UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO ABIGAIL SAVIETTO ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA IN VITRO DE ATIVOS DESODORANTES EM SOLUÇÃO HIDROALCOÓLICA Rio Claro 2013 CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ABIGAIL SAVIETTO ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA IN VITRO DE ATIVOS DESODORANTES EM SOLUÇÃO HIDROALCOÓLICA Orientador: FERNANDO CARLOS PAGNOCCA Co-orientadora: THAIS BEZERRA CLAUDIO DE AVILA Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharela e Licenciada em Ciências Biológicas. Rio Claro 2013 Aos meus pais, Téo e Márcia, minhas almas gêmeas AGRADECIMENTOS À Deus, pelo dom da vida, pelos ensinamentos, sabedoria e perseverança, não só nos momentos de dificuldade, mas por colocar na minha vida pessoas maravilhosas com as quais convivo, seus verdadeiros “anjos”. Aos meus pais, Márcia e Téo, por me criarem como águia, por me proporcionarem ir além, por estarem ao meu lado de maneira sólida e paciente, e pelo amor incondicional dedicado à nossa família. A eles devo minha vida, meus genes, meu fenótipo, meu amor. Aos meus irmãos Natan, Davi e Tobias, pelo companheirismo, amizade e exemplo de verdadeiros homens, cada um com seu jeito genuíno de ser. Aos meus avós Ana e Jair (in memorian) que pela grande sabedoria de vida, são meus exemplos de humildade e simplicidade. Muitos foram os que me motivaram a produzir ciência, pesquisando e desenvolvendo o conhecimento da vida. Coincidentemente um deles é o meu primeiro orientador, Prof. Dr. José Chaud Netto, com o qual aprendi a importância de se amar o que faz. E, em busca do que eu amo, encontrei a oportunidade de trabalhar em um lugar no qual não apenas admiro, mas que me identifico profundamente pela razão de ser. Agradeço à empresa Natura Inovação e Tecnologia de Produtos Ltda., pelo grande aprendizado ao longo do Programa de Jovens Talentos, no Laboratório de Desenvolvimento de Fórmulas, e pelo financiamento deste trabalho. À pesquisadora Thais Bezerra Claudio de Avila, pela amizade, confiança e co-orientação. Às pesquisadoras Selma Nascimento e Silvania Angelino, que me recepcionaram nos primeiros meses de Natura, me ensinando com dedicação e paciência, muito mais do que os primeiros passos. À Elisangela Gama, gestora e coaching, pelas conversas, incentivos e grande ajuda nos momentos finais deste trabalho. E, em especial, à pesquisadora Nancy Kanegae, pela amizade, carinho, atenção e grandes ensinamentos para a vida e para o desenvolvimento de produtos. À equipe da Microbiologia da Natura, pesquisadoras Tatiane Manzano e Audrey Barbosa, pelos conhecimentos construídos. Ao meu orientador Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca, pela confiança dedicada ao meu trabalho, pelos conhecimentos e desafios dados a mim. Agradeço a todos do Laboratório de Microbiologia do Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) da UNESP de Rio Claro, em especial à Weilan (Paixão), Marina, Daniela Tura (Capitu) e Lídia (Brê), pelos conhecimentos que construímos juntas, pela prontidão da ajuda nos ensaios finais e pela amizade. Aos grandes amigos e amigas, que proporcionaram experiências “inenarráveis (MOMO, 2009)” e colaboraram para a construção da minha caminhada na universidade. Primeiramente à Paula e Mariana (Mangá), minhas veteranas, primeiras companhias e amizades em Rio Claro, meu sincero agradecimento pela inesquecível recepção, carinho, cuidado e conselhos, por fazerem me sentir em casa, e por apresentarem pessoas incríveis com as quais pude conviver: Thalles (Confirma), Rafael (Fii), Luiz Felipe (Momo), Renato (Bill), Filipe Marcel (Minhoca), Rodrigo, Mateus (Cazuza) e todos os agregados da República Alpha. Às eternas Jussara (Sara, Mimo) e sua irmã, Jeane (Jeje), à Fernanda (Fer), com quem dividi a melhor e inesquecível morada em Rio Claro, à Larissa (Carioca, Família), Daniela (Dani), Laryssa (Sushi), Letícia (Lê), Lídia (Brê), Paula (Puca), Leonardo (Boi), Luá, Vanessa (Fingers, Van), Bianca (Bia), Paula (Paulets), e todo o restante da família CBI 2009, Ana (Tropeça), Alexandre (Piru), Aline, Antônio (Pó), Arthur (Fininho), Bruno (Febem), Débora (Baby), Dayene, Elen, Gabriela Pessenda, Gabriela Tibúrcio (Tibú), Gabriela Schonhaus (Mil), Jorge (Noé), Júlia (Chapinha), Laís, Lucas (Laranjinha), Marcel, Maria Luísa (Malu), Matheus (Tcherbi), Michelle (Fofoca), Pedro Francisco (Garça, Gaga), Poliana, Raquel, Renan (Zoado), Regiane, e Verônica, agradeço por fazerem grande diferença nestes cinco anos, tornando-os mais do que especiais e inesquecíveis, com a certeza de que somos a segunda família de cada um e que tudo não poderia ter sido melhor! Enfim, a todos que tornaram possível, direta ou indiretamente, a realização deste trabalho, meu singelo agradecimento. “Para ser grande, sê inteiro: nada Teu exagera ou exclui. Sê todo em cada coisa. Põe quanto és No mínimo que fazes. Assim em cada lago a lua toda Brilha, porque alta vive.” (Ricardo Reis, 14/2/1933) RESUMO As estruturas da derme como os folículos pilosos e os ductos das glândulas sudoríparas e de óleo, proporcionam uma via de passagem por onde os micro-organismos atingem os tecidos mais profundos da pele. A transpiração fornece umidade e alguns nutrientes para o crescimento microbiano (TORTORA, 2012). Dentre os vários gêneros de bactérias que constituem a microbiota residente das axilas, encontram-se o Staphylococcus e o Micrococcus, responsáveis pelo odor do ácido isovalérico, o odor caracterísitico das axilas. Estão presentes também bactérias do gênero Corynebacterium, responsáveis pelo odor axilar pungente dos esteróides androgênicos (JACKMAN & NOBLE, 1983). O método mais eficaz de inibir a produção de exoenzimas bacterianas responsáveis pelo mau odor axiliar são as composições desodorantes. O método consiste em produzir um veículo cosmético (emulsão, suspensão em gás, composição hidroalcoólica, entre outros) e adicionar um ativo desodorante dissolvido ou em suspensão, que tem como propriedade a inibição da produção das exoenzimas bacterianas que levam à produção dos cheiros desagradáveis. (EIGEN & FROEBE, 1997). Neste trabalho testamos a suscetibilidade de três espécies de bactérias semelhantes às que compõem a microbiota permanente das axilas (Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 e Corynebacterium xerosis ATCC 373), frente a três formulações cosméticas hidroalcoólicas de desodorantes