódio Domingues Coorientador: Prof. Dr. Lucas Tadeu Bidinotto Botucatu 2025 Vieira, Thiago Henrique Meinicke V658e Estudo da matriz na leucemia mieloide crônica: análise da expressão do hialuronano (HA), das enzimas hialuronano sintases e do CD44 para predição de casos resistentes ao Imatinibe (IMB) / Thiago Henrique Meinicke Vieira. -- Botucatu, 2025 111 f. : il., tabs., fotos Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Medicina, Botucatu Orientadora: Maria Aparecida Custódio Domingues Coorientador: Lucas Tadeu Bidinotto 1. Leucemia mieloide de fase crônica. 2. Medula óssea. 3. Imuno-histoquímica. 4. Ácido hialurônico. 5. Antígenos CD44. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Dados fornecidos pelo autor(a). Título da tese: Estudo da matriz na Leucemia Mieloide Crônica: Análise da expressão do Hialuronano (HA), das hialuronano sintases e do CD44 para predição de casos resistentes ao Imatinibe (IMB) Impacto científico esperado: Identificação de parâmetros morfológicos e/ ou imuno- histoquímicos a partir da análise de biópsias de medula óssea no momento do diagnóstico de LMC que sejam capazes de predizer o risco de desenvolvimento de quimiorresistência à terapia com inibidores de tirosina quinase. Impacto social: Redução da refratariedade à terapia com os inibidores de tirosina quinase e consequente prevenção do impacto negativo na qualidade de vida, sofrimento dos pacientes e desfecho desfavorável que a resistência ocasiona. Dessa forma, há manutenção da boa evolução clínica e sobrevida prolongada. Impacto econômico: A prevenção da deficiência de abastecimento e a redução do impacto financeiro no Sistema Único de Saúde são benefícios diretos da adoção de estratégias que otimizam o uso de inibidores de tirosina quinase, cuja disponibilidade é limitada. A identificação precoce de casos com potencial resistência permite uma mudança na conduta terapêutica, direcionando o tratamento para um inibidor mais potente e específico. Dessa forma, evita-se o uso sucessivo de múltiplos inibidores até a obtenção da resposta clínica adequada, garantindo a continuidade do fornecimento e minimizando prejuízos financeiros ao sistema público de saúde. Dedicatória ______________________________________________________________________ Dedico esta tese a: A meus pais Tania e Carlos, que sempre me apoiaram e incentivaram nos estudos durante toda a minha trajetória acadêmica. Continuo me inspirando em vocês e seguindo seus ensinamentos para ter sucesso e alcançar os meus objetivos. A minha irmã Vivian, minha grande amiga e companheira, que está sempre ao meu lado e me guia e fortalece nos momentos de que necessito. Aos meus amados avós Milda (in memorian), Cerly e João (in memorian) pelos quais sempre tive muito carinho, respeito e consideração. Agradecimentos ______________________________________________________________________ À Dra. Maria, minha orientadora, por todo o auxílio na elaboração e execução desse trabalho. Agradeço por estar sempre disponível para me atender seja durante o dia ou a noite. Seus conselhos, orientações e ensinamentos com certeza contribuíram para o meu amadurecimento como pesquisador. À Direção do Hospital de Amor Amazônia, por conceder em diversas ocasiões períodos de licença para que eu pudesse desenvolver esse trabalho com a dedicação e atenção necessárias. Às minhas amigas e colegas patologistas Flávia, Flora e Walquíria, que me ajudaram na coleta de dados, etapa fundamental para o desenvolvimento dessa pesquisa. Às minhas amigas e biomédicas Anayane, Letícia e Carla, que se empenharam para realizar as reações de imuno-histoquímica mesmo desconhecendo os protocolos dos anticorpos de pesquisa utilizados, e cortar os diversos blocos de parafina. Às minhas amigas Patrícia e Alenira, por realizarem as colorações de impregnação argêntica. Ao meu colega patologista Jefferson, por tornar possível realizar parte das reações de imuno-histoquímica em seu laboratório e por conceder permissão para fotografar as lâminas em seu microscópio. À minha amiga Cícera, pela ajuda na coleta dos dados iniciais. Aos colegas Eduardo e Fernando, pelos cortes dos diversos blocos de parafina. Epígrafe ______________________________________________________________________ ‘‘A felicidade pode ser encontrada inclusive nos momentos mais escuros; só é preciso se lembrar de acender a luz.’’ (J. K. Rowling, 2000) Resumo ______________________________________________________________________ Resumo Introdução: A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa clonal caracterizada pela expansão do setor mieloide a partir da célula-tronco pluripotente. Foi a primeira doença definida por metodologia citogenética através da identificação do cromossomo Philadelphia, originado a partir da t(9;22)(q34;q11.2). O desenvolvimento dos inibidores de tirosina quinase (ITQ) como Imatinibe (IMB) revolucionou a história natural da LMC, contudo uma porção dos pacientes apresenta resistência à terapia, sendo necessário o uso de ITQ mais potentes. A elucidação da patogênese da LMC a partir da compreensão do papel do remodelamento dos nichos da medula óssea pode contribuir para a identificação de preditores de risco aumentado de evolução para resistência. Objetivos: Analisar a expressão do hialuronano, das enzimas hialuronano sintases e do CD44 nos casos de LMC resistentes ao IMB juntamente com as características morfológicas da medula óssea; entender o papel desses marcadores no mecanismo de quimioressistência; identificar possíveis fatores preditores do risco de evolução para resistência. Materiais e métodos: Seleção de 161 pacientes com diagnóstico de LMC provenientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, Hospital de Amor de Barretos e Hospital de Amor Amazônia. Realizada divisão em 3 grupos: LMC resistente (116 casos), LMC não resistente (25 casos) e LMC intolerante (20 casos). Foram resgatadas as biópsias de medula óssea de cada grupo para análise morfológica e imuno- histoquímica com os marcadores CD44, hialuronano e hialuronano sintases (HAS1, HAS2 e HAS3). Resultados: A análise morfológica identificou que a presença de quantidade moderada de micromegacariócitos pode corresponder a um fator protetor contra a resistência. Na análise imuno-histoquímica, houve intensa expressão de CD44 no grupo resistente em fase crônica quando comparado com o grupo não resistente, no qual a intensidade de expressão foi baixa. Foi identificada perda de expressão de HAS2 celular nos nichos perivascular e peritrabecular na LMC resistente juntamente com ausência de expressão estromal como consequência da intensificação do remodelamento dos nichos na quimiorresistência. Conclusão: A resistência na LMC permanece um desafio terapêutico, apesar dos contínuos avanços no aprimoramento dos ITQ. O remodelamento dos nichos proporciona a manutenção da leucemogênese com desenvolvimento de resistência. A análise de CD44 e HAS2 em biópsias de medula óssea por exame imuno-histoquímico no momento do diagnóstico de LMC pode constituir uma abordagem eficaz na identificação de casos que evoluirão com resistência, evitando o impacto socioeconômico negativo que a quimiorresistência acarreta. Palavras chave: LMC, resistência, medula óssea, nicho, CD44, hialuronano, hialuronano sintases, remodelamento. Abstract ______________________________________________________________________ Abstract Introduction: Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative neoplasm characterized by the expansion of the myeloid sector from the pluripotent stem cell. It was the first defined disease by cytogenetic methodology through the identification of the Philadelphia chromosome, originating from t(9;22)(q34;q11.2). The development of tyrosine kinase inhibitors (TKI) such as Imatinib (IMB) revolutionized the natural history of CML, however, a portion of patients are resistant to therapy, which requires the use of more potent TKI. Elucidating the pathogenesis of CML by understanding the role of remodeling of bone marrow niches may contribute to the identification of predictors of increased risk of progression to resistance Objectives: Analyze the expression of hyaluronan, hyaluronan synthase enzymes and CD44 in cases of CML resistant to IMB together with the morphological characteristics of the bone marrow; understand the role of these markers in the chemoresistance mechanism; identify possible factors that predict the risk of progression to resistance. Materials and methods: Selection of 161 patients diagnosed with CML from the Hospital das Clínicas of Botucatu Medical School, Hospital de Amor de Barretos and Hospital de Amor Amazônia. Division into 3 groups: resistant CML (116 cases), non- resistant CML (25 cases) and intolerant CML (20 cases). Bone marrow biopsies from each group were retrieved for morphological and immunohistochemical analysis with the markers CD44, hyaluronan and hyaluronan synthases (HAS1, HAS2 and HAS3). Results: Morphological analysis identified that the presence of a moderate amount of micromegakaryocytes may correspond to a protective factor against resistance. In the immunohistochemical analysis there was intense expression of CD44 in the resistant group in the chronic phase compared to the non-resistant group in which the expression intensity was low. Loss of cellular HAS2 expression was identified in the perivascular and peritrabecular niches in resistant CML along with the absence of stromal expression as a consequence of the intensification of niche remodeling in chemoresistance. Conclusion: Resistance in CML remains a therapeutic challenge despite continuous advances in improving TKI. Niche remodeling provides maintenance of leukemogenesis with the development of resistance. The analysis of CD44 and HAS2 in bone marrow biopsies by immunohistochemical examination at the time of CML diagnosis may constitute an effective approach in identifying cases that will develop resistance, avoiding the negative socioeconomic impact that chemoresistance entails. Keywords: CML, resistance, bone marrow, niche, CD44, hyaluronan, hyaluronan synthases, remodeling. Lista de siglas e abreviaturas 4-UM: 4-methylumbelliferone AB: Domínio de ligação à actina ABL1: Abelson murine leukemia 1 ACA: Alterações citogenéticas adicionais AKT: Protein kinase B ATP: Adenosine triphosphate BAP1: BRCA1-associated protein 1 BAD: Bcl-2-associated death promoter BCL2: B-cell lymphoma 2 BCLxL: B-cell lymphoma-extra large BCR: Breakpoint cluster region CAR: CXCL12-abundant reticular CC: Domínio de oligomerização coil-coiled CDK6: Cyclin-dependent kinase 6 CDKN1A/B: Cyclin-dependent kinase 1A/B C/EBPα: CAAT enhancer binding protein α CSF3: Colony-stimulating factor 3 CTH: Células-tronco hematopoiéticas CXCR4: C-X-C chemokine receptor type 4 CXCL4: Platelet factor 4 CXCL12: C-X-C motif chemokine ligand 12 CXCL14: C-X-C motif chemokine ligand 14 DB: Domínio de ligação DNA: Ácido desoxirribonucleico EGFR: Epidermal growth factor receptor EUTOS: European treatment and outcome study ELTS: EUTOS Long-term survival EZH2: Enhancer of zeste 2 FC: Fase crônica FCA: Fase crônica de alto risco FDA: Food and drug administration FISH: Hibridização in situ fluorescente GAP: GTPase-activating protein G-CSF: Granulocyte colony stimulating factor GDP: Guanosine diphosphate G:E: Relação das séries granulocítica e eritroide GEF: Guanine nucleotide exchange factors GLUT1: Glucose transporter type 1 GMI-1271: E-selectin inhibitor Grb2: Growth factor receptor-bound protein 2 GTP: Guanosine triphosphate HA: Hialuronano HAS: Hialuronano sintase 1 HAS2: Hialuronano sintase 2 HAS3: Hialunorano sintase 3 HE: Hematoxilina-eosina HIF: Hypoxia-inducible factor HIF1α: Hypoxia-inducible factor 1-alpha IA: