RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 19/02/2022. UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Camila de Oliveira Barbeiro Análise da acetilação de histona H3 e sua contribuição para a instabilidade genômica na leucoplasia oral e leucoplasia verrucosa proliferativa Araraquara 2020 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Camila de Oliveira Barbeiro Análise da acetilação de histona H3 e sua contribuição para a instabilidade genômica na leucoplasia oral e leucoplasia verrucosa proliferativa Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara para obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas, na Área de Diagnóstico e Cirurgia Orientadora: Profa. Dra. Andreia Bufalino Coorientadora: Profa. Dra Luciana Yamamoto de Almeida Araraquara 2020 Barbeiro, Camila de Oliveira Análise da acetilação de histona H3 e sua contribuição para a instabilidade genômica na leucoplasia oral e leucoplasia verrucosa proliferativa / Camila de Oliveira Barbeiro. -- Araraquara: [s.n.], 2020 82 f.; 30 cm. Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Andreia Bufalino Coorientadora: Profa. Dra Luciana Yamamoto de Almeida 1. Leucoplasia oral 2. Histonas 3. Acetilação I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação Camila de Oliveira Barbeiro Análise da acetilação de histona H3 e sua contribuição para a instabilidade genômica na leucoplasia oral e leucoplasia verrucosa proliferativa Comissão Julgadora Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Diagnóstico e Cirurgia Andreia Bufalino Morgana Stabilli Guimarães Rose Mara Ortega Araraquara, 19 de fevereiro de 2020. DADOS CURRICULARES Camila de Oliveira Barbeiro NASCIMENTO: 01/11/1991 – Araraquara – São Paulo FILIAÇÃO: Andréa Gouvêa de Oliveira Roberto Henrique Barbeiro 2011-2016: Graduação em Odontologia pela Faculdade de Odontologia de Araraquara, FOAr – Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” - UNESP. 2013-2014: Iniciação Científica no Departamento de Odontologia Social - Faculdade de Odontologia de Araraquara, FOAr – Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” - UNESP. 2016-2016: Extensão Universitária em Laserterapia para pacientes com doenças bucais e complicações oncológicas junto ao departamento de Diagnóstico e Cirurgia da Faculdade de Odontologia de Araraquara, FOAr – Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” - UNESP. 2017-2018: Aperfeiçoamento em Estomatologia pela Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, UNESP e pela Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo (SES-SP). 2018-2020: Curso de Mestrado em Ciências Odontológicas na área de Diagnóstico e Cirurgia pela Faculdade de Odontologia de Araraquara, FOAr – Universidade Estadual Paulista ¨Julio de Mesquita Filho¨- UNESP. Dedico esta dissertação primeiramente à Deus, por ter me abençoado com essa conquista e por ter me dado forças para superar as dificuldades que surgiram durante o meu percurso. Aos meus pais, Andréa Gouvêa de Oliveira e Roberto Henrique Barbeiro por serem os responsáveis por eu ter chegado onde eu cheguei, pelos caminhos que trilhei, pela criação que me deram e por sempre terem me apoiado e me incentivado a estar onde eu estou hoje. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus que me deu a oportunidade de continuar meus estudos, agora na pós-graduação, de uma das melhores Universidades de Odontologia. Me deu forças para superar as dificuldades e foi a quem eu sempre busquei e me apoiei para conseguir concluir os meus objetivos. Sem Ele as conquistas e batalhas vencidas não teriam sido possíveis. Aos meus pais Andréa Gouvêa de Oliveira e Roberto Henrique Barbeiro por sempre me apoiarem, me darem todo amor e atenção e incentivo para eu nunca desistir. Além de todo apoio e ajuda para que eu pudesse realizar os meus sonhos. Minha mãe que sempre aguentou minhas crises e me ajudou com seu enorme amor e com os melhores conselhos; e meu pai, que além de meu professor da vida, continua sendo o melhor professor que eu poderia ter durante a minha vida acadêmica e agora na pós-graduação. Tive a honra de receber seu infinito conhecimento sobre a nossa profissão. Ambos são meu porto-seguro e á quem eu dedico as minhas vitórias e alegrias. Amo muito vocês! Quero agradecer aos meus avós queridos e amados, Jesus Carlos de Oliveira e Terezinha Vicência Gouvêa de Oliveira que também sempre me apoiaram e me deram todo amor e carinho que avós sabem dar. Agradeço à Janaina Spreafico por todo apoio e por ter me dado o melhor presente e a maior alegria durante o meu Mestrado: a Lulu, minha irmã mais linda que eu amo