em spray contendo ativos desodorantes. Utilizamos também a linhagem Escherichia coli ATCC 8739, pois esta enterobactéria pode estar presente nas axilas principalmente pelo contato destas com as mãos (BORICK & SARRA, 1960). A metodologia utilizada para os testes foi baseada na norma M7-A7 (CLSI, 2006), que trata dos testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição para bactérias de crescimento aeróbico. A fórmula desodorante que teve melhor desempenho sobre as cepas testadas foi a que continha Polyaminopropyl Biguanide (biguanida), quando comparado ao Polyglyceryl-3 Caprilate (éster) e ao 2-Methyl 5- Cyclohexylpentanol (álcool), mesmo sobre a E. coli. Concluímos também que o veículo cosmético utilizado, uma mistura de álcool hidratado neutro orgânico 96% e água desmineralizada, não interferiu nas respostas das bactérias aos ativos desodorantes. Palavras-chave: Microorganismos. Microbiologia Aplicada. Antimicrobianos. Desodorantes Spray. Concentração Inibitória Mínima. Sumário 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 9 1.1 A indústria de cosméticos e o incentivo às pesquisas em desenvolvimento de produtos inovadores ............................................................................................................. 9 1.2 Fisiologia do suor, microbiota axilar e desodorantes ............................................. 9 1.3 Mecanismos de ação de desodorantes .................................................................... 11 1.3.1 Ativos que atuam sob demanda enzimática ......................................................... 11 1.3.2 Ativos quelantes de moléculas de mau odor ....................................................... 12 1.3.3 Ativos impedientes de formação de biofilme ...................................................... 12 1.3.4 Ativos antitranspirantes ....................................................................................... 12 1.3.5 Ativos antimicrobianos bactericidas ou bacteriostáticos ..................................... 13 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 14 3 MATERIAIS ........................................................................................................................ 15 3.1 Ativos desodorantes ...................................................................................................... 15 3.1.1 Cosmocil® CQ (Polyaminopropyl Biguanide ou PHMB) .................................. 15 3.1.2 SymDeo® B125 N (2-Methyl 5-Cyclohexylpentanol) ....................................... 15 3.1.3 Tego Cosmo P813®, (Polyglyceryl-3 Caprylate) ............................................... 16 3.2 Cepas bacterianas ......................................................................................................... 17 3.2.1 Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis ........................................ 17 3.2.2 Corynebacterium xerosis ..................................................................................... 17 3.2.3 Escherichia coli ................................................................................................... 18 4 METODOLOGIA ................................................................................................................ 19 4.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). ..................................... 19 4.1.1 Preparação dos Desodorantes .............................................................................. 19 4.1.2 Preparação do cultivo de 24 horas ....................................................................... 19 4.1.3 Preparação das placas e realização do teste ......................................................... 20 4.2 Análise dos resultados .................................................................................................. 21 4.3 Determinação da atividade antibacteriana dos desodorantes .................................. 22 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 23 5.1 Determinação da concentração de ativo desodorante em cada produto ......................... 23 5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ............................................. 23 5.3 Mecanismos de ação dos ativos desodorantes ................................................................ 27 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 30 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 31 APÊNDICE A – RESULTADOS DETALHADOS ............................................................ 37 ANEXOS - CONSTITUINTES DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS ............... 38 Anexo A – Constituintes do meio TSB (Trypticase Soy Broth) ........................................... 38 Anexo B – Constituintes do meio TSA (Tripticase Soy Agar) ............................................ 38 9 1 INTRODUÇÃO 1.1 A indústria de cosméticos e o incentivo às pesquisas em desenvolvimento de produtos inovadores O mercado brasileiro de higiene pessoal, perfumaria e cosméticos ocupa o terceiro lugar no mercado consumidor de cosméticos e produtos de higiene pessoal no mundo, ficando atrás apenas dos EUA e Japão. É o primeiro mercado em perfumaria e desodorantes; segundo mercado em produtos para cabelos, produtos masculinos, infantis, produtos para banho, depilatórios e proteção solar; terceiro em produtos cosméticos coloridos (maquiagem) e de higiene oral; quarto em produtos para a pele (ABIHPEC, 2013). Para o presidente da Associação Brasileira de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos (Abihpec), João Carlos Basilio, esse crescimento se deve principalmente às mulheres, as quais representam quase 50% da população economicamente ativa e também à situação econômica favorável que o Brasil vive atualmente. As empresas do setor priorizaram os investimentos nas áreas de marketing, inovação tecnológica e na modernização do parque industrial, o que representou um investimento de R$ 9,2 bilhões em 2010 (SINDIFARMA JP, 2011). Em se tratando dos investimentos em inovação, a indústria de cosméticos vem realizando muitas pesquisas de base, resultando em melhorias e inovação para grande parte de seu portfólio de produtos. Nesse sentido, a Microbiologia desempenha papel preponderante na indústria de cosméticos, especialmente para a avaliação de conservantes e ativos desodorantes mais eficientes e seguros ao consumidor. Desde a introdução do primeiro produto desodorante no mercado, em 1888 (SEITZ et. al.), esta categoria de cosméticos vem crescendo e se tornando uma das maiores categorias CFT (do inglês “cosmetics, fragrancies and toilletries”) em termos de número de usuários, frequência de uso e total de vendas (SINDIFARMA JP, 2011). 