Impregnação argêntica ICAM-1: Intercellular adhesion molecule 1 IGH: Immunoglobulin heavy locus IL-1β: Interleukin-1β IL-6: Interleukin-6 IL-8: Interleukin-8 IMB: Imatinibe INCA: Instituto Nacional de Câncer IRIS: International randomized study of interferon ITQ: Inibidores de tirosina quinase IKZF1: IKAROS family zinc finger 1 JAK: Janus kinase Kb: Kilobases kDa: Kilodaltons KIT: KIT proto-oncogene, receptor tyrosine kinase LepR+: Leptin Receptor-expressing LLA: Leucemia linfoblástica aguda LMA: Leucemia mieloide aguda LMC: Leucemia mieloide crônica MAPK: Mitogen-activated protein kinases MDR1: Multidrug resistance protein 1 MF: Fibrose reticulínica miR-92a: microRNA 92a MO: Medula óssea Myc: MYC proto-oncogene, bHLH transcription factor NF-Κb: Nuclear Factor Kappa B NGS: Next-generation sequencing NK: Natural killer NTS: Nuclear translocation signal OB: Osteoblástico OCT1: Organic cation transporter-1 OMS: Organização Mundial da Saúde OPN: Osteopontina PAX5: Paired box 5 PKM2: Pyruvate kinase isoform M2 PDGFR: Platelet-derived growth factor PDGF: Platelet-derived growth factor PI-3kinase: Phosphatidylinositol 3-kinase Ph: Cromossomo Philadelphia PT: Peritrabecular PV: Perivascular RHAMM: hyaluronic acid-mediated motility: Rho: Ras homology RMM: Resposta molecular maior RNA: Ácido ribonucleico RNAm: RNA mensageiro RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction SCL/TAL1: Stem cell leukemia T-cell acute lymphoblastic leukemia-1 protein SCF: Stem cell factor SFRP 1/2: Secreted frizzled-related protein 1/2 SH1: Src homology 1 domain SH2: Src homology 2 domain SH3: Src homology 3 domain SIT1: Signaling threshold-regulating transmembrane adapter 1 STAT: Signal transducer and activator of transcription STK: Serine/threonine protein kinase TCR: T-cell receptor TGF-β: Transforming growth factor-β TNF: Tumor necrosis factor Tyr: Tyrosine VCAM-1: Vascular cell adhesion molecule-1 VEGF: Vascular endothelial growth factor VLA-4: Very late antigen-4 VLA-5: Very late antigen-5 Wnt5A: Wnt family member 5A Sumário Capítulo I ......................................................................................................................... 24 Revisão da Literatura ....................................................................................................... 25 1. Introdução ..................................................................................................................... 26 2. Perspectiva histórica .................................................................................................... 26 3. Epidemiologia .............................................................................................................. 27 4. Etiologia ........................................................................................................................ 28 5. História natural e manifestações clínicas ................................................................. 28 6. Estrutura molecular do gene BRC::ABL1 ................................................................ 30 7. Patogênese da LMC .................................................................................................... 33 8. Anormalidades citogenéticas adicionais (ACAs) .................................................... 35 9. Diagnóstico .......................................................................................................... 35 9.1 Considerações gerais ..................................................................................... 35 9.2 Citogenética clássica (cariótipo) .................................................................... 36 9.3 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ....................................................... 37 9.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................ 38 9.5 Biópsia de medula óssea (histopatologia da LMC) ....................................... 38 10. Tratamento ........................................................................................................... 40 10.1 Estratificação de risco .............................................................................. 40 10.2 Inibidores de tirosina quinase (ITQ) ........................................................ 41 10.3 Orientações para tratamento .................................................................... 42 10.4 Intolerância/ Toxicidade .......................................................................... 43 10.5 Alvos de tratamento ................................................................................. 43 10.6 Transplante de medula óssea ................................................................... 44 11. LMC resistente .................................................................................................... 45 12. Nichos da medula óssea ....................................................................................... 45 12.1 Introdução ................................................................................................ 45 12.2 Remodelamento dos nichos da medula óssea .......................................... 50 12.3 Remodelamento maligno dos nichos da medula óssea nas neoplasias .... 52 12.4 Remodelamento maligno dos nichos da medula óssea na LMC .............. 53 13. CD44 .................................................................................................................... 55 13.1 Estrutura molecular .................................................................................. 55 13.2 Funções biológicas ................................................................................... 56 13.3 CD44 nas neoplasias e na LMC ............................................................... 57 14. Hialuronano ......................................................................................................... 59 14.1 Estrutura molecular .................................................................................. 59 14.2 Funções biológicas ................................................................................... 60 14.3 Hialuronano nas neoplasias e na LMC .................................................... 60 15. Conclusão ............................................................................................................ 62 Referências ................................................................................................................................ 63 Capítulo II .................................................................................................................................. 74 Artigo Científico .............................................................................................................. 75 Resumo ................................................................................................................................ 76 1. Introdução ....................................................................................................................... 77 2. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 79 3. Resultados ....................................................................................................................... 81 4. Discussão ........................................................................................................................ 91 Referências ................................................................................................................ 96 Anexos ....................................................................................................................... 99 Conclusão final .............................................................................................................. 110 24 Capítulo I ______________________________________________________________________ 25 Revisão da Literatura ______________________________________________________________________ 26 1. Introdução A leucemia mieloide crônica (LMC) corresponde a uma neoplasia mieloproliferativa crônica maligna em que há a expansão clonal da célula-tronco hematopoiética pluripotente. Foi a primeira doença relacionada a uma anormalidade citogenética, caracterizada pela translocação t(9;22)(q34;q11.2), que origina o gene de fusão BCR::ABL1 com atividade constitutiva de tirosina quinase. A leucemogênese é desencadeada pela ativação anômala e contínua do ciclo celular independente da ação de citocinas aliada à geração de sinais apoptóticos aberrantes (1,2). 2. Perspectiva histórica Os primeiros registros de leucemia ocorreram no século XIX por volta de 1840 por David Craigie, John Hughes Bennet e Rudolph Virchow através de autópsias de pacientes com hepatoesplenomegalia, febre e leucocitose. Todos os casos apresentavam um aspecto incomum no sangue, que foi designado inicialmente como sangue espesso por Alfred Velpeau. Acreditava-se que essa característica era decorrente de etiologia infecciosa sendo atribuída posteriormente a descrição de purulento ao aspecto do sangue identificado nesses pacientes (3,4). Entretanto, somente em 1845 Virchow estabeleceu que a característica era decorrente de alterações hematopoiéticas que promoviam aumento na quantidade de células brancas no sangue, descrito assim como sangue branco e consagrando o termo leucemia em 1847, que foi reconhecida posteriormente como entidade distinta de natureza neoplásica. Em 1872, Ernst Neumann reconheceu que a origem da leucemia estava centrada na medula óssea (3,5,6). Com o desenvolvimento da coloração de panótico em 1891 por Paul Ehrlich, foi elaborada a classificação dos principais tipos de leucemia em virtude da caracterização detalhada das diferenças morfológicas entre as células mieloides e linfoides, sendo que até o momento a distinção era feita somente com base em células não coradas com formatos nucleares diferentes Em decorrência do advento das colorações citológicas, foi possível a identificação da LMC como entidade nosológica distinta, denominada de leucemia granulocítica crônica nesse momento (5). Aproximadamente meio século depois, a LMC foi associada à anormalidade cromossômica pelos citogeneticistas David Hungerford e Peter Nowell em 1960, por identificarem um pequeno cromossomo acrocêntrico alterado em dois casos de LMC, que 27 foi então chamado de cromossomo Philadelphia. Foi a primeira vez na história em que se estabeleceu associação entre uma doença oncológica e alteração cromossômica (3). Em 1973, com o advento das técnicas de bandeamento cromossômico, Janet Rowley concluiu que esse cromossomo era decorrente de uma translocação cromossômica equilibrada entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22, configurando a t(9;22)(q34;q11.2), o grande marco citogenético da LMC (3,7). Posteriormente, alterações citogenéticas foram identificadas na leucemia mieloide aguda. Os estudos citogenéticos então começaram a fornecer evidências de que as malignidades estavam relacionadas a perturbações genéticas nas células (5). O início da identificação do gene de fusão BCR::ABL1 ocorreu com a descoberta do oncogene v-Abl, por Herbert Abelson e Louise Rabstein em 1970, em um vírus murino capaz de induzir leucemia em camundongos. Em 1982, foi evidenciado que a translocação que originava o cromossomo Philadelphia envolvia a vertente humana normal do protooncogene c-Abl do cromossomo 9 para o cromossomo 22. No ano seguinte foi então descoberto o ponto de quebra no cromossomo 9 no gene ABL, que enolvia uma região genômica grande, e, em 1984, o ponto de quebra no cromossomo 22, que correspondia a uma região genômica relativamente pequena com agrupamento de 5,8 kb. A região foi denominada de breakpoint cluster region. Posteriormente, descobriu-se que essa região na verdade correspondia a uma porção específica de um gene, que foi então denominado de BCR (4,5,7). A partir da identificação dos pontos de quebra em ambos os cromossomos, foi possível, em 1985, a descoberta do produto de fusão BCR::ABL1 e constatação da atividade constitutiva de tirosina quinase (3,5). 