UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS 
CAMPUS DE BOTUCATU 

 

 

 

 

 

Helena Sanches Marcon 
 

 

 

 

 

Identificação da bactéria endossimbionte Wolbachia  
em populações de moscas-das-frutas do complexo  

Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) 
 

 

 

 

 

 

 

Dissertação de Mestrado 
 

 

 

 

 

2009 

 



 
 

 
HELENA SANCHES MARCON 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Identificação da bactéria endossimbionte Wolbachia  
em populações de moscas-das-frutas do complexo  

Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Orientador: Prof. Dr. Celso Luis Marino 
 
 
 
 
 
 

 

Dissertação de Mestrado 
apresentada no Curso de Pós-
graduação em Ciências Biológicas – 
área de concentração Genética  
para obtenção do título de Mestre. 

 
 
 

2009 
 
 



 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO 
 DA INFORMAÇÃO 

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus 
Marcon, Helena Sanches. 
    Identificação da bactéria endossimbionte Wolbachia em populações de 
moscas-das-frutas do complexo Anastrepha fraterculus (Díptera: Tephritidae)  
/ Helena Sanches Marcon. – Botucatu : [s.n.], 2009.    
 
    Dissertação (mestrado) –  Universidade Estadual Paulista, Instituto de 
Biociências, Botucatu, 2009. 
    Orientador: Celso Luis Marino 
    Assunto CAPES: 21303002 
 

1.  Mosca-das-frutas    2. Bactéria 
 

                                                                   CDD 595.7 
      
Palavras-chave: Anastrepha; Gene wsp; Linhagens; Sensibilidade; Transfe-
rência horizontal; Wolbachia 



 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Dedico esse trabalho a antecessora de Deus, 

 Nossa Senhora Aparecida, pelos momentos de oração,  

que fizeram do meu mestrado um período de aprendizado  

pessoal e profissional, trazendo um final cheio de luz. 

 
 
 
 
 
 



 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

Agradecimentos 
 



 
 

A Deus, pela minha saúde, pelas oportunidades, pela felicidade desta 

vida e pelos momentos de aprendizado. Pela minha amada família e meu querido 

amor. Tenho tudo o que preciso! 

Aos meus pais, Claudionor e Inês, que encheram minha vida de amor e 

apoio incondicionais. Pelo ombro “mãe-amigo”, tão necessário nos muitos 

momentos de dúvidas e desesperos. Pelo “paitrocínio”, que ajuda a “engordar” a 

bolsa. Além de tudo, pela compreensão da minha ausência, por permanecer 

tempos sem voltar para casa, para que o mestrado pudesse caminhar da melhor 

maneira possível. Amo vocês! 

Ao meu irmão, Marcelo, pelas conversas curtas ou longas, que passaram 

a ser mais maduras, mas sem deixar que as coisas de crianças se afastassem de 

nós, hoje somos mais que tudo “irmãos-amigos”. 

Ao meu amor, William, pelos tantos momentos de descobertas, que 

sempre afirmo nos fizeram crescer (e muito!). Por você me completar e 

possibilitar com que possa sonhar. Por ser meu cúmplice, desde ficar em casa 

vendo novela até nossas conversas filosóficas sobre a ciência e a vida. Eu te amo! 

Ao Zigui e a Jinnie, pela felicidade ao me verem chegando em casa para 

passar o final de semana, e especialmente a Nina, por encher a minha casa de 

alegria, além da fidelidade incondicional. 

Ao meu orientador, Celso, por apostar em minha capacidade e me dar a 

liberdade para crescer e me desenvolver intelectualmente. Pela sua amizade e 

conselhos nestes cinco anos de convivência no laboratório. 

A minha “amiga-vizinha”, Cíntia, pelas risadas nos momentos mais 

felizes e por me socorrer nos dias mais terríveis, obrigada amiga, nossa amizade 

não irá se perder. 

A amiga que de longe sempre esteve pronta a ajudar e apoiar, eterna 

Di. 



 
 

Aos amigos do Laboratório CAGEN: Vir, Tânia, Júlio, Vanussa, Jú, 

Suzan, Léo, Andréia, Aletéa, Toladinha, Maurício e Bruno (nossa que laboratório!), 

pelo aprendizado tanto de convivência quanto de ensinamentos.  

Em especial a Vir, que me ajudou muito em vários momentos, e pela 

compreensão do meu jeito de ser, as vezes complicado. 

E também a Suzana, quem sempre esteve pronta a me escutar e que 

nos descobrimos amigas, obrigada! 

Ao Laboratório BIOGEM, a todos presentes hoje: Jú, Rodrigo, Ed, 

Alessandra e Carol, e aos que passaram e deixaram seus ensinamentos em tantos 

momentos, Bonsai e Akemi.  

Ao pessoal da academia, as professoras Fernanda, Iris, Paula, Andréia 

e o professor Zuel e colegas, pelos momentos de descontração desfrutados junto 

com vocês. 

A Jan pelas conversas e risadas durante todo este tempo. 

A minha professora de Inglês Cris, pela conversation, e pelo help em 

tantos momentos, obrigada! 

Aos amigos da turma XXXVIII que aqui não caberiam, com os quais 

deixei de conviver, mas que dos meus pensamentos nunca sairão. 

Aos funcionários e colegas do Departamento de Genética da UNESP de 

Botucatu, em especial Aline e Zé, obrigada pela atenção e convivência. 

Aos professores do Departamento de Genética da UNESP de Botucatu, 

obrigada pela atenção nos momentos solicitados. 

A profa. Claudia, por estar sempre disponível a oferecer seu 

laboratório para realização das nossas análises, em especial a sua aluna Dani pela 

atenção e ajuda.  

Ao prof. Claudio e prof. Nei, obrigada pela atenção. 



 
 

Ao pessoal da Pós-graduação, Lú, Herivaldo, Marina Helena e Serginho, 

que sempre estiveram disponíveis para tirar as dúvidas e prontos para ajudar a 

solucioná-las. 

A Profa. Denise Selivon e ao Prof. André Perondini, obrigada pelo 

auxílio e por oferecer seu laboratório para realização de algumas análises. 

A FAPESP pelo apoio financeiro concedido para realização deste 

trabalho e minha formação profissional, obrigada! 

A todos os mestres que passaram por minha vida e semearam em mim o 

gosto pelo estudo. Espero um dia corresponder à dedicação de vocês! 

 

 

 

 

 

A vida com seus degraus, que destes muitos trazem respostas em uma forma 
difícil de entender, e mesmo que não tenhamos a mínina idéia do que tenha pela 
frente, seguimos com o desejo de que cada degrau a ser conquistado seja pela 

curiosidade para a elevação e passagem de espírito, somada pela idéia da 
conquista. O que nos torna buscadores de conhecimento insaciável e prisioneiros 

da ilusão da felicidade. De alguma forma levados para um degrau do merecimento, 
procurando algo dentro de nós. 

Helena S. Marcon 
 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Plante seu jardim e decore sua alma, ao invés                                                                        

de esperar que alguém lhe traga flores. E você aprende 

que realmente é forte, e que pode ir muito mais longe 

depois de pensar que não se pode mais. E que realmente 

a vida tem valor e que você tem valor diante da vida!” 

(William Shaskespeare) 

 

 



 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Resumo 
 



 
 

Wolbachia é uma bactéria endossimbionte comumente encontrada nos 

tecidos reprodutores de invertebrados, sendo herdada vertical e 

horizontalmente. Esta bactéria é desencadeadora de inúmeras alterações 

reprodutivas, dentre elas a incompatibilidade citoplasmática. Bactéria Wolbachia 

apresenta oito diferentes tipos de genoma, identificados de A a H. Dentre os 

hospedeiros da Wolbachia estão as moscas-das-frutas do gênero Anastrepha, 

que são um importante inseto-praga causador de inúmeras perdas na fruticultura 

de vários países na América. Neste estudo, foram utilizados os primers 16S 

rDNA, ftsZ e wsp na detecção da Wolbachia e identificação do supergrupo em 

três populações de Anastrepha do complexo fraterculus, de diferentes regiões 

do estado de São Paulo. Em todas as amostras de moscas foi detectada a 

presença da Wolbachia do supergrupo A, através da utilização dos primers 16S 

rDNA  e wsp, visto que o ftsZ apresentou baixa sensibilidade na detecção desta 

bactéria em Anastrepha. Comparações das sequências do gene wsp dos 62 

indivíduos no Genebank possibilitaram a identificação de duas linhagens de 

Wolbachia, uma pertencente a Anastrepha sp. 2 (wAsp2B) e a outra ao nematóide 

Brugia pahangi (Bp-1-1001). Com isso, sugere-se a ocorrência de transferência 

horizontal da linhagem Bp-1-1001 em Anastrepha através das vespas parasitas de 

dípteros. A partir de comparações entre as sequências geradas com o gene wsp, 

observou-se a ocorrência de quatro diferentes sequências pertencentes a novas 

linhagens de Wolbachia, denominadas wAsc, wAnc, wBjc e wBsp. Essas linhagens 

estão distribuídas nas diferentes populações de moscas-das-frutas do gênero 

Anastrepha. 

Palavras chave: Wolbachia, gene wsp, sensibilidade, linhagens, Anastrepha, 

transferência horizontal. 

 

 

 



 
 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
Abstract 

 



 
 

Wolbachia is a endosymbiont bacteria commonly found in reproducer 

tissue of invertebrates, being vertically and horizontally inherited. This bacteria 

cause innumerable reproductive alterations, among them a cytoplasmic 

incompatibility. Wolbachia have eight different types of genome, designated 

from A to H. Among Wolbachia host there are the fruit flies of genus 

Anastrepha. These arthropods are important pest insect that causes many 

losses in fruit production of many countries of America. In this work, were used 

the primers 16S rDNA, ftsZ and wsp to detect Wolbachia and to identify the 

supergroups of three Anastrepha populations the different regions of São Paulo 

state, Brazil. In all fruit flies samples, it was detected the presence of 

Wolbachia of the A supergroup, through the use of primers 16S rDNA and wsp, 

since ftsZ has low sensitivity in detecting this bacteria in Anastrepha. 

Comparisons of the wsp gene sequences of 62 samples in GeneBank, allowed the 

identification of two Wolbachia lineages, one relating to Anastrepha sp. 2 

(wAsp2B) and other in Brugia pahangi nematode (Bp-1-1001). Therefore it is 

propose the occurrence the horizontal transference of Wolbachia lineages Bp-1-

1001 into Anastrepha through the did parasite wasps of dipterous. The 

comparisons among the wsp gene sequences showed the occurrence of four 

different sequences, possibly belonging to the news lineages of Wolbachia, which 

were named wAsc, wAnc, wBjc and wBsp. These lineages are distributed in 

different fruit flies of populations of the Anastrepha genus. 

Key words: Wolbachia, wsp gene, sensitivity, lineages, Anastrepha, horizontal 

transference 

 

 

 

 

 

 



 
 

LISTA DE ILUSTRAÇÕES 

 Página 

Figura 1. Eletromicrografia de diferentes estágios de 

desenvolvimento gonadal de Anastrepha. 

       

26 

Figura 2. Diferentes fases do desenvolvimento das moscas-das-frutas 

Anastrepha fraterculus. 

       

37 

Figura 3. Mapa do Estado de São Paulo com as localidades de coleta 

dos frutos. 

       

44   

Figura Figura 4. Quantificação em gel de agarose a 0,8%. 55 

Figura 5. Gel de agarose 1% com os primers 16S rDNA A e B com 

população de Jacareí. 

       

56 

Figura 6. Gel de agarose 1% com os primers 16S rDNA A e B com 

população de Caraguatatuba. 

       

57 

Figura 7. Gel de agarose 1% com os primers 16S rDNA A com 

indivíduos da população de Serra Negra. 

       

57 

Figura 8. Gel de agarose 1% com o primer wsp A com indivíduos da 

população de Jacareí. 

       

58 

Figura 9. Gel de agarose 1% com o primer wsp A com indivíduos da 

população de Caraguatatuba. 

       

58 

Figura 10: Gel de agarose 1% com o primer ftsZ A com indivíduos da 

população de Jacareí. 

       

59 

Figura 11. Porcentagem de detecção da bactéria Wolbachia nas 

espécies de moscas-das-frutas utilizando os primers 16S rDNA, wsp e 

os diferentes protocolos utilizados com o primer ftsZ. 

             

...........

60 



 
 

Figura 12.  Gel de agarose 1% com indivíduos da população de Jacareí 

utilizando o protocolo VII com o primer ftsZ. 

       

62 

Figura 13. Identificação dos supergrupos A e B com conjuntos de 

primer 16S rDNA A e B, wsp A e B e ftsZ A e B. 

       

63 

Figura 14. Gel de agarose 1% com a população de Serra Negra com o 

primer wsp A e B. 

       

64 

Figura 15. Linhagens de Wolbachia detectadas nas populações de 

Anastrepha. 

       

67 

Figura 16. Árvore obtida a partir do método NJ, baseada no gene wsp, 

demonstrando a distância entre as Wolbachia da população de Jacareí. 

       

68 

Figura 17. Árvore obtida a partir do método NJ, baseada no gene wsp, 

demonstrando a distância entre as Wolbachia da população de Serra 

Negra. 

