UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (ZOOLOGIA) Diversidade e evolução do gênero Adenomera Steindachner, 1867 (Anura, Leptodactylidae) CARLA SANTANA CASSINI Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Ciências Biológicas (Área de concentração Zoologia). Março - 2015 CARLA SANTANA CASSINI Diversidade e evolução do gênero Adenomera Steindachner, 1867 (Anura, Leptodactylidae) Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad Março 2015 Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Ciências Biológicas (Área de concentração Zoologia). CARLA SANTANA CASSINI Diversidade e evolução do gênero Adenomera Steindachner, 1867 (Anura, Leptodactylidae) COMISSÃO EXAMINADORA ____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________ ____________________________________________________ Rio Claro, 30 de março de 2015. Março 2015 “This is ourselves Under pressure” (Queen, 1981) AGRADECIMENTOS Este trabalho só se concretizou porque ao longo dos anos pude contar com a preciosa ajuda de várias pessoas, às quais agradeço sinceramente: Ao meu orientador Célio pela oportunidade concedida, pelo exemplo profissional e pela confiança depositada em mim. À minha família, Sérvio, Vanira e Pedro pelo estímulo constante e apoio incondicional para que eu seguisse a carreira acadêmica. Aos curadores das coleções José Pombal Júnior, Paulo Garcia, Mirco Solé, Hussam Zaher, Taran Grant e Julián Faivovich pelo empréstimo de tecidos e exemplares sob seus cuidados, sem os quais não este projeto não teria sido viável. Ao Axel Kwet pela atenção nos e-mails e pelos cantos cedidos para análise dos holótipos de A. araucária e A. engelsi, e de exemplares de A. nana e de i sp. n “catarinense”. Ao Phillippe Kok pela gentileza em examinar caracteres morfológicos de Adenomera lutzi e A. heyeri. À Ariadne Fares e Mariana Lyra pela inestimável ajuda no CEIS. Ao Antoine Fouquet pela oportunidade de colaboração. Ao Pedro Taucce pela oportunidade de orientação, colaboração e principalmente por deixar meu dia a dia mais leve. À sua amizade serei sempre grata! À todos que me ajudaram nos trabalhos de campo realizados ao longo desses anos Bianca Berneck e Marina Walker (minha dupla infalível preferida!), Victor Dill, Carlos Paulo Callithrix, Julián Faivovich, William Costa, Iuri Ribeiro, Angele Delieux, Rafel Pontes, Camila Matedi, Carol Calijorne e Thiago Silva Lex. À Mariana Lyra pelo abrigo cedido durante a escrita da tese num ambiente inspirador. Aos colegas de laboratório UNESP-RC Bianca Berneck, Marina Walker, Carol Calijorne, Ariadne Fares, Pedro Taucce, Barnagleison Lisboa, Francisco Brusqueti, Carlos Paulo Callithrix, Fábio Quase Perin, Lucas Bandeira, Danilo Barea Jesus, Eliziane Garcia, Nadya Pupin, Laryssa Teixeira, Vinícius Loredam, Thaís Condez, Délio Baêta, Leo Malagoli, Maria Tereza, Olívia Gabriela e Marília Peri pelo convívio diário produtivo e divertido. Ao Taran Grant e Boris Blotto pelas discussões sempre inspiradoras e produtivas. Ao Victor Dill, por nunca ter se cansado de conversar sobre trabalho comigo, pela compreensão das minhas ausências e por me fazer tão bem mesmo nos momentos mais turbulentos de finais de teses. À sua amizade, companheirismo e amor. MUITO OBRIGADA! Aos meus orientadores de graduação, Renato Feio, e de mestrado, Carlos Cruz e Ulisses Caramaschi, por serem as pessoas que, juntamente com o Célio Haddad, foram os principais responsáveis pela minha formação. Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) pelo fomento provido para a realização da tese (através do processo 2010/515606-8) e ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA) e aos diretores dos parques pela licença concedida. Aproveito o momento e agradeço à Comissão de Pós-Graduação pelos prazos concedidos. Sumário INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................................................... 1 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................................... 5 CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................................... 9 DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA DOS CLADOS THOMEI E MARMORATA DO GÊNERO ADENOMERA STEINDACHNER, 1867 (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)......................................................................... 9 RESUMO ........................................................................................................................................... 9 ABSTRACT ..................................................................................................................................... 10 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 11 HISTÓRICO TAXONÔMICO .......................................................................................................... 15 OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 20 METODOLOGIA .............................................................................................................................. 21 NATUREZA DOS DADOS E NOMENCLATURA .............................................................................. 21 PROCEDIMENTOS MOLECULARES .............................................................................................. 23 MORFOLOGIA EXTERNA E BIOACÚSTICA .................................................................................. 25 DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA ........................................................................................................ 27 RESULTADOS ................................................................................................................................. 28 ANÁLISE FILOGENÉTICA ............................................................................................................ 28 ANÁLISE ACÚSTICA E MORFOLÓGICA ....................................................................................... 38 CARACTERIZAÇÃO TAXÔNOMICA DE ALGUMAS ESPÉCIES DO CLADO MATA ATLÂNTICA DO GÊNERO ADENOMERA ................................................................................................................. 76 DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 123 TOPOLOGIA .............................................................................................................................. 123 DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA EM ADENOMERA NOS CLADOS THOMEI E MARMORATA ............... 124 ESPÉCIES CRÍPTICAS E ESPÉCIES PARAFILÉTICAS .................................................................... 134 AMOSTRAGEM E UTILIZAÇÃO DE DADOS DIRETOS .................................................................. 136 CONCLUSÕES ............................................................................................................................... 139 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 140 CAPÍTULO 2 ..................................................................................................................................... 157 EVOLUÇÃO FENOTÍPICA NO GÊNERO ADENOMERA STEINDACHNER, 1867 COM COMENTÁRIOS ACERCA DA SUBFAMÍLIA LEPTODACTYLINAE ................................................................................. 157 RESUMO ....................................................................................................................................... 157 ABSTRACT ................................................................................................................................... 158 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 159 BREVE HISTÓRICO SOBRE O GÊNERO ADENOMERA .................................................................. 160 FONTES DE EVIDÊNCIA ............................................................................................................ 163 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 167 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................................. 167 AMOSTRAGEM DOS GRUPOS INTERNO E EXTERNO .................................................................. 167 AMOSTRAGEM DE CARACTERES .............................................................................................. 169 ANÁLISE FILOGENÉTICA .......................................................................................................... 174 RESULTADOS ............................................................................................................................... 176 CARACTERES FENOTÍPICOS ..................................................................................................... 176 ANÁLISE FILOGENÉTICA .......................................................................................................... 196 SINAPOMORFIAS ...................................................................................................................... 198 DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 216 TOPOLOGIA .............................................................................................................................. 216 BIOACÚSTICA .......................................................................................................................... 219 SINAPOMORFIAS ...................................................................................................................... 222 NINHO DE ESPUMA................................................................................................................... 226 DIETA DOS GIRINOS ................................................................................................................. 230 EM BUSCA DA TERRESTRIALIDADE? ........................................................................................ 233 CONCLUSÕES ............................................................................................................................... 237 SINAPOMORFIAS ...................................................................................................................... 237 EVOLUÇÃO DE CARACTERES ................................................................................................... 238 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 240 APÊNCIDES ...................................................................................................................................... 