3. Epidemiologia A LMC apresenta uma incidência anual mundial em torno de 1-2 casos por 100.000 habitantes com discreto predomínio no sexo masculino e idade média de acometimento em torno da quinta e sexta decádas de vida, podendo ocorrer em qualquer faixa etária inclusive na infância, embora seja incomum (8). No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou para o triênio 2023-2025 em 100.000 habitantes 11.540 casos novos de leucemia por ano, na região Sudeste 4.610 casos de leucemias e na região Norte 790 casos. No estado de São Paulo, a estimativa foi de 2.600 casos de leucemias e no estado de Rondônia 80 casos (9). 28 4. Etiologia Os fatores etiológicos são desconhecidos, porém a exposição à radiação ionizante constitui fator de risco conforme observado nos sobreviventes das explosões de bombas atômicas no Japão em 1945. O pico de incidência ocorre cerca de 5 a 12 anos após a exposição e é dose-dependente (8). 5. História natural e manifestações clínicas A LMC é habitualmente dividida em três fases (crônica, acelerada e crise blástica), que exibem diferentes apresentações clínicas e critérios diagnósticos (10). A fase crônica é caracterizada por um início insidioso em que aproximadamente 90- 95% dos pacientes são diagnosticados, sendo frequentemente assintomáticos até que a doença seja encontrada em exame físico de rotina ou através de hemograma evidenciando leucocitose. Os sinais e sintomas, quando presentes, são decorrentes de anemia e esplenomegalia e incluem principalmente fadiga, perda de peso, mal-estar, suores noturnos e dor no quadrante superior esquerdo. Manifestações raras incluem sangramentos, trombose, gota e priapismo. Esplenomegalia é o achado de exame físico mais encontrado enquanto que a hepatomegalia é menos frequente (3,10,11). Dependendo do volume da esplenomegalia, pode ocorrer compressão de vísceras ocas, resultando em distúrbios digestivos e saciedade precoce. É possível a ocorrência de infarto esplênico e, quando apresentar localização subcapsular, pode ocasionar dor devido à periesplenite (12). Linfadenopatia e infiltração da pele ou outros tecidos são raras e quando presentes sugerem fase acelerada ou crise blástica da LMC (10). Na história natural da LMC sem tratamento, há evolução da fase crônica para fases avançadas em um período de cerca de 3 a 5 anos após o diagnóstico (11). Na fase acelerada, a sintomatologia é mais severa e inclui dores ósseas, infiltração cutânea e agravamento da anemia e esplenomegalia. Febre, perda de peso, sudorese noturna, artralgia e dor abdominal também podem ocorrer (3,10,12). Na quinta edição da Organização Mundial da Saúde (OMS) para classificação dos tumores hematolinfoides, houve a omissão da fase acelerada, consolidando a doença como portadora de um curso bifásico caracterizado apenas pela fase crônica e crise 29 blástica. A justificativa consiste no fato de que o conceito de fase acelerada foi estabelecido no período em que o alvo terapêutico era a resposta hematológica, entretanto com o advento da terapia com os inibidores de tirosina quinase (ITQ) houve mudança nesse paradigma e hoje é notório o curso bifásico da doença. Contudo, deve-se ressaltar a importância do conceito referente às características de alto risco como nomenclatura alternativa para a fase acelerada visto que nessa nova edição foi introduzida a denominação de fase crônica de alto risco em substituição à fase acelerada. As características de alto risco correspondem em geral às mesmas características utilizadas anteriormente para definição da fase acelerada, sendo que essas características devem ser diferenciadas em relação ao momento de sua detecção, ou seja, se no momento do diagnóstico ou no decorrer do tratamento (11). As características que indicam risco aumentado de progressão de doença na fase crônica estão dispostas no Quadro 1 (11): Caractéristicas da fase crônica de alto risco Ao diagnóstico ou durante o tratamento ≥ 10% de blastos no sangue periférico e/ ou medula óssea ≥ 20% de basófilos no sangue periférico Anormalidades citogenéticas adicionais em células Ph+* Durante o tratamento Resistência aos inibidores de tirosina quinase Aparecimento de anormalidades citogenéticas adicionais** Mutações no domínio quinase de BCR::ABL1 Ph*: Cromossomo Philadelphia; Anormalidades citogenéticas adicionais**: rearranjo 3q26.2; monossomia do cromossomo 7, trissomia do cromossomo 8, rearranjo 11q23; isocromossomo 17q; trissomia do cromossomo 19; trissomia do cromossomo 21; cromossomo Philadelphia adicional e/ou cariótipo complexo definido como duas ou mais anormalidades cromossômicas adicionais. Fonte: WHO Classification of Tumours Editorial Board (2024). A crise blástica se manifesta como uma leucemia aguda e agravamento dos sintomas prévios. Pode ocorrer infiltração de qualquer sítio extramedular com predileção para baço, fígado, linfonodos, pele e partes moles (3). É incomum a manifestação primária da LMC em crise blástica, sendo necessário nessas situações o diagnóstico diferencial com a leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia linfoblástica aguda (LLA) visto que as estratégias terapêuticas são distintas. Alguns pacientes apresentam reversão para nova fase crônica após o tratamento (12). A crise blástica pode exibir fenótipos mieloide (70%), 30 pré-linfoide (25%) ou indeterminado (5%), sendo que o imunofenótipo B é mais comum que o T (13,14). Os critérios diagnósticos para a crise blástica da LMC estão dispostos no Quadro 2 (11): Fonte: WHO Classification of Tumours Editorial Board (2024). Anteriormente ao advento da terapia alvo, a LMC apresentava um curso bifásico ou trifásico, que consistia em uma fase crônica indolente inicial seguida para progressão para fase acelerada e/ou crise blástica, contudo após a terapia alvo, houve decréscimo na incidência de progressão para fases avançadas de modo que a média de sobrevida em 10 anos é em torno de 80-90% (11). A progressão para crise blástica contitui um processo complexo que envolve mutações somáticas e desregulação epigenética. A justificativa para a crise blástica poder apresentar fenótipo mieloide ou linfoide é que o BCR::ABL1 afeta a célula-tronco leucêmica. O aumento na expressão do oncogene está relacionado à parada da maturação, sendo que o aumento pode ser decorrente de uma segunda cópia do cromossomo Philadelphia (13). 6. Estrutura molecular do gene BCR::ABL1 O oncogene BCR::ABL1 é proveniente da translocação t(9;22)(q34;q11.2), que origina o cromossomo Philadelphia (15). Os pontos de quebra para que ocorra a translocação ocorrem preferencialmente nas regiões intrônicas dos genes ABL1 e BCR. No gene ABL1, as quebras ocorrem geralmente entre os éxons 1b e 1a, porém também podem ocorrer upstream do éxon 1b ou downstream do éxon 1a (16). A partir do ponto de quebra no gene BCR no cromossomo 22, podem ser originadas três isoformas de BCR::ABL1: 190 kDa, 210 kDa e 230 kDa (15,16). Os pontos de quebra ocorrem mais frequentemente na região M-bcr entre os éxons e13 e e14 ou entre e14 e e15. Também podem ocorrer quebras na região m-bcr entre os éxons e1 e e2, e na região µ-bcr entre os éxons e19 e e20. A ampla variedade de recombinações de BCR e ABL1 resulta em uma variedade de híbridos de RNAm (16). Os transcritos alternativos e13a2/e14a2 (ou b2a2/b3a2) são provenientes da justaposição dos éxons 13 ou 14 de BCR (localizados na região M-bcr) com o éxon 2 de Critérios diagnósticos para a crise blástica da LMC Detecção de ≥ 20% de blastos mieloides no sangue periférico ou medula óssea, ou Presença de proliferação blástica extramedular, ou Detecção de linfoblastos no sangue periférico ou medula óssea (mesmo que < 10%) 31 ABL1, produzindo uma proteína de 210 kDa, identificada em mais de 90% dos casos de LMC, sendo portanto a isoforma característica da doença (16,17). A isoforma e14a2 possui 25 aminoácidos a mais do que a isoforma e13a2 devido aos aminoácidos adicionais que são codificados pelo éxon 14 de BCR, sendo que essa corresponde à isoforma predominante. Aproximadamente 10% dos casos expressam ambas isoformas (18). O transcrito e1a2, proveniente da justaposição do éxon e1 de BCR localizado na região m- bcr com o éxon a2 de ABL1, está relacionado à isoforma p190, que é infrequente na LMC, porém comum na LLA. A proteína p230, isoforma rara encontrada na LMC, é originária do transcrito e19a2, proveniente da justaposição do éxon e19 de BCR localizado na região µ-bcr com o éxon a2 de ABL1. Foi descrito inicialmente em associação com leucemia neutrofílica crônica e raramente está presente na LMC (16,17). A Figura 1 ilustra os diferentes transcritos encontrados nas leucemias Ph+ (19). Figura 1 - A estrutura normal dos genes BCR e ABL1 e os diferentes transcritos encontrados nas leucemias Ph+. Diferentes pontos de quebra resultam nas isoformas p190, p210 e p230. Os pontos de quebra no gene ABL1 geralmente ocorrem nos íntrons entre os éxons 1b e 1a, evidenciados pelas setas verticais. Os pontos de quebra no gene BCR na LMC geralmente ocorrem entre os éxons e13 (b2) e e14 (b3) ou entre e14 (b3) e e15 (b4) ns região M-bcr, conforme evidenciado 32 pelas setas verticais. Na maioria dos casos de LLA Ph+, o ponto de quebra ocorre entre os éxons e1 e e2 na região m-bcr, conforme evidenciado pela seta vertical. Quatro possíveis transcritos de RNAm de BCR::ABL1 estão dispostos abaixo. Os dois primeiros (e13a2 e e14a2, respectivamente) são característicos de LMC. O transcrito e1a2 é identificado na maioria dos casos de LLA Ph+ e o transcrito e19a2 raramente é observado na LMC. Fonte: Mughal et al. (2016). Na porção N-terminal de BCR há um domínio responsável pela oligomerização e ativação constitutiva de BCR::ABL1. Em ABL1, são preservados os domínios SH1, SH2 e SH3 sendo que o domínio SH1 contém o sítio catalítico responsável pela iniciação das vias de sinalização que resultam em proliferação celular desordenada e resistência à apoptose (15). A Figura 2 ilustra a estrutura de BCR::ABL1 (15). Figura 2 – Representação esquemática da estrutura linear de BCR::ABL1 em sua isoforma p210 evidenciando os domínios de BCR e ABL na proteína: CC (domínio de oligomerização coil- coiled); STK (domínio serina/treonina quinase); domínio Rho/GEF; SH (domínios de homologia SRC) 1, 2 e 3; NTS (sinal de translocação nuclear); DB (domínio de ligação ao DNA); AB (domínio de ligação à actina). Fonte: Amarante-Mendes et al. (2022). A região BCR é responsável pela regulação da atividade enzimática e fornece sítios de ligação. O domínio coil-coil da porção N-terminal de BCR proporciona oligomerização e ativação constitutiva de BCR::ABL1. O componente ABL1 contém um domínio SH2, um domínio SH3 e um domínio de quinase. A proteína ABL1, quando não fusionada à BCR, apresenta um domínio miristolado N-terminal, que resulta em autoinibição da atividade de quinase, entretanto esse domínio é perdido quando ocorre a fusão. O domínio de quinase de BCR::ABL1 apresenta motivadores chave responsáveis por sua atividade como a alça ligante de fosfato (p-loop), o sítio de contato (ATP/IM), o domínio catalítico e a alça de ativação (A-loop). A ativação de BCR::ABL1 ocorre quando o ATP se liga ao domínio quinase de ABL1 e transfere um grupamento fosfato para o substrato ABL1. Os inibidores de tirosina quinase competem pelo sítio de ligação do ATP (17,20). A perda do domínio autoinibitório miristolado N-terminal contribui para a ativação constitutiva de BCR::ABL1. A ativação ainda é potencializada pelo domínio de 33 oligomerização coiled-coil, localizado na porção N-terminal de BCR::ABL1. Outra contribuição de BCR para a leucemogênese é a presença de um resíduo de tirosina no aminoácido na posição 177 (Tyr-177), que é fosforilado. Há interação com os domínios SH2 e SH3, resultando em ativação de vias de sinalização (21). Os 2 motivadores chave do primeiro éxon de BCR são a tirosina 177 e o domínio coiled- coil envolvendo os aminoácidos 1 a 63. A tirosina 177 fosforilada forma um sítio de ligação para Grb-2 (uma molécula adaptadora que conecta o BCR à via RAS), contribuindo dessa forma para a indução da leucemogênese. O domínio coiled-coil é importante para a dimerização de BCR::ABL1, que é necessária para a ativação da tirosina quinase de ABL1 e oncogenecidade de BCR::ABL1 (22-24). 