         

...........

69 

Figura 18. Árvore obtida a partir do método NJ, baseada no gene wsp, 

demonstrando a distância entre as Wolbachia da população de 

Caraguatatuba. 

          

...........

71 

Figura 19. Árvore obtida a partir do método NJ, baseada no gene wsp, 

demonstrando a distância entre as populações de moscas contendo 

Wolbachia. 

        

...........

74 

Figura 20. Diversidade de nucleotídeos (Pi) conforme as posições dos 

nucleotídeos nas diferentes linhagens de Wolbachia. 

        

78 

 
  
 
 
 
 



 
 

LISTA DE TABELAS 

 Página 

Tabela 1. Espécies de moscas-das-frutas, total de amostras em cada 

população, plantas hospedeiras e locais de coleta no estado de São de 

Paulo. 

         

...........

45 

Tabela 2. Sequências dos conjuntos de primers utilizados. 48 

Tabela 3. Quantificação de DNA mensurada em espectrofotômetro. 56 

Tabela 4. Alterações no protocolo de PCR com o primer ftsZ, 

identificados por I a VIII. 

        

61 

Tabela 5. Porcentagem de detecção da Wolbachia com as alterações 

feitas nos protocolos utilizando o primer ftsZ, indicados de I a VIII. 

        

61 

Tabela 6. Indivíduos que tiveram similaridade com outro sequência que 

não o gene wsp de Wolbachia. 

        

67 

Tabela 7. Linhagens de Wolbachia detectadas nas diferentes  

populações de Anastrepha. 

       

66 

Tabela 8.Valores de diferenciação genética calculados através do 

programa DnaSP Ver.5.00.05. 

       

72 

Tabela 9: Taxa diversidade de nucleotídeos (Pi) das sequências do 

gene wsp de Wolbachia ao se comparar as diferentes populações de 

moscas-das-frutas. 

       

...........

75 

Tabela 10: Média dos valores de diferenciação genética 

calculados através do programa DnaSP Ver.5.00.05. 

        

76 

Tabela 11: Posições de sítios polimórficos e total de indivíduos com 

estes polimorfismos na linhagem wAsc. 

       

76 



 
 

Tabela 12: Posições de sítios polimórficos e total de indivíduos com 

estes polimorfismos na linhagem wAnc. 

       

77 

Tabela 13: Posições de sítios variáveis nas linhagens de Wolbachia 

conforme as HVRs propostas por Baldo et al., 2005. 

       

78 

Tabela 14: Posições de sítios polimórficos e total de indivíduos com 

estes polimorfismos na linhagem wBsp. 

       

80 

Tabela 15: Posições de sítios polimórficos e total de indivíduos com 

estes polimorfismos na linhagem wBjc. 

       

82 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

SUMÁRIO 

Resumo Página 

Abstract  

Lista de Ilustrações  

Lista de Tabelas  

1. Introdução........................................................................................................... 20 

2. Revisão Bibliográfica 24 

2.1. A bactéria endossimbionte Wolbachia.......................................... 25 

2.1.1. As Interações da Wolbachia com seus Hospedeiros.......... 27 

2.1.2. A Transmissão da Wolbachia................................................... 31 

2.1.2.1 A Transferência Horizontal da Wolbachia.................. 32 

 2.1.3. A Transferência de Material Genética: Wolbachia vs. 

Hospedeiro.............................................................................................. 

      

33 

 2.1.4. Análises de populações de Hospedeiros relacionadas a 

presença da Wolbachia.......................................................................... 

      

35 

2.2. A relação Wolbachia e moscas-das-frutas do gênero 

Anastrepha.................................................................................................... 

       

36 

2.2.1. As moscas-das-frutas do gênero Anastrepha...................... 36 

2.2.2. A interação entre Wolbachia e Anastrepha......................... 38 

3. Objetivos  41 

3.1. Geral........................................................................................................ 42 

3.2. Específicos............................................................................................ 42 

4. Material e Métodos 43 



 
 

4.1. Coleta das moscas do gênero Anastrepha...................................... 44 

4.2. Obtenção do DNA genômico a partir do abdômen de 

Anastrepha  e Quantificação do DNA .................................................. 

      

46 

    4.2.1. Extração de DNA das moscas.................................................. 46 

4.2.2. Quantificação do DNA obtido................................................. 47 

4.3. Reação de PCR (Reação em cadeia da polimerase) e primers 

empregados para a detecção da Wolbachia.......................................... 

      

48 

4.4. Purificação da reação de PCR, excisão e purificação de  

fragmento de gel de agarose.................................................................... 

      

50 

    4.4.1. Purificação da reação de PCR................................................... 51 

4.4.2. Excisão e purificação de fragmento de gel de 

agarose...................................................................................................... 

        

51 

4.5. Método de Clonagem........................................................................... 51 

4.6. Sequenciamento................................................................................... 52 

4.7. Análise das sequências....................................................................... 52 

    4.7.1. Análises de variações das sequências..................................... 52 

5. Resultados 54 

5.1. A Quantificação do DNA extraído das moscas............................ 55 

5.2. Detecção da Wolbachia e Sensibilidade dos primers................. 56 

5.2.1. Primer 16S rDNA......................................................................... 56 

5.2.2. Primer wsp.................................................................................... 58 

5.2.3. Primer ftsZ................................................................................... 59 

5.2.3.1. Alterações nas reações de PCR com o primer ftsZ.. 59 



 
 

5.3. Análise das populações de Anastrepha quanto aos 

supergrupos................................................................................................... 

       

63 

5.4. Análises das sequências..................................................................... 64 

5.4.1. Amplificação de sequências não relacionadas ao gene 

wsp..............................................................................................................    

      

65 

5.4.2. Análises das diferentes populações de Anastrepha 

quanto as linhagens de Wolbachia detectadas................................ 

       

65 

5.5. Análises das sequências da Wolbachia encontradas com 

relação as populações de mosca-das-frutas do gênero 

Anastrepha................................................................................................... 

     

.......... 

67                

5.5.1. Análises Intrapopulacionais....................................................... 68 

5.5.2. Análises Interpopulacionais...................................................... 72 

5.5.3. Análises das Sequências conforme a linhagem de 

Wolbachia................................................................................................. 

      

75 

5.5.3.1 Análises da Linhagem de Wolbachia caracterizada 

como Wolbachia de A. sp. 2 (wAsp2B)....................................... 

      

75 

5.5.3.2 Análises da Linhagem de Wolbachia caracterizada 

como de B. pahangi (Bp-1-1001).................................................... 

      

79 

6. Discussão ............................................................................................................. 85 

7. Conclusões ........................................................................................................... 94 

8. Referências Bibliográficas .............................................................................. 96 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Introdução                            
 



21 
 

 

Bactérias do gênero Wolbachia são endossimbiontes obrigatórios 

pertencentes a família Rickettsiaceae. Seu primeiro relato foi feito nas células 

do tecido reprodutivo do mosquito Culex pipiens (Hertig e Wolbach, 1924). 

Atualmente, se conhece sua ampla distribuição entre os invertebrados, sendo 

encontradas em 65% das espécies de insetos (Hilgenboecker et al., 2008), além  

de isópodos (Rousset et al., 1992), crustáceos (Cordaux et al., 2001) e 

nematóides (Sironi et al., 1995).  

Wolbachia foi dividida em oito supergrupos designados de A a H 

(Werren et al., 1995b; Lo et al., 2002;  Bordenstein e Rosengaus 2005, Lo et al., 

2007), baseados nos marcadores 16S rDNA (gene ribossomal) (O´Neill et al., 

1992), ftsZ,  (gene do ciclo celular da bactéria) (Holden et al., 1993) e o wsp, 

(gene de proteína de superfície de membrana) (Zhou et al., 1998).  

Inúmeros estudos são realizados com esta bactéria devido as 

alterações reprodutivas que esta pode causar em seus hospedeiros, como a 

incompatibilidade citoplasmática (IC) (O’ Neill, 1990), a indução de 

paternogênese (Stouthamer, 1990) e a feminização e morte de machos (Rousset 

et al., 1992).   

A transferência da Wolbachia ocorre verticalmente, via maternal, pelo 

citoplasma dos ovos (Jiggins et al., 2002), e também por transferência paterna, 

que é pouco frequente (Turreli et al., 1992; Turelli e Hoffmann, 1995). Além 

disso, pode ocorrer a transferência horizontal, onde a transmissão da bactéria é 

realizada entre organismos de espécies diferentes, este mecanismo é utilizado 

para se explicar o quanto Wolbachia é amplamente encontrada em diferentes 

invertebrados. 

O uso da Wolbachia em programas de controle biológico de seus 

hospedeiros tem sido muito mencionado nos últimos tempos (Zabalou et al., 2004; 

Bourtzis, 2008). A utilização desta bactéria constitui em se reduzir a população 



22 
 

dos insetos, sendo o mecanismo baseado na liberação de machos infectados com 

diferentes linhagens da bactéria, ou mesmo machos com uma única linhagem, na 

presença de populações não infectadas. Isto resultaria na redução ou eliminação 

dos machos na progênie, ocorrendo um desvio da proporção sexual na prole 

(Zabalou et al., 2004).  

Entre os hospedeiros da Wolbachia estão as moscas-das-frutas, que 

são classificadas como insetos praga por causarem grandes prejuízos a 

fruticultura mundial. Estas moscas utilizam os frutos durante o seu ciclo 

biológico, isto ocasiona o amadurecimento precoce dos mesmos (Salles, 2000). 

Nas moscas-das-frutas da família Tephritidae foi detectada a 

presença da Wolbachia em várias espécies de Anastrepha (Werren et al., 1995a, 

Selivon et al., 2002; Mascarenhas, 2007; Coscrato, 2006; et al., 2009), também 

em Ceratitis capitata (Lincoln et al., 2005), e algumas espécies de  Bactrocera 

(Kittayapong et al., 2000; Jamnongluk et al., 2002; Sun et al., 2004; Liu et al., 

2006) e em Rhagoletis cerase (Riegler e Stauffer, 2002). 

Selivon e colaboradores (1996) identificaram no vitelo e nas células 

polares dos embriões de Anastrepha sp. 2 uma expressiva quantidade de 

bactérias endossimbiontes. Posteriormente, observaram a redução na eclosão de 

larvas e desvios na proporção sexual na progênie das moscas, este fato foi 

relacionado ao fenômeno da IC devido a possível infecção pela Wolbachia 

(Selivon et al., 1999). Análises posteriores, detectaram a presença da Wolbachia 

em Anastrepha sp. 2 com a utilização do primer ftsZ (Selivon et al., 2002), e 

além disso já foi demonstrado que o fenômeno da IC realmente ocorre nestas 

moscas (Ribeiro, 2009).  

Estudos realizados com populações de Bactrocera dorsalis de 

diferentes locais da China detectaram a infecção pelos supergrupos A e B de 

Wolbachia, os quais possuíam sequências referentes a três linhagens da bactéria. 



23 
 

As análises subsequentes demonstraram a ocorrência de isolamento reprodutivo 

relacionada a presença da Wolbachia (Sun et al., 2007). Em diferentes espécies 

de moscas-das-frutas do gênero Anastrepha detectou-se somente a infecção 

com o supergrupo A (Mascarenhas, 2007; Coscrato et al., 2009), e Coscrato e 

colaboradores (2009) encontraram diferentes linhagens de Wolbachia através 

de análises de um único indivíduo de cada região estudada utilizando-se o primer 

wsp. Este fato pode sugerir que as diferentes linhagens de bactéria se 

comportam de forma variável conforme o organismo que infectam. Desta forma 

se faz necessário uma avaliação dentro das populações de Anastrepha para 

entender como ocorre a distribuição da bactéria Wolbachia quanto aos 

diferentes supergrupos e linhagens. A partir destes resultados será possível 

investigar o efeito que estas linhagens da bactéria têm sobre a biologia da 

Anastrepha.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Revisão Bibliográfica 



25 
 

 

 
2.1. A bactéria endossimbionte Wolbachia  

 

Os endossimbiontes são organismos que vivem em simbiose no interior 

do corpo ou das células de um ser vivo. As relações simbiônticas são definidas 

como uma mistura entre o mutualismo (benéfica), o comensalismo (neutra) e o 

parasitismo (prejudicial) (Werren et al., 2008). As bactérias estão entre os 

endossimbiontes obrigatórios de diversos eucariotos, sendo que esta interação 

estabeleceu-se a milhões de anos (Moran e Wernegreen, 2000).  

A bactéria Wolbachia (figura 1) é classificada como um membro do 

grupo “secundário” dos simbiontes por ser intracelular obrigatória e estabelecer 

relações de mutualismo e parasitismo com seus hospedeiros (Siozios et al., 

2008). Além disso, apresentam a peculiaridade de não sobreviver fora das células 

dos invertebrados. Contudo, foi observada sua sobrevivência nas células de 

mosquitos mortos (Fallon, 2008), e a sua resistência durante uma semana a 

temperatura ambiente após a retirada das células do hospedeiro (Rasgon et al., 

2006).  