267 1 INTRODUÇÃO GERAL Documentar a biodiversidade se tornou uma corrida contra o relógio considerando o ritmo da degradação ambiental e, consequentemente, da perda de hábitats das espécies (Da Silva et al., 2005; Laurance, 2007), o aparecimento de doenças (Pounds et al., 2006) e a ameaça de mudanças climáticas (Rull e Vegas-Vilarrubia, 2006). Nosso conhecimento acerca da biodiversidade global ainda é rudimentar (Mora et al., 2011) e o que conhecemos não deve representar 10% de toda a nossa biodiversidade (Hammond, 1992 apud Hanken, 1999). Esta lacuna enorme no conhecimento não está limitada apenas a grupos como microorganismos e artrópodos (Quince et al., 2008; Hamilton et al., 2013), mas também a alguns grupos de vertebrados, como é o caso de anfíbios tropicais (Fouquet et al., 2007; Vieites et al., 2009; Funk et al., “2011” [2012]). Inevitavelmente, diversas espécies e populações serão extintas antes mesmo de serem reconhecidas pela ciência (Wake e Vredenburg, 2008). Quando comparamos o conhecimento da biodiversidade das diferentes regiões do mundo, nos chama a atenção a deficiência deste conhecimento nos trópicos, que abrigam a maior biodiversidade global (Gaston e Williams, 1996; Dirzo e Raven, 2003). Os biomas da América do Sul são de extrema importância por abrigarem mais espécies do que em qualquer outro lugar do mundo (Gaston e Williams, 1996; Myers et al., 2000). A Mata Atlântica está distribuída ao longo do leste e sudoeste do Brasil, leste do Paraguai e norte da Argentina (Galindo-Leal e Gusmão Câmara, 2005). Este bioma é um dos mais importantes hotspts para a conservação da biodiversidade mundial devido ao seu alto grau de endemismo e, simultaneamente, por constituir um ambiente altamente ameaçado em 2 virtude do grau de degradação e da velocidade de destruição da floresta (Galindo-Leal e Gusmão Câmara, 2005). A intensa ocupação humana e as consequentes formas de uso da terra ao longo da faixa litorânea atlântica brasileira fizeram com que sua área fosse reduzida para 8% a 11% da formação original, sendo que mais de 80% dos remanescentes florestais correspondem a fragmentos menores do que 50 ha, com variados graus de isolamento (Galindo-Leal e Gusmão Câmara, 2005; Ribeiro et al., 2009). Dado que um terço das espécies de anfíbios está ameaçado de extinção — mais do que qualquer outro grupo de vertebrado (Stuart et al., 2004) – conhecer a biodiversidade de anfíbios deste bioma se torna um dos desafios mais importantes diante da crise da biodiversidade (Wake e Vredenburg, 2008). Entretanto, conhecer a biodiversidade de anfíbios anuros é uma tarefa árdua, pois no geral, estes apresentam morfologia bastante conservada (Emerson, 1986). Contudo, avanços em diferentes linhas de pesquisas, dentre elas a biologia molecular, nos permite examinar mais de perto a extensão da complexidade desta biodiversidade. As descobertas de espécies crípticas (sensu Bickford et al., 2007) estão alterando nossa percepção da estrutura da biodiversidade em níveis taxonômicos, ecológicos, biogeográficos, evolutivos e de políticas de conservação (Angulo and Icochea, 2010; Bickford et al., 2007; Pfenninger and Schwenk, 2007). O gênero Adenomera é constituído atualmente por 18 espécies distribuídas na América do Sul ao leste dos Andes, das quais oito estão distribuídas na Mata Atlântica. As espécies do gênero geralmente apresentam desenvolvimento terrestre com girinos endotrófico e constroem ninhos de espuma subterrâneos com desovas pequenas. No entanto, duas espécies, A. diptyx e A. thomei, apresentam desovas maiores e fase larval aquática (De la Riva, 1996; Almeida e Angulo, 2006). Apesar do grupo ser composto por espécies frequentemente abundantes onde ocorrem, por décadas o gênero foi negligenciado em 3 estudos de sistemática de anuros devido à sua taxonomia “caótica” (Angulo, 2004; Duellman, 2005). A complexidade taxonômica observada no gênero Adenomera pode ser atribuída devido a nossa dificuldade de: i) encontrar padrões morfológicos intra e interespecíficos a partir de indivíduos depositados em coleções e ii) estabelecer uma correlação de confiança dos dados acústicos com indivíduo depositado em coleção. Neste último caso, a situação mais comum é ter acesso ao arquivo de canto através de terceiros mas não existir o indivíduo testemunho, devido à dificuldade de coletar estes indivíduos em campo. A primeira análise filogenética mais expressiva que incluiu o gênero Adenomera foi conduzida por Fouquet et al. (2013) com 11 espécies amostradas. Utilizando uma análise bayesiana, os autores recuperaram as espécies distribuídas na Mata Atlântica como um grupo monofilético. Posteriormente, numa extensa amostragem molecular do gênero Adenomera, Fouquet et al. (2014) delimitaram 35 espécies candidatas, das quais 16 já possuíam nome naquele momento. Os autores se basearam num protocolo adaptado de Vieites et al. (2009), buscando convergência hierárquica de evidências que incluía: monofilia recíproca, divergência genética, compartilhamento de alelos e dados indiretos (baseados em literatura) de morfologia e bioacústica da maioria das espécies candidatas. O trabalho “Species delimitation, patterns of diversification and historical biogeography of the Neotropical frog genus Adenomera (Anura, Leptodactylidae)” (Fouquet et al., 2014; Apêndice 1) foi o primeiro subproduto desta tese. Na análise filogenética bayesiana, utilizando 320 terminais, Fouquet et al. (2014, figura 1) não recuperaram as espécies distribuídas na Mata Atlântica como um grupo monofilético. Nesta análise, o “clado Thomei” composto pelas espécies A. thomei, A. sp. L e A. sp. M, é recuperado como irmão dos clados Martinezi (composto pelas espécies A. martinezi, A. saci e A. sp. B) e 4 Hylaedactyla (composto pelas espécies A. hylaedactyla e A. diptyx). Nesta topologia, o clado Thomei + Martinezi + Hylaedactyla apresenta baixa probabilidade posterior (0,60). Subsequentemente, no mesmo trabalho, quando um exemplar de cada espécie candidata foi selecionado para as análises de datação molecular multilocus (‘species tree’) e concatenada, ambas recuperaram as espécies distribuídas na Mata Atlântica como um grupo monofilético com a topologia: clado Thomei + clado Marmorata (Fouquet et al., 2014; figura 4 a e b). Na análise concatenada esta topologia apresenta propabilidade posterior com valor maior que 0,95, porém na análise multilocus a mesma topologia apresentou probabilidade posterior no valor de 0,88. Após a submissão deste artigo, mais dados (moleculares, morfológicos e bioacústicos) foram coletados e uma reanálise foi feita no presente estudo. Assim, esta tese está organizada em dois capítulos. No primeiro capítulo, realizamos uma análise filogenética do grupo com uma amostragem aumentada em relação a Fouquet et al. (2014) e testamos a hipótese de que cada espécie candidada (confirmadas e não confirmadas) dos clados Thomei e Marmorata (sensu Fouquet et al., 2014) constitui uma espécie diagnosticável. Para tanto, usamos evidências moleculares, morfológicos e bioacústica a partir de dados diretos (dados fenotípicos obtidos de exemplares analisados molecularmente na análise filogenética). Em seguida, neste mesmo capítulo, apresentamos as considerações taxonômicas oriundas da análise de variação fenotípica de cada espécie com a descrição das espécies novas e redescrição das espécies de taxonomia complexa dos clado Marmorata. No segundo capítulo buscamos identificar padrões de evolução de caracteres fenotípicos, dentre eles aqueles usados para diagnosticar e diferenciar as espécies do gênero Adenomera. Para tal, testamos hipóteses de homologias e buscamos levantar possíveis sinapomorfias para o gênero Adenomera e para os grupos a ele relacionados. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Almeida, A. d. P., Angulo, A. 2006. A new species of Leptodactylus (Anura: Leptodactylidae) from the state of Espírito Santo, Brazil, with remarks on the systematics of associated populations. Zootaxa 1334, 1–25. Angulo, A. 2004. The evolution of the acoustic communication system in members of the genus Adenomera (Anura: Leptoactylidae): a comparative approach. Graduate Department of Zoology. 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"2011"[2012]. High levels of cryptic species diversity uncovered in Amazonian frogs. Proccedings of the Royal Society B 279, 1806–1814. Galindo-Leal, C., Gusmão Câmara, I. 2005. Mata Atlântica. Biodiversidade, Ameacas e perpectivas. Fundação SOS Mata Atlântica-Conservação Internacional, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. Gaston, K. J., Williams, P. H. 1996. Spatial patterns in taxonomic diversity. In: Gaston, K. J. (Ed.) Biodiversity A biology of numbers and differences, pp. 202–229. Hamilton, A. J., Novotny, V., Waters, E. K., Basset, Y., Benke, K. K., Grimbacher, P. S., Miller, S. E., Samuelson, G. A., Weiblen, G. D., Yen, J. D., Stork, N. E. 2013. Estimating global arthropod species richness: refining probabilistic models using probability bounds analysis. Oecologia 171, 357–365. Hammond, P. M. 1992. Species inventory. Chapman & Hall. 7 Hanken, J. 1999. Why are there so many new amphibian species when amphibian are declining? Trends in Ecology and Evolution 14, 7–8. Laurance, W. 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No presente trabalho, propomos testar se as espécies candidatas distribuídas na Mata Atlântica compõem um grupo monofilético. Usando uma abordagem interativa com dados diretos de morfologia externa e bioacústica, pudemos delimitar espécies dentro dos clados Thomei e Marmorata. A maior amostragem dados fenotípicos e de um fragmento do gene 16S de indivíduos da Mata Atlântica na análise, permitiu inferir com maior confiança que as espécies distribuídas na Mata Atlântica compõem um grupo monofilético (clados Thomei + Marmorata), irmão do clado Hylaedactyla + Martinezi. O material adicional nos permitiu delimitar e redescrever duas espécies previamente consideradas como um complexo de espécies (Adenomera marmorata e A. bokermanni). Das 16 espécies candidatas do clado 10 Mata Atlântica previamente sugeridas, pudemos delimitar apenas 10 espécies sendo sete já conhecidas e três novas para a Ciência. ABSTRACT The genus Adenomera has 16 species, six of which are Atlantic Forest dwellers. The genus has a difficult taxonomy, mostly due to the high levels of intra and interspecific polymorphism. Recently, a phylogenetic analysis using samples collected through the whole geographic distribution of the genus (roughly tropical and temperate cis-Andean South America) suggested the existence of 35 candidate species; 16 of which being Atlantic Forest dwellers.The present contribution intends to test whatever the Atlantic Forest dwellers are a monophyletic unit. An integrative approach with directly observed data on morphology and bioacoustics allowed species delimitation within the Thomei and Marmorata Clades. Based on a denser sampling of phenotipic and 16S rRNA fragments, we recovered the Atlantic Forest dwellers are a monophyletic unit, with two major clades (Thomei + Marmorata) and sister to the Hylaedactyla + Martinezi clade. The additional material allowed the delimitation and redescritpion of two species previously understood as species complexes (Adenomera marmorata and A. bokermanni). Of the 16 Atlantic Forest dwellers candidate species, we could delimit only 10; seven of those assignable to previously described species. 