7. Patogênese da LMC O principal mecanismo através do qual o oncogene BCR::ABL1 é responsável por ocasionar a leucemogênese consiste em uma cascata de vias de sinalização dependentes de tirosina quinase. A ativação de BCR::ABL1 se inicia a partir da dimerização ou tetramerização proporcionada pelo domínio coiled-coil. Após a dimerização, ocorre a autofosforilação por uma tirosina regulatória no loop de ativação de quinase em ABL1, que é seguida pela fosforilação do domínio SH2. Dessa forma, há aumento no número de resíduos de fosfotirosina na proteína BCR::ABL1 e consequentemente aumento dos sítios de ligação para domínios homólogos como por exemplo SH2 em que proteínas se associam para ativação de vias de sinalização celular. A partir da fosforilação de SH2 ocorre a ruptura da interação inibitória existente entre SH2 e SH3, resultando em ativação completa da atividade de quinase de BCR::ABL1 e formação de clones neoplásicos (15,22,25). Há ativação de vias de sinalização como RAS/MAPK, JAK-STAT e PI-3 quinase, que resultam em transformação e proliferação celulares (26). A ativação da via RAS/ MAPK ocorre inicialmente a partir da autofosforilação da tirosina 177, que gera um sítio de ligação para a molécula adaptadora Grb-2 no domínio SH2. Consequentemente, há a conversão da forma inativa de Ras vinculada ao GDP para a forma ativa associada ao GTP. O resultado final é a ativação de uma cascata de sinalização pela via MAPK, ocasionando proliferação celular desordenada (22). 34 Também por intermédio da interação com o domínio SH2, ocorre ativação da via JAK, que é uma via responsável pela regulação do ciclo celular e proliferação celular. A partir da associação direta entre as proteínas STATs e o domínio SH2, ocorre a ativação da via JAK com formação do complexo JAK-STAT e desregulação da proliferação celular (15,27). A ativação da via PI3K/AKT promove aumento da sobrevida celular através de mecanismos antiapoptóticos a partir da fosforilação de proteínas como Bcl2 e Bcl-xL. O BCR::ABL1 promove o bloqueio da liberação do citocromo C pela mitocôndria. Em condições habituais, a liberação é necessária para a ativação da caspase-3 e início do processo de apoptose. A ativação da via PI-3 quinase aciona a proteína Akt, que possui atividade antiapoptótica. Um substrato de Akt é a proteína proapoptótica Bad. Na via da apoptose, Bad se liga às proteínas Bcl-2 e Bcl-xL, inibindo-as e gerando morte celular. A partir da fosforilação de Bad por Akt há um bloqueio na ligação de Bad a essas proteínas com consequente supressão da apoptose (22,28). Logo, a resistência à apoptose é decorrente do bloqueio mitocondrial na liberação do citocromo C para o citoplasma e consequente inativação de caspases efetoras. Como não ocorre a liberação do citocromo C, as caspases não são ativadas e a via de sinalização de morte celular programada não é iniciada. O aumento na sobrevida além de promover a perpetuação do clone maligno ainda propicia condições para obtenção de mutações sequenciais (15). O protooncogene Myc também é alvo de BCR::ABL1. Myc converte sinais de estímulo à mitose em alterações de expressão gênica sendo que seus alvos incluem genes relacionados ao ciclo celular e apoptose. A partir da interação entre o domínio SH2 de BCR::ABL1 e a porção C-terminal com Myc e em associação com Jak2, há a ativação completa de Myc e consequente estabelecimento de atividade oncogênica (22,29). Há sinais independentes de atividade de tirosina quinase do BCR::ABL1, que permitem a sobrevivência das células neoplásicas, resultando em outro mecanismo que justifique a transformação maligna. Foi demonstrado que o bloqueio da atividade catalítica não ocasiona a completa dissociação do complexo molecular do cromossomo Philadelphia, justificando dessa forma a resistência desenvolvida aos inibidores de tirosina quinase em uma parcela de casos. Há geração de eventos sinalizadores, que asseguram a sobrevivência das células neoplásicas mesmo na ausência de atividade de tirosina quinase conforme é observado em casos de resistência ao Imatinibe (IMB) (15,30). 35 8. Anormalidades citogenéticas adicionais (ACAs) A maioria das ACAs correspondem a alterações cromossômicas não balanceadas e podem ser divididas em rota maior e rota menor. As alterações de rota maior são trissomia do cromossomo (8+), isocromossomo 17q (i17q), trissomia do cromossomo 19 (19+) e um segundo cromossomo Philadelphia (Ph+). As alterações de rota menor incluem perda do cromossomo Y (-Y), monossomia do cromossomo 7 (-7), monossomia do cromossomo 17 (-17), trissomia do cromossomo 21 (+21) e t(3;21)(q26;q22) (31,32). A divisão das ACAs em rota maior e rota menor foi estabelecida em 1993 com base na frequência em que eram detectadas na fase acelerada e crise blástica. Posteriormente, estudos demonstraram que as anormalidades de rota maior estão associadas com impacto negativo na sobrevida, no entanto foi constatado que algumas alterações de rota menor conferem alto risco como por exemplo o rearranjo 3q26, que está associado com resistência aos ITQs e mau prognóstico (13,33). As anormalidades cromossômicas mais comuns em ordem de frequência são: trissomia do cromossomo 8 (34%), segundo cromossomo Philadelphia (30%), isocromossomo 17q (20%), trissomia do cromossomo 19 (13%), perda do cromossomo Y (8%), trissomia do cromossomo 21 (7%), monossomia do cromossomo 17 (5%) e monossomia do cromossomo 7 (5%) (31,32). A presença de ACAs de rota maior ao diagnóstico indica risco de progressão de doença e configura critério para a fase crônica de alto risco/ fase acelerada. A presença de ACAs de rota maior ou rota menor no decorrer do tratamento também configura critério de fase acelerada, pois indica evolução clonal e falha terapêutica (9,11,34). 9. Diagnóstico 9.1 Considerações gerais A maioria dos pacientes é assintomática e o diagnóstico ocorre a partir de exames rotineiros evidenciando leucocitose persistente e inexplicada. A investigação diagnóstica deve então ser iniciada pela anamnese e exame físico com especial atenção à presença de hepatoesplenomegalia. A avaliação laboratorial inicial é realizada através do hemograma, que evidencia leucocitose em geral superior a 25.000/ mm³. A contagem diferencial evidencia acentuada granulocitose com desvio à esquerda, caracterizada por neutrófilos 36 em diversos estágios de maturação, aumento de mielócitos, metamielócitos sem displasia. Anemia e basofilia assim como plaquetopenia ou plaquetose podem estar presentes no momento do diagnóstico (3,35). O aspirado de medula óssea é necessário para a avaliação citogenética e mielograma. O mielograma fornece informações necessárias para a definição da fase em que a doença se encontra a partir da contagem de blastos e basófilos (1). 9.2 Citogenética clássica (cariótipo) O diagnóstico da LMC consiste na identificação citogenética do cromossomo Philadelphia e molecular do transcrito BCR::ABL1 (1). A citogenética clássica por intermédio do cariótipo constitui a técnica padrão ouro para evidenciar a presença do cromossomo Philadelphia em ≥ 95% das metáfases analisadas em uma quantidade mínima recomendada de 20 metáfases. Dessa forma, é essencial para o diagnóstico e também para a identificação de alterações citogenéticas adicionais, que podem implicar em pior prognóstico, sendo que o cariótipo corresponde à única técnica de rotina capaz de identificá-las. Preferencialmente, o cariótipo deve ser realizado no material obtido através do aspirado medular, contudo é possível a realização no sangue periférico exceto se a indicação for para monitoramento da doença em que deve ser feito apenas no aspirado de medula óssea (3,18,26). O exame apresenta limitações pelo fato de ser um procedimento invasivo devido à necessidade de realização de aspirado medular e pela ausência de obtenção de metáfases suficientes em aproximadamente 5% das amostras (18,26). A Figura 3 abaixo ilustra um cariótipo com presença do cromossomo Philadelphia (26). 37 Figura 3: Cariótipo de um paciente do sexo masculino com presença do cromossomo Philadelphia originado como resultado da translocação recíproca entre o braço longo do cromossomo 9 na região 3 banda 4 e o braço longo do cromossomo 22 na região 1 banda 1. 46,XY,t(9;22)(q34;q11). Fonte: Ankathil et al. (2020). Em 90% dos casos é observada a translocação característica, entretanto em aproximadamente 5% é detectado um cromossomo Philadelphia variante, envolvendo outros cromossomos além dos cromossomos 9 e 22. O prognóstico e a resposta ao tratamento com ITQ nesses casos são semelhantes aos casos em que a translocação é clássica (1,26). 9.3 Hibridização in situ fluorescente (FISH) O exame de hibridização in situ fluorescente (FISH) consiste em uma técnica de citogenética molecular capaz de detectar essencialmente todos os tipos de rearranjo do BCR::ABL1 independente do ponto de quebra, entretanto não é possível a identificação de alterações citogenéticas adicionais visto que são utilizadas sondas específicas para a translocação t(9;22) (18). Em alguns centros, a técnica de FISH é utilizada de maneira rotineira para o diagnóstico de LMC enquanto que o cariótipo é destinado à detecção de anormalidades citogenéticas 38 adicionais, entretanto pode ser o exame alternativo caso não haja número suficiente de metáfases na análise do cariótipo ou quando as metáfases apresentam baixa qualidade, inviabilizando a correta avaliação citogenética (18,26). 9.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a detecção e monitoramento dos níveis do oncogene. Na LMC, é utilizada a RT-PCR (reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa), que consiste em técnica adequada para o diagnóstico visto que detecta o transcrito do gene de fusão, que pode ser qualitativa ou quantitativa. Se for empregada na forma qualitativa, o objetivo é o diagnóstico de LMC a partir da constatação do transcrito de fusão do gene BCR::ABL1 enquanto que a forma quantitativa é utilizada para monitoramento dos níveis dos transcritos no decorrer da terapia. O princípio de ambas as formas é o mesmo com a diferença de que na RT-PCR quantitativa a quantificação dos níveis dos transcritos é feita por intermédio da mensuração da emissão de fluorescência durante a PCR (1,26). 