1.2 Fisiologia do suor, microbiota axilar e desodorantes A pele humana contém dois tipos de glândulas sudoríparas: as glândulas merócrinas e as apócrinas. As glândulas merócrinas estão espalhadas por toda a superfície corporal. O composto secretado por estas últimas, o suor, é de natureza aquosa, composto por uma 10 solução extremamente diluída, que contém sódio, potássio, íons cloreto, ureia, amônia, ácido úrico e pouca quantidade de proteínas (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008). Essas glândulas agem tanto na termorregulação, pois sua secreção evapora ao atingir a superfície da pele, fazendo baixar a temperatura corporal, quanto na excreção de catabólitos. Já as glândulas apócrinas, estão presentes nas axilas, nas regiões perianal e pubiana e na auréola mamária. Elas produzem uma secreção viscosa e inodora que adquire um odor desagradável e característico devido à ação decompositora (enzimática) das bactérias da pele. Os ductos das glândulas apócrinas bem como os ductos das glândulas sebáceas, desembocam nos folículos pilosos, e suas secreções se misturam na superfície da pele. A secreção das glândulas sebáceas é uma mistura complexa de lipídeos que contém triglicerídeos, ácidos graxos livres, colesterol e ésteres de colesterol, além de restos celulares (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008). A investigação sobre a natureza do odor corporal se iniciou em torno da década de 1960 com a descoberta de que o odor axilar é produzido pela ação decompositora de bactérias sobre as secreções inodoras de glândulas apócrinas que produzem o suor (STRAUSS & KLIGMAN, 1956). Embora a visão inicial de Strauss e Kligman tenha sido de que qualquer população axilar de bactérias, sejam elas Gram-positivas ou Gram-negativas, pudesse causar odor, poucos anos mais tarde, Shehaden e Kligman (1963) descreveram que o mau odor axilar é causado principalmente por bactérias de natureza Gram-positiva, que liberam exoenzimas que decompõem as secreções glandulares, resultando em odores desagradáveis. Segundo Tortora et al. (2012), as axilas apresentam-se como áreas de oclusão parcial que fazem com que a temperatura e umidade se elevem. Por serem quentes, úmidas e revestidas de pelos em grande área superficial, respondem pela proliferação de bactérias causadoras do típico odor axilar. As condições de temperatura e umidade das axilas dão origem ao aparecimento de uma microbiota peculiar, sendo uma parte desta microbiota residente e outra, transitória. A microbiota residente, representada por uma pequena diversidade de micro-organismos, está presente na superfície do extrato córneo, na parte superior dos folículos pilosos e nas glândulas sebáceas, sendo um lugar profundo e de difícil eliminação. Já a microbiota transitória apresenta grande variedade de micro-organismos localizados sobre a superfície da pele e é facilmente eliminada pela higienização adequada (VIGLIOGLIA & RUBIN,1991 apud COSTA, 2005). Dentre os vários gêneros de bactérias que constituem a microbiota residente das axilas, encontram-se o Staphylococcus e o Micrococcus, responsáveis pelo odor do ácido isovalérico, caracterísitico das axilas. Estão presentes também bactérias do gênero Corynebacterium, responsáveis pelo odor axilar pungente dos esteróides androgênicos, além 11 de representantes de outros gêneros, como Propionibacterium, Streptococcus e Sarcina (JACKMAN & NOBLE,1983). Já a microbiota transitória é constituída por bactérias Gram- negativas, presentes no trato gastrointestinal e que podem ser passadas para as axilas pelo contato de boca e mãos devido à má higienização (BORICK & SARRA, 1960). O método mais eficaz de inibir a produção de exoenzimas bacterianas responsáveis pelo mau odor axiliar são as composições desodorantes. O método consiste em produzir um veículo cosmético (emulsão, suspensão em gás, composição hidroalcoólica, entre outros) e adicionar um ativo desodorante dissolvido ou em suspensão, que tem como propriedade a inibição da produção das exoenzimas bacterianas que produzem o mau cheiro (EIGEN & FROEBE, 1997). 1.3 Mecanismos de ação de desodorantes Os ativos desodorantes podem atuar de diversas maneiras: (i) demanda enzimática; (ii) quelantes de moléculas que geram o mau odor; (iii) impedientes da formação de biofilme; (iv) ação antimicrobiana bactericida ou bacteriostática (LUKACS et al, 1991). Outra maneira de inibir a produção do mau odor axilar é através de (v) substâncias antitranspirantes, as quais não são consideradas ativos desodorantes químicos, mas físicos. 1.3.1 Ativos que atuam sob demanda enzimática Os ativos desodorantes que atuam sob demanda enzimática foram propostos no início da década de 1990, com destaque para os ésteres citrato de etila, poligliceril-3 caprilato e o lactato de alquila. Eles atuam indiretamente sobre a atividade das bactérias da axila, liberando componentes ácidos na pele humana, os ácidos equivalentes: ácido cítrico, ácido caprílico e ácido lático, respectivamente. Esta liberação ocorre depois da clivagem enzimática do éster pela ação das bactérias. Desta forma esses ativos modificam o ambiente axilar, reduzindo o pH da superfície da pele e assim, previnem a ação das bactérias sobre o suor, uma vez que elas são mais ativas em lugares onde o pH da superfície da pele é menos ácido (OSBERGHAUS, 1980). 12 1.3.2 Ativos quelantes de moléculas de mau odor Nos ativos quelantes de moléculas que geram o mau odor ou absorvedores de odor, como os sais de metais como o zinco, as moléculas presentes no suor, como as derivadas de aminas, ácidos graxos e compostos sulfonados ligam-se ao metal, formando outros compostos, reduzindo assim a produção do mau odor (KUHN, et al., 2000). O ativo com este mecanismo, mais utilizado atualmente é o ricinoleato de zinco, molécula patenteada pela empresa alemã Evonik e hoje utilizada em larga escala na neutralização de odores de efluentes industriais (KUHN, et al., 2000). Alguns pesquisadores acreditam que em algumas fragrâncias há compostos que podem formar quelatos com o zinco e assim atuarem como um ativo desodorante. Entretanto, neste contexto, as fragrâncias em geral apenas são consideradas ingredientes mascaradores de odor, pois se misturam com o odor corporal e não eliminam ativamente as bactérias ou as moléculas de mau odor (LOWICHI, 1974). 