11 DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA DOS CLADOS THOMEI E MARMORATA DO GÊNERO ADENOMERA STEINDACHNER, 1867 (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) “Também não discutirei aqui as muitas definições que já foram apresentadas sobre o termo espécie. Nenhuma dessas definições satisfaz todos os naturalistas, mesmo que todos tenham uma vaga ideia do que querem dizer quando se referem a uma espécie em particular.” Darwin (1859) INTRODUÇÃO Embora “espécie” seja um conceito fundamental na biologia, estabelecer uma definição universal para tal não é algo trivial, se é que é possível (Mayr, 1963; Pavlinov, 2013; de Queiroz, 2007; Wheler & Meier, 2000). Todos os conceitos apresentam suas próprias idiossincrasias e nenhum pode ser aplicado para todas as formas de vida conhecidas (de Queiroz, 2007; Wheler & Meier, 2000), o que leva alguns autores a questionar se espécies são realmente entidades naturais (Mallet 2007). Dos vários conceitos propostos para definir espécies até hoje, os mais empregados na biologia moderna foram os conceitos biológico (Mayr, 1942); filogenético (Donogue, 1985; Cracraft, 1983) e evolutivo (Simpson, 1961; Wiley, 1978). Atualmente, a maioria dos biólogos modernos concorda que espécies são populações ou metapopulações que evoluem separadamente em linhagens independentes (de 12 Queiroz, 2007); uma abordagem muito semelhante (para não dizer a mesma) ao conceito evolutivo de espécie proposta por Wiley (1978), que definiu espécie como “uma única linhagem de populações ancestrais e seus descendentes que mantem sua identidade dentre todas as outras linhagens e que possui suas próprias tendências evolutivas e destino histórico”. Uma vez bem fundamentada, a escolha do critério operacional para delimitação específica é tão importante quanto a definição teórica do conceito de espécie abordado num trabalho (Grant, 2002). Neste sentido, a operacionalização do conceito evolutivo de espécie segundo Wiley (1978) apresenta uma impossibilidade empírica, pois, a asserção de que uma espécie deve “manter sua identidade” possuindo um “destino histórico” único, implica na manutenção desta espécie numa perspectiva futura (Frost, 2000). Assegurar a manutenção da espécie para o futuro torna este conceito operacionalmente não-testável empiricamente e faz com que espécies que venham a sofrer introgressão, por exemplo, nunca tenham existido (Grant, 2002). Já o conceito de espécie como um indivíduo histórico elaborado por Kluge (1990) define espécie como “o menor indivíduo histórico que apresenta padrões de parentesco de ancestralidade e descendência”. Assim, apesar de semelhante ao conceito evolutivo de Wiley (1978), o conceito de indivíduo histórico está centrado em se a menor unidade individual em questão se deve a interações contemporâneas e/ou relacionamento histórico, não sendo relevante a sua permanência no futuro (Grant et al., 2002). Enquanto indivíduos contemporâneos compartilham um mesmo espaço e tempo em relações tokogenéticas durante um curto espaço de tempo (e.g., demes); indivíduos históricos (espécies) não compartilham o mesmo espaço e /ou tempo, sendo relacionados devido à uma história em comum e não por 13 interações coexistentes, e por isso o relacionamento entre eles é filogenético (Kluge, 1990; figura 2). Operacionalmente, os indivíduos históricos são delimitados por autapomorfias (Kluge, 1990), ainda que estas sejam triviais ou “vulgares”, como a mudança na posição da terceira base de um códon, por exemplo (Frost e Kluge, 1994). Ainda assim, muitas vezes é difícil apontar, no contínuo de diversificação das linhagens, se estas devem ser consideradas como espécies distintas ou não (de Queiroz, 2007; figura 1). Isto porque em diversificações recentes, linhagens ainda não mutuamente diagnosticáveis podem representar linhagens separadas apenas temporariamente ou linhagens cujas individualidades já representam distinção histórica da linhagem ancestral (Frost e Kluge, 1994; figuras 1 e 2). Por isso é necessário estabelecer um critério operacional utilizando múltiplas linhas de evidências relevantes para delimitar uma metapopulação (linhagem evolutiva) de outra (de Queiroz, 2007; Padial e de La Riva, 2010) e entender se as relações envolvidas são tokogenéticas (entre indivíduos contemporâneos) e/ou filogenéticas (entre indivíduos históricos). Integrar distintos conjuntos de dados, lançando mão de mais de uma fonte de evidência para delimitar os taxa investigados tem sido o cerne da chamada “taxonomia integrativa” (Dayrat, 2005; Will et al., 2005; Padial e de La Riva, 2009, 2010). No entanto, quando diferentes resultados são obtidos independentemente por meio de linhas de evidências distintas, incertezas podem emergir de modo que decisões taxonômicas se tornem arbitrárias (Wiens & Penkrot, 2002; Padial e de la Riva, 2009). Por isso, alguns autores contra-argumentam que a maioria dos estudos de taxonomia integrativa não necessariamente integram conjuntos de dados, mas analisam separadamente se distintas fontes de dados apresentam resultados que corroboram ou se correlacionam à uma determinada hipótese de 14 delimitação específica (Yeates et al., 2011). No sentido comum que usamos a palavra integrar, a taxonomia integrativa deveria objetivar uma análise com métodos quantitativos onde distintos conjuntos de dados contribuem conjuntamente para a delimitação específica (Yeates et al., 2011), como é proposto pela evidência total (Kluge, 1989). Apesar de todas as ressalvas, utilizaremos aqui o termo “integrativo” num sentido amplo, referindo-nos a qualquer tipo de análise que utilize de forma integrada, correlacionada ou corroborativa, distintos conjuntos de dados e/ou análises para delimitar determinados taxa. Historicamente, a análise da morfologia externa juntamente com a análise bioacústica têm sido as maiores fontes de evidência utilizadas para delimitar as espécies em anfíbios anuros. A bioacústica, em especial, é uma ferramenta muito útil para entender os limites específicos deste grupo. Apesar da variação intrínseca, via de regra os machos produzem vocalizações estereotipadas e estas funcionam como uma barreira reprodutiva pré-zigótica entre espécies distintas (Ryan, 2001). No entanto, diferenças encontradas (morfológicas e/ou bioacústicas) podem ser resultado de plasticidade comportamental intrapopulacional devido ao contexto social (no caso da bioacústica) ou a variação geográfica (Martins e Jim, 2003; Cassini et al., 2013; Costa e Toledo, 2013; Gambale e Bastos 2014), não indicando necessariamente a separação entre duas linhagens em indivíduos históricos distintos (Frost e Kluge, 1994; de Queiroz, 2007; Padial e De la Riva, 2010). De fato, vários exemplos de polimorfismos (morfológicos e acústicos) em de anuros, em especial do gênero Adenomera, mostram que a variabilidade específica pode dificultar a delimitação de espécies (Angulo et al., 2003; Kokubum e Giaretta, 2005; Kwet, 2006; Angulo e Reichle, 2008; Angulo e Icochea, 2010). 15 Apesar do gênero Adenomera ser composto por espécies frequentemente abundante nos locais onde ocorrem, poucas revisões sistemáticas da taxonomia do grupo foram conduzidas (Heyer, 1973; 1974). O grupo apresenta espécies crípticas (sensu Bickford et al., 2007), simpátricas, com alto grau de polimorfismo intraespecífico e interespecífico (De la Riva, 1996, Kwet e Angulo, 2002). Este cenário faz com que a delimitação específica precisa do gênero Adenomera seja desafiadora. Não obstante, grande esforço tem sido feito e alguns progressos obtidos (Kwet & Angulo, 2002; Angulo & Icochea, 2003, 2010; Angulo et al., 2003; Kokubum & Giaretta, 2005; Almeida & Angulo, 2006; Kwet, 2007; Angulo & Reichle, 2008; Berneck et al., 2008; Fouquet et al., 2013; Fouquet et al., 2014). Ainda assim, os últimos trabalhos mostram que várias espécies permanecem ainda por serem descritas (Angulo et al., 2003; Angulo, 2004; Fouquet et al. 2013; Fouquet et al. 2014) e uma revisão taxonômica do grupo ainda se faz necessária. HISTÓRICO TAXONÔMICO HISTÓRICO DO GÊNERO ADENOMERA O gênero Adenomera foi primeiramente apresentado por Steindachner (1867) na descrição de Adenomera marmorata. Adolpho Lutz (1930) foi o primeiro autor a sinonimizar o gênero Adenomera com Leptodactylus no subgênero Parvulus que seria composto por: Leptodactylus (Parvulus) nanus e L. (Parvulus) trivitattus (A. Lutz, 1926), que está atualmente na sinonímia de A. marmorata. Posteriormente, Parker (1932) alegou prioridade do nome Adenomera e propôs seu uso como subgênero de Leptodactylus no lugar de 16 Parvulus; Parker (1935) realocou Adenomera marmorata Steindachner para Leptodactylus (L. marmoratus). Heyer (1969) organizou as espécies do gênero Leptodactylus em grupos, baseados em modos reprodutivos e morfologia larval, e definiu o grupo L. marmoratus ( = gênero Adenomera) sendo composto pela espécie que nomeia o grupo, L. marmoratus, e L. hylaedactylus. Heyer (1973) assinalou três espécies adicionais ao grupo: L. andreae, L. bokermanni e L. martinezi. Historicamente, muitos estudos tentaram definir a posição filogenética do gênero Adenomera, bem como seus relacionamentos internos. O gênero Adenomera foi revalidado por Heyer (1974) que recuperou em sua análise Adenomera + Lithodythes (com Leptodactylus discodactylus incluso) como grupo irmão das demais espécies do gênero Leptodactylus. Estudos subsequentes discutiram a posição filogenética do gênero Adenomera baseados em distintas linhas de evidência (morfologia externa, osteologia, história natural e DNA) e duas hipóteses de relacionamentos foram propostas: i) Adenomera + Lithodythes como grupo irmão de Leptoactylus stricto sensu, em concordância com Heyer (1974) (Frost et al., 2006; Ponssa, 2008; Ponssa et al. , 2010) considerando rearranjos genéricos de Leptodactylus