9.5 Biópsia de medula óssea (histopatologia da LMC) A biópsia de medula óssea na LMC em fase crônica exibe hipercelularidade global e acentuada hiperplasia granulocítica com manutenção da diferenciação e perda das células adiposas. Não deve ser observada displasia nessa linhagem. Frequentemente é constatado um aumento na quantidade de granulócitos imaturos peritrabeculares, formando camadas em torno de 5-10 células ao contrário de uma medula óssea normal em que são observadas camadas contendo apenas em torno de 2-3 células (11,36,37). A maturação granulocítica ocorre em direção ao centro dos espaços intertrabeculares de forma que é possível a presença de eventuais blastos entre as células granulocíticas maduras no meio dos espaços intertrabeculares, entretanto a presença de agregados de blastos nessa localização não é característica da fase crônica (11,38). Eosinofilia e basofilia podem ser identificadas (11,36). A série eritroide é tipicamente hipocelular, porém morfologicamente normal com maturação preservada. Diante da hipercelularidade granulocítica e hipocelularidade eritroide, a relação G:E é aumentada (37,38). A série megacariocítica é hipercelular com presença de formas pequenas e hipossegmentadas, caracterizando os ‘’megacariócitos anões’’, entretanto não correspondem aos verdadeiros micromegacariócitos observados na neoplasia mielodisplásica. A presença de numerosos micromegacariócitos semelhantes aos 39 observados na neoplasia mielodisplásica deve levantar a suspeita para progressão de doença (11,38). Pode ocorrer a formação de pequenos agrupamentos de megacariócitos e identificação de formas ectópicas isoladas peritrabeculares (37). Em aproximadamente 30% dos casos, são identificadas as células pseudo-Gaucher, que correspondem a macrófagos grandes com citoplasma xantomatoso e núcleo excêntrico lobulado (36,37). Essas células contêm glicolipídios fagocitados e hemossiderina, decorrente do elevado turnover celular provocado pela doença. São carreadoras do gene BCR::ABL1 por serem progenitoras da célula-tronco leucêmica (37,38). Aumento no número de mastócitos e plasmócitos em localização perivascular é frequentemente visto (37). A fibrose reticulínica pode ser identificada em torno de 30% dos casos, correlacionando-se com a quantidade de megacariócitos, contudo a fibrose acentuada é incomum. Raramente a fibrose reticulínica é significativa a ponto de ocasionar confusão diagnóstica com mielofibrose primária (11,13,37). O aumento na deposição de fibras reticulínicas pode estar presente no momento do diagnóstico, entretanto é mais frequente na fase acelerada e na crise blástica (37). Os blastos tipicamente perfazem menos de 5% da celularidade medular de forma que quantidades superiores a 10% indicam progressão para fases subsequentes (38). A biópsia de medula óssea pode ser realizada para identificar eventuais ninhos de blastos que não foram visualizados no mielograma quando o esfregaço é insuficiente ou subótimo (13). Foram descritos dois subtipos de LMC: Gran e Gran-Meg. O subtipo Gran é caracterizado por proliferação granulocítica com ausência ou diminuição na quantidade de megacariócitos enquanto que o subtipo Gran-Meg apresenta proliferação granulocítica e megacariocítica, sendo que os megacariócitos são ectópicos e polimórficos com presença de formas pequenas e micromegacariócitos. Os subtipos apresentam história natural e prognóstico distintos de modo que no subtipo Gran a sobrevida é menor com progressão para crise blástica enquanto que no subtipo Gran-Meg a sobrevida é maior com tendência à progressão para mielofibrose (39). Os fatores prognósticos descritos na fase crônica anteriormente à introdução da terapia com ITQ eram número de megacariócitos, grau de fibrose reticulínica e a proporção de precursores eritroides, que isoladamente se correlacionavam com melhor prognóstico (37). 40 A fibrose reticulínica na era pré-ITQ estava relacionada a um pior desfecho, entretanto atualmente o significado é incerto (38). Na fase acelerada, as alterações displásicas podem existir em qualquer linhagem, sendo evidentes na linhagem megacariocítica, que exibe agrupamentos de pequenos megacariócitos inclusive verdadeiros micromegacariócitos juntamente com aumento significativo da trama reticulínica. Há elevação na quantidade de blastos, compreendendo o intervalo de 10-19% na medula óssea ou sangue periférico (38,40,41). A biópsia de medula óssea em crise blástica exibe geralmente agregados difusos de blastos, porém pode haver infiltração focal. Os blastos apresentam um nucléolo único proeminente e significativo pleomorfismo. A mielofibrose é detectada em aproximadamente 40% dos casos nessa fase, tornando o aspirado insuficiente e sendo necessária a realização de biópsia para o diagnóstico de crise blástica (11,37). A presença de ≥ 20% de blastos mieloides é necessária para o diagnóstico de crise blástica na medula óssea ou sangue periférico enquanto que a detecção de linfoblastos mesmo que < 10% na medula óssea ou sangue periférico também configura critério diagnóstico (11). Majoritariamente, os blastos são de origem mieloide, entretanto em cerca de 20% a 30% dos casos a origem é linfoide de predomínio B, sendo que há relatos de linfoblastos de origens T e NK. É possível a ocorrência de crise blástica de fenótipo misto, caracterizada pela presença de blastos mieloides e linfoides simultaneamente (38). 10. Tratamento 10.1 Estratificação do risco O primeiro escore de estratificação de risco desenvolvido foi o de Sokal, em 1984. Foi elaborado na era pré-ITQ em que o tratamento consistia essencialmente em quimioterapia. Compreende os seguintes parâmetros: idade, contagem de blastos, contagem plaquetária e tamanho do baço. Os resultados possíveis são < 0,8; 0,8-1,2 e >1,2 e correspondem, respectivamente, às categorias baixo, intermediário e alto risco. O objetivo é a predição da probabilidade de sobrevida global nos três diferentes grupos (13,42). Posteriormente, foi criado o escore Euro, em 1998, que avalia a sobrevida global com base no tratamento com interferon alfa. Em 2011, foi elaborado o escore EUTOS 41 (European Treatment and Outcome Study) baseando-se no tratamento com IMB. Esse escore determina dois grupos com diferentes probabilidades de obter resposta citogenética completa após 18 meses de tratamento (42). Em 2016, o escore ELTS (EUTOS Long-Term Survival) foi desenvolvido, sendo o escore mais moderno e que considera que com o advento da terapia com os ITQ, os óbitos ocorrem em decorrência de causas secundárias não relacionadas diretamente à LMC. Os parâmetros utilizados são os mesmos que no escore Sokal e as categorias resultantes são baixo, intermediário e alto risco. O objetivo é determinar o risco de óbito relacionado à LMC em três grupos distintos (13,42). Vários estudos demonstraram que o escore ELTS é superior em identificar as populações de alto risco, é melhor preditor em relação ao risco de óbito decorrente de LMC e também de se obter as respostas citogenética completa e molecular maior. Portanto, atualmente é o escore preferencialmente recomendado (13,43). 10.2 – Inibidores de tirosina quinase (ITQ) O tratamento padrão para a LMC consiste na administração de ITQ, que correspondem a pequenas moléculas, também utilizadas para tratamento de tumores sólidos. O desenvolvimento da terapia com base nos ITQ na LMC resultou em um acentuado aumento na sobrevida semelhante ao de indivíduos saudáveis, ressaltando dessa forma a importância da terapia alvo. Anteriormente à descoberta dos ITQ, a LMC era fatal a longo prazo (44,45). Diferem entre si em relação à potência, atividade contra as mutações em BCR::ABL1, farmacocinética e efeitos adversos (13). O IMB é a opção inicial de tratamento da LMC com exceção dos casos diagnosticados durante a gestação visto que os ITQ são teratogênicos. No início do tratamento, pode ser utilizada hidroxiureia em pacientes sintomáticos com altas contagens leucocitárias ou plaquetárias enquanto a confirmação citogenética e molecular está pendente. O IMB corresponde a um ITQ de primeira geração, que se liga à forma inativa do BCR::ABL1. Atua através da inibição competitiva do sítio de ligação do ATP no domínio de quinase subsequentemente bloqueando a habilidade do BCR::ABL1 de fosforilar os resíduos de tirosina (44-46), conforme demonstrado na Figura 4 abaixo (47). 42 Figura 4 – Representação esquemática do mecanismo de ação do IMB. (A) A molécula de ATP ocupa o seu sítio de ligação na porção ABL da oncoproteína BCR::ABL e promove a fosforilação do substrato, que então se dissocia e efetua contato funcional com a molécula efetora, ativando a via de sinalização intracelular, que ocasiona a leucemogênese. (B) O IMB compete pelo sítio de ligação do ATP de forma que, quando está ligado, impede a fosforilação do substrato, bloqueando consequentemente a ativação da via de sinalização pela molécula efetora. Fonte: Mughal et al. (2006). Foi o primeiro inibidor de tirosina quinase a ser aprovado para uso nos Estados Unidos pelo FDA (Food and drug administration) em 2001, iniciando a terapia alvo para câncer com o uso de ITQ (44,46). Os inibidores de segunda geração são mais potentes do que o IMB e incluem: Dasatinibe, Nilotinibe e Bosutinibe. O Ponatinibe é um inibidor de tirosina quinase de terceira geração, sendo mais potente do que todos os outros anteriormente descritos. O uso está destinado aos pacientes com a mutação T315I ou com resistência a dois ou mais ITQ (46). 10.3 Orientações para tratamento No diagnóstico inicial, a escolha do ITQ a ser utilizado depende do objetivo do tratamento, idade, presença de comorbidades, escores de Sokal e ELTS, custo e disponibilidade da medicação (1,13). Os principais objetivos da terapia são normalização 43 da sobrevida e obtenção de resposta molecular profunda prolongada (2). Para primeira linha de tratamento em fase crônica estão disponíveis IMB e os inibidores de segunda geração (Dasatinibe, Nilotinibe e Bosutinibe), sendo que todos os inibidores de segunda geração são superiores ao IMB e a superioridade é mais evidente nos grupos de alto risco (13). Se a LMC for diagnosticada em fase crônica de alto risco, a recomendação para o tratamento inicial é pelos inibidores de segunda geração preferencialmente o Dasatinibe (48). Na crise blástica podem ser utilizados ITQ de segunda geração ou terceira geração com ou sem quimioterapia para alcançar a segunda fase crônica e então realizar o transplante de medula óssea alogênico (1,3,49). A escolha da quimioterapia depende do tipo de crise blástica, se mieloide ou linfoide. Na crise blástica linfoide, podem ser utilizados protocolos para LLA com vincristina e prednisona enquanto que na crise blástica mieloide os protocolos são semelhantes aos utilizados para LMA e envolvem antraciclina e citarabina (3,48,50). Para todos os pacientes em fase crônica de alto risco ou crise blástica o transplante alogênico deve ser considerado (48). 10.4 - Intolerância/ Toxicidade A intolerância à terapia ocorre na presença de efeitos colaterais que não podem ser manejados a partir da redução da dose do medicamento ou tratamento dos sintomas, resultando em interrupção do tratamento atual e substituição por outro ITQ (51). Cada ITQ apresenta perfis de toxicidade distintos, sendo necessária ponderação no momento de escolha para tratamento. A maioria é bem tolerada e na presença de toxicidade, o reajuste da dose geralmente normaliza o quadro (1). 10.5 - Alvos do tratamento O objetivo do tratamento da LMC é obtenção de respostas hematológica, citogenética e molecular maior de longa duração. A resposta hematológica completa é definida como contagens leucocitária e plaquetária normais e desaparecimento dos sintomas relacionados à LMC. A resposta hematológica parcial é definida como um decréscimo na contagem leucocitária inferior a 50% do valor inicial anterior ao tratamento ou normalização dos níveis de leucócitos, porém com esplenomegalia persistente ou presença de blastos no sangue periférico (14). 