1.3.3 Ativos impedientes de formação de biofilme Os ativos antibiofilme atuam de forma a imitar as estruturas e substâncias da pele onde as bactérias costumam aderir - estruturas específicas de proteínas, oligossacarídeos, lipídeos e superfícies hidrofóbicas (COSMETIC SOLABIA GROUP, 2012). Como o ativo imita essas estruturas, as bactérias aderem a ele ao invés de aderirem à pele, e com isso não ocorre a formação de biofilme, formado principalmente pelas bactérias do gênero Staphylococcus e Corynebacterium (BROCK, 2010), presentes na axila. 1.3.4 Ativos antitranspirantes Outra maneira de controlar o crescimento da população de bactérias responsáveis pelo odor axilar se dá pelo uso de sais de alumínio ou zircônio nas composições desodorantes. Os sais de alumínio obstruem fisicamente os ductos das glândulas, impedindo a sudorese, e dessa forma, pela diminuição da quantidade de água nas axilas, as bactérias tem seu crescimento diminuído (ALVES et al., 2006). Segundo Draelos (1999) desodorantes são tidos como formulações destinadas a remover o mau odor das axilas, enquanto que os antitranspirantes são usados para promover a redução da quantidade de suor produzido através de mecanismos fisiológicos. Os antitranspirantes também funcionam como desodorantes, mas os desodorantes não agem como antitranspirantes. (DRAELOS, 1999). Tem-se verificado grande eficácia na 13 diminuição do odor axilar nestas formulações consideradas antitranspirantes, bem como na redução do desconforto da sudorese (ALVES et. al., 2006). 1.3.5 Ativos antimicrobianos bactericidas ou bacteriostáticos Os ativos desodorantes antimicrobianos são os mais utilizados para prevenir o mau odor. Atuam de maneira a controlar o crescimento da microbiota bacteriana presente na superfície da pele das axilas, agindo diretamente nas bactérias causadoras do mau odor, pela inibição do crescimento bacteriano ou causando a morte das bactérias. Como exemplos de ativos antimicrobianos utilizados no mercado, temos o Triclosan e o Farnesol (COX, 1987). O ativo desodorante Triclosan, é ainda amplamente utilizado nos dias de hoje por diversas indústrias cosméticas, mas têm sido questionado sob diversos aspectos (LUKACS, 1991). Em 1994, este ativo foi considerado um possível agente carcinogênico pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (Usepa - United States Environmental Protection Agency) (ASSUNÇÃO & PESQUERO, 1999). Em vista disso, algumas indústrias têm investido na busca de novos ativos desodorantes antimicrobianos, alternativos ao triclosan, comprometidos não só com a eficácia do produto, mas também, com questões de segurança ambiental e social. Ainda sobre os ativos antimicrobianos reside a problemática da resistência de patógenos humanos a múltiplas drogas, sendo que a procura de novos ativos antimicrobianos a partir de espécies vegetais é uma das possibilidades para a produção de ativos com maior eficácia e segurança (ANTUNES, et al.,2006) (CATÃO et al., 2006) (NOVAIS, et al. 2003) (OLIVEIRA, et al, 2006) (OLIVEIRA, et al. 2007). Extratos e óleos essenciais de várias espécies vegetais mostraram-se eficientes no controle do crescimento de uma ampla variedade de micro-organismos, incluindo fungos e bactérias e, portanto, apresentam grande potencial para o desenvolvimento de produtos mais seguros para o uso (DEOUX, 1998). Em vista do exposto acima, pesquisas para a produção de conservantes e desodorantes mais eficazes para o consumidor e mais seguros sócio ambientalmente, quando comparados com os utilizados hoje, precisam ser estimuladas. 14 2 OBJETIVOS Este trabalho teve como objetivos: I. Determinar a suscetibilidade de micro-organismos residentes da flora axilar em relação a três diferentes fórmulas cosméticas de desodorantes em spray hidroalcoólicos. II. Determinar o mecanismo de ação dos ativos desodorantes em relação às cepas testadas. 15 3 MATERIAIS 3.1 Ativos desodorantes 3.1.1 Cosmocil® CQ (Polyaminopropyl Biguanide ou PHMB) Cosmocil® CQ ou polyamynopropyl biguanide (figura 1), é uma solução aquosa de 20% de poly(hexamethylenebiguanide) hydrochloride, também conhecido como PHMB, um agente antimicrobiano de amplo espectro, que tem sido utilizado há anos como antisséptico no meio hospitalar (KUSNETSOV et al, 1997). Na indústria farmacêutica, é utilizado em formulações para desinfecção de lentes de contato (HITI et al, 2002.), e como antisséptico bucal (ROSIN et al, 2001, 2002). Na indústria de alimentos, é utilizada para o tratamento de ovos para incubação evitando a infecção por Salmonella (COX et al, 1998, 1999). Já na indústria cosmética, o Cosmocil® CQ é um composto eficaz na conservação de produtos tais como removedores de maquiagem, cremes hidratantes, sabonetes líquidos, lenços umedecidos e também tem ação como conservante e desodorante (ARCH CHEMICAL, 2012). Figura 1 – Estrutura química da Polyaminopropyl biguanide (PHMB) Fonte: ARCH PERSONAL CARE PRODUCTS (2005) 3.1.2 SymDeo® B125 N (2-Methyl 5-Cyclohexylpentanol) O 2-Methyl 5-Cyclohexylpentanol (figura 2) é um produto patenteado, amplamente utilizado como agente antimicrobiano específico contra as bactérias gram-positivas causadoras do mau odor axilar, e também atua como agente antiformação de biofilme por bactérias dos gêneros Corynebacterium e Staphylococcus (SYMRISE, 2012). 16 Figura 2 – Estrutura química do 2-Methyl 5-Cyclohexylpentanol Fonte: SYMRISE (2012) 3.1.3 Tego Cosmo P813®, (Polyglyceryl-3 Caprylate) O polyglyceryl-3 caprylate, também conhecido como triglyceryl monocaprylate é um éster de ácido caprílico e poliglicerina-3. Possui atividade desodorante sob demanda enzimática. As enzimas produzidas durante a transpiração clivam o polyglyceryl-3 caprylate formando ácido caprílico, que é cem vezes mais eficaz que o seu químico de origem, no combate ao mau odor (EVONIK, 2009), pois modifica o ambiente axilar pela redução do pH da superfície da pele e dessa forma, diminui a ação das bactérias sobre o suor (OSBERGHAUS, 1980). De origem vegetal, o éster é obtido do óleo de coco ou de palma. Não contém adição de conservantes e oxidantes. Possui função surfactante e co-emulsionante, com atividade antimicrobiana. Pode ser aplicado em loções, cremes, sprays e géis transparentes para produtos desodorantes e destinados ao cuidado da pele. Figura 3 – Estrutura química do Polyglyceryl-3 Caprylate Fonte: ENOVIK (2009) 17 3.2 Cepas bacterianas Os seguintes micro-organismos (cepas de referência da ATCC, American Type Culture Collection) foram utilizados nos ensaios: Staphylococcus aureus ATCC 6538; Escherichia coli ATCC 8739; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Corynebacterium xerosis ATCC 373. São considerados como organismos-padrão da flora axilar (TANNOCK, 1995) e são frequentemente utilizados em testes para verificação da ação antimicrobiana de desodorantes cosméticos. 