discodactylus e L. lineatus (Heyer, 1998; De Sá et al. , 2005; Frost et al. , 2006; Ponssa, 2008; Pyron e Wiens, 2011; de Sá et al., 2014); ou ii) aninhado dentro do grupo de L. fuscus, tornando o gênero Leptodactylus parafilético (Heyer, 1998; Giaretta et al., 2011). Frost et al. (2006) sinonimizaram Adenomera com o gênero Lithodytes, e alocaram Lithodytes como subgênero de Leptodactylus numa tentativa de remediar a parafilia do gênero Leptodactylus, com base nas evidências sugeridas por Heyer (1998) e por Kokubum 17 e Giaretta (2005). No entanto, os últimos estudos filogenéticos envolvendo o gênero Adenomera (Pyron e Wiens, 2011; Fouquet et al., 2013; Fouquet et al. 2014; de Sá et al, 2014) recuperaram Adenomera + Lithodythes como clado irmão de Leptodactylus stricto sensu, não tornando este último parafilético. Destes últimos trabalhos apenas de Sá et al. (2014) revalidaram formalmente o gênero Adenomera baseados na forma reprodutiva de algumas espécies do gênero, distinta de todas as demais espécies do gênero Leptodactylus. HISTÓRICO DAS ESPÉCIES DOS CLADOS THOMEI E MARMORATA A Mata Atlântica abriga oito espécies do gênero Adenomera: A. ajurauna Berneck, Costa e Garcia, 2008; A. araucaria (Kwet e Angulo, 2002); A. bokermanni Heyer, 1973; A. engelsi (Kwet, Steiner e Zillikens, 2009); A hylaedactyla (Cope, 1868); A. marmorata Steindachner, 1867; A. nana Müller, 1922; A. thomei Almeida e Angulo, 2006. O holótipo de A. marmorata foi coletado na expedição “Novara Reise”, e portanto, sua localidade tipo é provavelmente o município do Rio de Janeiro ou alguma localidade próxima percorrida pela expedição percorreu como o maciço da Tijuca, Ilha de Paquetá e Petrópolis (Steindachner, 1867). Angulo (2004) reporta um canto de um indivíduo do município de Teresópolis e Almeida e Angulo (2006) atestam que os cantos do município de Teresópolis (e, portanto, próximo ao município de Petrópolis) e Rio de Janeiro são muito distintos um do outro. No entanto, cantos do município de Petrópolis ou Teresópolis não foram analisadas por Fouquet et al. (2014). Leptodactylis trivittatus foi descrito por A. Lutz (1926) baseado em exemplares de “Campo Bello” e “Alto da Serra de Cubatão”, atualmente municípios de Itatiaia, estado do 18 Rio de Janeiro, e Santo André, estado de São Paulo, respectivamente (Bokermann, 1966). Bertha Lutz (1947) alocou L. trivittatus anteriormente descrita por A. Lutz como sinônimo júnior de L. marmoratus. Cochran (1956) redescreveu Leptodactylus marmoratus e considerou L. nanus e L. trivittatus como sinônimos daquela espécie. Heyer (1973) manteve a espécie L. trivittatus como sinônimo júnior de L. marmoratus e designou um lectótipo para ambas as espécies. Entretanto, o autor não distinguiu as localidades definidas anteriormente por Lutz (1926) e definiu como localidade tipo “Campo Bello, Alto da Serra de Cubatão, Brasil”. Uma vez que “Campo Bello” e “Alto da Serra de Cubatão” são duas localidades distintas e distantes entre si (cerca de 270 km), Cochran (1955), que havia anteriormente examinado o material que posteriormente Heyer (1973) designou como lectótipo da espécie L. trivittatus, especificou a localidade tipo da espécie como “Montserrat, Campo Bello, Rio de Janeiro”, onde fica localizada atualmente a sede do Parque Nacional do Itatiaia. Assim, se o nome L. trivittatus for válido (sob a combinação A. trivittata) corresponderá àquelas populações do município do Itatiaia, estado do Rio de Janeiro. Mais recentemente, Kwet (2007) revalidou Leptodactulus nanus e manteve a espécie L. trivittatus como sinônimo júnior de L. marmoratus, devido à distância geográfica separando as espécies L. nanus e L. trivittatus. Fouquet et al. (2014) sugeriram que a espécie canditada A. sp. K, do município de Itatiaia, poderia corresponder àquela população de Teresópolis (Angulo, 2004) ou do Itatiaia, podendo neste último caso, corresponder à espécie A. trivittata. Adenomera bokermanni foi descrita por Heyer (1973). O autor designou o holótipo (UMMZ 104527) do município de Paranaguá, estado do Paraná e parátipos de várias localidades nos estados de Minas Gerais (municípios de “Água Limpa”, Caeté, Poços de Caldas e Belo Horizonte), Rio de Janeiro (municípios de Niterói, Teresópolis e Guapimirim), 19 São Paulo (municípios de Anhembi, Botucatu, Campos do Jordão, Iguape, Limeira, Piquete e Santa Branca) e Paraná (município de Morretes). O autor encontrou diferenças morfológicas entre indivíduos da série tipo, mas na ocasião ele considerou estas diferenças como sendo variações intraespecíficas. Mais tarde, Heyer (1984) alegaram que A. bokermanni é, na verdade, um complexo composto por pelo menos duas espécies. Fouquet et al. (2014) verificaram que a espécie A. bokermanni possui uma distribuição muito mais restrita (apenas o litoral do estado do Paraná e norte do estado de Santa Catarina) do que aquela definida por Heyer (1973). Considerando a área de ocorrência, muitos dos parátipos de A. bokermanni devem, na verdade, corresponder à espécie A. thomei (Fouquet et al., 2014). A. Lutz (1930) descreveu o canto de Adenomera nana como um “ping” metálico e, com base nisso, concluiu ser uma espécie muito comum e amplamente distribuída nos estados de Santa Catarina, São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Baseada em padrão de morfologia externa, Cochran (1956) aloca A. nana como sinônimo de A. marmorata. Mais tarde, utilizando uma metodologia baseada em caracteres morfológicos, Heyer (1973) chega a uma conclusão similar sobre a distribuição da espécie de A. nana que A. Lutz (1930; sobre o nome de A. marmorata). Mesmo não tendo comparado seus dados com publicações prévias (A. Lutz, 1930; Cochran, 1956), Heyer (1973) aloca a espécie A. nana como sinônimo de A. marmorata. Este ato nomenclatural foi questionado pro Kwet e Angulo (2002). Mais tarde, Kwet (2007) retirou A. nana da sinonímia de A. marmorata e reconheceu-a como espécie plena baseado em análises bioacústicas. Fouquet et al. (2014) encontraram uma distribuição de A. nana muito similar àquela descrita previamente na literatura de (Kwet, 2006; Kwet, 2007; Conte et al., 2010). 20 Fouquet et al. (2014) encontraram a espécie canditada A. sp. R como sendo irmã de A. araucaria. A primeira está distribuída na ilha de Florianópolis e áreas continentais adjacentes do estado de Santa Catarina e A. araucaria está distribuída desde o norte do estado do Rio Grande do Sul até a área central do estado de Santa Catarina. A identidade da espécie candidata A. sp. R ainda não está clara, pois estas populações já haviam sido reportadas anteriormente na literatura e seu status específico questionado (Kwet, 2007; Conte et al., 2010). Segundo Fouquet et al. (2014), a espécie A. sp. R provavelmente corresponde à A. sp. 2 (Kwet, 2007). Conte (2010) também analisou populações dos municípios dos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul e considerou todas como representantes de uma única unidade evolutiva, não diferindo entre si, sob o nome de A. araucaria. As espécies A. ajurauna, A. araucaria, A. engelsi e A. thomei foram descritas recentemente (Berneck et al., 2006; Kwet, 2007; Kwet, 2009; Almeida e Angulo, 2006) com dados morfológicos e acústicos bem definidos a partir de populações que não haviam sido amostradas ou citadas previamente, não possuindo registro anterior na literatura. Por serem bem delimitadas em suas descrições originais, também não apresentam confusões taxonômicas históricas desde a sua descrição; portanto, não existe um histórico taxonômico a ser abordado. OBJETIVOS Baseando na definição de espécie como indivíduo histórico (Kluge, 1990; Grant, 2002), propomos reconstruir a história filogenética do gênero Adenomera. Para tanto, utilizaremos evidência histórica molecular (filogenética) e delimitar espécies dentro do 21 gênero Adenomera dos clados Thomei e Marmorata (sensu Fouquet et al., 2014) utilizando dados diretos de morfologia externa e bioacústica (obtididos diretamente do exemplar analisado molecularmente). Assim, com uma amostragem aumentada poderemos analisar sistematicamente as hipóteses de espécies candidatas apresentadas por Fouquet et al. (2014). Com esta conduta, será possível associar com confiança cada informação morfológica e bioacústica a um dado terminal da árvore filogenética. Nosso objetivo é, portanto, responder às seguintes questões : i) os clados Thomei e Marmorata formam um agrupamento monofilético? ii) Quantas espécies do gênero Adenomera ocorrem na Mata Atlântica? iii) Como é possível delimitá-las? METODOLOGIA NATUREZA DOS DADOS E NOMENCLATURA A proposta de Vieites (2009) para classificar linhagens genealógicas em espécies candidatas é uma maneira rápida de acessar a possível diversidade específica envolvida dentro de um determinado grupo. Fouquet et al. (2014) se basearam nesta metodologia para acessar a diversidade envolvida no gênero Adenomera e classificaram as espécies candidatas em confirmadas ou não confirmadas, conforme a existência ou não de concordância entre divergência genética de linhagens e outras fontes de evidência. A natureza desta fonte de evidência utilizada para confrontar com os dados genéticos foi, em sua maioria, a partir de dados fenotípicos indiretos, obtidos a partir da literatura ou de indivíduos da mesma localidade não sequenciados, inferidos indiretamente à um determinado terminal. Os dados 22 diretos de morfologia e bioacústica são aqueles obtidos a partir do exemplar coletado e examinado geneticamente. É, portanto, uma informação direta e confiável que determinado terminal apresenta. Neste trabalho, utilizamos dados diretos para poder inferir com confiabilidade os limites específicos de cada espécie candidata. A nomenclatura envolvendo espécies candidatas pode ser confusa, pois as espécies candidatas analisadas podem ou não possuir um nome formal (descrito e reconhecido como válido pelo código de nomenclatura zoológica), disponível para sua utilização. Quando não possuíam nomes formais disponíveis, nomes inespecíficos (numerais ou alfabéticos) foram dados às espécies candidatas (e.g., Adenomera sp. A, A. sp. B, A. sp. K, A. sp. O; Fouquet et al., 2014), não configurando um ato nomenclatural válido. No trabalho de Fouquet et al. (2014), quando dados filogenéticos e fenotípicos não indicaram que tais espécies canditadas propostas eram sinônimos de outra espécie, estas foram tratadas como espécies candidatas confirmadas. Caso contrário, quando não foi possível acessar a validade do nome da espécie com confiança, estas foram diagnosticadas como