44 A resposta citogenética, avaliada preferencialmente pelo cariótipo, é mensurada a partir da quantificação de células Ph+ remanescentes após a implementação da terapia. Divide- se em completa, parcial, minor e mínima. A resposta citogenética completa é definida como ausência de metáfases Ph+ nas células da medula óssea. Na resposta citogenética parcial são encontradas de 1 a 35% de células Ph+ enquanto que na resposta citogenética minor há entre 36%-65% de células Ph+. Na resposta citogenética mínima há 66%-95% de células Ph+ (13,36). A resposta molecular, avaliada através da técnica de PCR quantitativo, é mensurada com base no descréscimo na quantidade de células contendo a oncoproteína p210. Divide- se em resposta molecular precoce, resposta molecular maior e resposta molecular profunda/ indetectável. Na resposta molecular precoce os níveis de BCR::ABL1 são iguais ou inferiores a 10% em 3 a 6 meses após o início do tratamento, ou seja, houve uma redução de 90% ou mais na quantidade de células leucêmicas. Uma resposta molecular de BCR::ABL1 ≤ 1% é equivalente à resposta citogenética completa. Na resposta molecular maior (RMM ou MR3), há um decréscimo de BCR::ABL1 para 0,1% (BCR- ABL1 ≤ 0,1%). A resposta molecular profunda (RM4, RM4,5 ou RM5)/ indetectável ocorre quando os níveis da oncoproteína são iguais ou inferiores a 0,01% (BCR::ABL1 ≤ 0,01%). A expressão resposta molecular completa deve ser evitada e substituída pelo termo leucemia molecularmente indetectável (LMI) (14,18,46). 10.6 – Transplante de medula óssea O transplante de medula óssea com células-tronco alogênico é destinado aos casos com resistência ou intolerância a múltiplos ITQ. Falha de resposta com Ponatinibe após 3 meses de tratamento indica alto risco de progressão e também constitui critério para transplante. Outras indicações incluem diagnóstico já em fase crônica de alto risco e sem resposta adequada ao tratamento, progressão para fase crônica de alto risco em vigência de tratamento, diagnóstico inicial ou progressão para crise blástica (1,46). Nesse contexto, o transplante deve ser realizado assim que uma segunda fase crônica for atingida visto que o desfecho é melhor na fase crônica do que se efetuado na fase crônica de alto risco ou crise blástica (13). 45 11. LMC resistente A LMC pode apresentar resistência primária ou secundária. A resistência primária refere-se à ausência de resposta hematológica, citogenética ou molecular nas etapas iniciais do tratamento enquanto que a resistência secundária ocorre quando há perda de resposta prévia (52,53). A incidência de resistência é em torno de 10% em 10 anos de tratamento, ou seja, 1% ao ano (54). Diante de falha no tratamento, deve ser investigada a causa. Dessa forma, é necessário averiguar se a adesão à medicação está adequada e se há alguma interação medicamentosa visto que pode interferir na absorção e metabolismo dos ITQ. A falta de adesão à medicação pode ser decorrente da presença de efeitos colaterais. Após a exclusão dessas possíveis causas, uma avaliação completa de resistência deve ser efetuada e inclui: exame físico, hemograma, mielograma, biópsia de medula óssea, cariótipo de medula óssea e pesquisa de mutação no gene BCR::ABL1 (13). Dessa forma, deve ser efetuada nova avaliação medular para confirmação da fase da doença e existência de alterações citogenéticas adicionais juntamente com a troca para um inibidor de tirosina quinase de segunda geração (1). Os mecanismos de resistência aos ITQ podem ser dependentes ou independentes de ABL1. A resistência independente de ABL1 é mais comumente vista na resistência primária e compreende instabilidade genômica, quiescência de células-tronco leucêmicas e processos biológicos que interferem com a biodisponibilidade dos ITQ, resultando em baixos níveis plasmáticos. Há ativação de vias de sinalização alternativas no contexto de inibição eficaz de BCR::ABL1 que ocasionam resistência. A resistência secundária envolve mecanismos dependentes de BCR::ABL1 que são capazes de subverter a inibição eficaz do oncogene e incluem mutações em BCR::ABL1, amplificação gênica e aumento da expressão (52,53). 12 - Nichos da medula óssea 12.1 - Introdução As células-tronco hematopoiéticas (CTH) possuem capacidade evolutiva intrínseca de autorrenovação e diferenciação em todas as linhagens hematopoiéticas com o propósito de manter a dinâmica da produção sanguínea. No início da década de 70, foi proposto que 46 o microambiente local da medula óssea, denominado de nicho, fornecia importantes estímulos para a autorrenovação e diferenciação das CTH. Em 1978, a hipótese foi oficialmente formulada por Ray Schofield, que estabeleceu que o nicho é responsável pelo controle da quiescência e entrada das CTH no ciclo celular ao fornecer informações a respeito do estado funcional do organismo e, consequentemente, definindo o destino das CTH em direção à autorrenovação ou diferenciação (55). De acordo com Schofield, o nicho deve fornecer sinais autócrinos, endócrinos e parácrinos para que as CTH se renovem ou se diferenciem durante a hematopoiese. São descritos dois nichos: osteoblástico (endosteal) e perivascular (56,57). Os métodos de comunicação celular dentro dos nichos ocorrem através de contato celular direto e por intermédio de ligação via receptores de superfície (56). As CTH estão presentes em ambos os nichos de modo que são reguladas funcionalmente por mecanismos distintos. O nicho endosteal está localizado ao redor da superfície óssea, sendo habitado por osteoblastos, osteoclastos, osteócitos, células estromais mesenquimais e células T reguladoras ao passo que no nicho perivascular são encontradas células endoteliais sinusoidais, pericitos e células de Schwann não mielinizadas. Outro tipo celular que faz parte do microambiente medular é a célula adiposa, que está distribuída ao longo da medula óssea (56,57). O Quadro 3 indica os principais tipos celulares encontrados nos nichos com os respectivos fatores secretados/ expressos e sua função (56). 47 Tipos celulares e o papel nos nichos da medula óssea Não hematopoiéticos Fatores secretados ou expressos Função nos nichos Osteoblastos CSF3, Osteopontina/CD44 . Controle da expansão das CTH e autorrenovação . Regulação das CTH: endereçamento, quiescência e mobilização Osteócitos CSF3 . Regulação dos osteoblastos Células mesenquimais CXCL12, SCF . Diferenciação em osteoblastos, condrócitos e adipócitos . Potencializa a diferenciação das CTH e manutenção Células CAR CXCL12 . Manutenção das CTH . Manutenção dos progenitores linfoides Células de Schwann não mielinizadas TGFβ . Quiescência das CTH Sistema nervoso simpático Catecolaminas . Controle da liberação circadiana das CTH Adipócitos Adiponectina . Regulação negativa da homeostasia Células endoteliais E-selectina, P-selectina, VCAM-1 . Manutenção das CTH . Aumento da quiescência e autorrenovação das CTH Hematopoiéticos Fatores secretados ou expressos Função nos nichos Osteoclastos Enzimas proteolíticas . Manutenção das cavidades do nicho osteoblástico . Mobilização das CTH Macrófagos Prostaglandina E2, Oncostatina M . Mobilização das CTH . Retenção das CTH no nicho osteoblástico . Promoção de eritropoiese Linfócitos - . Regulação do crescimento das CTH . Papel importante de células T reguladoras na tolerância imunológica CAR: CXCL12-abundant reticular. Fonte: Khattab et al. (2024). 48 Na região perissinusoidal, as CTH são mantidas em um estado menos quiescente pela ação de CXCL12 e do fator de célula-tronco (SCF) por células endoteliais e células reticulares com abundante CXCL12 (CAR). No nicho endosteal, as CTH são mantidas em estado de quiescência a partir da interação dos tipos celulares que nele residem. As células mesenquimais estromais de ambos os nichos apresentam semelhanças, porém foi proposto que as células estromais mesenquimais endosteais promovem a quiescência das CTH e as células estromais perivasculares incentivam a proliferação das CTH (57,58). A população de células mesenquimais apresenta uma estreita relação nos nichos visto que as células estromais mesenquimais se diferenciam nas linhagens adipocítica, condrogênica e osteogênica, entretanto as diferentes células progenitoras podem exercer efeitos distintos sobre as CTH como, por exemplo, os adipócitos, que são fonte de SCF e atuam na manutenção das CTH, mas também podem atuar como reguladores negativos por inibirem a formação de sinusoides. Os osteoblastos, por sua vez, atuam sobre as CTH através do controle da expansão, quiescência e mobilização (56,59). Existe uma relação funcional entre o nicho endosteal e as CTH visto que osteoblastos secretam o fator estimulador do crescimento de colônicas granulocíticas (G-CSF) e osteopontina (OPN), que promovem a manutenção na quantidade de células progenitoras CD34+ na medula óssea. As CTH se deslocam na medula óssea através da secreção de CXCL12/CXCR4 e VCAM-1/VLA-4 por osteoblastos e ação de fibras nervosas simpáticas, logo desempenham função de endereçamento das CTH na medula óssea e retenção no nicho endosteal (57). As células endoteliais e estromais perivasculares promovem a manutenção das CTH. As células endoteliais da medula óssea são responsáveis pela produção de fatores que asseguram a manutenção e regeneração das CTH como SCF e CXCL12. As células estromais LepR+ também produzem essas proteínas, assegurando a homeostasia das CTH (58). 49 A Figura 5 ilustra o microambiente da medula óssea (60). Figura 5: Representação dos nichos da medula óssea. O microambiente medular é constituído por diferentes populações celulares, que contribuem de maneira coordenada para a regulação da hematopoiese a partir da interação entre os nichos osteoblástico e perivascular. Fonte: Krause et al. (2015). Muitas células modulam diretamente ou indiretamente as CTH e os nichos por mecanismos distintos das células endoteliais e estromais perivasculares. A redução na quantidade de monócitos e células dendríticas ocasiona a mobilização das CTH devido à modificação na expressão de CXCL12 pelas células estromais e mudança na permeabilidade das células endoteliais. Uma parcela de macrófagos proporciona a quiescência das CTH a partir da liberação de TGF-β assim como os megacariócitos, que estão localizados na região perivascular próximo às CTH e exercem influência sobre os nichos através da produção da citocina CXCL4, que inibe a proliferação das CTH, e TGF- β, que as mantém em estado quiescente (55,58). A arquitetura da medula óssea é fundamental para a integridade do comportamento das CTH de modo que a localização precisa dos diferentes tipos celulares nos nichos exerce influência sobre as CTH, especificamente no estado de quiescência (59,61). Estudos experimentais em que o remodelamento dos nichos foi induzido a partir da deleção de 50 tipos celulares como células LepR+, megacariócitos e células de Schwann, demonstraram declínio da hematopoiese e, a longo prazo, falência medular. Logo, constata-se que os diferentes tipos celulares exercem coletivamente influência sobre o funcionamento das CTH (59,62,63). Algumas células precursoras de determinadas linhagens apresentam localizações específicas no microambiente medular. Há progenitores linfoides que residem próximo à região endosteal onde dependem de CXCL12, produzido por osteoblastos enquanto que há uma parcela de progenitores linfoides que reside próximo de arteríolas para obtenção de SCF, produzido por células estromais LepR+. Progeniores eritroides estão localizados adjacente aos sinusoides onde também dependem de SCF, produzido por células LepR+ (58). Em condições estáveis do organismo, os níveis das CTH e a liberação de células hematopoiéticas na corrente sanguínea apresentam oscilações circadianas no decorrer do dia e da noite em virtude da produção de CXCL12 pelos nichos. Foram observadas flutuações circadianas nos níveis de norepinefrina e TNF, que ocasionam aumento temporário na quantidade de melatonina e espécies reativas de oxigênio nos compartimentos medulares (59,64). A melatonina promove autorrenovação das CTH e protege as células estromais dos nichos dos efeitos tóxicos negativos provocados pelas espécies reativas de oxigênio (59,65). Logo, foi constatado que os nichos oscilam entre um estado de estresse inflamatório, ocasionado pelo aumento de TNF e espécies reativas de oxigênio, e um estado livre de estresse, evidenciando um papel importante da melatonina na proteção dos nichos, que estão em constante equilíbrio dinâmico diário (59). 