3.2.1 Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis As bactérias do gênero Staphylococcus apresentam-se como células esféricas com cerca de 1µm de diâmetro, tendendo a formar agrupamentos irregulares semelhantes a cachos de uva. Elas também ocorrem como cocos isolados ou formando pares, tétrades ou cadeias curtas. Não formam esporos e são imóveis. Os cocos jovens são Gram-positivos, mas com o envelhecimento celular, algumas células podem tomar a aparência de Gram-negativos. São largamente distribuídos na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves. Crescem rapidamente em muitos tipos de meios de cultura e por isso, são pouco exigentes nutricionalmente. São metabolicamente ativos, aeróbios facultativos, fermentando carboidratos e produzindo pigmentos que variam do branco ao amarelo forte. (JAWETZ, et al 2000; TORTORA, et al 2000). O S.aureus forma colônias variando de acinzeantadas a amarelo-douradas. No isolamento primário as colônias de S.epidermidis costumam ser de cor cinza a branca. Muitas colônias só apresentam coloração após a incubação prolongada (JAWETZ, et al 2000). Staphylococcus epidermisdis são muito comuns na pele, representando quase 90% da microbiota desta região. Geralmente são patogênicos apenas quando a barreira da pele é rompida ou invadida por procedimentos médicos. Já o S. aureus é o mais patogênico dos estafilococos. É residente permanente das passagens nasais de 20% da população, e cerca de 60% são portadores ocasionais (TORTORA et al., 2012). 3.2.2 Corynebacterium xerosis As bactérias do gênero Corynebacterium têm de 0,5 a 1µm de diâmetro e vários micrômetros de comprimento (JAWETZ et al., 2000). São organismos bacilares Gram- positivos, aeróbicos, imóveis e com a propriedade de formarem arranjos de formato irregular, B 18 em clava ou em “V” durante o crescimento normal. O gênero Corynebacterium consiste em um grupo extremamente diverso de bactérias, incluindo patógenos de animais e plantas (BROCK, 2010). 3.2.3 Escherichia coli São bactérias bacilares, Gram-negativas, aeróbias facultativas e não formadoras de esporos, que fermentam a lactose produzindo gás. É um micro-organismo habitante do trato intestinal e algumas vezes são patogênicas. Formam colônias lisas e um pouco mucoides. Bactérias do trato intestinal podem, ocasionalmente, ser encontrados na pele, dispersadas pelo contato com as mãos contaminadas. Elas raramente crescem sobre a pele, devido a sua incapacidade de competir com os organismos Gram-positivos, mais adaptados às condições secas (BROCK, 2010). 19 4 METODOLOGIA Para se determinar a concentração ideal que os desodorantes em spray deveriam conter de cada ativo antimicrobiano, foi feito um levantamento em bases bibliográficas comumente utilizadas em cosmetologia como o Personal Care Products Council – On-line Infobase, Ingredients Database, e em bibliografia emitida pelos fornecedores dos ativos desodorantes. Posteriormente, os desodorantes foram manipulados baseando-se nas faixas de concentrações encontradas na literatura dos fornecedores. As concentrações aplicadas nas fórmulas de desodorante deste trabalho encontram-se aproximadamente na média da faixa indicada por eles (ver tópico 5.1). Com o intuito de se investigar a suscetibilidade de micro-organismos residentes da flora axilar em relação a três diferentes fórmulas cosméticas hidroalcoólicas de desodorantes, foram realizados Testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM). 4.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). A concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a menor concentração de um agente antimicrobiano que impossibilita o crescimento visível do micro-organismo em teste (CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (CLSI), 2006). 4.1.1 Preparação dos Desodorantes Após a determinação das concentrações de cada ativo, os produtos desodorantes foram manipulados em base hidroalcoólica, contendo quantidade fixa de álcool etílico neutro orgânico (715g/L), e as quantidades de ativo desodorante indicadas pela literatura. O volume foi completado para 1 litro com água desmineralizada. Também foi preparada uma solução de álcool etílico hidratado neutro orgânico 96% à 71,5% da fórmula (715g/L), e 28,5% de água desmineralizada (285g/L), sem ativo desodorante, para controle negativo dos produtos. 4.1.2 Preparação do cultivo de 24 horas As cepas conservadas em freezer a -80°C foram reativadas em meio Trypticase soy agar (TSA). Após 24 horas de incubação a 25°C, os isolados foram repicados novamente para 20 o meio TSA. As placas foram incubadas a 35°C +/- 2ºC por 24 horas, para posterior utilização nos testes. 4.1.3 Preparação das placas e realização do teste A partir da cultura de 24 horas em TSA, foi preparada uma suspensão celular em solução salina 0,85%. A turbidez foi ajustada de acordo com a escala de McFarland 0,5, a qual corresponde a uma suspensão-padrão de bactérias com concentração de fator células/mL. Foram utilizadas placas de Elisa com fundo chato, indicadas para a leitura em espectrofotômetro Anthos Multiread 400 - Leitora de Elisa Espectrofotométrica. Na preparação das placas, foram distribuídos 100 μL do meio Trypticase Soy Broth (TSB) em todos os poços da microplaca. Foram acrescentados, de forma decrescente, 100μL de desodorante, em 10 poços de cada linha da microplaca, ou seja, as diluições foram procedidas transferindo-se 100μL da coluna 2 para a coluna 3, 100μL da coluna 3 para a coluna 4 e assim sucessivamente até a coluna 11. A coluna 12 foi reservada para controle do inóculo (100μL do meio Tryptic Soy Broth (TSB) e 100μL do inóculo), e poços da coluna 1 foram reservados para controle do meio (200μL do meio TSB) e controle do meio contendo desodorante (100 μL de meio e 100 μL de desodorante). Após esse processo, foi aplicado 100 μL da suspensão de bactérias em todos os poços de duas linhas da microplaca, as quais já continham o desodorante, de forma que todas as cepas foram testadas em duplicata na mesma placa (figura 4). 