Hertig e Wolbach (1924) foram os primeiros a detectar Wolbachia em 

ovários do mosquito Culex pipiens. Sua caracterização como organismo ocorreu 

muitas décadas depois como pertencente ao filo das Proteobactérias, classe das 

Alphaproteobactérias, ordem Rickettsiales e família Rickettsiaceae.  

Os estudos realizados atualmente com a utilizam técnicas moleculares 

para seu diagnóstico, distinguindo os supergrupos infectantes, além das linhagens 

existentes. As análises a partir destes estudos em muitos dos casos auxiliam nas 

questões sobre alterações reprodutivas, evolucionárias, de variabilidade, entre 

outras.   



26 
 

 

 
  Figura 1: Eletromicrografia de diferentes estágios de desenvolvimento gonadal de 

Anastrepha. (A) Bactéria (Bc) localizada em uma vesícula no citoplasma do 
hospedeiro; (B) Bactéria no pólo posterior do ovo, após a formação da célula; (C) 
Pólo posterior celular contendo inúmeras bactérias. Escala em bar 0,1µm; N: núcleo; 
M: mitocôndria; Vm: membrana vesicular; Y: centro nuclear. (Selivon et al., 2002).   

 

A utilização de oligonucleotídeos para a detecção da Wolbachia deu 

início aos trabalhos realizados com biologia molecular. Inicialmente, foi utilizado 

o gene ribossomal 16S rDNA (O´Neill et al., 1992), que continua sendo 

empregado devido a sua alta sensibilidade na detecção da bactéria. Contudo, não 

é indicado como único meio para a distinção dos supergrupos A e B da Wolbachia, 

pois apresenta baixa divergência nas sequências, havendo indícios de que estes 

supergrupos tenham provavelmente se separado a 50 milhões de anos (Werren et 

al., 1995a, 1997). Com isso, este primer não auxiliava nas análises evolutivas e de 

alteração reprodutivas acometidas pela presença da Wolbachia, somente no seu 

diagnóstico.  



27 
 

 

Outro primer empregado nos estudos com Wolbachia é o ftsZ, que foi 

caracterizado a partir de um gene do ciclo celular da bactéria (Holden et al., 

1993). Este gene foi amplamente difundido por Werren (1995a, b). No entanto, 

apresenta baixa sensibilidade na detecção de Wolbachia (Werren e Windsor 

2000; Jeyaprakash e Hoy, 2000, 2002; Hong et al., 2002, Coscrato, 2006). 

Braig e colaboradores (1998) a partir da caracterização de uma 

proteína específica de superfície de membrana de Wolbachia confeccionaram o 

oligonucleotídeo wsp. Este primer é altamente variável e vem sendo utilizado em 

análises populacionais e filogenéticas da bactéria (Sun et al., 2007; Coscrato et 

al., 2009). Estudos recentes caracterizam o wsp, demonstrando que este 

oligonucleotídeo apresenta quatro regiões hipervariáveis (HVRs) que se 

organizaram a partir de eventos combinatórios (Baldo et al., 2005).  

A combinação do uso dos primers mencionados, possibilitou que 

Wolbachia fosse dividida em oito supergrupos taxonômicos classificados de A a 

H. Os supergrupos A e B são comumente detectados em insetos (Werren et al., 

1995a), enquanto os supergrupos C e D são encontrados em nematóides (Lo et al., 

2002), o supergrupo E é característico de colembolas, assim como G somente foi 

detectado em aranhas australianas (Rowley et al., 2004) e o H em cupins 

(Bordenstein e Rosengaus, 2005). O supergrupo F é encontrado em nematóides, e 

recentemente foi detectado em artrópodes (Baldo et al., 2006b; Panaram e 

Marshall, 2007). 

 

2.1.1. As Interações da Wolbachia com seus Hospedeiros 

 

Nas últimas décadas a bactéria Wolbachia foi amplamente encontrada 

infectando diferentes espécies de invertebrados, com maior número de relatos 

entre os artrópodes como os insetos (Werren et al., 1995b, Stouthamer et al., 

1999; Jeyaprakash e Hoy, 2000), os aracnídeos (Breeuwer e Jacobs, 1996), os 



28 
 

 

crustáceos (Cordaux et al., 2001; Gotoh, et al., 2003) e os isópodes. Além disso, 

são encontradas em nematóides (Bandi et al., 1998, 2001).  

Análises estatísticas recentes confirmam a extensa distribuição desta 

bactéria entre os invertebrados, estimando encontrá-la em 65 % das espécies de 

insetos (Hilgenboecker et al., 2008), o que reafirma estudos que propunham sua 

infecção de 20 a 70 % dos insetos (Jeyaprakash e Hoy, 2000). 

As interações entre a bactéria e seu hospedeiro causam alterações 

reprodutivas, tais como: A incompatibilidade citoplasmática (IC), que é um dos 

tipos de alteração reprodutiva melhor caracterizada (O’ Neill et al., 1992; 

Rousset et al., 1992), e é comumente observada em moscas, vespas e mosquitos 

(Werren et al., 2008). A IC acontece a partir da incompatibilidade dos gametas 

masculino e feminino, levando a morte do zigoto, em espécies diplóides, ou 

aumento do número de machos na prole, em haplodiplóides (Stouthamer, 1999). 

Além disso, a incompatibilidade pode ocorrer nos cruzamentos de populações, 

espécies e linhagens evolutivamente próximas, podendo ser unidirecional 

(cruzamento compatível sendo o recíproco incompatível) ou bidirecional 

(cruzamentos recíprocos incompatíveis). Em decorrência deste mecanismo a prole 

terá um elevado número de fêmeas com Wolbachia, o que provavelmente 

resultará em proles infectadas que disseminarão ainda mais a bactéria. 

Outro mecanismo estudado é a indução a partenogênese (IP) 

(Stouthamer, 1990), que é menos comum que a IC. A IP ocorre através de ovos 

haplóides que se convertem em uma geração de fêmeas diplóides (Stouthamer, 

1999).  

Algumas das alterações reprodutivas apresentam mecanismos pouco 

conhecido, como a feminização dos machos (Hiroki et al., 2002; Negri et al., 

2008), acredita-se que esta ocorra a partir de machos sendo geneticamente 

convertidos em fêmeas (Stouthamer, 1999), e a morte de machos (Rousset, 

1992). 



29 
 

 

Mesmo não se conhecendo completamente todos os mecanismos das 

alterações reprodutivas ocasionadas pela presença da Wolbachia, acredita-se 

que estas ocorram durante o desenvolvimento embrionário do hospedeiro. Há um 

consenso que no mecanismo da IC exista alguma “modificação” (sistema mod) no 

esperma dos machos infectados, sendo estes marcados, e o desenvolvimento de 

embriões normais somente ocorre se o ovo materno ao ser fecundado também 

esteja infectado, para que se consiga “recuperar”  (sistema rescue) os 

cromossomos paternos, viabilizando o processo reprodutivo (Bourtzis e O’Neill, 

1998).   

Poinsot e colaboradores (2003) propõem três modelos bioquímicos que 

tentam traduzir o mecanismo adequado para estes fatores de “modificação” e 

“resgate” que determinam a IC. Tais modelos são designados como: (i) hipótese 

“chave-fechadura”; (ii) hipótese “titulação-restituição”; (iii) hipótese “câmera 

lenta”. Porém, os mesmos pesquisadores concluem que o modelo de “chave-

fechadura” é o mais parcimonioso, no entanto, os outros não são descartados, 

mas seriam necessários mais dados para a compreensão. A hipótese da “chave-

fechadura” consiste em se ter uma função mod (modificação) representada por 

uma “fechadura” na bactéria, a qual se ligará ao cromossomo paterno. Com isso, a 

formação do zigoto somente ocorrerá se os ovos estiverem infectados com a 

bactéria, visto que estas apresentariam a “chave” para remoção da “fechadura” 

(recuperação). 

Além da possível atuação nos gametas dos hospedeiros da Wolbachia, 

foi observada sua íntima relação com os microtúbulos do fuso mitótico através de 

análises citológicas durante a divisão mitótica de Drosophila. Este fato 

possibilitou explicar sua distribuição nas regiões dos pólos das células durante a 

mitose. No mesmo estudo foi sugerido, que após a divisão a bactéria seria capaz 

de se distribuir pelo citoplasma vindo a construir domínios no interior da célula 

(Callaini et al., 1994; Kose e Karr, 1999). Em outras análises observou-se a 



30 
 

 

distribuição da Wolbachia em embriões, visualizando uma maior concentração da 

bactéria no pólo posterior, sendo que nesta região ocorre a formação das células 

germinativas, o que permitiria a transmissão vertical da bactéria a prole do 

hospedeiro (Hadfield e Axton, 1999; Selivon et al., 2002).  

As alterações reprodutivas desencadeadas pela presença da Wolbachia 

têm sido consideradas como uma estratégia da bactéria, sendo referida como um 

parasitismo reprodutivo. Além desta relação simbiôntica, o mutualismo tem sido 

apresentado como uma segunda forma de interação da Wolbachia com alguns de 

seus hospedeiros (Werren et al., 2008). Entretanto, Bordenstein e 

colaboradores (2009), concluíram em recente estudo que estes evolucionários 

relacionamentos mantidos entre a bactéria e seus hospedeiros não poderão ser 

realmente solucionados até que um número maior de caracterizações taxonômicas 

da Wolbachia sejam realizadas.  

As análises feitas por Bordenstein et al. (2009) indicam a presença da 

relação de mutualismo entre quatro linhagens diferentes da Wolbachia  e 

nematóides hospedeiros. Neste mesmo trabalho, os invertebrados apresentaram 

aumento da fertilidade e da viabilidade reprodutiva com a presença da bactéria, 

sendo que em nematóides é amplamente difundida a questão que a presença da 

Wolbachia garante normal desenvolvimento e fertilidade. Estas demonstrações 

tiveram início a partir de estudos com tratamentos para controlar os 

invertebrados patogênicos, os quais observaram que os antibióticos utilizados 

agiam sobre a bactéria e não atacavam o nematóide, como era esperado. A 

Wolbachia, portanto, passou a ser encarada como a mediadora nos tratamentos 

contra estes parasitas patogênicos (Taylor et al., 2005). Em humanos o uso do 

antibiótico doxycycline causou redução maior que 95% da bactéria, demonstrado 

através das análises com microfilárias existentes no sangue, este fato foi 

acompanhado do crônico declínio da infecção com o nematóide (Hoerauf et al., 

2003a). 



31 
 

 

Wolbachias encontradas em alguns insetos têm sido descritas como as 

prováveis manipuladoras do processo de apoptose celular no sistema reprodutor 

feminino, sua presença garante o desenvolvimento de ovos, que transmitirão o 

endossimbionte a próxima geração (Werren et al., 2008). Tal fato pôde ser 

demonstrado com estudos realizados com vespas, primeiramente Wolbachia foi 

removida com a ação de antibióticos e se observou a incapacidade de produção do 

oócito (Dedeine et al., 2001).  Posteriormente, Pannebakker et al. (2007) 

detectou que a maturação do oócito nas mesmas vespas somente ocorre com a 

presença da bactéria, pois ao ser retirada resultava na morte da célula por 

apoptose. Zchori-fein e colaboradores (2006) encontraram semelhante 

manipulação no processo de oogênese em besouros ao eliminar Wolbachia.  É de 

extrema importância ressaltar que insetos não infectados com esta bactéria 

apresentam normal processo de embriogênese. 

 

2.1.2. A Transmissão da Wolbachia 

 

A forma como a Wolbachia é herdada apresenta peculiaridades de 

indivíduo para indivíduo (Huigens et al., 2000). Comumente sua transmissão 

ocorre de forma vertical através do citoplasma dos ovos maternos infectados 

(Werren, 1997), o que é análogo a herança mitocondrial herdada. Frydman e 

colaboradores (2006) demonstraram que Wolbachia ao ser introduzida in vitro na 

cavidade abdominal de fêmeas de Drosophila estariam se concentrando 

preferencialmente nas SSCN (Somatic Stem Cell Niche), e que a bactéria estaria 

migrando através de três diferentes tecidos da mosca, até alcançar o ovário, 

estabelecendo-se 15 dias após a infecção. Wolbachia possivelmente prefere 

estas células por garantirem a sua transmissão vertical. Porém, este mecanismo 

não explica a sua ampla distribuição entre os invertebrados (Jeyaprakash e Hoy, 



32 
 

 

2000; Werren e Windsor 2000). A partir disto sugere-se a existência de 

transferência horizontal da Wolbachia entre diferentes gêneros.  

 

2.1.2.1. A Transferência Horizontal da Wolbachia 

 

A transferência horizontal passou a ser descrita a partir de 

comparações entre as filogenias da bactéria e do hospedeiro, em que se 

observava incongruência entre os resultados, pois era esperado uma homologia 

nestas análises (O’ Neill et al., 19922; Stouthamer et al., 1993; Werren et al., 

1995b; Vavre et al., 1999; Baldo et al., 2006b).  