12.2 – Remodelamento dos nichos da medula óssea O remodelamento dos nichos pode ocorrer através de uma resposta frente a um estresse agudo ou crônico, tratamento citotóxico, infecções e malignidades. Essas condições podem gerar a liberação de citocinas proinflamatórias, que recrutam as CTH quiescentes para o ciclo celular com consequente remodelamento do nicho perivascular (59,66). A resposta dos nichos diante de um evento estressor como por exemplo presença de lipopolissacárides, produzidos por infecção bacteriana, pode ser evidenciada no recrutamento das CTH quiescentes para entrada no ciclo celular e diferenciação (59,67). Posteriormente, há a saída de neutrófilos da medula óssea, acompanhada de remodelamento da vasculatura sinusoidal (59). A irradiação de corpo inteiro, outro evento 51 estressor, afeta as células estromais dos nichos, pois são altamente sensíveis à irradiação, no entanto ocorre rápida recuperação devido à mobilização dos megacariócitos remanescentes para o nicho osteoblástico (59,68). A partir desse povoamento na superfície do nicho, é observado aumento na linhagem osteoblástica, restaurando a configuração e constituição do nicho a partir da mobilização das CTH. Paralelamente à recuperação osteoblástica, há dilatação e congestão da vasculatura sinusoidal acompanhada de progressivo decréscimo e degeneração adiposa subsequente (59,69). A desregulação nos nichos também pode ser desencadeada pelo envelhecimento e malignidades hematológicas crônicas como neoplasia mielodisplásica e neoplasias mieloproliferativas, que cursam com hematopoiese ineficaz (59,70). Atualmente, não é bem compreendido quais os tipos celulares estão envolvidos no mecanismo de desregulação da homeostasia das CTH, impactando na sua sobrevivência e geração de clones malignos. Dessa forma, torna-se evidente a complexidade morfológica e funcional dos nichos da medula óssea assim como a possibilidade de serem alvos terapêuticos para interferir no suprimento de estados patológicos (59,71). O processo de envelhecimento constitui um fator de risco importante para o decréscimo funcional das CTH e desenvolvimento de malignidades hematológicas (59). O envelhecimento desencadeia o remodelamento crônico dos nichos devido a um aumento nas células adiposas e redução das células osteogênicas (72). O desbalanço ocorre pela reprogramação dos precursores mesenquimais em direção à diferenciação adiposa associado à senescência estromal (59,73). Nesse contexto, o remodelamento altera a diferenciação celular, podendo resultar em aumento da mielopoiese, trombopoiese e hematopoiese clonal. Logo, há risco aumentado para o desenvolvimento de neoplasias mieloides no contexto de envelhecimento, porém é desconhecida a conexão precisa entre remodelamento dos nichos, expansão mieloide, hematopoiese clonal e ocorrência de malignidades hematológicas crônicas (59). No transplante de medula óssea, há agressão dos nichos pelas medicações citotóxicas utilizadas e irradiação. São desconhecidos quais mecanismos dos nichos afetam a longo prazo a taxa de sucesso dos transplantes, contudo sabe-se que fatores como Sfrp1/2 e Wnt5a, que não atuam na manutenção do equilíbrio dos nichos de maneira significativa em condições habituais, são necessários para o sucesso da regeneração das CTH quiescentes. Dessa forma, o conjunto de proteínas envolvidas na restauração dos nichos 52 após o transplante difere das proteínas envolvidas essencialmente na homeostase dos nichos em condições fisiológicas (59,74,75). Perturbações no nicho podem ocasionar colapso hematopoiético com transformação maligna e desenvolvimento de leucemia a partir da mudança no comportamento das CTH (55,59). As células-tronco leucêmicas possuem a capacidade de converter nichos saudáveis em malignos para promover a sua sobrevivência e proliferação, logo usufruem dos nichos da medula óssea para evadir da morte celular provocada pela quimioterapia, ocasionando, consequentemente, quimioressistência (56). As células-tronco leucêmicas agravam a desregulação da hematopoiese devido à criação de seu próprio microambiente, voltado para a manutenção das células neoplásicas e incapaz de fornecer os sinais necessários para promover a manutenção das CTH normais e hematopoiese (59). 12.3 – Remodelamento maligno dos nichos da medula óssea nas neoplasias A transformação maligna ocasionada pela desregulação dos nichos é um processo gradual aliado à produção de citocinas inflamatórias e fatores de crescimento, que como resultado promovem mielopoiese às custas da manutenção das CTH (76). Diante do contexto neoplásico, a microarquitetura dos nichos é distorcida com alterações osteopênicas conforme demonstrado por estudos histológicos nas neoplasias mielodisplásicas e neoplasias mieloproliferativas (59,77). Não são completamente conhecidos os mecanismos responsáveis pela distorção arquitetural dos nichos, mas foi demonstrado que os nichos promovem a manutenção das células malignas por intermédio da via inflamatória NFκΒ, que gera ativação estromal, e da produção de citocinas proinflamatórias como IL6 e TGFβ1. Constatou-se em culturas que as células mesenquimais estromais nas neoplasias mielodisplásicas e neoplasias mieloproliferativas apresentam alterações inflamatórias em comparação às células mesenquimais estromais saudáveis, evidenciando que a inflamação estromal está relacionada ao remodelamento (78-80). As células endoteliais no nicho perivascular reduzem a transformação proinflamatória das células estromais, desencadeando, portanto, um efeito protetor na manutenção da hematopoiese. Em compensação, a permeabilidade vascular está significativamente aumentada na LMA de modo que o direcionamento de alvos terapêuticos contra a produção de espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico aumenta a resposta à quimioterapia (81,82). Nas neoplasias mieloproliferativas, a ativação constitutiva da via 53 NFκΒ resulta em sobrevivência das células oncogênicas nos nichos, logo a utilização de terapias direcionadas contra essa via ocasiona morte das células malignas e consequente restauração dos nichos. Dessa forma, o estudo aprofundado dos nichos pode levar ao desenvolvimento de terapias alvo capazes de restabelecer o microambiente medular necessário para a manutenção das CTH e eliminar os nichos malignos remodelados (59,83). 12.4 - Remodelamento maligno dos nichos da medula óssea na LMC A terapia com ITQ é eficaz no tratamento da LMC, contudo com frequência não ocorre a erradicação das células-tronco leucêmicas e, consequentemente, há recidiva e persistência da doença. Acredita-se que um dos motivos para a persistência dessas células seja devido aos nichos medulares funcionalmente alterados, que conferem proteção a elas. Os nichos são remodelados para conferirem aporte às células-tronco leucêmicas, contribuindo dessa forma com a sua manutenção. Paralelamente, o microambiente medular se torna hostil para as CTH normais (76,84). Durante a progressão leucêmica, as células neoplásicas são capazes de reprogramar o seu nicho com o intuito de intensificar a proliferação desordenada e comprometer a hematopoiese normal. Estudos demonstram que fatores mesenquimais derivados do nicho como CXCL12, Wnt e IL-1 promovem a manutenção do estado de quiescência das células-tronco leucêmicas, protegendo-as consequentemente da ação dos ITQ. A superexpressão de citocinas inflamatórias como TNF-α em associação com quimiocinas provenientes do nicho remodelado proporciona às células-tronco leucêmicas uma vantagem proliferativa em relação às CTH normais (76,85,86). Na LMC, a desregulação molecular dos nichos foi demonstrada a partir da constatação da redução da quimiocina CXCL14 no compartimento estromal da medula óssea por Dolinska et al (2023). A restauração da expressão de CXCL14 resultou em supressão da manutenção das células-tronco leucêmicas e potencializou a ação dos ITQ. Logo, CXCL14 pode corresponder a um novo alvo terapêutico na LMC (76). As selectinas e integrinas são proteínas envolvidas no processo de endereçamento e adesão das CTH. A expressão de integrinas permite que as CTH se liguem à VCAM-1 no endotélio da medula óssea e à fibronectina na matriz extracelular. Integrinas como VLA4 e VLA5 interagem com E-selectina e P-selectina, expressas constitutivamente na superfície do endotélio. CXCL12 corresponde a uma quimiocina com função de quimiotaxia para as CTH através de seu receptor CXCR4 juntamente com as integrinas 54 β1 e β2. Por intermédio dessas múltiplas interações, ocorre o endereçamento e adesão das CTH (87). Foi demonstrado que as células-tronco leucêmicas apresentam diversas anormalidades nas moléculas de adesão. Apresentam a integrina β1 disfuncional, que provoca diminuição da adesão ao estroma, contudo não há decréscimo na expressão de VLA4 e VLA5. Devido à perda de função da integrina β1, as células-tronco leucêmicas podem se redistribuir no sangue periférico e em outros órgãos, provocando infiltração extramedular (88). Há expressão reduzida de CXCR4 e quimiotaxia deficiente por CXCL12. A partir de mecanismos alternativos, as células-tronco leucêmicas são capazes de aderir e permanecer na medula óssea, apesar da perda de funcionalidade dessas moléculas de adesão (87,89). A E-selectina, uma molécula de adesão expressa em células endoteliais e ativada por citocinas, é uma das principais proteínas do nicho perivascular e juntamente com o seu ligante CD44 promove a adesão das células-tronco leucêmicas no nicho (90). Na LMC, foi demonstrado que a interrupção da interação entre a E-selectina e CD44 com as células- tronco leucêmicas impede a ligação ao endotélio e juntamente com a associação ao uso de IMB há maior erradicação das células malignas em comparação com o uso de IMB isolado (87). Observou-se que há interação entre as células-tronco leucêmicas e o nicho perivascular a partir de experimentos com camundongos tratados com um inibidor de E-selectina (GMI-1271) visto que nesses animais houve redução da interação entre essas células e o endotélio. As células leucêmicas apresentavam uma localização distante do nicho perivascular quando foram tratadas com GMI-1271 e IMB simultaneamente. Foi constatado ainda aumento na sobrevida, redução nos clones leucêmicos, prejuízo ao endereçamento das células-tronco leucêmicas na medula óssea e baço, e redução esplênica (87). A reprogramação das funções celulares dos nichos pode ser ocasionada pela liberação pelas células neoplásicas de exossomos (vesículas de comunicação) contendo microRNAs e anfiregulina, que são direcionados às células estromais adjacentes (88,91). A partir da transferência de miR-92a, há ativação da via de sinalização SRC, que induz a fosforilação de AKT e geração de sinais oncogênicos por BCR::ABL1. A secreção através de exossomos de anfiregulina eleva a adesão das células-tronco leucêmicas e 55 sobrevivência por ativação da via do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Também ocorre aumento na secreção de IL-8, que estimula as células endoteliais a aumentarem a expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e VCAM-1, consequentemente elevando a adesão das células-tronco leucêmicas na região endotelial (88,92). A presença de áreas hipóxicas na medula óssea constitui regiões do microambiente favoráveis devido aos níveis aumentados de fatores indutores de hipóxia (HIF), que são importantes para a proliferação, quiescência, resistência aos ITQ e sobrevivência das células-tronco leucêmicas. Nas regiões medulares hipóxicas, é observado aumento na transformação das CTH em células-tronco leucêmicas. Logo, o microambiente hipóxico é favorável às células-tronco leucêmicas (88,93). 