espécie candidatas não confirmadas. Como exemplo, A. coca foi recuperado como um clado dentro de A. hylaedactyla por Fouquet et al. (2014). Como não foi possível acessar com confiança a identidade de A. hylaedactyla, não foi possível saber se A. coca é um sinônimo de A. hylaedactyla ou não. Por isso, A. coca foi considerada como espécie candidata não confirmada (Fouquet et al., 2014). Para a análise fenotípica das espécies candidatas, utilizamos a nomenclatura inespecífica de Fouquet et al. (2014) (e.g., espécies canditadas A. ajurauna, A. sp. R). No presente trabalho utilizaremos os nomes dos clados em letra maiúscula e fonte regular (não itálico) e para a delimitação específica (subitem “Caracterização taxonômica de algumas espécies do clado Mata 23 Atlântica do gênero Adenomera” nos Resultados) uma nomenclatura formal com nomes fantasias distintos dos nomes fictícios das espécies candidatas de Fouquet et al. (2014). PROCEDIMENTOS MOLECULARES Novas sequências de DNA produzidas neste trabalho e as referências das amostras de tecido utilizadas bem como seus respectivos testemunhos (número de coleção ou número de campo dos exemplares dos quais procedem os tecidos sequenciados) encontram-se no Apêndice 2. Das sequências publicadas por Fouquet et al. (2014), utilizamos até cinco terminais de cada espécie candidata, exceto para os clados Thomei e Marmorata, dos quais utilizamos todas as sequências disponibilizadas pelos autores na análise filogenética. No presente trabalho, amostramos tecidos de 370 indivíduos do gênero Adenomera pertencentes aos clados Thomei e Marmorata de 61 localidades adicionais a Fouquet et al. (2014). Gravamos o canto de anúncio e analisamos a morfologia externa do testemunho do tecido utilizado na análise filogenética para cerca de 30% dos exemplares de todas as espécies candidatas de Fouquet et al. (2014) exceto por A. sp. A e A. sp. N (Apêndice 2). Seguimos a nomenclatura taxônomica de Frost (2014). A análise molecular foi conduzida a partir do sequenciamento de quatro fragmentos de genes (três mitocondriais e dois nucleares), além das sequências produzidas por Fouquet et al. (2014). Esforços foram concentrados para preencher o máximo possível da matriz com fragmentos dos genes mitocondriais COI e CytB (aproximadamente 600 pb cada um) e os nucleares RAG-1 (aproximadamente 800 pb) e POMC (aproximadamente 600 pb). Para um terço dos terminais foi sequenciado um fragmento do gene mitocondrial 16S (aproximadamente 600 pb). Os pares de primers utilizados seguiram Fouquet et al. (2014). 24 A extração do DNA (mitocondrial e nuclear) foi feita a partir de tecidos de músculo da perna dos indivíduos utilizando o kit DNeasy (Quiagen). A amplificação do DNA foi realizada utilizando Fermentas Master Mix e conduzida em termocicladores Axygen Maxygene. Para amplificação dos fragmentos de genes, conduzimos distintos protocolos que incluíam número de ciclos, temperatura e duração de cada fase da PCR (“polimerase chain reaction”), de acordo com par de primer. Para a maioria dos fragmentos, o programa padrão de reação de PCR inciou com a etapa de desnaturação de 2 minutos a 94º C, seguidos de 35 a 40 ciclos de anelamento (94º C por 30 segundos, 48–56º C por 30 segundos, 72º C por 2 minutos) e a etapa final de extenção a 72º C por 10 minutos. Produtos de PCR não purificados foram então enviados para empresa Macrogen Inc. (Coreia do Sul) onde foram conduzidas as reações de purificação e sequenciamento num sequenciador ABI 3730XL. Utilizamos o programa Sequencer 3.0 (Gene Codes, Ann Arbor, MI, USA) para avisualização dos cromatogramas, emparelhamento da fita 3’5’ com a fita 5’3’, leitura e edição das sequências. Para checar possíveis contaminações utilizamos o recurso do “Basic Local Alignment Search Tool” – BLAST (ALTSCHUL et al., 1997). Alinhamos as sequências utilizando o algoritmo MUSCLE no programa MEGA6 (Tamura et al., 2013) e corrigido a olho posteriormente. ANÁLISE FILOGENÉTICA As sequências alinhadas e os fragmentos concatenados no programa Sequence Matrix foram submetidos à análise de parcimônia no programa TNT (Goloboff et al., 2008). Gaps foram tratados como dados faltantes. O algoritmo utilizado para a busca de árvores mais parcimoniosas foi New Technology, com nível de busca ajustado para 50 e as definições 25 default de “Sectorial Search”, “Drift” e Tree-“Fusing” (GOLOBOFF, 1999). As buscas cessaram quando o comprimento mínimo da árvore foi encontrado por quatro vezes e o consenso estrito foi calculado. O suporte foi calculado através de reamostragem por Jackknife (veja Farris et al., 1996). Produzimos 1000 pseudorréplicas a partir da árvore consenso estrito, usando os mesmos parâmetros utilizados anteriormente, através do New Technology para busca de árvores mais parcimoniosas. MORFOLOGIA EXTERNA E BIOACÚSTICA A análise da morfologia externa foi baseada nos caracteres descritos por Heyer (1973, 1989). Para análise da variação morfológica utilizamos o CRC (comprimento rostro-cloacal) e, adicionalmente, para descrição do holótipo de A. marmorata utilizamos o CC (comprimento da cabeça), LC (largura da cabeça), DO (diâmetro do olho), DT (diâmtetro do tímpano, DON (diastância olho-narina), DIN (distância internasal), DIO (distância interorbital), CF (comprimento do fêmur), TIB (comprimento da tíbia), TAR (comprimento do tarso). As medidas foram obtidas utilizando um paquímetro digital com precisão de 0,01 mm (Mitutoyo), exceto para as medidas DO, DT, DON, DIN e DIO, que foram obtidas através do uso de uma ocular milimetrada acoplada no estereomicroscópio. Para descrição do girino de A. bokermanni utilizamos as seguintes medidas baseadas em Altig e McDiarmid (1999): CT (comprimento total), CC (comprimento da cabeça), CCa (comprimento da cauda), AMC (altura máxima da cauda), AMuC (altura do músculo da cauda), LMC (largura do músculo da cauda), AC (altura do corpo), LC (largura do corpo), LCN (largura do corpo na altura das narinas), LCO (alturo do corpo na altura dos olhos), DIN (distância internasal), 26 DIO (distância interorbital), DFN (distância focinho-narina), DFO (distância focinho-olhos), DON (distância olho-narina), DN (diâmetro da narina), LDO (largura do disco oral, DO (diâmetro do olho). As medidas do girino foram feitas com o software ImageTool (version 3.00). Para a obtenção das fotos usadas nas medidas foi utilizada uma câmera digital acoplada a um stereomicroscópio. Para as gravações dos cantos utilizamos um gravador digital Marantz Professional modelo PMD-660, amostrando 44,1 kHz e um microfone unidirecional Sennheiser ME-66. Oscilogramas e espectogramas foram confeccionados no programa Raven Pro 64 1.4 nos seguintes parâmetros: window size = 256 amostras, 75% de sobreposição; hop size = 64 amostras, DFT = 1024 amostras; e para os parâmetros window type Hanning, resolução, contraste e brilho utilizamos os parâmetros default do programa. Para ilustrar os espectogramas e oscilogramas utilizamos os pacotes TuneR versão 1.0 (Ligges et al. 2013) e Seewave versão 1.7.3 (Sueur et al. 2008) da plataforma R (versão 3.0.3). Os espectogramas foram obtidos utilizando window length de 128 samples com 75% de sobreposição, hop size de 64 amostras, e window name Hanning. O material testemunho foi depositado na Coleção Herpetológica da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e na Coleção Célio Fernando Baptista Haddad (CFBH; apêndice 2). Os seguintes parâmetros foram analisados: duração da nota (variação temporal do início ao final da nota, medida no ocilograma) e frequência dominante (= peak frequency). Analisamos 20 cantos de cada indivíduo. Indivíduos gravados foram incluídos na análise de morfologia externa e na análise filogenética. O material analisado para morfologia, bioacústica e os fragmentos amplificados de cada tecido estão listados no Apêndice 2. As siglas das coleções científicas seguem: CFBH e CFBHt – Coleção Célio Haddad (exemplares e tecidos, respectivamente), UFMG e UFMGt 27 – Coleção Herpetológica da Universidade Federal de Minas Gerais (exemplares e tecidos, respectivamente), MNRJ – Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro, e as de números de campo: BB – número de campo Bianca Berneck, PPGT – número de campo Pedro Paulo Goulart Taucce, CCT, CC e CV – número de campo dos tecidos de Carla Cassini, K – número de campo de Carlos Eduardo Conte, MZUSPfield – número de campo do Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo. DELIMITAÇÃO ESPECÍFICA Tomando como hipóteses as espécies candidatas levantadas por Fouquet et al. (2014), delimitamos as espécies do gênero Adenomera dentro dos clados Thomei e Marmorata, adicionando mais amostras genéticas à análise filogenética, dados de morfologia externa e bioacústica. Buscamos identificar o menor indivíduo histórico delimitando o ponto do limite específico na análise filogenética onde as propriedades dos indivíduos contemporâneos se diluem (Kluge, 1990; Grant, 2002). Em última instância, o indivíduo histórico requer caracteres diagnósticos e a análise filogenética facilita sua descoberta (Grant et al., 2006). Na tentativa de estabelecer um critério operacional objetivo, consideramos: 1 – a topologia do cladograma obtido na análise filogenética envolvendo as populações das espécies candidatas e; 2 – identificar ao menos uma característica fenotípica diagnóstica; ou uma evidência de separação de linhagens evolutivas distintas do seu grupo irmão. 