Recentemente Baldo et al. (2008) indicaram que o movimento da 

Wolbachia dentro de aranhas do gênero Agelenopsis reflete o seu padrão de 

interação com outros hospedeiros, parasitas e predadores, vindo a aumentar a 

chance de ocorrência da transferência horizontal. Os autores detectaram neste 

aracnídeo a presença de transferência horizontal entre espécies do mesmo 

gênero. Em estudo realizado por Jiggins et al., (2002) demonstram que algumas 

linhagens de Wolbachia são comumente encontradas em espécies de hospedeiros 

intimamente relacionados, este padrão é explicado através de uma consequente 

especiação do invertebrado, sendo que a Wolbachia acompanhou este processo 

evolutivo estabelecendo-se nestas espécies. Dados semelhantes foram 

observados por Breeuwer e Werren (1990) em que identificaram a presença de 

incompatibilidade de vespas do gênero Nasonia que vivem em simpatria, e estudos 

subsequentes realizados por Bordenstein e colaboradores (2001), com o 

cruzamento de vespas Nasonia de espécies relacionados simpátricas observaram 

a geração de prole com indivíduos híbridos não férteis, pode-se então 

demonstrar a ocorrência de isolamento reprodutivo pós-zigótico devido a 

presença da Wolbachia, causadora da IC nestes insetos.   



33 
 

 

Raychoudhury et al. (2009) descreveram uma variedade de linhagens 

de Wolbachia que infectam vespas do gênero Nasonia. Neste estudo foi 

observada a transferência da bactéria entre gêneros diferentes de insetos, 

sendo adquiridas de moscas varejeiras, de Muscidifurax uniraptror (outra 

espécie de vespa) e de Drosophila sp. A transferência entre espécies 

relacionadas também foi detectada em populações de Ephestia kuehniella e seu 

parasitóide do gênero Trichogramma (Meer et al., 1999). Os parasitóides são um 

potencial meio de se transferir Wolbachia, como observado por Kondo et al. 

(2002), que detectaram a transferência da bactéria entre besouro e moscas-

das-frutas mediada pelo vetor (parasitóide).  

A transmissão entre clados geneticamente diferentes foi observada no 

Panaram e Marshall, (2007), ao detectar a presença do supergrupo F de 

Wolbachia, característico de nematóide, em insetos ortópteros, sendo o modo de 

aquisição ainda desconhecido. Porém, os autores sugerem que esta transferência 

tenha acontecido recentemente, quando houve a divergência entre os grupos de 

artrópodes e nematóides, o que foi também observado por Casiraghi et al. 

(2005). Além disso, atualmente, é proposto que a transmissão horizontal da 

Wolbachia entre artrópodes e nematóides venha ocorrendo a cerca de 100 

milhões de anos (Lo et al., 2002; Casiraghi et al., 2004). 

 

2.1.3. A transferência de Material Genético: Wolbachia vs. 

Hospedeiro 

 

A caracterização dos genomas de duas linhagens de Wolbachia 

encontradas nos invertebrados Drosophila melanogaster e Brugia malayi, 

indicaram como este estava organizado (Wu et al., 2004; Foster et al., 2005). A 

linhagem wMel da Wolbachia identificada em D. melanogaster, apresentou ampla 

quantidade de elementos repetitivos e móveis, observados com maior frequência 



34 
 

 

nos supergrupos A e B de bactéria (Wu et al., 2004; Bordenstein e Reznikoff, 

2005). A presença dos transposons nesta bactéria são um dos meios pelo qual se 

pode ter maior variabilidade de linhagens da Wolbachia. 

Os transposons são conhecidos como “genes saltadores” ou elementos 

transponíveis, estes são sequências de DNA que se movem pelo genoma, e são 

encontrados em diferentes posições de uma única célula, o que é denominado 

transposição.  

McClintock (1950) foi a pioneira na observação da presença de 

transposons no genoma de milho, atualmente já se sabe que 50 % do genoma 

deste cereal é constituído por elementos transponíveis. Em humanos há dados de 

mais de um milhão de cópias de um mesmo elemento e mais de 100.000 de um 

segundo tipo (Smit e Riggs, 1996; Kazazian e Moran, 1998 apud Kidwell e Lisch, 

2001). A primeira detecção de transposons em moscas-das-frutas foi realizada 

em Drosphila melanogaster, em que encontraram sequências similares as de milho 

e a de nematóides (Jacobson et al., 1986). 

Estudos realizados em invertebrados, tais como besouros, encontraram 

em seu DNA fragmentos do genoma da Wolbachia (Kondo et al., 2002). Hotopp e 

colaboradores (2007), também detectaram em quatro espécies de insetos e 

quatro nematóides a inserção de fragmentos de praticamente todo o genoma da 

bactéria (maior 1 megabase), e outros menores (menor 500 pares de base).  Além 

da transferência de fragmentos de DNA da Wolbachia para os invertebrados, o 

mecanismo inverso também é relatado (Masui et al., 1999). 

Werren e colaboradores (2008) sugerem que as inserções dos 

fragmentos de DNA da Wolbachia no hospedeiro podem resultar em novas 

funções aos genes.  Além disso, indicam que aquisição destes novos genes 



35 
 

 

ocasionaria um rearranjo do cromossomo do invertebrado, resultando em 

mecanismos de isolamento reprodutivo. 

 

2.1.4. Análises de populações de Hospedeiro relacionadas a 

presença da Wolbachia 

 

O início dos estudos com o gene wsp de Wolbachia foi marcado por 

demonstrar que invertebrados hospedeiros de um mesmo gênero, mas de 

espécies diferentes apresentavam grande similaridade nas sequências da 

proteína analisada. Contudo, algumas regiões possuíam grande variabilidade, com 

isso desde o principio já se enunciava que esta variabilidade refletia a diferença 

entre os supergrupos, e que representava a adaptação e especiação dos 

hospedeiros devido a íntima relação com esta bactéria intracelular (Braig et al., 

1998). 

A partir da diferenciação dos supergrupos de Wolbachia foi possível 

detalhar a sua diversidade. Tagami e Miura (2004) realizaram análises em 

populações (do Japão), de borboleta da ordem Lepidoptera, e observaram 

distribuição congruente entre os supergrupos A e B da Wolbachia, os quais 

apresentavam sequências completamente idênticas. Outros estudos não 

encontram semelhantes resultados, detectando maior variabilidade entre as 

linhagens de Wolbachia detectadas (Braig et al., 1998; Jeyaprakash e Hoy, 

2000).  

Behbahani e colaboradores (2005) ao estudarem uma espécie de 

mosquito de duas ilhas na Polinésia Francesa (ilhas Moorea e Fiji), detectaram a 

presença de Wolbachia do supergrupo A, mas com linhagens diferentes. Os 

pesquisadores sugerem que este fato ocorreu, pois uma das espécies divergiu 



36 
 

 

mais recentemente do que as outras linhagens deste hospedeiro.  

Em moscas da família Tephritidae foi realizado um trabalho com cinco 

populações de locais diferentes na China buscando relações com a distribuição da 

Wolbachia. Um dos grupos não estava infectado, porém os que apresentaram a 

bactéria foram divididos em quatro grupos distintos, conforme análises das 

sequências do gene wsp. As sequências apresentaram taxas de divergência maior 

que 23% a menores que 1%. Estes dados foram semelhantes aos obtidos com o 

gene mitocondrial COI. A partir disto, os pesquisadores propuseram que a 

dispersão da Wolbachia não ocorreu nos tempos atuais e concluem que houve 

coevolução entre a bactéria e a mosca da espécie Bactrocera dorsalis (Sun et al., 

2007). 

Os trabalhos realizados através das comparações entre as populações 

de hospedeiro e a infecção com a Wolbachia possibilitaram compreender o 

período que os invertebrados vem sendo infectado e se houve alguma influência 

na sua evolução devido as alterações causadas pela presença da bactéria. 

 

2.2. A relação Wolbachia e moscas-das-frutas do gênero Anastrepha 
 

2.2.1.  As moscas-das-frutas do gênero Anastrepha 

 

Uma grande parte das espécies de moscas-das-frutas é classificada 

como insetos praga por atacarem frutos de valor comercial. O ciclo de vida 

destas moscas (figura 2 A) é iniciado com o acasalamento, seguida por ovoposição 

em frutos (figura 2 B), eclosão, e desenvolvimento das larvas que irão se 

alimentar do fruto (figura 2 C), o qual cairá ao solo e a mosca passa pela etapa de 

ecdise pupal, após acontece uma metamorfose, e a saída das moscas adultas 

(Salles, 2000). 



37 
 

 

 
Figura 2: Diferentes fases do desenvolvimento de Anastrepha fraterculus. (A) Ciclo de 

vida de Anastrepha fraterculus (Salles, 2000); (B) Anastrepha fraterculus 
durante ovoposição (www.jardineiro.net/br/artigos/bichinho_goiaba.php); (C) 
Ameixas atacada por larvas de Anastrepha fraterculus 
(http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Ameixa/CultivodaA
meixeira). 

 
 

O gênero Anastrepha é endêmico da América e existem cerca de 200 

espécies descritas neste continente, sendo que no Brasil é encontrada em 99 

localidades (Zucchi, 2007 apud Ribeiro, 2009). Uma das espécies que apresenta 

maior destaque na América do Sul é a Anastrepha fraterculus sensu lato 

(moscas-das-frutas Sul Americana) (figura 2B). Estas moscas são encontradas 

em mais de 90 espécies de frutos, (Malavasi et al., 2000). 

A espécie A. fraterculus foi dividida através de análises 

cromossômicas e morfométricas, inicialmente em duas novas espécies A. sp. 1 

aff. fraterculus e A. sp. 2 aff. fraterculus, referidas como A. sp. 1 e A. sp. 2 

(Selivon, 1996; 2005 apud Ribeiro 2009). Posteriormente, foram descritas duas 

outras novas espécies, sendo A. sp. 3 aff. fraterculus encontrada no litoral e nas 

regiões sul e sudeste do Brasil, e A. sp. 4 aff. fraterculus foi caracterizada em  

Guayaquil, no Equador (Selivon, 2004a e b apud Ribeiro, 2009). 



38 
 

 

Análises moleculares utilizando o DNA ribossomal de três espécies de 

moscas do complexo fraterculus brasileiras (A. sp. 1 ,  A. sp. 2 e A. sp. 3),  que A. 

sp. 1 possui maior similaridade com A. sp. 2 do que ambas com A. sp. 3 (Prezotto, 

2008 apud Ribeiro 2009). Em A. sp. 1 e A. sp. 2 detectou-se um mecanismo de 

isolamento reprodutivo pós-zigótico, que pode ser causado por uma alteração 

reprodutiva, a IC. Além disso, em estudos morfológicos da A. fraterculus se 

observou inúmeras semelhanças entre A. sp. 1 e A. sp. 2, isto pode estar 

relacionado ao isolamento reprodutivo, que levaria a uma especiação (Selivon et 

al., 2002). 

O combate as moscas das frutas pela fruticultura ocorre conforme as 

exigências dos países importadores, especialmente com relação à presença de 

resíduos agrotóxicos. O uso de agrotóxicos deve ser feito sob cuidados 

especiais, procurando-se evitar sempre que possível. Os programas de manejo de 

pragas têm incentivado vários métodos e táticas de controle, como os métodos 

culturais, uso de atrativos, resistência varietal, e principalmente o controle 

biológico (Carvalho et al., 2000). 

O controle biológico das moscas-das-frutas tem sido proposto por 

meio de diversos organismos como vírus, bactérias, fungos, nematóides, 

predadores e parasitóides (Carvalho et al., 2000). Wolbachia, tem sido estudada 

como um meio de controle biológico para os seus hospedeiros, por manipular a 

reprodução destes, o que acabaria por controlar a prole (Bourtzis, 1998; Zabalou 

et al., 2004). 

 

2.2.2. A interação entre Wolbachia e Anastrepha 

 

A Wolbachia foi descrita em um grande número de espécies de 

Anastrepha (Werren et al., 1995; Selivon et al., 2002; Mascarenhas, 2007; 

Coscrato et al, 2009) e também em outros gêneros de moscas-das-frutas como 



39 
 

 

Bactrocera ( Kittayapong et al., 2000; Jamnongluk et al., 2002; Sun et al., 2007), 

Rhagoletis (Riegler e Staufer, 2002) e Ceratitis capitata (Rocha et al., 2005). 

A primeira suposição de presença da Wolbachia em moscas-das-frutas 

em território nacional foi feita por Selivon e colaboradores (1999) em espécies 

de A. sp. 2, em que detectou-se redução na eclosão de larvas e desvios na 

proporção sexual da progênie adulta, sendo que estas alterações poderiam estar 

relacionadas a populações de bactéria que haviam sido observadas em estudos 

anteriores (Selivon et al., 1996). A partir destas observações foi proposta uma 

possível alteração no padrão reprodutivo classificada como IC, o que foi 

associada a presença da Wolbachia como causadora desta alteração reprodutiva. 

A infecção pela Wolbachia em Anastrepha foi confirmada com o auxílio do gene 

ftsZ  e técnicas de eletromicrografia eletrônica (figura 1) por Selivon e 

colaboradores (2002). 