13 - CD44 13.1 – Estrutura molecular CD44 corresponde a uma glicoproteína multiestrutural e multifuncional, que apresenta duas isoformas: CD44s (isoforma padrão) e CD44v (isoforma variante). O gene responsável pela codificação de CD44 está localizado no cromossomo 11p13. Esse gene apresenta dois conjuntos de éxons, sendo um constante e o outro variável. O conjunto constante compreende os éxons 1-5 e 16-20, que são processados em conjunto através de splicing e originam o transcrito, que resulta na isoforma CD44s. O conjunto de éxons variáveis compreende os éxons 6-15, que são processados de modo alternativo (splicing alternativo) e inseridos junto aos éxons do conjunto padrão, originando diferentes combinações de transcritos, que resultam na isorfoma CD44v (94,95). A estrutura gênica de CD44 está representada na Figura 6 (96). 56 Figura 6: Estrutura gênica de CD44. A isoforma CD44s é codificada pelos éxons 1-5 e 16-20 enquanto que a isoforma variante (CD44v) sofre splicing alternativo envolvendo os éxons 6-15. Fonte: Szatanek et al. (2021). É uma glicoproteína transmembrana com peso molecular de 80-100 kDa, localizada predominantemente na região extracelular. A porção carboxiterminal da proteína está localizada na região intracelular e interage com o citoesqueleto da célula através do domínio citoplasmático enquanto que a extremidade amino-terminal está localizada na região extracelular e interage com o microambiente incluindo o seu ligante mais específico: hialuronano (HA) (94,95). A isoforma padrão (CD44s) é expressa em diversos tecidos como pele, fígado, pâncreas e pulmões. A isoforma variante (CD44v) apresenta uma distribuição restrita a queratinócitos, linfócitos ativados, macrófagos, estômago, bexiga e cérvice uterina (94,95). A estrutura molecular de CD44 em suas formas padrão (CD44s) e variante (CD44v) está representada na Figura 7 (96). Figura 7: Estrutura molecular de CD44 em suas formas padrão (CD44s) e variante (CD44v). Fonte: Szatanek et al. (2021). 13.2 - Funções biológicas CD44 apresenta múltiplas funções, que incluem adesão celular (agregação e migração), endereçamento e sinalização celulares. A justificativa para a multifuncionalidade proteica é o processamento alternativo do pré-RNAm (splicing alternativo) juntamente com 57 modificações pós-traducionais nos sítios de ligação da proteína como fosforilação, glicosilação e adição de glicosaminoglicanos (94,96). A principal função é relacionada à adesão, que permite a interação entre células ou entre célula e matriz extracelular. É característico o aumento na expressão de CD44 em linfócitos T ativados após contato antigênico. Nesse contexto, há a adesão de linfócitos T ao endotélio vascular por meio de seu ligante, HA, resultando desse modo em extravasamento linfocitário para os sítios de inflamação (94,96). A função de endereçamento é executada por CD44 localizado na superfície de linfócitos visto que interage com a proteína adressina, presente nas vênulas de endotélio alto nas placas de Peyer, e direciona a migração dos linfócitos para os linfonodos (94). A sinalização celular mediada por CD44 é exemplificada a partir da emissão de sinais inicializadores de proliferação para as linhagens hematopoiéticas, contribuindo consequentemente para a mielopoiese e linfopoiese (94). Foi demonstrado que o bloqueio de CD44s em camundongos inibe a linfopoiese a longo prazo em culturas de medula óssea e também inibe o endereçamento de linfócitos T precursores aos linfonodos e timo (97). Na medula óssea, o CD44 é altamente expresso nas CTH, especialmente naquelas localizadas no nicho osteoblástico, e em precursores eritroides, porém a expressão reduz à medida que ocorre o amadurecimento da linhagem. O CD44 promove regulação das CTH e do microambiente influenciando na composição da matriz extracelular, captura e liberação de citocinas/quimiocinas, ancoragem proteica ao citoesqueleto e consequente transdução de sinal, e degradação por clivagem proteolítica da matriz extracelular repercutindo dessa forma na adesão, endereçamento, migração e quiescência (97). O CD44s constitui o receptor mais comum de HA, sendo que atua no seu metabolismo através da síntese e degradação (97). CD44 é importante para a manutenção das CTH no nicho osteoblástico, pois sintetizam e expressam HA. A expressão de HA associada à sua interação com CD44 e as CTH se correlaciona com a migração seletiva das CTH em direção ao nicho osteoblástico. Desse modo, CD44 e HA são importantes no endereçamento das CTH no microambiente medular (98). 13.3 – CD44 nas neoplasias e na LMC A interação entre CD44 e HA possibilita o desenvolvimento e crescimento tumorais. As células tumorais que expressam CD44 se relacionam com a matriz extracelular através 58 de seus ligantes como HA, fibronectina, osteopontina e colágeno, resultando em colonização eficaz. Acredita-se que a isoforma CD44s esteja envolvida com a ocorrência de invasão tumoral e metástases devido à função de adesão à matriz extracelular (94). A ligação entre CD44 e HA promove ativação de vias de sinalização como PI3 kinase-AKT, resultando em invasão tumoral, proliferação e quimiorresistência. Dessa forma, a inibição farmacológica de CD44 tem sido relacionada ao aumento da sensibilidade à quimioterapia nas células tumorais (99). Os carcinomas que se originam em epitélios contendo CD44v na superfície, em geral, mantém a sua expressão inclusive em altas concentrações, porém os achados apresentam variações como por exemplo nos carcinomas escamosos pulmonares, que expressam CD44 enquanto que nos demais tipos histológicos a expressão é baixa ou ausente. Em carcinomas pancreáticos foi observada a presença da variante CD44 v6, que também é encontrada no epitélio ductal pancreático habitual. A mesma variante também é observada nos carcinomas colorretais. A expressão em sarcomas também é variável visto que no sarcoma epitelioide e angiossarcoma há alta expressão de CD44 enquanto que no lipossarcoma e sarcoma de células claras a expressão é baixa (94). As células neoplásicas no câncer de mama expressam CD44s e CD44v, que foram relacionados ao aumento da capacidade de progressão de doença e potencial metastático. A colocalização de CD44 e HA nos sinusoides da medula óssea, que correspondem a um sítio de metástase para o câncer de mama, pode estar relacionada à ocorrência de metástases ósseas. Logo, a interação CD44-HA sugere um potencial alvo terapêutico para redução das metástases ósseas (95). Na LMC, a inibição de E-selectina resulta em ausência de adesão e aumento da expressão do produto do protooncogene SCL/TAL1 nas células leucêmicas. Esse gene é um regulador transcricional negativo da expressão de CD44 de modo que a superexpressão gênica resulta em aumento de sobrevida. A proteína SCL-TAL1 é um alvo indireto de fosforilação por BCR::ABL1 (89). Foi demonstrado por Godovarthy et al. (2020) que as células leucêmicas apresentam elevada quantidade de CD44 em comparação às células saudáveis e quando as células BCR::ABL1+ foram tratadas com o inibidor de E-selectina (GMI-1271) isolado ou associado ao IMB houve um aumento de células nas fases G2-S-M do ciclo celular e decréscimo nas células na fase G0, logo as células tratadas entraram no ciclo celular. Aliado a esse fato, foi observado aumento na ciclina promotora do ciclo celular CDK6 e diminuição na expressão do inibidor do ciclo, 59 p16. Além disso, a proteína SCL-TAL1 foi fosforilada por BCR::ABL1 através da via AKT com consequente redução na expressão de CD44, diminuição da adesão ao nicho perivascular e entrada no ciclo celular (87). Foi observada alta expressão de CD44 em células com a mutação T315I, correlacionando-se com aumento na ligação à E-selectina e maior quantidade de células aderentes à matriz na fase G0. Os achados sugerem, portanto, que a elevada expressão de CD44 e aumento da ligação à E-selectina podem contribuir para a quiescência das células-tronco leucêmicas e resistência aos ITQ (89). 14. Hialuronano 14.1 – Estrutura molecular O hialuronano ou ácido hialurônico (HA) é um componente abundante da matriz extracelular, correspondendo a um polissacarídeo não sulfatado, pertencente aos glicosaminoglicanos, que são constituídos por unidades repetidas de dissacarídeos. O HA é originado a partir de repetições de ácido glicurônico e N-acetilglicosamina com formação de ligações glicosídicas alternadas (94,95,100). A estrutura do HA está representada na Figura 8 (100). Figura 8: Representação esquemática do HA constituído por unidades dissacarídicas repetidas de ácido glicurônico e N-acetilglicosamina. Fonte: Passi et al. (2019). 60 14.2 – Funções biológicas A função biológica depende do seu peso molecular. Em seu estado conformacional nativo, apresenta peso molecular em torno de 1.000 kDa, exibindo atividades antiangiogênicas, antiinflamatórias e de inibição proliferativa. Há uma apresentação conformacional alternativa em que possui peso molecular abaixo de 500 kDa. Nessa forma exibe atividade angiogênica e proliferativa além de estimular a migração celular e resposta imune (95,96). Ao contrário dos demais glicosaminoglicanos, é sintetizado por três hialuronano sintases (HAS1, HAS2 e HAS3) na porção interna da membrana plasmática e não no complexo de Golgi. Posteriormente, é secretado para o meio extracelular, onde contribui para a organização tissular e processos importantes como migração, proliferação e sobrevivência celulares (96). As formas com diferentes pesos moleculares apresentam atividade diferencial na velocidade de síntese e no tamanho da proteína produzida, sendo que as isoformas de hialuronano sintase 1 e 2 (HAS1 e HAS2) produzem HAs com pesos moleculares maiores do que HAS3 (101,102). Existem diversos receptores que reconhecem o HA em suas diferentes conformações com pesos moleculares distintos de modo que o CD44, tanto na sua forma padrão quanto na variante, é o principal ligante (96). Na medula óssea, o HA é importante para o microambiente, pois está relacionado ao endereçamento das CTH no nicho osteoblástico assim como à proliferação e diferenciação das CTH (97). É capaz de estimular diretamente a produção de citocinas pelas células hematopoiéticas, sendo dessa forma uma relevante molécula indutora de sinais para a hematopoiese. Goncharova et al. (2012) evidenciaram que a inibição de HA na medula óssea resulta em descréscimo na hematopoiese e redução na capacidade do microambiente de recrutar CTH. Os achados demonstram um papel regulatório importante do HA como um componente biologicamente ativo e integral do microambiente hematopoiético (103). 14.3 – Hialuronano nas neoplasias e na LMC O HA é abundantemente produzido por células neoplásicas e estromais contribuindo para o crescimento de tumores em diversos órgãos como bexiga, mama, próstata e intestino. As funções que favorecem a progressão e manutenção tumorais compreendem 61 estímulos à proliferação celular, adesão celular e proteção contra a ação do sistema imune (96). O HA de baixo peso molecular é frequentemente encontrado nas malignidades e a mudança da forma de alto peso molecular para a forma de baixo peso molecular está associada com progressão tumoral. Logo, pode ser um possível alvo terapêutico nas neoplasias malignas (101). No câncer de mama, os macrófagos demonstram migração preferencial em direção a estruturas estromais ricas em HA. A partir da interação entre HA e CD44 ocorre modificação no metabolismo tumoral devido à produção do fator indutor de