21 Figura 4 – Preparação das placas de Elisa: Coluna 1, poços A, B, C e D: controle do meio TSB; Coluna 1, poços E, F, G e H: controle do meio com desodorante em teste; Coluna 12: Controle dos inóculos; Colunas 2 a 11: meio TSB, desodorante em diluições sucessivas e inóculos; Linhas A e B: Staphylococcus aureus ATCC 6538; Linhas C e D: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Linhas E e F: Escherichia coli ATCC 8739; Linhas G e H: Corynebacterium xerosis ATCC 373. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H FONTE: elaborado pela autora Com a adição do inóculo, as concentrações dos desodorantes nos poços variaram 1750 mg/L a 6,68 µg/L de Polyaminopropyl Biguanide; 750 mg/L a 2,86 µ/L de Polyglyceryl-3 Caprylate; e 1250mg/L a 4,77µg/L de 2-Methyl 5-Cyclohexylpentanol. Todos os testes foram realizados duas vezes para confirmação do primeiro resultado. A incubação foi a 35°C +/- 2º C, em estufa com temperatura controlada, durante 24 e 48 horas. 4.2 Análise dos resultados Foram realizadas leituras visuais e em espectrofotômetro após 24 horas e 48 horas de incubação. A análise visual foi realizada com o auxílio de um espelho para a leitura. Para os ativos bactericidas, como o 2-Methyl 5-Cyclohexylpentanol e o Polyaminopropyl Biguanide, a determinação da CIM se fez em 100% de inibição, ou seja, na concentração onde não se observou nenhum crescimento. Para o ativo polyglyceryl-3-caprylate, a CIM foi determinada com 50% de inibição, pois este ativo tem mecanismo de ação sob demanda enzimática, e portanto poderia atuar como um bacteriostático, e não bactericida, de acordo com o nível de liberação de ácido caprílico. O controle do inóculo foi considerado como 100% de crescimento, com o qual foi realizada a comparação para determinação da CIM. 22 Para a leitura em espectrofotômetro foi utilizado filtro de 450nm. Esta leitura é realizada para confirmar a leitura visual, sendo importante principalmente para a análise dos resultados do ativo polyglyceryl-3 caprylate, já que a determinação visual para 50% do crescimento pode possibilitar maior chance de erro. Para este ativo, a CIM foi determinada pelo valor de absorbância mais próximo da metade do valor do controle do inóculo. Para os ativos bactericidas, o resultado foi obtido a partir da análise do primeiro poço em que o valor se aproximou do valor da absorbância no controle do meio. Os resultados da leitura visual e da absorbância foram comparados para determinação do resultado final. 4.3 Determinação da atividade antibacteriana dos desodorantes Após as análises visuais e por espectrofotometria, as placas foram submetidas a um novo teste, para verificar a viabilidade das bactérias em cada poço das microplacas. Com auxílio de um inoculador de múltiplos pontos, o conteúdo dos poços das placas foi inoculado em placas de petri contendo meio TSA, e cultivado novamente em estufa com temperatura controlada a 35ºC +/- 2ºC, por 24 horas. Nos posições dos poços onde não se observou crescimento, foi considerada a concentração bactericida mínima (CBM) do ativo desodorante. 23 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Determinação da concentração de ativo desodorante em cada produto A partir de informações da literatura, comentadas na seção 4 deste trabalho, foi determinada a concentração ideal que cada desodorante deveria conter de ativo. É importante ressaltar que a metodologia utilizada pelos fornecedores para determinar as faixas de concentração ideal de ativo é determinada através da Concentração Inibitória Mínima (CIM), pelo Método das Diluições Sucessivas, de acordo com a norma M7-A7 (CLSI, 2006). As concentrações permitidas variam para a finalidade do uso – se desodorante, se conservante, se emoliente; de acordo com a função cosmética a que se destina o ativo –, bem como o país em que se está produzindo o cosmético. A “potência”, se assim podemos dizer em relação às matérias-primas cosméticas, e o espectro de ação de cada ativo também varia, portanto, a concentração dos ativos nas fórmulas de desodorante em spray não foram as mesmas para cada ativo. O desenho experimental deste estudo baseou-se nas informações bibliográficas de cada fornecedor para os ativos desodorantes em questão. As concentrações aplicadas nas fórmulas de desodorante deste trabalho encontram-se aproximadamente na média da faixa indicada pelos fornecedores (tabela 1), e estão dentro da concentração permitida pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para a formulação de desodorantes grau 1 (sem ativo antitranspirante) (RESOLUÇÃO - RDC Nº 211, DE 14 DE JULHO DE 2005). Tabela 1 – Faixa da concentração indicada pelos fornecedores para cada ativo em teste e concentração utilizada nas formulações desodorantes. Ativo desodorante Faixa de concentração indicada (g/L) Concentração utilizada nas fórmulas (g/L) Cosmocil 2 a 15 7 Symdeo 1 a 11 5 5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) Os resultados deste teste demonstraram que a fórmula desodorante contendo 715g/L de álcool etílico hidratado neutro orgânico 96% e água desmineralizada, ou seja, o veículo 24 diluente das fórmulas desodorantes testadas neste trabalho, não teve efeito sobre os micro- organismos, visto que não houve inibição do crescimento bacteriano. Observa-se na tabela 2 que para a E. coli, não houve inibição do crescimento nas duas primeiras colunas da microplaca, onde a concentração do veículo cosmético hidroalcoólico era de 178,75 mg/L e 44,6875 mg/L respectivamente. A suscetibilidade das cepas de E. coli, frente ao veículo cosmético hidroalcoólico, quando comparada às outras bactérias estudadas, se deve ao fato de que bactérias Gram- negativas apresentam relativa resistência à entrada de substâncias no interior celular, devido à presença de uma membrana externa lipopolissacarídica, e às características de suas porinas (orifícios da parede de bactérias Gram-negativas), que selecionam as moléculas que penetram na célula (TORTORA et al., 2012). Tabela 2 – CIMs para a fórmula de desodorante spray, sem ativo desodorante, frente às quatro cepas de bactérias, com base em leitura visual. Espécie Período de Incubação (h) CIM (mg/L) S. aureus 24 178,75 48 178,5 S. epidermidis 24 