A IC tem sido demonstrada como um meio de alteração reprodutiva em 

diferentes tipos de moscas-das-frutas do gênero Anastrepha, como R. cerasi e C. 

capitata (Riegler e Staufer, 2002; Zabalou et al., 2004). Recentemente em um 

estudo com o cruzamento de A. sp. 1 e A. obliqua comprovou-se a ocorrência da 

IC nas moscas do gênero Anastrepha (Ribeiro, 2009). Tais resultados elevam a 

perspectiva de ter ocorrido especiação das moscas do complexo fraterculus 

devido à presença da Wolbachia. 

As linhagens de Wolbachia encontradas em diferentes gêneros de 

moscas-das-frutas são em muitos dos casos semelhantes à bactéria encontradas 

em outros tephritideos, o que indica uma transferência horizontal entre táxons 

que divergiram de uma mesma família, tais como moscas que se estabeleceram em 

uma mesma planta, sendo que ao ocupar o mesmo ambiente há maiores chances de 

ocorrer a transferência da bactéria (Kittayapong et al., 2000).  Outro fato 

observado foi em populações de Bactrocera dorsalis da China, em que se 

detectou similaridade com supergrupos de Wolbachia da Tailândia das mesmas 



40 
 

 

espécies de moscas, o que sugere uma a transferência do endossimbionte entre 

estes organismos (Sun et al., 2007). Em diferentes espécies de Anastrepha 

Coscrato e colaboradores (2009) detectaram linhagens de Wolbachia que 

apresentaram relações filogenéticas com o tipo wMel de D. melanogaster.  

Portanto, há uma grande variedade de linhagens de Wolbachia infectando as 

espécies de moscas-das-frutas (Kittayapong et al., 2000). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Objetivos



42 
 

 

 

3.1. Objetivo Geral 

 

 Detectar a presença da bactéria Wolbachia dentro de populações de três 

espécies de Anastrepha, coletadas de diversas regiões do Estado de São Paulo, 

através do uso de marcadores moleculares como o gene wsp, ftsZ e 16S rDNA da 

Wolbachia. 

 

3.2. Objetivos Específicos  

 

 Detecção da presença da Wolbachia em populações de três espécies de 

Anastrepha do estado de São Paulo. 

 

 Caracterizar as linhagens de Wolbachia quanto aos supergrupos A e B por 

meio do uso dos marcadores moleculares. 

 

 Análise das sequências obtidas de Wolbachia nas diferentes populações de 

moscas do complexo fraterculus, utilizando os parâmetros de diversidade 

haplótipa, diversidade nucleotídica (Pi), entre outros que poderão ser 

apresentados.  

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Material e Métodos 



44 
 

 

 

4.1. Coleta das moscas do gênero Anastrepha 

 

Os exemplares de moscas do complexo fraterculus foram obtidos 

através de frutos coletados em campo pelos pesquisadores do Laboratório de 

Biologia Evolutiva e do desenvolvimento de Insetos do Instituto de Biociências 

(IB), da Universidade de São Paulo (USP). 

As coletas foram realizadas em três diferentes regiões do estado de 

São Paulo, (figura 3). No total, foram trabalhados com 74 indivíduos distribuídos 

em três populações de diferentes espécies de Anastrepha (tabela 1).  

 

 

 
Figura 3: Mapa do Estado de São Paulo com as localidades de coleta dos frutos. 

 

 

 

 



45 
 

 

Tabela 1: Espécies de moscas-das-frutas, total de amostras em cada população, plantas hospedeiras, 
locais de coleta e posição geográfica no estado de São de Paulo. 

Táxon Espécie N. de 
Indivíduos 

Planta hospedeira Local Coleta Posição 
Geográfica 

 A. sp. 1 aff. fraterculus 11 Goiaba           
(Psidium guajava) 

Jacareí 23o 17´S; 46o 01´W 

fraterculus A. sp. 1 aff. fraterculus 19 Goiaba           
(Psidium guajava) 

Serra Negra 22o 35´S; 46o 50´W 

 A. sp.2 aff. fraterculus 21 Chapéu-do-sol 
(Terminalia catappa) 

Caraguatatuba 23o 39S; 45o 25´W 

 A. sp. 3 aff.fraterculus 24 Chapéu-do-sol 
(Terminalia catappa) 

  

N.: Número 
 

As coletas dos frutos contendo os ovos de moscas-das-frutas, e a 

estocagem foram feitas segundo o procedimento estabelecido por Selivon 

(1996).  

Os frutos infestados (tabela 1) foram coletados e armazenados em 

caixas com vermiculita e encaminhados para o laboratório de Biologia Evolutiva e 

do desenvolvimento de Insetos–IB–USP/SP, onde ocorreu o desenvolvimento das 

larvas até a fase de pupas. Posteriormente, a vermiculita das caixas foi 

peneirada, obtendo-se as pupas, que foram acondicionadas em caixas de acrílico 

apropriadas, para emergência e manutenção das moscas adultas. 

As moscas foram identificadas de acordo com a espécie, sendo 

selecionadas e armazenadas em álcool a concentração de 70% e a temperatura de 

-20oC. 

As amostras foram enviadas para o laboratório de Biotecnologia e 

Genética Molecular, do Departamento de Genética, do Instituto de Biociências 

da UNESP do Campus de Botucatu. Esses materiais foram acondicionados em 

freezer a -20ºC para posterior extração do DNA. 

 

 



46 
 

 

4.2. Obtenção do DNA genômico a partir do abdomen de Anastrepha e 

Quantificação do DNA  

 

4.2.1. Extração de DNA das moscas 

 

O DNA foi extraído do abdômen dos adultos das moscas-das-frutas, 

descritas na tabela 1, utilizando o método descrito por Jowett (1986) com 

algumas modificações. 

As moscas que estavam conservadas em álcool a uma concentração de 

70% foram lavadas em água miliQ autoclavada para a retirada resíduos que 

poderiam atrapalhar a extração. 

Posteriormente, os abdomens das moscas foram excisados com o 

auxílio de uma lâmina e transferidos para tubos de centrifuga de 1,5ml 

autoclavados. 

Em cada tubo contendo o abdômen foi adicionado 200 l de solução de 

homogeneização [Tris-HCl 1 mM (pH = 7, 5), NaCl 60 mM e EDTA 50 mM], sendo 

macerados com o auxílio de pistilos (Eppendorff), até que todo material pôde ser 

visivelmente dissolvido e diluído nas soluções. Após, se adicionou 200 l de 

solução de lise [SDS 1,25%, Tris-HCl 0,3 mM (pH = 9,0), EDTA 0,1 Mm e 

sacarose 5%],  em seguida adicionou-se 5 l de proteinase K (Life Technologies), 

numa concentração final de 100 g/ml. Os tubos foram novamente 

homogeneizados e incubados por uma hora a 65ºC em banho-maria com agitação. 

Posteriormente, as amostras foram resfriadas em gelo por 5 min 

(minutos), adicionou-se 120 l de acetato de potássio 8 M (gelado) e voltaram 

para o gelo por uma hora. Após, os tubos foram centrifugados a 14000 rpm, a 

uma temperatura 4ºC, por um período 10 min. As amostras foram retiradas da 

centrífuga com devido cuidado para que as diferentes fases no tubo 

permanecessem separadas. O sobrenadante foi transferido para outro 



47 
 

 

microtubo, e em seguida dois volumes de etanol 100% foram adicionados. Os 

tubos foram homogeneizados levemente e descansados por 5 min. Após, as 

amostras foram centrifugadas por 5 min, a 25ºC e 14000 rpm, em seguida 

retirou-se o sobrenadante e o pellet foi mantido.  

O pellet foi lavado por duas vezes com etanol a 70% e centrifugado a 

14000 rpm por 2 min a 25ºC. Posteriormente, o etanol foi retirado e os 

microtubos invertidos para a secagem do pellet de DNA, sendo levados para o 

Speed Vacuum. 

O DNA obtido foi diluído em 30 l de água miliQ autoclavada e 

adicionado o volume de 4 l RNAse (10 mg/ml). Em seguida, o DNA foi incubado a 

37ºC em um intervalo 30 a 60 min e armazenado em freezer a - 20ºC. 

 

4.2.2. Quantificação do DNA obtido 

 

O DNA foi quantificado utilizando-se dois métodos. O primeiro 

procedimento de quantificação foi realizado em gel de agarose a 0,8% com Tris-

Borato-EDTA (TBE) 1 X e corado com brometo de etídio, utilizando-se 1 l de 

DNA e 3 l de tampão de carregamento (4 g de sacarose, 0,01 g de azul de 

bromofenol e 10 ml de TE). Este DNA foi comparado com padrões de peso 

molecular conhecido (Lambda DNA, Invitrogen). A visualização foi feita com o 

sistema de fotodocumentação digital Eagle Eye II (Stratagene).  

O segundo método de quantificação foi realizado em 

espectrofotômetro (NanoDrop ND-1000) obtendo-se a concentração do DNA em 

ng/l (tabela 2), além de mensurar a qualidade do DNA por meio de comparações 

de valores de absorbância e grau de pureza.  

 

 



48 
 

 

4.3. Reação de PCR (Reação em cadeia da polimerase) e primers 

empregados para a detecção da Wolbachia  

 

Para detecção da presença da Wolbachia e tipagem dos supergrupos, 

utilizaram-se três conjuntos de primers. Os oligonucleotídeos confeccionados 

referiam-se aos supergrupos A e B de Wolbachia, visto que são comumente 

encontrados em insetos. Assim foi usado o gene ftsZ  A e B (responsável pelo 

ciclo celular da bactéria) descrito por Holden et al. (1993), o 16S A e B rDNA 

(gene ribossomal) (O´Neill et al., 1992) e o wsp A e B (gene que codifica uma 

proteína de superfície da membrana externa da bactéria Wolbachia) (Braig et 

al., 1998) (tabela 2). 

 

Tabela 2: Sequências dos conjuntos de primers utilizados. 
Primer Sequência Referência 

ftsZ A F 5’ CTC AAG CAC TAG AAA AGT CG 3’ Holden et al., 1993 
ftsZ A R 5’ TTA GCT CCT TCG CTT ACC TG 3’ Holden et al., 1993 
ftsZ B F 5' CCG ATG CTC AAG CGT TAG AG 3’ Holden et al., 1993 
ftsZ B R 5’ CCA CTT AAC TCT TTC GTT TG 3’ Holden et al., 1993 

16S A rDNA F 5’ TTC GGC CGG GTT TCA CAC AG 3’ O´Neill et al.,1992 
16S A rDNA R  5’ TAA GGG ATT AGC TTA GCC TC 3’ O´Neill et al., 1992 
16S B rDNA F 5’ TTC GGC CGG ATT TTA CAC AA 3’ O´Neill et al., 1992 
16S B rDNA R 5’ TAG GGA TTA GCT TAG GCT TG 3’ O´Neill et al., 1992 
wsp 136 A F 5´ TGA AAT TTT ACC TCT TTT C 3´ Braig et al., 1998 
wsp 691 A R 5´AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3’ Braig et al., 1998 
wsp 81 B F 5´ TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAA C 3’ Braig et al., 1998 

wsp 522 B R 5´ ACC AGC TTT TGC TTG ATA 3´ Braig et al., 1998 
F: foward; R: reverse 

 

Para o conjunto de primers wsp a reação consistiu de amostras na 

concentração de 50 ng, 2 µl de tampão 10 X (Invitrogen), 1,0 µl de MgCl2 (50 

µM), 0,4 µl de uma mistura de nucleotídeos (10 µM de cada), 0,5 µl de primer 

foward (F) (20 µM), 0,5 µl de primer reverse (R) (20 µM), 0,5 µl da DNA Taq 

polimerase (5 U/l) (Invitrogen), água destilada ou deionizada autoclavada para o 

volume final de 20 µl. Os ciclos de amplificação foram: um ciclo de 1 min a 94oC, 1 



49 
 

 

min a 58oC, 2 min a 72oC, 35 ciclos de 15 s (segundos) a 94oC, 1 min a 58oC, 2 min 

a 72oC e um ciclo de 15s a 94oC, 1 min a 58oC, 7 min a 72oC.  

O outro oligonucleotídeo empregado foi o ftsZ, a reação de PCR 

empregada consistiu de amostras de DNA na concentração de 50 ng, 2 l de 

tampão 10 X (Invitrogen), 0,6 l de MgCl2 (50 M), 0,4 l de uma mistura de 

nucleotídeos (10 M de cada), 0,5 l de primer F a 10 M, 0,5 l de primer R a 

10M, 0,5 l de DNA Taq polimerase (Invitrogen) (5 U/l), água destilada ou 

deionizada autoclavada adicionada para um volume final de 20 l. A amplificação 

para este primer ocorreu com uma desnaturação inicial de 4 min a 94ºC, um ciclo 

de 1 min a 58ºC e 2 min a 72ºC, 38 ciclos de 15 s a 94ºC, 1 min a 58ºC e 2 min a 

72ºC, e outro ciclo de 15 s a 94ºC, 1 min a 58ºC, com uma extensão final de 7 min 

a 72ºC. 