28 RESULTADOS ANÁLISE FILOGENÉTICA A análise de parcimônia resultou em 20 árvores ótimas (igualmente parcimoniosas) de 18312 passos a partir da qual foi calculada a árvore consenso estrito (Figura 1 e 2). A busca pelas árvores mais parcimoniosas levou 103,97 segundos e a reamostragem durou aproximadamente 21 horas (76.083,81 segundos). A árvore foi enraizada em Centrolenidae e não recuperamos a monofilia de Leiuperinae com respeito à Pseudopaludicola falcipes. A maioria dos nós envolvendo os outgroups apresentou altos valores de Jackknife. O clado Hydrolaetare + Leptodactylus foi recuperado como grupo irmão do clado Lithodythes + Adenomera com alto valor de suporte (100%). O gênero Adenomera foi recuperado com valor de 100% de jackknife (Figura 2). Não foi possível reconstruir os relacionamentos basais dentro do gênero Adenomera a partir da topologia da árvore de consenso estrito obtida. Não obstante, recuperamos os clados Andreae, Lutzi, Heyeri, Martnezi, Hylaedactyla, Marmorata e Thomei. O clado Thomei foi recuperado como grupo irmão do clado Marmorata no consenso estrito (= clado Mata Atlântica sensu Fouquqet et al., 2014), porém com valor de 90 de jackkniffe (Figura 2). Subdividimos o clado Marmorata em dois subgrupos: clado Marmorata Norte e Clado Marmorta Sul (Figuras 1 e 2). O clado Marmorata Norte, recuperado com valor de 100% de Jackknife, é composto por cinco espécies candidatas distribuídas na região central da Mata Atlântica (Figura 3c, 3d e 4): A. ajurauna, A. sp. S, A. sp. K, A. sp. J e A. marmorata (sensu Fouquet et al, 2014). O clado Marorata Sul, recuperado com valor de 86% de Jackniffe é composto por sete espécies candidatas distribuídas na região centro-sul da Mata Atlântica 29 (Figuras 3b e 4): A. sp. O, A. sp. R, A. araucaria, A. sp. N, A. nana, A engelsi, A. bokermanni. A variação genética dentro de cada espécie candidata é apresentada na Tabela 1 e as distâncias genéticas entre as espécies candidatas são apresentadas na Tabela 2. Tabela 1. Variação intraespecífica de parte dos genes mitocondriais COI e 16S. Porcentagem (%) de bases diferentes por sítio (p-distance) dentro de cada espécie canditada (sensu Fouquet et al, 2014). A matriz de dados é composta 430 sequências de COI com 374 pb e 130 sequências de 16S com 350 pb. COI 16S Adenomera sp. L 0,7 0,0 A. sp. M 2,0 2,0 A. thomei 4,9 2,5 A. sp. R 3,1 0,0 A. araucaria 5,6 2,3 A. sp. O 3,6 2,1 A. bokermanni 3,3 1,2 A. nana 2,9 1,4 A. engelsi 0,9 0,5 A. sp. N 1,5 0,0 A. ajurauna 4,9 2,1 A. sp. S 2,1 1,3 A. sp. K 2,6 2,4 A. sp. J 3,6 1,2 A. marmorata 4,3 2,3 30 Figura 1. Árvore filogenética de consenso estrito resumida obtida a partir das 20 árvores mais parcimoniosas. Tree 20: Rupirana Pseudopaludicola Pleurodema Physalaemus Paratelmatobius Lithodyteslineatus L_rhodomystax L_pentadactylus L_mystaceus L_melanonotus L_latrans L_fuscus Hydrolaetare Engystomops Crossodactylodes Atho4_CTU22 Atho3c_CFBH7450 Atho3b_CFBH7456 Atho3a_DT2891 Atho3a_CY239 Atho1b_M_RJ60463 Atho1a_MTR17686 Atho1a_CFBH9053 AspU_ZSM751 AspS_ITH0585 AspS_CY855 AspS_CTMZ02241 AspS_AF512 AspS_978425 AspR2_TRPD9 AspR1_MTR18496 AspQ_AJC2490 AspP_AJC2464 AspP_AJC2390 AspMMTR16429 AspMMD2568 AspL2_mtr21951 AspL_MTR20994 AspKM_RJ74640 AspK_MTR15575 AspJ4H33 AspJ3CTMZ01932 AspJ2CTMZ01602 AspJ2_H182 AspJ1CTMZ02393 AspI2a_CFBH10952 AspI2a_AF1098 AspI2a_4525 AspI1_MRT7494 AspI1_CHU_B46034 AspH1b_CHU_B46027 AspH1a_MTR14446 AspH1a_GRC18259 AspH1a_CFBH10953 AspH1a_AF970 AspG3_PMJ154 AspG3_968179 AspG2_MTR12832 AspG1_MTR13067 AspG1_MTR12711 AspF1b_PV2594 AspF1b_PV1373 AspF1a_TG3259 AspF1a_T314 AspF1a_AF301 AspE1c_US_M268936 AspE1c_AA9972 AspE1b_M_C_2828 AspE1a_US_MFS152234 AspE1a_M_C_34709 AspD1a_QU2965 AspD1a_PEP515 AspD1a_MH_C10092 AspD1a_LSU13787 AspD1a_AJC2777 AspC2_MH_C8385LAT174 AspC1b_AM29 AspC1a_US_M268935 AspC1a_M_C_34687 AspB_ESTR307 AspA1a_MRT7532 AspA1a_MRT3953 AspA1a_CHU_B45600 AspA1a_CHU_B27327 Anan4MTR18499 Anan3MTR18505 Amart_CHU_B40220 Amart_CHU_B40218 Amarm2b_IGAR2 Amarm2a_MTR22738 Amarm2a_M_RJ75916 Amarm2a_M_RJ73063 Amarm2a_M_RJ65495 Amarm2a_CMRJ1 Amarm2a_CFBH12850 Amarm1a_U_IBA_1986 Amarm1a_MTR14086 Amarm1a_MRT9861 Amarm1a_AF906 Amarm1a_AF467 Alut_ROM43842 Alut_ROM43828 Alut_ROM40167 Ahyl11_AJC2882 Ahyl10bMTR21603 Ahyl10b_AF1642 Ahyl10a_CTMZ05373 Ahyl10a_AF1570 Ahey2a_C_1051 Ahey2a_127AF Ahey2a_11965SM_S Ahey1_469PG Ahey1_269AF Ahey1_264MC Aeng2_ZUFG093 Aeng2_TRPD1 Aeng2_M_RJ72224 Aeng1_MTR18497 Adip2_IIBH1133 Adip1_UFMT3923 Adip1_U__EC9724 Adip1_U__EC8293 Adip1_IIBH905 Adip1_CFBH7463 Abok2_MTR18508 AaraMCP11241 AaraMCP10769 AaraEMLG0609 Aand10c_QU4250 Aand10c_MH_C9799 Aand10c_LSU13786 Aand10bJMP2129 Aand10a_QU2822 Aaju_MZUSP0257 Aaju_ITH63 Aaju_ILALC2 Aaju_H566 Aaju_CTMZ01611 Aaju_AF771 Aaju_AF1562 Aaju_AF1506 Aaju__US_M303076 99_Itag 97_IItac 79_IItac 77_RioOst 75_RioOst 74_CelRam 70_Guatu 68_Guatu 65_Morr 60_Mogi 58_RiGde 56_Pari 556_Naz 555_sul 554_Itati 553_Naz 551_Nebl 550_Itati 55_IComp 546_Igua 545_Itati 543_Itati 541_Mari 54_Blum 538_Mira 537_Itati 536_Itan 534_Ubat 532_Igua 530_Ubat 53_Linh 528_Naz 527_Itati 526_Mira 524_Ubat 522_Mira 521_Itati 520_RiJa 52_Linh 518_Igua 514_RiJa 513_Itati 512_Nebl 511_Itati 510_Ubat 51_BirMi 508_Igua 506_SLPar 505_Itati 504_Igua 503_Para 502_SLPar 501_Var 500_Mira 50_SBeCa 5_SIsa 498_Igua 497_Igua 496_Tiju 495_SLPar 494_Igua 493_Mira 492_Camp 491_Ubat 490_Mira 49_Cuba 489_Mira 487_Tiju 486_Igua 485_Mari 484_QuaBa 481_SSeb 480_Camp 48_IAlca 479_Ubat 476_Itan 475_Mari 474_Itati 473_Itan 470_Guapir 47_Guatu 469_BirMi 468_Var 467_Mira 466_MoMor 465_Muri 464_Parpia 46_Guarv 459_Parpia 458_Bert 457_Peru 454_IBela 452_IBela 451_ICar 450_IBela 45_Guarv 449_RiGde 448_IBela 447_Igra 446_ICana 445_Parpia 444_Pari 443_IBela 442_Pargua 44_Sant 439_Ubat 438_Igra 437_Nebl 436_CachMac 434_CachMac 432_CachMac 431_IComp 427_Igra 425_Nebl 422_Bert 420_Pargua 42_Caie 419_Nebl 418_Igra 417_Parpia 414_Mogi 413_Tiju 412_ICana 411_Mogi 410_Guatu 409_Tiju 407_Parpia 406_Tiju 401_ICana 40_Anit 399_ICana 398_Tiju 396_Guapi 394_Mogi 392_Mogi 39_SIsa 389_Igua 388_CachMac 385_ICana 384_CachMac 383_ICana 382_IBela 381_Pargua 380_Parpia 38_SIsa 379_Igua 378_Nebl 377_Igua 375_ICana 373_Guarmi 372_ICana 371_Cama 370_Ubat 366_IBela 362_Nebl 36_SIsa 358_ICana 357_Igra 356_Itan 355_IBela 353_Morr 348_Cama 346_Igua 345_Tiju 344_RiClar 343_Botu 342_Parpia 341_Cipo 340_Tiju 34_Var 339_Pargua 338_Pargua 337_Pargua 336_Flor 335_SFran 334_SFran 333_Tiju 332_Tiju 331_Pargua 330_Itapo 328_Itati 327_Itati 326_Itati 325_SBeSul 324_SBeSul 323_SBeSul 322_Cipo 320_Guapi 319_Guapi 318_Guapi 317_Guapi 316_Petro 315_Petro 314_Parpia 313_Parpia 312_Parpia 311_Parpia 31_Igua 309_Mogi 308_SFran 307_Flor 306_AMor 305_AMor 304_Var 303_Flor 302_SBon 301_SBon 300_Itati 30_Pari 3_Linh 299_RaQuei 297_RaQuei 296_RaQuei 295_RaQuei 294_RaQuei 293_RaQuei 292_Itati 291_Nebl 290_Nebl 289_Nebl 286_StaBar 260_Parpia 26_Mogi 259_Parpia 257_Parpia 255_Parpia 253_Parpia 250_IAlca 248_IAlca 246_IAlca 243_IAlca 242_IAlca 241_IAlca 24_ICana 239_IAlca 237_SBca 234_SBca 232_SBca 230_SBca 227_SBca 225_SBca 223_Guarmi 221_Guarmi 22_Mogi 218_RiGde 216_CelRam 214_SPau 212_Pie 211_Igua 21_RaQuei 209_ICar 207_Igua 205_Igua 202_ICana 20_Cuba 2_ICouv 198_Mimo 196_Linh 193_Ubat 191_IPorc 189_ICouv 186_ICouv 184_StaIsa 180_CarMo 18_Curu 179_Para 177_IBela 175_ICana 173_ICar 170_Igua 166_Igua 164_Igua 163_Igua 161_Igua 16_Ubat 159_Pari 157_IBela 154_Peru 152_Cuba 150_Tapi 147_Igua 145_Cana 143_Cuba 141_RaQuei 139_SBeSul 137_Curu 132_Maric 131_RiClar 13_CachMac 127_RaQuei 125_RaQuei 122_SBoni 118_Macae 116_Macae 101_IGde 1_IBela Centrolenidae Clado Lutzi Clado Andreae Clado Heyeri Clados Martinezi + Hylaedactyla Clado Thomei Clado Marmorata Sul Clado Marmorata Norte C la d o M ar m o ra ta C la d o M at a A tl ân ti ca 31 Figura 2. Árvore filogenética de consenso estrito resumida obtida a partir das 20 árvores mais parcimoniosas. Valores abaixo dos nós mostram a frequência absoluta estimada de Jackknife utilizando TNT. Asteriscos (*) representam valores de 100% de Jackknife. 32 Figura 3a – Clado Thomei. Árvore filogenética de consenso estrito obtida a partir das 20 árvores mais parcimoniosas. Valores abaixo dos nós mostram a frequência absoluta estimada de Jackknife utilizando TNT. Group freqs., 1000 replicates, cut=50 (tree 0) - Jacknifing (P=36) Rupirana Pseudopaludicola Pleurodema Physalaemus Paratelmatobius Lithodyteslineatus L_rhodomystax L_pentadactylus L_mystaceus L_melanonotus L_latrans L_fuscus Hydrolaetare Engystomops Crossodactylodes Atho4_CTU22 Atho3c_CFBH7450 Atho3b_CFBH7456 Atho3a_DT2891 Atho3a_CY239 Atho1b_M_RJ60463 Atho1a_MTR17686 Atho1a_CFBH9053 AspU_ZSM751 AspS_ITH0585 AspS_CY855 AspS_CTMZ02241 AspS_AF512 AspS_978425 AspR2_TRPD9 AspR1_MTR18496 AspQ_AJC2490 AspP_AJC2464 AspP_AJC2390 AspMMTR16429 AspMMD2568 AspL2_mtr21951 AspL_MTR20994 AspKM_RJ74640 AspK_MTR15575 AspJ4H33 AspJ3CTMZ01932 AspJ2CTMZ01602 AspJ2_H182 AspJ1CTMZ02393 AspI2a_CFBH10952 AspI2a_AF1098 AspI2a_4525 AspI1_MRT7494 AspI1_CHU_B46034 AspH1b_CHU_B46027 AspH1a_MTR14446 AspH1a_GRC18259 AspH1a_CFBH10953 AspH1a_AF970 AspG3_PMJ154 AspG3_968179 AspG2_MTR12832 AspG1_MTR13067 AspG1_MTR12711 AspF1b_PV2594 AspF1b_PV1373 AspF1a_TG3259 AspF1a_T314 AspF1a_AF301 AspE1c_US_M268936 AspE1c_AA9972 AspE1b_M_C_2828 AspE1a_US_MFS152234 AspE1a_M_C_34709 AspD1a_QU2965 AspD1a_PEP515 AspD1a_MH_C10092 AspD1a_LSU13787 AspD1a_AJC2777 AspC2_MH_C8385LAT174 AspC1b_AM29 AspC1a_US_M268935 AspC1a_M_C_34687 AspB_ESTR307 AspA1a_MRT7532 AspA1a_MRT3953 AspA1a_CHU_B45600 AspA1a_CHU_B27327 Anan4MTR18499 Anan3MTR18505 Amart_CHU_B40220 Amart_CHU_B40218 Amarm2b_IGAR2 Amarm2a_MTR22738 Amarm2a_M_RJ75916 Amarm2a_M_RJ73063 Amarm2a_M_RJ65495 Amarm2a_CMRJ1 Amarm2a_CFBH12850 Amarm1a_U_IBA_1986 Amarm1a_MTR14086 Amarm1a_MRT9861 Amarm1a_AF906 Amarm1a_AF467 Alut_ROM43842 Alut_ROM43828 Alut_ROM40167 Ahyl11_AJC2882 Ahyl10bMTR21603 Ahyl10b_AF1642 Ahyl10a_CTMZ05373 Ahyl10a_AF1570 Ahey2a_C_1051 Ahey2a_127AF Ahey2a_11965SM_S Ahey1_469PG Ahey1_269AF Ahey1_264MC Aeng2_ZUFG093 Aeng2_TRPD1 Aeng2_M_RJ72224 Aeng1_MTR18497 Adip2_IIBH1133 Adip1_UFMT3923 Adip1_U__EC9724 Adip1_U__EC8293 Adip1_IIBH905 Adip1_CFBH7463 Abok2_MTR18508 AaraMCP11241 AaraMCP10769 AaraEMLG0609 Aand10c_QU4250 Aand10c_MH_C9799 Aand10c_LSU13786 Aand10bJMP2129 Aand10a_QU2822 Aaju_MZUSP0257 Aaju_ITH63 Aaju_ILALC2 Aaju_H566 Aaju_CTMZ01611 Aaju_AF771 Aaju_AF1562 Aaju_AF1506 Aaju__US_M303076 99_Itag 97_IItac 79_IItac 77_RioOst 75_RioOst 74_CelRam 70_Guatu 68_Guatu 65_Morr 60_Mogi 58_RiGde 56_Pari 556_Naz 555_sul 554_Itati 553_Naz 551_Nebl 550_Itati 55_IComp 546_Igua 545_Itati 543_Itati 541_Mari 54_Blum 538_Mira 537_Itati 536_Itan 534_Ubat 532_Igua 530_Ubat 53_Linh 528_Naz 527_Itati 526_Mira 524_Ubat 522_Mira 521_Itati 520_RiJa 52_Linh 518_Igua 514_RiJa 513_Itati 512_Nebl 511_Itati 510_Ubat 51_BirMi 508_Igua 506_SLPar 505_Itati 504_Igua 503_Para 502_SLPar 501_Var 500_Mira 50_SBeCa 5_SIsa 498_Igua 497_Igua 496_Tiju 495_SLPar 494_Igua 493_Mira 492_Camp 491_Ubat 490_Mira 49_Cuba 489_Mira 487_Tiju 486_Igua 485_Mari 484_QuaBa 481_SSeb 480_Camp 48_IAlca 479_Ubat 476_Itan 475_Mari 474_Itati 473_Itan 470_Guapir 47_Guatu 469_BirMi 468_Var 467_Mira 466_MoMor 465_Muri 464_Parpia 46_Guarv 459_Parpia 458_Bert 457_Peru 454_IBela 452_IBela 451_ICar 450_IBela 45_Guarv 449_RiGde 448_IBela 447_Igra 446_ICana 445_Parpia 444_Pari 443_IBela 442_Pargua 44_Sant 439_Ubat 438_Igra 437_Nebl 436_CachMac 434_CachMac 432_CachMac 431_IComp 427_Igra 425_Nebl 422_Bert 420_Pargua 42_Caie 419_Nebl 418_Igra 417_Parpia 414_Mogi 413_Tiju 412_ICana 411_Mogi 410_Guatu 409_Tiju 407_Parpia 406_Tiju 401_ICana 40_Anit 399_ICana 398_Tiju 396_Guapi 394_Mogi 392_Mogi 39_SIsa 389_Igua 388_CachMac 385_ICana 384_CachMac 