178,5 48 178,5 C. xerosis 24 178,5 48 178,5 E. coli 24 11,2 48 44,7 Para interpretar os resultados de determinação da CIM segundo categorias de suscetibilidade (suscetível, suscetibilidade dose-dependente ou resistente) é necessário comparação com informações já disponíveis na literatura para cada espécie ou gênero frente a cada ativo antimicrobiano. Como esses dados não estão disponíveis para os ativos utilizados neste trabalho, não existem valores específicos de breakpoints, portanto, adotaram-se para as quatro espécies em questão apenas a comparação da atividade dos ativos frente às quatro espécies de bactérias usadas nos ensaios. A leitura de 50% de inibição para antibacteriano bacteriostático se faz necessária para que os valores obtidos sejam mais confiáveis, uma vez que não atuam nas células já formadas que foram aplicadas no teste e estas podem acarretar em leituras de falsa resistência, através do fenômeno de trailing. O trailing é identificado quando há um aumento da CIM de 24 horas 25 para 48 horas e o isolado que era classificado como “sensível” se torna “resistente” (CLSI, 2006). Alguns resultados demonstraram diferença de uma diluição entre a leitura visual de 24h e 48h; apesar disso, não houve alteração da categoria de interpretação, ou seja, não resultou em uma mudança da classificação da cepa de “sensível” para “resistente”. Porém, algumas cepas apresentaram um aumento no valor da CIM entre 24h e 48h, frente aos ativos Symdeo e o Tego. No entanto, no caso do Symdeo, este aumento não foi caracterizado como trailing, porque este ativo é bactericida. Por outro lado, no caso do Tego, por atuar sob demanda enzimática, este apresenta uma tendência de aumento dos valores de CIM com o passar do tempo e, portanto, reforça-se a orientação sobre a realização de leituras no menor tempo possível, desde que haja crescimento do isolado no controle-positivo, pois o ativo pode perder sua atividade ao longo do tempo (EVONIK, 2009). Os valores de CIM obtidos tanto nas duplicatas presentes na mesma placa quanto nos testes realizados para confirmação dos resultados foram semelhantes. Para S. aureus, esses valores ficaram entre 0,03 mg/L a 0,11mg/L para o Cosmocil, 1,22 mg/L a 4,88 mg/L para o Symdeo e 46,88 mg/L a 187,5 mg/L para o Tego. Para S. epidermidis as faixas de CIMs determinaram valores de 0,03 mg/L a 0,11 mg/L para o Cosmocil, 1,22 mg/L a 4,88 mg/L para o Symdeo e 46,88 mg/L a 187,5 mg/L para o Tego. Para C. xerosis, os valores de CIMs foram 0,01mg/L a 0,03 mg/L para o Cosmocil, 1,22 mg/L para o Symdeo e 11,72 a 46,88 mg/L para o Tego. Para a cepa de E. coli, única bactéria Gram-negativa utilizada nos testes, este valores compreendem faixas maiores, sendo estas 0,03 mg/L a 0,43 mg/L para o Cosmocil, 78,13 mg/L a 312,5 mg/L para o Symdeo e 11,72 mg/L a 187,5 mg/L de Tego. Tabela 3 – Valores de CIM dos três ativos desodorantes frente às quatro espécies de bactérias, com base em análise visual. Espécie Período de Incubação (h) Faixa de CIM (mg/L) Cosmocil Symdeo Tego S. aureus 24 0,03 – 0,11 1,22 – 4,88 46,88 – 187,5 48 0,03 – 0,11 0,31 – 4,88 46,88 – 187,5 S. epidermidis 24 0,03 – 0,11 1,22 – 4,88 46,88 – 187,5 48 0,01 – 0,11 1,22 – 4,88 11,72 – 187,5 C. xerosis 24 0,01 – 0,03 1,22 11,72 – 46,88 48 0,01 – 0,03 1,22 2,93 – 46,88 E. coli 24 0,03 – 0,43 78,13 – 312,5 46,88 48 0,03 – 0,43 78,13 – 312,5 11,72 – 187,5 26 Comparativamente, vemos na tabela 3 que o ativo Polyaminopropyl biguanide (Cosmocil ou PHMB), teve o melhor desempenho, ou seja, inibiu o crescimento bacteriano em menores concentrações, quando comparado aos demais ativos. Broxton et al. (1984) demonstraram que a atividade máxima do PHMB ocorre entre a faixa de pH de 5 a 6 e que, inicialmente, o biocida interage com a superfície das células e, em seguida, é transferido para o citoplasma e a membrana citoplasmática. Ikeda e colaboradores (1984) mostraram que o PHMB catiônico teve pouco efeito sobre os fosfolipídeos neutros da membrana bacteriana; sua principal atuação foi sobre as estruturas de membrana carregadas negativamente que, induzidas a se agregarem, promoviam um aumento na fluidez e permeabilidade. Isto resulta na liberação de lipopolissacarídeos da membrana externa, afluxo de íons de potássio e consequente morte celular. Portanto, talvez esta deva ser a razão da melhor atuação deste ativo, inclusive sobre a E. coli, a qual, por ser Gram-negativa, apresenta membrana lipopolissacarídica. Em estudo específico sobre a ação de PHMB sobre cepas de E.coli¸ Allen e colaboradores (2004) descobriram uma forte relação do PHMB com o DNA bacteriano, conduzindo a uma precipitação in vitro. Esta descoberta indica um fator crítico subjacente aos diferentes efeitos das concentrações de PHMB utilizadas (se bactericida ou bacteriostático): em baixas concentrações, o PHMB causa danos ao genoma da bactéria, mas estes podem ser tolerados e até mesmo reparados. Entretanto, em altas concentrações o PHMB causa uma intensa perturbação nas funções do DNA, levando à morte celular (ALLEN, et al. 2006). Portanto, além dos danos à membrana celular descritos por Broxton e Ikeda em 1984, o PHMB não só afeta a membrana celular, mas também interage letalmente com o DNA da célula, quando em altas concentrações. A classe das biguanidas tem amplo espectro de atividade e são efetivas contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, porém não apresentam atividade esporocida (TORTORA, et al. 2012), o que corrobora com os resultados apresentados neste trabalho para as espécies de Staphylococcos. O ativo Symdeo, 2-metyl 5-hexylciclohexanol, não teve tanto sucesso na inibição da E. coli, por ser um ativo que tem atividade específica sobre as bactérias Gram-positivas (SYMRISE, 2012). Entretanto, teve boa atuação frente a C. xerosis. Estudos fornecidos pelo patenteador deste ativo desodorante, a empresa Symrise, mostraram que o 2-metyl 5- hexylciclohexanol inibiu o crescimento planctônico de C. xerosis durante as primeiras 24h em ensaio in vitro, dessa forma, impedindo a formação de biofilme por estas bactérias. Estudos anteriores demonstraram que o Symdeo reduz em 92% a formação de biofilme por C.xerosis e 27 em 56% o crescimento planctônico da mesma espécie, quando comparado ao Triclosan, na mesma concentração (SYMRISE, 2012). Já o polyglyceryl-3 caprylate (Tego), quando comparado aos outros ativos desodorantes, teve o pior desempenho. Nas concentrações utilizadas atualmente pela empresa, os valores de CIM foram insatisfatórios para a redução da atividade bacteriana, in vitro. O Tego apresentou diferença na CIM em 24h e 48h em relação a E. coli e isto pode ser explicado pelo mecanismo de ação por demanda enzimática. Entretanto, para as bactérias Gram-positivas, a CIM se manteve a mesma nos períodos observados, já que este ativo também atua melhor sobre esta classe de bactérias (EVONIK, 2009). 