Para o primer 16S rDNA, a reação consistiu em amostras de DNA na 

concentração de 50 ng, 2,5 l de tampão 10X (Invitrogen), 0,75 l de MgCl2 

(50M), 0,5 l de mistura de nucleotídeos (10mM de cada), 0,35 l de primer F 

(20M), 0,35 l de primer R (20 M), 0,25 l de DNA Taq polimerase 

(Invitrogen) (5 U/l), água destilada ou deionizada autoclavada para um volume 

final de 25 l. O programa de amplificação consiste em uma desnaturação inicial 

de 2 min a 95ºC, 35 ciclos de 30 s a 95ºC, 1 min a 55ºC e 1 min a 72ºC, com 

extensão de 3 min a 72ºC. 

Os produtos da amplificação foram detectados por eletroforese, na 

corrente constante de 110 mA, por aproximadamente duas horas. Em cada 

canaleta do gel foram adicionados 5 l de cada amostra, juntamente com de 3 l 

de TC, em um gel de agarose 1%, com tampão Tris-Borato EDTA (TBE 1X). O gel 

foi corado com brometo de etídio 1%. A visualização foi feita com o sistema de 

fotodocumentação digital Eagle Eye II (Stratagene). Os fragmentos observados 

tiveram tamanho de 1043-1055 pb (pares de base) para o primer ftsZ A, 259 pb 

para o 16S A rDNA e em torno de 600 bp para o wsp A. 



50 
 

 

4.4. Purificação da reação de PCR, excisão e purificação de fragmento 

de gel de agarose  

 

4.4.1. Purificação da reação de PCR 

 

As purificações das reações de PCR foram realizadas com o primer wsp 

quando se visualizou um único fragmento no gel de agarose com tamanho em torno 

de 600 bp. Para esta purificação foi utilizada 2 µl da enzima Exosap (GE) e 8 µl 

da reação de PCR. Posteriormente, foram levados ao banho maria a 37oC por 33 

min, e após este período a outro banho maria a 85oC por 15 min. Após a 

purificação, as amostras foram avaliadas quanto a sua concentração em 

espectrofotômetro (NanoDrop ND-1000). 

 

4.4.2. Excisão e purificação de fragmento de gel de agarose 

 

Ao se visualizar e detectar a presença de mais um fragmento, quando 

houve inespecificidade da reação, foi realizado a excisão da banda do gel e 

transferida para tubos de 1,5 ml. Após, foram submetidas a purificação com o kit 

GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification da Amersham Pharmacia Biotech, de 

acordo com a metodologia do fabricante. 

 

4.5. Método de Clonagem 

 

Para realização da clonagem o DNA foi ligado ao vetor pGEM-T 

(Promega) utilizando-se diferentes volumes DNA conforme a sua concentração. 

Adicionou-se 1,0 l da enzima T4 ligase, 3,5 l tampão e 0,5 l do vetor para o 

volume final de 7,0 l. Estes valores foram otimizados a partir do protocolo 

original fornecido pelo fabricante, sendo mantida a 16ºC por 16 horas.  



51 
 

 

Após este período, os 7,0 l da ligação foram adicionados em 50 l de 

células competentes DH5- de Escherichia coli, preparadas no próprio 

laboratório e transformadas após choque térmico. Posteriormente, adicionou-se 

volume de 600 l de meio CG (Circle Grow/Bio 101, Inc.) as amostras foram 

transformadas, e colocadas em um agitador a 37ºC por uma hora. 

As amostras que cresceram foram plaqueadas em meio CG contendo 

ágar, ampicilina (50 mg/ml) e os marcadores X-GAL e IPTG. Após este 

procedimento, foram estocadas em estufa a 37ºC overnight. No outro dia, as 

colônias brancas, que se esperou conter o insert, foram selecionadas com 

ponteiras estéreis, mergulhadas em um mix, previamente preparado com o primer 

M13 F e M13 R, e riscadas em outra placa com CG e ágar para produção de 

colônias permanentes.  

A reação de PCR com o primer M13 foi otimizada utilizando-se 2,5 l 

de tampão 10 X (Invitrogen), 1,25 l de MgCl2 (50 M), 1,25 l de mistura de 

nucleotídeos (10 mM de cada), 1,25 l de primer F (20 M), 1,25 l de primer R 

(20 M), 0,10 l de DNA Taq polimerase (5 U/l) e água destilada ou deionizada 

autoclavada para o volume final de 25 l. O programa de amplificação consistiu 

em uma desnaturação inicial de 3 min a 95ºC, 35 ciclos de 45 s a 95ºC, 45 s a 55º 

C e 1 min a 72ºC, com extensão de 5 min a 72ºC. 

A confirmação da presença do insert foi realizada através de 

visualização em gel de agarose a 1%. Os produtos de PCR que continham o 

fragmento de DNA de interesse amplificaram bandas com tamanho em torno de 

600 bp para wsp A mais uma região do plasmídeo, em torno de 280 bp. 

Posteriormente a reações de PCR positivas foram purificados 

utilizando a enzima Exosap (GE). Em seguida as amostras foram quantificadas em 

espectrofotômetro (NanoDrop ND-1000). 

 



52 
 

 

4.6. Sequenciamento 

 

Duas reações foram realizadas, uma para o primer F e outra o primer 

R, com um volume de DNA na concentração de 100 ng/l de acordo com o 

tamanho do fragmento. Adicionou-se 1,0 l de Tampão de Sequenciamento (Tris-

HCl 1M pH 9.0 e MgCl2 50mM), 2,0 l  Big Dye e 1,00 l de primer (5 pmol/l), 

água destilada ou deionizada autoclavada para o volume final de 10 l. 

O programa de amplificação consistiu em desnaturação inicial de 1 min 

a 96ºC, 35 ciclos de 10 s a 96ºC, 5 s a 50ºC e 4 min a 60ºC, permanecendo a 10ºC. 

As seqüências foram obtidas a partir do sequenciador automático 

modelo 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). 

 

4.7. Análise das sequências   

 

Os consensos dos reads de cada clone foram montados através dos 

programas phred Phrap/consed versão (ver.) 14.0 (Gordon et al., 1998). Após, 

foram retirados os fragmentos do vetor das sequências com o auxílio da 

ferramenta vecscreen encontrada no banco de dados NCBI (National Center for 

Biotechnology Information), http://www.ncbi.nlm.nih.gov e foram inseridas na 

ferramenta “blastn” (Altschul et al., 1990) do NCBI para se buscar homologia 

com Wolbachia. 

 

4.7.1. Análises de variações das sequências 

 

Com a confirmação da presença da Wolbachia, as sequências foram 

alinhadas no programa ClustaX ver. 1.81 para PC (Thompson et al., 1997) e quando 

necessário foi realizada a formatação manual no programa BIOEDIT (www. 

mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), com o auxílio do programa Chromas 1.45 



53 
 

 

(1996-1998, Connor McCarthy) (http://www.technelysium.com.au/chromas.hlp). 

Em seguida as análises de distância genética intra e interpopulacionais foram 

determinadas através do modelo de Kimura 2 parâmetros (Kimura, 1980) em que 

se excluíram os alinhamentos em gap. As matrizes de distância foram calculadas 

para a construção de dendograma com o algoritmo Neighbor-joining (NJ) (Saitou 

e Nei, 1986), realizando análises de bootstrap com 10000 réplicas através do 

software MEGA ver. 4.0.2 (Kumar et al., 2008).  

Com o software DnaSP ver. 5.00.05 (Librado e Rozas, 2009) foram feitas 

análises de número de haplótipos (h), diversidade haplotípica (Hd), a diversidade 

de nucleotídeos dentro e entre as populações (Pi), e por fim a taxa de 

diversidade de nucleotídeos conforme as substituições sinonímias (SS). 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
5. Resultados 



55 
 

 

 
 5.1. A Quantificação do DNA extraído das moscas-das-frutas 
 
 

Dois métodos de quantificação de DNA foram utilizados após a 

extração do DNA dos exemplares de Anastrepha. Um desses realizado em gel de 

agarose 0,8%, contudo, os valores obtidos não foram confiáveis, pois se 

basearam na visualização e comparação com padrões de peso molecular conhecido 

(figura 4).  

 

 
Figura 4: Quantificação em gel de agarose a 0,8%. 1,2 e 3: marcadores com peso 

molecular de 50, 100 e 150 ng/µl, respectivamente; 4 a 14: DNA de 
Wolbachia extraída de A. sp. 1. 

 

 

A análise realizada através do espectrofotômetro apresentou valores 

precisos, além de fornecer dados sobre a qualidade do DNA. As amostras que 

apresentaram valor de absorbância próximo a dois foram utilizadas nas reações 

de PCR, pois este é o grau indicado para uma boa qualidade do DNA. As médias 

dos valores de concentração de DNA e absorbância das amostras de cada região 

estudada podem ser observadas na tabela 3. 

 

 

 



56 
 

 

 

Tabela 3: Quantificação do DNA de Anastrepha spp. mensurada em 
espectrofotômetro com média das concentrações de DNA e dos valores 
da relação 260/280, de acordo com a região estudada. 

População Amostras Concentração DNA (ng/ul) Relação 260/280 
Jacareí A. sp. 1 559,66 2,05 

Serra Negra A. sp. 1 578,82 1,88 
Caraguatatuba A. sp. 2 317,23 1,70 

A. sp. 3 673,92 1,94 
 

5.2. Detecção da Wolbachia e Sensibilidade dos primers 

 

Os testes realizados com os primers 16S rDNA, wsp e ftsZ são 

apresentados a seguir: 

 

 5.2.1. Primer 16S rDNA 

 

As amostras das três regiões estudadas foram testadas com o primer 

16S rDNA,  onde se detectou a presença da bactéria Wolbachia gerando 

fragmentos em torno de 259 bp (figuras 5, 6 e 7).  

 

 
Figura 5: Gel de agarose 1% com indivíduos da população de Jacareí. (A) Primer 16S A 

rDNA. (B) Primer 16S B rDNA. 1: Ladder 100bp; 2 a 13: indivíduos A. sp. 1. 
 

 



57 
 

 

 
 
 
 
 

 
Figura 6: Gel de agarose 1% com indivíduos da população de Caraguatatuba. (A) Primer 16S A 

rDNA. (B) Primer 16S B rDNA. 1: Ladder 100bp; 2 a 5: indivíduos A. sp.2 , 6 a 10: 
indivíduos A. sp.3; 12: Controle positivo com o primer 16SA e B rDNA; 13: Controle 
negativo. 

 
 
 
 
 
 

 
Figura 7: Gel de agarose 1% com o primer 16S A rDNA 

com os indivíduos da população de Serra Negra. 
1: Ladder 100bp; 2 a 6: indivíduos A. sp.1; 7: 
Controle negativo. 

 
 
 
 



58 
 

 

5.2.2. Primer wsp 

 

Com a utilização do oligonucleotídeo wsp também foram detectadas a 

presença da Wolbachia nas 74 amostras (figuras 8 e 9), assim como observado 

com o primer 16S rDNA.  

 

 
Figura 8: Gel de agarose 1% com o primer wsp A com indivíduos da 

população de Jacareí. 1: Ladder 100bp; 2 a 11: indivíduos A. 
sp.1,  12: Controle negativo. 

 
 
 
 

 
Figura 9: Gel de agarose 1% com o primer wsp A com indivíduos da população de 

Caraguatatuba; 1: Ladder 100bp; 2 a 5: indivíduos A.  sp.2; 6 a 13: 
indivíduos A.  sp.3; 14: Controle negativo.  

 
 



59 
 

 

5.2.3. Primer ftsZ 

 

As primeiras amostras a serem testadas com o primer ftsZ foram da 

população de Jacareí da espécie A. sp. 1 (figura 10).  

 

 
Figura 10: Gel de agarose 1% com o primer ftsZ A com indivíduos 

da população de Jacareí. 1: Ladder 100bp; 2 a 9: 
indivíduos A. sp.1. Setas indicam a presença de 
fragmento. 

 
 

Os testes posteriores realizados com o primer ftsZ passaram por 

diversas alterações nos protocolos de PCR, e serão apresentadas a seguir: 

 

5.2.3.1. Alterações nas reações de PCR com o primer ftsZ 

 

O primer ftsZ  é amplamente estudado em Wolbachia, e devido a sua 

baixa sensibilidade na detecção da bactéria em Anastrepha, neste trabalho 

procurou-se otimizar o protocolo de PCR, fazendo alterações nas concentrações 

de DNA, MgCl2, dNTPs, primers, DNA Taq polimerase e qualidade do DNA 

utilizado, na tentativa de redução dos falsos negativos. 



60 
 

 

As mudanças realizadas na reação de PCR com o primer ftsZ são 

apresentadas na tabela 4. Inicialmente alterou-se o volume de DNA, utilizando 

diferentes valores a partir dos 5 l (50ng/l) empregados anteriormente. No 

entanto, foi detectada Wolbachia em 27% das amostras da população de Jacareí 

com um volume de 3 l de DNA (50ng/l) (tabela 5). Com a obtenção destes 

resultados adotou-se o volume de 3 l (50ng/l) nas reações em seguida 

propostas. 

Os protocolos de II a VIII (tabela 4) não permitiram a detecção de 

Wolbachia (figura 11), demonstrando a ineficiência destas alterações. 

 

 

 
  Figura 11: Porcentagem de detecção da bactéria Wolbachia nas espécies de moscas-das-

frutas utilizando os primers 16S rDNA, wsp e os diferentes protocolos utilizados 
com o primer ftsZ (indicados de I a VIII). 