383_ICana 382_IBela 381_Pargua 380_Parpia 38_SIsa 379_Igua 378_Nebl 377_Igua 375_ICana 373_Guarmi 372_ICana 371_Cama 370_Ubat 366_IBela 362_Nebl 36_SIsa 358_ICana 357_Igra 356_Itan 355_IBela 353_Morr 348_Cama 346_Igua 345_Tiju 344_RiClar 343_Botu 342_Parpia 341_Cipo 340_Tiju 34_Var 339_Pargua 338_Pargua 337_Pargua 336_Flor 335_SFran 334_SFran 333_Tiju 332_Tiju 331_Pargua 330_Itapo 328_Itati 327_Itati 326_Itati 325_SBeSul 324_SBeSul 323_SBeSul 322_Cipo 320_Guapi 319_Guapi 318_Guapi 317_Guapi 316_Petro 315_Petro 314_Parpia 313_Parpia 312_Parpia 311_Parpia 31_Igua 309_Mogi 308_SFran 307_Flor 306_AMor 305_AMor 304_Var 303_Flor 302_SBon 301_SBon 300_Itati 30_Pari 3_Linh 299_RaQuei 297_RaQuei 296_RaQuei 295_RaQuei 294_RaQuei 293_RaQuei 292_Itati 291_Nebl 290_Nebl 289_Nebl 286_StaBar 260_Parpia 26_Mogi 259_Parpia 257_Parpia 255_Parpia 253_Parpia 250_IAlca 248_IAlca 246_IAlca 243_IAlca 242_IAlca 241_IAlca 24_ICana 239_IAlca 237_SBca 234_SBca 232_SBca 230_SBca 227_SBca 225_SBca 223_Guarmi 221_Guarmi 22_Mogi 218_RiGde 216_CelRam 214_SPau 212_Pie 211_Igua 21_RaQuei 209_ICar 207_Igua 205_Igua 202_ICana 20_Cuba 2_ICouv 198_Mimo 196_Linh 193_Ubat 191_IPorc 189_ICouv 186_ICouv 184_StaIsa 180_CarMo 18_Curu 179_Para 177_IBela 175_ICana 173_ICar 170_Igua 166_Igua 164_Igua 163_Igua 161_Igua 16_Ubat 159_Pari 157_IBela 154_Peru 152_Cuba 150_Tapi 147_Igua 145_Cana 143_Cuba 141_RaQuei 139_SBeSul 137_Curu 132_Maric 131_RiClar 13_CachMac 127_RaQuei 125_RaQuei 122_SBoni 118_Macae 116_Macae 101_IGde 1_IBela Centrolenidae 47 90 88 37 99 100 99 100 92 100 100 80 82 100 100 100 100 87 58 48 100 98 100 100 99 68 100 43 100 51 97 99 100 93 67 71 3786 100 100 100 100 96 85 99 100 100 100 100 100 100 99100 100 96 96 100 95 83 39 100 100 54 39 95 100 99 100 100 100 93 99 92 95 100 92 84 85 31 47 95 87 100 99 64 61 62 100 99 99 98 56 78 55 62 63 61 61 40 69 99 99 88 99 39 39 100 100 99 98 65 100 98 99 100 86 82 61 59 100 59 89 39 41 100 99 100 75 57 71 100 100 45 53 92 76 41 94 99 94 99 89 53 74 9699 100 100 85 45 49 35 95 98 64 92 90 100 99 43 67 28 63 65 87 41 91 74 62 58 85 20 100 96 100 50 68 39 99 97 95 100 64 100 91 62 46 74 97 88 84 100 100 98 81 72 96 71 75 100 40 98 69 42 92 99 75 56 62 29 100 70 62 76 100 100 100 63 66 47 78 93 97 39 100 100 100 100 92 100 26 100 99 95 46 97 100 97 48 100 100 63 99 99 96 36 86 100 95 48 74 100 100 97 38 100 97 71 23 100 100 84 61 100 95 67 100 100 100 95 90 100 100 99 100 100 99 100 61 85 75 Clado Marmorata (Figuras 3b, 3c e 3d) Adenomera thomei Adenomera sp. L Adenomera sp. M 33 Figura 3b – Clado Marmorata Sul. Árvore filogenética de consenso estrito obtida a partir das 20 árvores mais parcimoniosas. Valores abaixo dos nós mostram a frequência absoluta estimada de Jackknife utilizando TNT. Group freqs., 1000 replicates, cut=50 (tree 0) - Jacknifing (P=36) Rupirana Pseudopaludicola Pleurodema Physalaemus Paratelmatobius Lithodyteslineatus L_rhodomystax L_pentadactylus L_mystaceus L_melanonotus L_latrans L_fuscus Hydrolaetare Engystomops Crossodactylodes Atho4_CTU22 Atho3c_CFBH7450 Atho3b_CFBH7456 Atho3a_DT2891 Atho3a_CY239 Atho1b_M_RJ60463 Atho1a_MTR17686 Atho1a_CFBH9053 AspU_ZSM751 AspS_ITH0585 AspS_CY855 AspS_CTMZ02241 AspS_AF512 AspS_978425 AspR2_TRPD9 AspR1_MTR18496 AspQ_AJC2490 AspP_AJC2464 AspP_AJC2390 AspMMTR16429 AspMMD2568 AspL2_mtr21951 AspL_MTR20994 AspKM_RJ74640 AspK_MTR15575 AspJ4H33 AspJ3CTMZ01932 AspJ2CTMZ01602 AspJ2_H182 AspJ1CTMZ02393 AspI2a_CFBH10952 AspI2a_AF1098 AspI2a_4525 AspI1_MRT7494 AspI1_CHU_B46034 AspH1b_CHU_B46027 AspH1a_MTR14446 AspH1a_GRC18259 AspH1a_CFBH10953 AspH1a_AF970 AspG3_PMJ154 AspG3_968179 AspG2_MTR12832 AspG1_MTR13067 AspG1_MTR12711 AspF1b_PV2594 AspF1b_PV1373 AspF1a_TG3259 AspF1a_T314 AspF1a_AF301 AspE1c_US_M268936 AspE1c_AA9972 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451_ICar 450_IBela 45_Guarv 449_RiGde 448_IBela 447_Igra 446_ICana 445_Parpia 444_Pari 443_IBela 442_Pargua 44_Sant 439_Ubat 438_Igra 437_Nebl 436_CachMac 434_CachMac 432_CachMac 431_IComp 427_Igra 425_Nebl 422_Bert 420_Pargua 42_Caie 419_Nebl 418_Igra 417_Parpia 414_Mogi 413_Tiju 412_ICana 411_Mogi 410_Guatu 409_Tiju 407_Parpia 406_Tiju 401_ICana 40_Anit 399_ICana 398_Tiju 396_Guapi 394_Mogi 392_Mogi 39_SIsa 389_Igua 388_CachMac 385_ICana 384_CachMac 383_ICana 382_IBela 381_Pargua 380_Parpia 38_SIsa 379_Igua 378_Nebl 377_Igua 375_ICana 373_Guarmi 372_ICana 371_Cama 370_Ubat 366_IBela 362_Nebl 36_SIsa 358_ICana 357_Igra 356_Itan 355_IBela 353_Morr 348_Cama 346_Igua 345_Tiju 344_RiClar 343_Botu 342_Parpia 341_Cipo 340_Tiju 34_Var 339_Pargua 338_Pargua 337_Pargua 336_Flor 335_SFran 334_SFran 333_Tiju 332_Tiju 331_Pargua 330_Itapo 328_Itati 327_Itati 326_Itati 325_SBeSul 324_SBeSul 323_SBeSul 322_Cipo 320_Guapi 319_Guapi 318_Guapi 317_Guapi 316_Petro 315_Petro 314_Parpia 313_Parpia 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99 100 92 100 100 80 82 100 100 100 100 87 58 48 100 98 100 100 99 68 100 43 100 51 97 99 100 93 67 71 3786 100 100 100 100 96 85 99 100 100 100 100 100 100 99100 100 96 96 100 95 83 39 100 100 54 39 95 100 99 100 100 100 93 99 92 95 100 92 84 85 31 47 95 87 100 99 64 61 62 100 99 99 98 56 78 55 62 63 61 61 40 69 99 99 88 99 39 39 100 100 99 98 65 100 98 99 100 86 82 61 59 100 59 89 39 41 100 99 100 75 57 71 100 100 45 53 92 76 41 94 99 94 99 89 53 74 9699 100 100 85 45 49 35 95 98 64 92 90 100 99 43 67 28 63 65 87 41 91 74 62 58 85 20 100 96 100 50 68 39 99 97 95 100 64 100 91 62 46 74 97 88 84 100 100 98 81 72 96 71 75 100 40 98 69 42 92 99 75 56 62 29 100 70 62 76 100 100 100 63 66 47 78 93 97 39 100 100 100 100 92 100 26 100 99 95 46 97 100 97 48 100 100 63 99 99 96 36 86 100 95 48 74 100 100 97 38 100 97 71 23 100 100 84 61 100 95 67 100 100 100 95 90 100 100 99 100 100 99 100 61 85 75 Clado Thomei (Figura 3a) Clado Hylaedactyla Clado Marmorata Norte (Figuras 3c e 3d) Adenomera sp. R Adenomera araucaria Adenomera bokermanni Adenomera nana Adenomera engelsi Adenomera sp. O Adenomera sp. N 34 Figura 3c – Adenomera ajurauna e Adenomera sp. S. Árvore filogenética de consenso estrito obtida a partir das 20 árvores mais parcimoniosas. Valores abaixo dos nós mostram a frequência absoluta estimada de Jackknife utilizando TNT. Group freqs., 1000 replicates, cut=50 (tree 0) - Jacknifing (P=36) Rupirana Pseudopaludicola Pleurodema Physalaemus Paratelmatobius Lithodyteslineatus L_rhodomystax L_pentadactylus L_mystaceus L_melanonotus L_latrans L_fuscus Hydrolaetare Engystomops Crossodactylodes Atho4_CTU22 Atho3c_CFBH7450 Atho3b_CFBH7456 Atho3a_DT2891 Atho3a_CY239 Atho1b_M_RJ60463 Atho1a_MTR17686 Atho1a_CFBH9053 AspU_ZSM751 AspS_ITH0585 AspS_CY855 AspS_CTMZ02241 AspS_AF512 AspS_978425 AspR2_TRPD9 AspR1_MTR18496 AspQ_AJC2490 AspP_AJC2464 AspP_AJC2390 AspMMTR16429 AspMMD2568 AspL2_mtr21951 AspL_MTR20994 AspKM_RJ74640 AspK_MTR15575 AspJ4H33 AspJ3CTMZ01932 AspJ2CTMZ01602 AspJ2_H182 AspJ1CTMZ02393 AspI2a_CFBH10952 AspI2a_AF1098 AspI2a_4525 AspI1_MRT7494 AspI1_CHU_B46034 AspH1b_CHU_B46027 AspH1a_MTR14446 AspH1a_GRC18259 AspH1a_CFBH10953 AspH1a_AF970 AspG3_PMJ154 AspG3_968179 AspG2_MTR12832 AspG1_MTR13067 AspG1_MTR12711 AspF1b_PV2594 AspF1b_PV1373 AspF1a_TG3259 AspF1a_T314 AspF1a_AF301 AspE1c_US_M268936 AspE1c_AA9972 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451_ICar 450_IBela 45_Guarv 449_RiGde 448_IBela 447_Igra 446_ICana 445_Parpia 444_Pari 443_IBela 442_Pargua 44_Sant 439_Ubat 438_Igra 437_Nebl 436_CachMac 434_CachMac 432_CachMac 431_IComp 427_Igra 425_Nebl 422_Bert 420_Pargua 42_Caie 419_Nebl 418_Igra 417_Parpia 414_Mogi 413_Tiju 412_ICana 411_Mogi 410_Guatu 409_Tiju 407_Parpia 406_Tiju 401_ICana 40_Anit 399_ICana 398_Tiju 396_Guapi 394_Mogi 392_Mogi 39_SIsa 389_Igua 388_CachMac 385_ICana 384_CachMac 383_ICana 382_IBela 381_Pargua 380_Parpia 38_SIsa 379_Igua 378_Nebl 377_Igua 375_ICana 373_Guarmi 372_ICana 371_Cama 370_Ubat 366_IBela 362_Nebl 36_SIsa 358_ICana 357_Igra 356_Itan 355_IBela 353_Morr 348_Cama 346_Igua 345_Tiju 344_RiClar 343_Botu 342_Parpia 341_Cipo 340_Tiju 34_Var 339_Pargua 338_Pargua 337_Pargua 336_Flor 335_SFran 334_SFran 333_Tiju 332_Tiju 331_Pargua 330_Itapo 328_Itati 327_Itati 326_Itati 325_SBeSul 324_SBeSul 323_SBeSul 322_Cipo 320_Guapi 319_Guapi 318_Guapi 317_Guapi 316_Petro 315_Petro 314_Parpia 313_Parpia 312_Parpia 311_Parpia 31_Igua 309_Mogi 308_SFran 307_Flor 306_AMor 305_AMor 304_Var 303_Flor 302_SBon 301_SBon 300_Itati 30_Pari 3_Linh 299_RaQuei 297_RaQuei 296_RaQuei 295_RaQuei 294_RaQuei 293_RaQuei 292_Itati 291_Nebl 290_Nebl 289_Nebl 286_StaBar 260_Parpia 26_Mogi 259_Parpia 257_Parpia 255_Parpia 253_Parpia 250_IAlca 248_IAlca 246_IAlca 243_IAlca 242_IAlca 241_IAlca 24_ICana 239_IAlca 237_SBca 234_SBca 232_SBca 230_SBca 227_SBca 225_SBca 223_Guarmi 221_Guarmi 22_Mogi 218_RiGde 216_CelRam 214_SPau 212_Pie 211_Igua 21_RaQuei 209_ICar 207_Igua 205_Igua 202_ICana 20_Cuba 2_ICouv 198_Mimo 196_Linh 193_Ubat 191_IPorc 189_ICouv 186_ICouv 184_StaIsa 180_CarMo 18_Curu 179_Para 177_IBela 175_ICana 173_ICar 170_Igua 166_Igua 164_Igua 163_Igua 161_Igua 16_Ubat 159_Pari 157_IBela 154_Peru 152_Cuba 150_Tapi 147_Igua 145_Cana 143_Cuba 141_RaQuei 139_SBeSul 137_Curu 132_Maric 131_RiClar 13_CachMac 127_RaQuei 125_RaQuei 122_SBoni 118_Macae 116_Macae 101_IGde 1_IBela Centrolenidae 47 90 88 37 99 100 99 100 92 100 100 80 82 100 100 100 100 87 58 48 100 98 100 100 99 68 100 43 100 51 97 99 100 93 67 71 3786 100 100 100 100 96 85 99 100 100 100 100 100 100 99100 100 96 96 100 95 83 39 100 100 54 39 95 100 99 100 100 100 93 99 92 95 100 92 84 85 31 47 95 87 100 99 64 61 62 100 99 99 98 56 78 55 62 63 61 61 40 69 99 99 88 99 39 39 100 100 99 98 65 100 98 99 100 86 82 61 59 100 59 89 39 41 100 99 100 75 57 71 100 100 45 53 92 76 41 94 99 94 99 89 53 74 9699 100 100 85 45 49 35 95 98 64 92 90 100 99 43 67 28 63 65 87 41 91 74 62 58 85 20 100 96 100 50 68 39 99 97 95 100 64 100 91 62 46 74 97 88 84 100 100 98 81 72 96 71 75 100 40 98 69 42 92 99 75 56 62 29 100 70 62 76 100 100 100 63 66 47 78 93 97 39 100 100 100 100 92 100 26 100 99 95 46 97 100 97 48 100 100 63 99 99 96 36 86 100 95 48 74 100 100 97 38 100 97 71 23 100 100 84 61 100 95 67 100 100 100 95 90 100 100 99 100 100 99 100 61 85 75 Clado Marmorata Sul (Figura 3b) Figura 3d Adenomera sp. S Adenomera ajurauna 35 Figura 3d – Adenomera marmorata, Adenomera sp. J, Adenomera sp. K e Adenomera sp. A. Árvore filogenética de consenso estrito obtida a partir das 20 árvores mais parcimoniosas. Valores abaixo dos nós mostram a frequência absoluta estimada de Jackknife utilizando TNT. Group freqs., 1000 replicates, cut=50 (tree 