5.3 Mecanismos de ação dos ativos desodorantes No caso do desodorante spray sem ativo desodorante, houve crescimento em todos os poços da microplaca, exceto na coluna onde apenas havia controle do meio (figura 5), confirmando que o veículo cosmético hidroalcoólico não afeta o crescimento microbiano. Figura 5 – Crescimento em meio TSA das bactérias inoculadas a partir da suspensão celular da microplaca contendo a fórmula de desodorante spray sem ativo desodorante, com 24 horas de incubação. Coluna 1 sem crescimento = controle do meio. FONTE: elaborado pela autora A concentração ótima do álcool etílico, com ação antisséptica se dá em 70%, mas concentrações entre 60 e 95% também podem funcionar (TORTORA, et al., 2012). O mecanismo de ação do álcool etílico normalmente é pela desnaturação de proteínas, mas ele também pode romper membranas e dissolver lipídeos (TORTORA, et al., 2012). Na fórmula spray utilizada neste trabalho a concentração inicial do álcool era de 71,5% em água = 1 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 28 715g/L, e atingiu a concentração máxima de 178,5 g/L nos teste de CIM. Dessa forma, não foi possível uma comparação da atividade bactericida ou bacteriostática desta formulação sem ativo desodorante, ela serviu apenas como controle negativo do ativo. Entretanto, é possível inferir que em estudos in vivo o álcool pode atuar melhorando o desempenho do desodorante apenas nas primeiras horas de uso, já que por esta fórmula de desodorante em spray não conter ativo antitranspirante, a sudorese e a diluição do veículo irão ocorrer normalmente após algumas horas, e o crescimento bacteriano pode voltar a ocorrer (informação pessoal fornecida pela pesquisadora Thais Bezerra Claudio de Avila). Estudos de Broxton (1984) e Gilbert (1990) demonstraram que o ativo PHMB apresenta mecanismo de ação bacteriostática para E. coli em cultura líquida, em baixas concentrações (1 mg/L a 10 mg/L), e em concentrações acima de 10 mg/L, o ativo atua como bactericida. Entretanto, neste trabalho, verificamos que o crescimento foi completamente inibido em concentrações mais baixas do que 1 mg/L (figura 6). A fórmula de desodorante spray contendo o PHMB mostrou ser bactericida a partir da concentração de 0,43 mg/L para S.aureus e E. coli; 0,03 mg/L para S. epidermidis e em concentração igual a 0,01 mg/L para C. xerosis. Porém, há a necessidade de maiores estudos com o ativo puro, para a comprovação destes resultados. Figura 6 – Inóculo de Placa de Elisa contendo PHMB com 24 horas de incubação. Coluna 12: Controle do inóculo; Coluna 11: 0,01mg/L; Coluna 10: 0,03mg/L; Coluna 9: 0,11mg/L. FONTE: elaborado pela autora 9 10 11 12 29 O ativo Symdeo, 2-metyl 5-hexylciclohexanol, não foi tão eficiente na inibição da E. coli (figura 7) por ser um ativo que tem atividade específica sobre as bactérias Gram-positivas (SYMRISE, 2012). Atuou como bactericida sobre as bactérias S. aureus, S. epidermidis e C. xerosis, a partir da concentração de 0,11 mg/L, 0,01 mg/L e 0,01 mg/L respectivamente. Entretanto, foi eficiente frente a C. xerosis. Estudos fornecidos pelo patenteador deste ativo desodorante, a empresa Symrise, mostraram que o 2-metyl 5-hexylciclohexanol, inibiu o crescimento planctônico de C. xerosis durante as primeiras 24h em ensaio in vitro, dessa forma, impedindo a formação de biofilme por estas bactérias. Figura 7 - Inóculo de Placa de Elisa contendo Symdeo com 24 horas de incubação. Coluna 12: Controle do Inóculo. Linhas E e F: E. Coli. FONTE: elaborado pela autora 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 H G F E D C B A 30 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS Os testes in vitro comprovaram que o veículo cosmético hidroalcoólico, uma mistura de 715g/L de álcool etílico neutro orgânico 96% e 285g/L de água desmineralizada, não interferiu na atividade antibacteriana dos produtos testados (ativos desodorantes). Entretanto, é provável que in vivo o álcool possa atuar melhorando o desempenho do desodorante, ao menos nas primeiras horas de uso. Verificamos que os melhores resultados foram obtidos com o Polyaminopropyl Biguanide (Cosmocil ou PHMB), quando comparado aos ativos 2-Methyl 5-Hexylciclohexanol (Symdeo) e Polyglyceryl-3 Caprylate (Tego), agindo tanto sobre as bactérias Gram-positivas quanto para a E.coli. Os resultados demonstraram também que as concentrações dos ativos utilizadas nas formulações podem ser reduzidas, já que inibem o crescimento bacteriano em concentrações muito menores do que as aplicadas nos desodorantes em spray. Com isso, poderá haver diminuição de custos para a indústria de cosméticos, sem interferir na eficácia e qualidade do produto. A pesquisa precisa ser complementada com testes in vivo como o swab de axila e o sniff test, os quais permitirão comprovar a eficácia destes ativos em função do tempo (24 ou 48 h de proteção) durante o uso. Para estudos futuros, sugere-se também a verificação da suscetibilidade das bactérias em presença de dois ou mais ativos com mecanismos de ação diferentes. 31 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABIHPEC, Associação Brasileira de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos. Panorama do Setor. Disponível em: . Acesso em: 05 de maio de 2013. ALLEN, M. J.; MORBY, A. P.; WHITE, G. F. Cooperativity in the binding of the cationic biocide polyhexamethylene biguanide to nucleic acids. Biochemistry Biophysics Research Communications. Vol.318, p. 397–404, 2004. ALLEN, M.J.; ┼ GRAHAM F.W.; ANDREW P. M., The response of Escherichia coli to exposure to the biocide polyhexamethylene biguanide. Microbiology. Vol. 152, p.989–1000, 2006. ALVES, A.L.T.; TERCI, D.B.L; TERCI,D.; PINHEIRO,T,Ap.L; PINHEIRO, A.S. Fisiologia da Sudorese e Ação de Desodorantes e Antitranspirantes. Cosmetics and Toiletries. Vol. 18, p.42-45, 2006. ANTUNES R. M. P.; LIMA E. O.; PEREIRA M. S. V.; CAMARA C. A.; ARRUDA T. A.; CATÃO R. M. 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