 

 

 

 



61 
 

 

 
Tabela 4: Alterações no protocolo de PCR com o primer ftsZ, identificados por I a VIII. 

Reação de PCR Reagentes Concentração Volume (l) 
I DNA 50 ng/l 3,00 
II MgCl2 50 mM 0,50 

 DNA 50 ng/l 3,00 
 Primer F 8 M 0,50 

III Primer R 8 M 0,50 
 DNA 50 ng/l 3,00 

IV MgCl2 50 mM 0,50 
 Primer F 8 M 0,50 
 Primer R 8 M 0,50 
 DNA 50 ng/l 3,00 
 DNTP 10 mM 0,50 

V MgCl2 50 mM 0,50 
 DNA 50 ng/l 3,00 
 DNTP 10 mM 0,50 
 MgCl2 50 mM 0,50 

VI Primer F 8 M 0,50 
 Primer R 8 M 0,50 
 DNA 50 ng/l 3,00 

VII DNA Taq polimerase 1 unidade 0,25 
 DNA 50 ng/l 3,00 

VIII DNA fresco 50ng/l 5,00 
 
 
 
 
 
 

Tabela 5: Porcentagem de detecção da Wolbachia com as alterações feitas 
nos protocolos utilizando o primer ftsZ, indicados de I a VIII. 

Protocolos           Populações                            Total 
Jacareí Serra Negra Caraguatatuba  

I 27% - - 4% 
II - - - - 
III - - - - 
IV - - - - 
V - - - - 
VI - - - - 
VII 63,33% 42,10% 42,50% 44,90% 
VIII - 55% n 20,16% 

(-): 100% de ausência de fragmento; (n): amostras não testadas com protocolo. 
 
 
 
 



62 
 

 

Com a modificação do volume da enzima DNA Taq polimerase e do 

número de ciclos da reação de PCR, de 35 para 40 (para aumentar o número de 

fragmentos de DNA gerados), diagnosticou-se Wolbachia em 44,90% das 

amostras (tabela 5 e figura 11). Porém, este protocolo, ao ser utilizado com os 

mesmos indivíduos em reações diferentes não apresentou repetição de 

resultados (figura 12A e B).  

 

 

 
Figura 12: Gel de agarose 1% com exemplares de A. sp. 1 da população de Jacareí 

utilizando o protocolo VI com o primer ftsZ. (A) 2 a 5: A. sp.1; (B) 2 a 
13: A. sp.1; interrogação (?): baixa repetibilidade dos dados, com 
ausência de fragmento que era observado na figura A, no mesmo 
indivíduo. 1: Ladder 100bp; Setas: presença de fragmento. 

 
 
 

A qualidade do DNA foi testada com material fresco, utilizado um dia 

após a extração, com as amostras de Jacareí e Serra Negra (tabela 4). Nas 

reações anteriores estava-se empregando DNA armazenado por um período 

maior que sete dias a uma temperatura de -20o C, o que poderia prejudicar a 

qualidade deste DNA. Um total de 20,16% de presença da Wolbachia foi 

observado na reação de PCR com o primer ftsZ nas amostras de DNA fresco 

(tabela 5).  

 



63 
 

 

5.3. Análise das populações de Anastrepha quanto aos supergrupos  

 

A três populações de moscas-das-frutas apresentaram infecção com 

Wolbachia como observado anteriormente. Além disso, foram analisadas quanto 

ao supergrupo A e B da bactéria com conjuntos de primers wsp A e B, 16S A e B 

rDNA e ftsZ A e B.  

Na figura 13, observa-se que os primers 16S A e B rDNA e os primers 

ftsZ A e B detectaram somente infecção com o supergrupo A. Porém, o primer 

wsp indicou também a presença do supegrupo B de Wolbachia (Figura 14B), mas 

estes dados não foram considerados, pois o oligonucleotídeo wsp apresenta 

reação cruzada, isto é o marcador wsp B apresenta região homologa ao do wsp A. 

Somente se consideraria estes resultados se os outros primers empregados 

também detectassem o mesmo tipo de supergrupo nas amostras estudadas. 

 

 

 
Figura 13: Identificação dos supergrupos A e B de Wolbachia com conjuntos de primers 16S 

A e B rDNA, wsp A e B e ftsZ A e B, nas Anastrepha spp. populações estudadas. 
 



64 
 

 

 
Figura 14: Gel de agarose 1% com a população de A. sp. 1 de Serra Negra. (A) 

primer wsp A. (B) primer wsp B. 1: Ladder 100bp; 2 a 6: indivíduos  
A.  sp.1. 

 
 

5.4. Análises das sequências  

 

Os fragmentos gerados com a utilização do primer wsp A nas 74 

amostras de Anastrepha foram clonados, sequenciados e submetidos ao 

GeneBank, o que permitiu confirmar a correspondência destes fragmentos como 

sendo de Wolbachia. Além disso, estes resultados foram utilizados para avaliar 

os polimorfismos das diferentes sequências de DNA amplificadas nas populações 

estudadas. 

Seis sequências apresentaram baixa homologia com o genoma da 

Wolbachia devido o cromatograma ter apresentado uma grande quantidade de 

picos sobrepostos, dificultando a análise dos dados. Estes resultados persistiram 

mesmo após diferentes alterações nos protocolos de PCR, clonagem e 

sequenciamento. 

 

 

 



65 
 

 

5.4.1. Amplificação de sequências não relacionadas ao gene wsp 

 

Os fragmentos gerados com o primer wsp das 68 amostras foram 

comparados no banco de dados NCBI, e observou-se que seis destas sequências 

não foram homologas ao gene wsp. 

Das seis sequências, três obtidas de indivíduos da população Jacareí e 

duas da população de Caraguatatuba das moscas da espécie A. sp. 3, 

apresentaram similaridade com sequências de transposon  tipo mariner de 

Bactrocera tryoni, acesso AF349132. Uma amostra da população Caraguatatuba 

(A. sp. 2) teve similaridade com sequência de transposon tipo mariner em 

Ceratitis rosa, com acesso AY426626 (tabela 6). 

 

Tabela 6: Indivíduos que tiveram similaridade com outra sequência que não o gene wsp de 
Wolbachia. 

População Espécie N. ind. Supergrupo* Similaridade Acesso 

Jacareí A. sp. 1 3 A Transposon mariner de 
Bactrocera tryoni 

AF349132 

    
Caraguatatuba 

A. sp. 2 1 A Transposon mariner de 
Ceratitis rosa 

AY426626 

 A. sp. 3 2 A Transposon mariner de 
Bactrocera tryoni 

AF349132 

N.: número, ind.: indivíduos, *: Referente a análises realizadas via PCR.  
 

 

5.4.2. Análise das diferentes populações de Anastrepha quanto as 

linhagens de Wolbachia detectadas 

  

Na tabela 7 estão representadas as diferentes linhagens de Wolbachia 

encontrada nas populações estudadas. 

 

 



66 
 

 

Tabela 7: Linhagens de Wolbachia detectadas nas diferentes populações de Anastrepha. 

População Espécie Linhagem ACESSO Similaridade Total 

Jacareí A. sp. 1 B. pahangi (Bp-1-1001) AY527208.1 96% 100% 

Serra Negra A. sp. 1 B. pahangi (Bp-1-1001) AY527208.1 96% 21,05% 

  A. sp. 2 (wAsp2B) EU116316.1 99% 78,95% 

Caraguatatuba A. sp. 2,  B. pahangi (Bp-1-1001) AY527208.1 96% 61,1% 

 A. sp. 3 A. sp. 2 (wAsp2B) EU116316.1 98% 38,9% 

 

De 10 indivíduos, sete (70%) das sequências geradas a partir das 

bactérias encontradas nas moscas da população de Jacareí, apresentaram 

similaridade com uma única linhagem da bactéria presente no hospedeiro 

nematóide Brugia pahangi (Bp-1-1001) (tabela 7 e figura 15), e 30% apresentaram 

altos valores de similaridade com elementos transponíveis  

A população de Serra Negra apresentou duas diferentes linhagens de 

Wolbachia (tabela 7). Destas, 78,95% apresentaram similaridade de 99% com 

Wolbachia encontradas em Anastrepha sp. 2 (wAsp2B), e 21,05% apresentaram 

similaridade de 96% com Wolbachia de Brugia pahangi (Bp-1-1001).  

A população de Caraguatatuba apresentou duas linhagens de 

Wolbachia, uma pertencente a Brugia pahangi (Bp-1-1001) e outra a A. sp. 2  

(wAsp2B), com valores de  similaridade 96% e 98%, respectivamente (tabela 7).  

As amostras estudadas apresentaram maior grau de infecção com a 

linhagem de Wolbachia Bp-1-1001, e 46% das amostras apresentaram linhagem de 

Wolbachia wAsp2B (figura 15). 

 



67 
 

 

 
Figura 15: Linhagens de Wolbachia detectadas nas populações de Anastrepha. 

 
 
 

5.5. Análises das sequências das Wolbachia encontradas nas 

Populações de mosca-das-frutas do gênero Anastrepha  

 

Os dados apresentados foram realizados com 62 amostras, uma vez 

que foram excluídas 12 amostras referentes as sequências de baixa qualidade 

para análise, e sequências que apresentaram homologia com transposon. 

As análises de distância genética foram realizadas no software MEGA 

ver. 4.0.2 utilizando como parâmetro o algoritmo de Kimura (Kimura 2-

parâmetros), que considera a ocorrência de transições e transversões, dando 

pesos diferentes para estas duas modificações. Para a construção dos 

dendograma foi utilizado o método de NJ.  

O software DnaSP ver. 5.00.05 foi utilizado para se estimar o número 

de haplótipos encontrados (h), diversidade haplotípica (Hd),  a taxa de 

diversidade de nucleotídeos (Pi) e a diversidade de nucleotídeos de acordo com 

as substituições sinônimas (SS) através das análises inter e intrapopulacionais 

demonstradas a seguir. 



68 
 

 

5.5.1. Análises Intrapopulacionais 

 

Com as comparações realizadas entre as sequências da Wolbachia 

encontradas nas populações de Anastrepha, pode-se observar como estavam 

distribuídos as linhagens de Wolbachia em cada população.  

A população de Jacareí teve média dos valores de distância de 0, 298 

(figura 16), e o indivíduo JAsp1-4 apresentou menor similaridade com as 

sequências desta população.   

 

 
Figura 16: Árvore obtida a partir do método NJ com bootstrap de 10000 repetições, 

baseada no gene wsp, demonstrando a distância entre as Wolbachia da 
população de Jacareí (A. sp. 1-2, 3, 4, 5, 6, 8 e 11). Os valores de bootstrap 
são indicados antes de cada nó. 

 

A população de Serra Negra já havia sido diagnosticada com as duas 

linhagens de Wolbachia. As análises com o método de Kimura detectaram altos 

valores de distância (média de 0, 895), visto que as sequências são distintas 

entre si. Na figura 17 pode-se observar a formação de dois grupos, um no ramo 

inferior com quatro indivíduos infectados com a linhagem de Wolbachia de 

nematóide (Bp-1-1001) (identificados como “Bru”), e outro no ramo superior com 

a linhagem de Wolbachia de A. sp. 2 (wAsp2B) (indicados por “Mos”).  



69 
 

 

Ao analisar a subpopulação “Bru” foi encontrado altos valores de 

distância relacionados ao individuo Asp1-10, os outros indivíduos apresentaram 

alta similaridade de 99%. Já no subgrupo “Mos” houve homologia das sequências 

de 50,5%, isto se deve ao fato da formação de dois grupos, um no ramo superior 

com similaridade de 99,3% e distância média de 0,007, e outro no ramo inferior 

com similaridade de 99,7% e distância média de 0,003 (figura 17).  

 

 
Figura 17: Árvore obtida a partir do método NJ com bootstrap de 10000 repetições, baseada no 

gene wsp, demonstrando a distância entre as Wolbachia da população de Serra Negra 
(A. sp. 1- 1 a 19). “Mos”: grupo ramos superior; “Bru”: grupo ramo inferior. Os valores 
de bootstrap são indicados antes de cada nó. 



70 
 

 

Na figura 18 observa-se que na população de Caraguatatuba formaram-

se dois grupos distintos. Um no ramo superior, em que se observou íntima relação 

entre os indivíduos infectados com linhagem de Wolbachia de nematóide (Bp-1-

1001) (indicado como “Nem”), e no ramo inferior há um grupo formado com as 

sequências das Wolbachia com a linhagem de A. sp.2 (wAsp2B) (indicados como 

“Fly”).  

Na subpopulação “Nem” a similaridade das sequências foi de 63,2%, 

com distância entre a linhagem de Wolbachia encontrada de 0, 368, estes 

valores estão relacionados as ramificações observadas na figura 18, que se 

formaram devido a diferença entre as sequências das linhagens de Wolbachia de 

nematóide. Os indivíduos do ramo superior apresentaram distância média de 

0,014, com similaridade de 98,6%, e na outra bifurcação a similaridade foi de 

98,4% com distância média de 0,016. 