0) - Jacknifing (P=36) Rupirana Pseudopaludicola Pleurodema Physalaemus Paratelmatobius Lithodyteslineatus L_rhodomystax L_pentadactylus L_mystaceus L_melanonotus L_latrans L_fuscus Hydrolaetare Engystomops Crossodactylodes Atho4_CTU22 Atho3c_CFBH7450 Atho3b_CFBH7456 Atho3a_DT2891 Atho3a_CY239 Atho1b_M_RJ60463 Atho1a_MTR17686 Atho1a_CFBH9053 AspU_ZSM751 AspS_ITH0585 AspS_CY855 AspS_CTMZ02241 AspS_AF512 AspS_978425 AspR2_TRPD9 AspR1_MTR18496 AspQ_AJC2490 AspP_AJC2464 AspP_AJC2390 AspMMTR16429 AspMMD2568 AspL2_mtr21951 AspL_MTR20994 AspKM_RJ74640 AspK_MTR15575 AspJ4H33 AspJ3CTMZ01932 AspJ2CTMZ01602 AspJ2_H182 AspJ1CTMZ02393 AspI2a_CFBH10952 AspI2a_AF1098 AspI2a_4525 AspI1_MRT7494 AspI1_CHU_B46034 AspH1b_CHU_B46027 AspH1a_MTR14446 AspH1a_GRC18259 AspH1a_CFBH10953 AspH1a_AF970 AspG3_PMJ154 AspG3_968179 AspG2_MTR12832 AspG1_MTR13067 AspG1_MTR12711 AspF1b_PV2594 AspF1b_PV1373 AspF1a_TG3259 AspF1a_T314 AspF1a_AF301 AspE1c_US_M268936 AspE1c_AA9972 AspE1b_M_C_2828 AspE1a_US_MFS152234 AspE1a_M_C_34709 AspD1a_QU2965 AspD1a_PEP515 AspD1a_MH_C10092 AspD1a_LSU13787 AspD1a_AJC2777 AspC2_MH_C8385LAT174 AspC1b_AM29 AspC1a_US_M268935 AspC1a_M_C_34687 AspB_ESTR307 AspA1a_MRT7532 AspA1a_MRT3953 AspA1a_CHU_B45600 AspA1a_CHU_B27327 Anan4MTR18499 Anan3MTR18505 Amart_CHU_B40220 Amart_CHU_B40218 Amarm2b_IGAR2 Amarm2a_MTR22738 Amarm2a_M_RJ75916 Amarm2a_M_RJ73063 Amarm2a_M_RJ65495 Amarm2a_CMRJ1 Amarm2a_CFBH12850 Amarm1a_U_IBA_1986 Amarm1a_MTR14086 Amarm1a_MRT9861 Amarm1a_AF906 Amarm1a_AF467 Alut_ROM43842 Alut_ROM43828 Alut_ROM40167 Ahyl11_AJC2882 Ahyl10bMTR21603 Ahyl10b_AF1642 Ahyl10a_CTMZ05373 Ahyl10a_AF1570 Ahey2a_C_1051 Ahey2a_127AF Ahey2a_11965SM_S Ahey1_469PG Ahey1_269AF Ahey1_264MC Aeng2_ZUFG093 Aeng2_TRPD1 Aeng2_M_RJ72224 Aeng1_MTR18497 Adip2_IIBH1133 Adip1_UFMT3923 Adip1_U__EC9724 Adip1_U__EC8293 Adip1_IIBH905 Adip1_CFBH7463 Abok2_MTR18508 AaraMCP11241 AaraMCP10769 AaraEMLG0609 Aand10c_QU4250 Aand10c_MH_C9799 Aand10c_LSU13786 Aand10bJMP2129 Aand10a_QU2822 Aaju_MZUSP0257 Aaju_ITH63 Aaju_ILALC2 Aaju_H566 Aaju_CTMZ01611 Aaju_AF771 Aaju_AF1562 Aaju_AF1506 Aaju__US_M303076 99_Itag 97_IItac 79_IItac 77_RioOst 75_RioOst 74_CelRam 70_Guatu 68_Guatu 65_Morr 60_Mogi 58_RiGde 56_Pari 556_Naz 555_sul 554_Itati 553_Naz 551_Nebl 550_Itati 55_IComp 546_Igua 545_Itati 543_Itati 541_Mari 54_Blum 538_Mira 537_Itati 536_Itan 534_Ubat 532_Igua 530_Ubat 53_Linh 528_Naz 527_Itati 526_Mira 524_Ubat 522_Mira 521_Itati 520_RiJa 52_Linh 518_Igua 514_RiJa 513_Itati 512_Nebl 511_Itati 510_Ubat 51_BirMi 508_Igua 506_SLPar 505_Itati 504_Igua 503_Para 502_SLPar 501_Var 500_Mira 50_SBeCa 5_SIsa 498_Igua 497_Igua 496_Tiju 495_SLPar 494_Igua 493_Mira 492_Camp 491_Ubat 490_Mira 49_Cuba 489_Mira 487_Tiju 486_Igua 485_Mari 484_QuaBa 481_SSeb 480_Camp 48_IAlca 479_Ubat 476_Itan 475_Mari 474_Itati 473_Itan 470_Guapir 47_Guatu 469_BirMi 468_Var 467_Mira 466_MoMor 465_Muri 464_Parpia 46_Guarv 459_Parpia 458_Bert 457_Peru 454_IBela 452_IBela 451_ICar 450_IBela 45_Guarv 449_RiGde 448_IBela 447_Igra 446_ICana 445_Parpia 444_Pari 443_IBela 442_Pargua 44_Sant 439_Ubat 438_Igra 437_Nebl 436_CachMac 434_CachMac 432_CachMac 431_IComp 427_Igra 425_Nebl 422_Bert 420_Pargua 42_Caie 419_Nebl 418_Igra 417_Parpia 414_Mogi 413_Tiju 412_ICana 411_Mogi 410_Guatu 409_Tiju 407_Parpia 406_Tiju 401_ICana 40_Anit 399_ICana 398_Tiju 396_Guapi 394_Mogi 392_Mogi 39_SIsa 389_Igua 388_CachMac 385_ICana 384_CachMac 383_ICana 382_IBela 381_Pargua 380_Parpia 38_SIsa 379_Igua 378_Nebl 377_Igua 375_ICana 373_Guarmi 372_ICana 371_Cama 370_Ubat 366_IBela 362_Nebl 36_SIsa 358_ICana 357_Igra 356_Itan 355_IBela 353_Morr 348_Cama 346_Igua 345_Tiju 344_RiClar 343_Botu 342_Parpia 341_Cipo 340_Tiju 34_Var 339_Pargua 338_Pargua 337_Pargua 336_Flor 335_SFran 334_SFran 333_Tiju 332_Tiju 331_Pargua 330_Itapo 328_Itati 327_Itati 326_Itati 325_SBeSul 324_SBeSul 323_SBeSul 322_Cipo 320_Guapi 319_Guapi 318_Guapi 317_Guapi 316_Petro 315_Petro 314_Parpia 313_Parpia 312_Parpia 311_Parpia 31_Igua 309_Mogi 308_SFran 307_Flor 306_AMor 305_AMor 304_Var 303_Flor 302_SBon 301_SBon 300_Itati 30_Pari 3_Linh 299_RaQuei 297_RaQuei 296_RaQuei 295_RaQuei 294_RaQuei 293_RaQuei 292_Itati 291_Nebl 290_Nebl 289_Nebl 286_StaBar 260_Parpia 26_Mogi 259_Parpia 257_Parpia 255_Parpia 253_Parpia 250_IAlca 248_IAlca 246_IAlca 243_IAlca 242_IAlca 241_IAlca 24_ICana 239_IAlca 237_SBca 234_SBca 232_SBca 230_SBca 227_SBca 225_SBca 223_Guarmi 221_Guarmi 22_Mogi 218_RiGde 216_CelRam 214_SPau 212_Pie 211_Igua 21_RaQuei 209_ICar 207_Igua 205_Igua 202_ICana 20_Cuba 2_ICouv 198_Mimo 196_Linh 193_Ubat 191_IPorc 189_ICouv 186_ICouv 184_StaIsa 180_CarMo 18_Curu 179_Para 177_IBela 175_ICana 173_ICar 170_Igua 166_Igua 164_Igua 163_Igua 161_Igua 16_Ubat 159_Pari 157_IBela 154_Peru 152_Cuba 150_Tapi 147_Igua 145_Cana 143_Cuba 141_RaQuei 139_SBeSul 137_Curu 132_Maric 131_RiClar 13_CachMac 127_RaQuei 125_RaQuei 122_SBoni 118_Macae 116_Macae 101_IGde 1_IBela Centrolenidae 47 90 88 37 99 100 99 100 92 100 100 80 82 100 100 100 100 87 58 48 100 98 100 100 99 68 100 43 100 51 97 99 100 93 67 71 3786 100 100 100 100 96 85 99 100 100 100 100 100 100 99100 100 96 96 100 95 83 39 100 100 54 39 95 100 99 100 100 100 93 99 92 95 100 92 84 85 31 47 95 87 100 99 64 61 62 100 99 99 98 56 78 55 62 63 61 61 40 69 99 99 88 99 39 39 100 100 99 98 65 100 98 99 100 86 82 61 59 100 59 89 39 41 100 99 100 75 57 71 100 100 45 53 92 76 41 94 99 94 99 89 53 74 9699 100 100 85 45 49 35 95 98 64 92 90 100 99 43 67 28 63 65 87 41 91 74 62 58 85 20 100 96 100 50 68 39 99 97 95 100 64 100 91 62 46 74 97 88 84 100 100 98 81 72 96 71 75 100 40 98 69 42 92 99 75 56 62 29 100 70 62 76 100 100 100 63 66 47 78 93 97 39 100 100 100 100 92 100 26 100 99 95 46 97 100 97 48 100 100 63 99 99 96 36 86 100 95 48 74 100 100 97 38 100 97 71 23 100 100 84 61 100 95 67 100 100 100 95 90 100 100 99 100 100 99 100 61 85 75 Figura 3c Adenomera sp. A Adenomera sp. K Adenomera sp. J Adenomera marmorata 36 Figura 4. Mapa de distribuição das espécies candidadtas do clado Mata Atlântica. 37 Tabela 2. Distâncias genéticas (p-distance, em porcentagem %) entre as espécies candidatas de Adenomera (sensu Fouquet et al., 2014) para uma parte de dois genes mitocondriais: em azul acima da diagonal - COI (430 sequências com 374 pb); e em amarelo abaixo da diagonal - 16S (130 sequências com 350 pb). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 1 Adenomera lutzi 11,2 14,3 17,5 15,4 16,8 15,2 15,6 15,2 15,9 16,5 16,6 15,7 14,3 16,0 15,6 14,9 13,9 14,0 12,8 13,9 12,9 16,1 14,5 13,2 14,0 16,0 15,4 15,5 16,3 16,1 15,8 2 A. sp. P 10,0 12,4 17,5 15,4 17,0 14,6 14,2 16,4 15,9 15,5 16,3 18,3 15,6 16,7 15,5 15,7 16,6 15,4 13,0 15,2 13,6 13,7 13,4 13,9 14,4 17,6 15,1 15,4 17,3 16,0 16,1 3 A. sp. I 11,4 14,0 17,6 13,9 14,9 13,5 14,0 17,1 16,8 16,5 14,0 17,0 14,1 16,8 15,7 13,9 12,8 13,7 14,9 14,5 15,1 14,9 16,0 15,2 15,3 14,9 13,6 16,2 16,1 15,8 15,7 4 A. sp. Q 9,7 14,2 11,7 19,9 18,9 17,9 17,8 15,5 16,4 18,9 17,8 17,1 16,1 18,1 19,3 19,5 18,5 18,6 20,3 18,3 19,8 18,7 19,2 18,0 18,4 20,6 18,0 20,3 23,2 20,1 21,0 5 A. heyeri 8,3 12,8 7,1 9,1 17,7 15,7 16,6 18,1 19,8 19,8 17,6 19,8 18,7 18,9 15,6 17,7 17,8 16,2 16,3 15,8 15,7 18,0 17,3 17,4 17,8 14,8 18,7 18,0 15,4 17,0 16,3 6 A. sp. G 10,3 14,5 10,0 10,5 8,5 12,6 12,7 18,2 19,0 19,3 16,7 19,5 19,1 19,3 19,8 15,4 15,1 15,9 17,2 16,7 16,4 16,4 17,5 17,2 16,9 17,6 16,4 17,4 17,9 17,7 17,8 7 A. sp. H 10,0 12,0 12,0 11,4 10,0 8,5 12,1 17,2 17,9 17,3 13,8 18,2 17,1 18,4 16,5 16,9 15,6 16,2 15,9 17,4 15,1 16,3 15,7 15,6 15,8 16,3 14,9 16,1 18,8 17,2 17,4 8 A. sp. F 8,5 13,1 10,0 9,4 7,1 5,4 6,8 18,6 19,1 18,8 17,2 19,8 17,4 17,9 17,1 17,1 14,8 15,8 15,5 15,4 15,5 15,9 15,8 16,1 15,5 16,0 15,5 17,2 17,8 15,8 16,8 9 A. andreae 12,0 16,5 10,8 13,7 9,7 12,5 14,5 11,7 10,9 14,5 17,5 20,3 17,5 19,6 17,3 16,6 17,9 17,9 16,1 17,7 15,7 17,8 17,8 16,4 15,5 19,0 19,9 20,5 19,5 18,5 17,6 10 A. sp. D 11,7 16,0 11,7 13,1 8,3 13,4 14,5 11,7 5,4 13,9 15,3 19,1 16,2 17,8 17,0 17,6 17,3 18,6 17,1 18,4 16,4 18,0 17,3 17,3 15,1 18,0 17,5 18,0 19,1 18,6 17,9 11 A. sp. E 12,0 15,4 10,5 13,1 8,3 12,5 14,2 11,4 4,3 2,3 16,3 18,9 17,1 17,2 16,1 19,3 19,3 17,7 16,7 17,9 16,7 18,0 18,1 16,9 16,2 16,5 17,0 15,0 17,8 18,4 18,5 12 A. martinezi 8,8 13,7 8,8 10,5 7,7 8,3 11,4 6,8 8,8 8,8 8,3 13,5 12,2 14,8 14,3 15,9 12,7 14,8 16,2 16,8 13,8 16,2 15,4 15,2 16,0 15,5 15,2 16,4 18,9 16,8 17,1 13 A. sp. B 9,7 14,5 9,1 10,8 9,4 10,3 11,7 9,4 12,8 11,4 10,8 7,1 10,0 15,3 16,9 16,3 16,8 16,4 17,1 17,1 15,6 15,9 16,3 16,1 17,2 17,1 15,7 17,1 18,3 15,8 17,0 14 A. saci 10,1 13,2 9,5 11,1 7,8 9,4 11,5 8,4 12,1 11,4 11,0 7,7 8,3 15,9 15,9 15,2 14,1 14,0 15,0 16,1 14,6 15,1 15,6 15,0 14,9 15,7 14,7 17,2 18,3 16,3 16,6 15 A. hylaedactyla 7,1 13,7 11,1 10,0 9,1 11,1 11,7 9,7 12,3 11,4 11,4 9,4 9,4 10,5 11,2 16,7 16,7 15,3 16,5 15,7 16,6 16,7 15,4 15,6 16,3 16,1 16,6 16,5 16,9 17,5 17,0 16 A. diptyx 7,1 12,0 9,7 9,4 8,5 9,4 10,8 7,7 10,0 9,4 8,3 7,4 7,4 8,3 7,1 17,8 16,5 15,0 14,3 12,8 14,6 15,5 14,3 13,8 14,1 14,5 15,8 15,2 15,2 16,2 16,1 17 A. sp. L 9,4 13,7 10,0 10,5 9,4 10,8 13,1 10,5 9,7 11,4 10,0 9,7 9,1 9,3 10,5 7,4 9,4 10,0 15,0 14,0 13,5 14,8 15,5 14,8 13,3 14,2 13,5 17,2 17,5 16,8 16,1 18 A. sp. M 8,5 13,1 10,7 11,7 9,0 11,0 12,4 9,5 10,7 10,4 9,3 9,0 8,7 8,7 8,8 6,1 4,7 9,7 14,9 13,9 14,0 14,5 15,5 15,4 14,6 14,3 13,3 16,6 16,8 16,2 16,0 19 A. thomei 8,4 11,8 10,0 10,8 8,2 9,1 11,1 8,6 10,6 9,7 8,8 8,1 8,4 7,7 10,0 6,0 6,4 5,3 14,1 12,8 13,2 14,9 14,9 14,1 14,6 14,1 13,1 15,6 15,2 15,9 15,6 20 A. sp. R 9,7 12,5 8,3 11,7 8,5 7,7 10,3 7,4 10,3 11,7 10,5 7,7 8,5 7,4 10,3 7,4 6,6 7,5 6,5 9,6 10,2 11,4 10,1 11,1 10,1 13,6 13,5 15,0 12,6 14,7 14,5 21 A. araucaria 9,7 12,5 9,7 11,7 9,1 8,5 9,7 7,8 11,8 12,0 11,7 10,1 10,1 8,2 10,0 8,7 8,5 8,5 7,3 3,7 9,7 11,5 11,2 9,7 10,3 13,0 12,5 12,7 11,8 14,7 12,9 22 A. sp. O 10,9 13,3 10,3 12,3 9,2 10,3 10,9 8,8 11,7 11,1 9,6 8,9 9,7 8,9 11,3 8,1 9,3 7,9 7,1 5,0 6,7 9,6 9,0 7,8 8,4 11,7 12,6 14,2 12,7 14,4 14,3 23 A. bokermanni 10,1 12,7 9,8 11,9 9,5 9,4 10,1 9,1 10,5 10,6 9,4 8,5 9,2 8,7 10,5 8,0 7,8 7,3 6,6 3,9 5,4 3,4 8,8 7,4 9,1 12,8 12,5 13,4 14,3 13,5 14,0 24 A. nana 10,4 12,8 9,3 11,9 9,7 10,0 10,8 9,3 9,8 10,7 9,2 9,1 9,7 8,8 9,8 7,8 7,0 6,8 7,0 4,4 5,9 4,3 2,5 7,4 8,0 12,0 12,5 14,6 13,7 12,6 13,3 25 A. engelsi 10,4 12,3 10,0 11,0 8,7 10,4 11,4 9,3 12,8 11,3 11,0 10,6 10,3 9,1 11,2 8,5 9,0 8,1 7,7 7,0 7,4 6,7 6,4 6,0 7,4 11,4 11,4 13,1 13,9 14,3 13,1 26 A. sp. N 9,7 12,3 10,0 11,4 8,0 10,3 10,3 8,5 11,4 9,7 9,7 9,4 9,7 8,1 10,3 8,3 8,3 7,0 6,3 4,6 5,0 2,9 2,4 3,0 4,8 10,3 10,4 11,9 12,1 10,8 10,5 27 A. ajurauna 9,7 12,