Na subpopulação “Fly” a similaridade foi de 72%, com distância média 

de 0,280, e do mesmo modo que a subpopulação “Nem”, foram observadas 

ramificações conforme o tipo de sequência encontrada na linhagem Wolbachia 

referente a mosca (wAsp2B). Entre os indivíduos Asp3-18 e 19 houve 

similaridade de 99%, com distância média de 0, 010, já no ramo inferior a 

similaridade teve valores correspondentes a 100%. 

 



71 
 

 

 
Figura 18: Árvore obtida a partir do método NJ com bootstrap de 10000 repetições, 

baseada no gene wsp, demonstrando a distância entre as Wolbachia da população 
de Caraguatatuba (A. sp. 2 e A. sp. 3). “Nem”: grupo do ramo superior; “Fly”: 
grupo do ramo inferior. Os valores de bootstrap são indicados antes de cada nó. 



72 
 

 

Através das análises intrapopulacionais, observou-se que as populações 

de Serra Negra e Caraguatatuba apresentaram altos níveis de diversidade de 

nucleotídeos (Pi) e de substituições sinonímias (SS) entre as sequências do gene 

wsp de Wolbachia analisadas (tabela 8). Cada uma destas populações é 

constituída por duas linhagens diferentes de Wolbachia (wAsp2B e Bp-1-1001), o 

que aumenta sua diferença conforme Pi e SS. Ao avaliar suas subpopulações 

houve destaque de uma em cada população, a “Mos” e a “Nem”.   

Os valores de Pi e de SS observados foram semelhantes, com exceção 

da população de Serra Negra e de Caraguatatuba, devido as diferentes linhagens 

de Wolbachia existentes nestas populações (tabela 8). Estes valores serão 

melhores explorados ao se analisar os diferentes padrões de sequências 

referentes as linhagens de Wolbachia encontradas. 

 

Tabela 8: Valores de diferenciação genética calculados através do programa DnaSP Ver.5.00.05. 
 Jacareí Serra 

Negra 
“Bru” “Mos” Caraguatatuba “Nem” “Fly” 

Diversidade de nucleotídeos 
(Pi) 

0,165 0,418 0,278 0,281 0,413 0,203 0,153 

Diversidade de 
nucleotídeos(Pi) conforme 

SS 

0,168 0,464 0,291 0,330 0,450 0,207 0,179 

 

5.5.2. Análises Interpopulacionais 

 

As análises a seguir foram realizadas através de comparações das 

populações estudadas. 

A partir da comparação das sequências de Wolbachia das populações, 

foi construído um dendograma representado na figura 19, e formaram-se dois 

grupos distintos com altos valores de distância entre estes. Estes grupos 

organizaram-se conforme a linhagem da Wolbachia, um observado no ramo 



73 
 

 

superior, constituído somente por moscas que apresentaram a mesma linhagem de 

Wolbachia Bp-1-1001 (nematóide) (indicado por “Bgi”). O segundo grupo, no ramo 

inferior (indicado por “Asp”), foi composto por linhagens de Wolbachia 

pertencentes A. sp. 2 (wAsp2B). As médias das distâncias dentro dos grupos 

“Bgi” e “Asp” foram de 0, 348 e 0, 493 respectivamente. 

Além disso, observou-se que toda a população de Jacareí está 

agrupada em “Bgi”, juntamente com as outras linhagens de Wolbachia referente 

a B. pahangi (Bp-1-1001) das populações de Serra Negra e Caraguatatuba. Com 

isso, o grupo “Asp” foi constituído pelas populações de Serra Negra e 

Caraguatatuba. 

O subgrupo “Bgi” formou dois ramos, o inferior teve 98,5% de 

similaridade; o indivíduo Asp3-13 apresentou as maiores distâncias de 0, 014 a 

0,019. A bifurcação superior apresentou distância média de 0, 014, com 

similaridade de 98,6%. Portanto, ao se subdividir o grupo “Bgi” e analisá-lo 

conforme as divisões observadas a similaridade foi maior que a apresentada no 

grupo maior, que foi de 65,2%. 

A similaridade observada no grupo “Asp” foi de 50,8%, e também 

houve distribuição em dois grupos como em “Bgi” (figura 19). No ramo inferior a 

similaridade foi de 99,4%, sendo que os indivíduos reunidos na parte superior 

deste agrupamento foram idênticos entre si, assim como os indivíduos Asp1-2, 8, 

11, 14 e 19. Dentro deste mesmo subgrupo, o indivíduo Asp1-13 apresentou os 

maiores valores de distâncias médias de 0, 003 a 0, 014 comparado com os 

outros indivíduos. 

 



74 
 

 

 
Figura 19: Árvore obtida a partir do método NJ com bootstrap de 10000 repetições, baseada no 

gene wsp, demonstrando a distância entre as populações de moscas contendo Wolbachia. 
Jacareí: JAsp1; Serra Negra: Asp1; Caraguatatuba: Asp2 e Asp 3;  “Asp”: subgrupo superior; 
“Bgi”: subgrupo inferior, wBjc, wBsp, wAnc e wAsc: agrupamentos que deram origem as novas 
linhagens. Os valores de bootstrap são indicados antes de cada nó. 



75 
 

 

Na tabela 9 estão indicadas as taxas de diversidade de nucleotídeos 

(Pi) das sequências do gene wsp de Wolbachia, ao se comparar as populações 

estudadas. Os valores de Pi entre Jacaréi e Caraguatatuba foram menores 

comparando-se Jacareí e Caraguatutaba a Serra Negra, demonstrado as 

sequências mais similares. 

 

Tabela 9: Taxa diversidade de nucleotídeos (Pi) das sequências do gene wsp de Wolbachia 
ao se comparar as diferentes populações de moscas-das-frutas. 

 Jacareí “Bru” “Mos” “Nem” “Fly” Serra 
Negra 

Caraguatatuba 

Jacareí - 0, 187 0, 448 0, 190 0, 397 0, 462 0, 389 
Bru 0, 187 - 0, 418 0, 204 0, 352 - 0, 403 
Mos 0, 448 0, 418 - 0, 442 0, 272 - 0, 456 
Nem 0, 190 0, 204 0, 442 - 0, 413 0, 431 - 
Fly 0, 397 0, 352 0, 272 0, 413 - 0, 358 - 

 

 

5.5.3. Análises das Sequências conforme a linhagem de Wolbachia  

 

Ao comparar as duas linhagens de Wolbachia das três populações de 

Anastrepha foi observado um total de 42 haplótipos com altas taxas de 

diversidade haplotípica (tabela 4). Estas linhagens de Wolbachia encontradas 

apresentaram dois tipos de sequências para cada uma, o que gerou altas taxas de 

diversidade, e a partir disso, foram realizadas análises conforme o tipo de 

sequência. 

 

5.5.3.1. Análises da Linhagem de Wolbachia caracterizada como 

Wolbachia de A. sp. 2 (wAsp2B) 

 

Dois tipos de sequências foram encontrados na linhagem de Wolbachia 

caracterizada como de A. sp. 2 (wAsp2B), as quais foram denominadas wAsc e 

wAnc. 



76 
 

 

A linhagem wAsc foi correspondente aos indivíduos encontrados no 

ramo inferior do grupo “Asp”, e wAnc a ramificação superior do grupo “Asp” 

(figura 19). Ambas as linhagens apresentaram grande similaridade das suas 

sequências ao serem avaliados separadamente, conforme já observado.  

Ao observar uma frequência relativa maior que 1,00% de uma sequência 

com diferentes mutações, pode-se considerar diferentes haplótipos nas 

linhagens de Wolbachia encontradas. 

 Um total de três haplótipos foram encontrados na linhagem wAsc, e 

baixo valor Pi (tabela 10). Além disso, foram identificadas duas substituições 

sinônimas (SS) e seis substituições não sinônimas (NSS) (tabela 11), sendo que os 

indivíduos que possuíram maior número de mutações foram Asp1-2, 8, 11, 14, 19, 

pertencentes população de Jacareí. 

 

 

Tabela 10: Média dos valores de diversidade genética calculados através do 
programa DnaSP Ver.5.00.05. 

 wAsc wAnc wBsp wBjc 
Node haplótipos (h) 3 8 7 25 

Diversidade Haplótipica (Hd) 0,522 0,945 1 0,994 
Diversidade de nucleotídeos (Pi) 0,006 0,007 0,014 0,013 
Diversidade de Nucleotídeos (Pi) 

conforme SS 
0,008 0,012 0,025 0,017 

 
 

 

Tabela 11: Posições de sítios polimórficos e total de indivíduos com estes polimorfismos na 
linhagem wAsc. 

Haplótipos Total de 
Indivíduos 

FR* 

1 A C A G A T G A 11 64,7% 
2 G T G A C A A T 5 29,4% 
3 · T G . . . . . 1 5,9% 

Posição dos sítios 
variáveis 

55 165 255 281 286 292 296 316   

*FR: Frequência relativa dos haplótipos observados na linhagem indicada. 
 
 



77 
 

 

 
A linhagem wAnc apresentou oito tipos de haplótipos e valor de Pi 

semelhante a wAsc (tabela 10), gerando um total de quatro SS e oito NSS 

(tabela 12), e os indivíduos que apresentaram maior número de substituições 

foram Asp1-12 e 16. 

 
 
 
Tabela 12: Posições de sítios polimórficos e total de indivíduos com estes polimorfismos na 

linhagem wAnc. 
Haplótipos Total de 

Indivíduos 
FR* 

1 A A A C T T T C T A T 1 9% 
2 G . . . . . C T A G C 1 9% 
3 . T C T . . . . . . C 1 9% 
4 . . . . G . C T A . C 2 18,3% 
5 . . . . . A C T A . C 2 18,3% 
6 . . . . . . C T A G C 1 9% 
7 . . . . . . . . . G C 1 9% 
8 . . . . . . . . . . C 2 18,3% 

Posição dos 
sítios 

variáveis 

153 167 202 203 218 263 282 283 290 516 523   

*FR: Frequência relativa dos haplótipos observados na linhagem indicada. 
 

 

Na tabela 13 podem ser observadas a quantidade de posições de sítios 

variáveis comparando-as as regiões hipervariáveis (HVRs), propostas por Baldo et 

al. (2005) nas linhagens wAsc e wAnc. Somente a linhagem wAnc apresentou 

maior similaridade entre as suas posições de sítios variáveis e as HVRs (figura 

20B), e três mutações não se encontravam nas regiões analisadas (263, 282 e 

283), assim como em wAsc (255, 281 e 286). 

 

 

 

 

 



78 
 

 

 

 

Tabela 13: Posições de sítios variáveis nas linhagens de Wolbachia conforme as HVRs propostas 
por Baldo et al. (2005). 

HVRs N. de posições de sítios variáveis nas Linhagens 
Wolbachia 

 wAsc wAnc wBjc wBsp 
HVR I (0 – 90 bp) 1 - 12 4  

HVR II (150 – 225 bp) 1 5 11 6  
HVR III (300 – 375 bp) 3 1 9 5  
HVR IV (450 – 540 bp) - 2 12 11  

HVRs: Regiões hipervariáveis; N.: número 
 
 
 
 
 
 

 
Figura 20: Diversidade de nucleotídeos (Pi) conforme as posições dos nucleotídeos nas 

diferentes linhagens de Wolbachia. (A) Pi conforme posição dos nucleotídeos em wAsc. 
(B) Pi conforme posição dos nucleotídeos em wAnc. (C) Pi conforme posição dos 
nucleotídeos em wBjc. (D) Pi conforme posição dos nucleotídeos em wBsp. 

 
 
 
 
 
 



79 
 

 

5.5.3.2. Análises da Linhagem de Wolbachia caracterizada como 

de B. pahangi (Bp-1-1001) 

 

As sequências referentes ao gene wsp homólogas a linhagem de 

Wolbachia encontrada no nematóide B. pahangi (Bp-1-1001) apresentaram dois 

tipos de sequências diferentes, e foram denominadas wBsp e wBjc. 

A linhagem wBsp representa os indivíduos da ramificação inferior do 

grupo de “Bgi”, e wBjc os indivíduos do ramo superior do grupo “Bgi” (figura 19). 

Estas linhagens foram analisadas separadamente anteriormente e apresentaram 

grande similaridade nas suas sequências. 

Observou-se 25 haplótipos em wBjc e sete em wBsp, porém os valores 

de Pi foram semelhantes entre as duas linhagens (tabela 10). Em wBsp  observou-

se 22 NSS e sete SS representadas no tabela 14, conforme distribuição nos 

respectivos haplótipos. Já em wBjc apresentou 23 SS e grande número de NSS 

(tabela 15). 

As análises comparativas das posições de sítios variáveis das linhagens 

de Wolbachia wBsp e wBjc  e as HVRs, apresentaram maior quantidade de 

mutações (tabela 13 e figura 20C e D). Três mutações da linhagem wBsp (247, 

398 e 421) e 21 mutações da linhagem  wBjc  (111, 116, 134, 241, 252, 254, 260, 

264, 266, 271, 273, 276, 278, 281, 391, 395, 397, 404, 405, 411, 428), não se 

encontraram nas regiões hipervariáveis analisadas.



80
 

       Ta
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 1

4:
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81
 

     Ta
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82
 

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10

 
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11

 
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A
 

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G 

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12
 

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A

 
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G 

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13
 

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