infinitamente. Ao Thiago Paiva Fronteira que sempre viu toda a correria da Faculdade e sempre me apoiou, me desejando muito sucesso e proferindo palavras de incentivo. Agradeço ao Augusto Cesar Fiore, meu companheiro que muitas vezes teve que me aguentar estressada e preocupada, mas sempre me apoiou fazendo eu acreditar que no fim tudo daria certo. Agradeço à minha professora e orientadora Andreia Bufalino por ter sempre compartilhado comigo todo seu conhecimento e por ter sido responsável pela execução e conclusão desta pesquisa, além de ter depositado em mim a sua confiança para fazer parte desta pesquisa. Assim como agradeço a amizade. À minha coorientadora Luciana Yamamoto de Almeida por todo conhecimento compartilhado, pelos ensinamentos, amizade, por toda ajuda e contribuição para realização desta pesquisa e por todo apoio durante o percurso até aqui. Agradeço também ao professor Jorge Esquiche León por também compartilhar todo seu conhecimento, por sempre estar disposto a ajudar e esclarecer dúvidas, assim como sempre me ofereceu a oportunidade de apresentar trabalhos em Congressos. Agradeço também por ter me dado a oportunidade de participar e acompanhar as atividades desenvolvidas em seu laboratório de histopatologia na FORP-USP. Aos meus amigos de pós-graduação, Mariel Ruivo Biancardi, Heitor Albergoni da Silveira, Maria Leticia de Almeida Lança, Larissa Natiele Miotto, Audrey Foster Lefort Rocha, Túlio Morandin Ferrisse, Darcy Fernandes, Analú Barros de Oliveira, Esteban Arroyo, Lais Grifoni pela amizade, pela parceria nos trabalhos, pela companhia do dia-a-dia e por tornarem os momentos difíceis mais leves. Agradeço imensamente às meninas do laboratório, Laura Gonzales, Natalie Fernandes, Mariana Cominotte por sempre estarem dispostas a ajudar quando eu precisei, por terem me ensinado quase tudo que aprendi dentro do laboratório de Biologia Molecular e também por acreditarem no meu potencial e sempre me incentivarem e também pela companhia do dia-a-dia no laboratório. Às minhas queridas amigas da graduação e da pós-graduação, Claudia Carolina Jordão e Camila Jabr por terem sempre me apoiado, me consolado nos momentos difíceis, compartilhado comigo suas experiências da pós-graduação e principalmente, pela amizade. À minha amiga Maria Cristina Barbieri Góes que me recebeu durante o congresso internacional que eu tive a oportunidade de participar e que sempre me apoiou nos estudos, desde a época do colegial e do cursinho. Obrigada por toda amizade e por todo incentivo. Á minha amiga Paola Palombo que mesmo “longe” esteve presente durante meu mestrado, me ajudando com a experiência que adquiriu em seu mestrado e agora no doutorado. Obrigada por me ouvir, me orientar e sempre me estimular com palavras de apoio. Agradeço á Andréa Tocci Dias por todos os anos de acompanhamento, suporte, orientação, carinho e apoio. Obrigada por toda força que sempre me deu e por todos os incentivos. À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo nº 2018/04954-2) pelo apoio financeiro essencial para realização dessa pesquisa. Agradeço também à Ana Cristina Jorge da Biblioteca que foi muito atenciosa em me ajudar e me orientar para que eu pudesse fazer a edição e formatação da minha dissertação, bem como à Marley Cristina Chiusoli Montagnoli que ajudou com a confecção da ficha catalográfica. Aos demais professores do departamento de Diagnóstico e Cirurgia, assim como os professores do Programa de Ciências Odontológicas e amigos da pós- graduação que de alguma forma contribuíram para o sucesso desta pesquisa, bem como á minha evolução durante o Mestrado. Aos funcionários da secretaria da pós-graduação, Cristiano Afonso Lamounier e José Alexandre Garcia por todo auxílio e disponibilidade durante o meu Mestrado. Agradeço a Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr, UNESP, na pessoa de sua atual diretora Elaine Maria Sgavioli Massucato por todas as oportunidades concedidas. “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor nas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes.” Marthin Luther King* * Marthin Luther King. “I have a dream”; 1963. Barbeiro CO. Análise da acetilação de histona H3 e sua contribuição para a instabilidade genômica na leucoplasia oral e leucoplasia verrucosa proliferativa [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. RESUMO As desordens potencialmente malignas orais (DPMOs) são apresentações clínicas que apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de câncer na cavidade oral, seja ela uma lesão precursora definida ou mucosa clinicamente normal. Dentre as principais DPMOs, a leucoplasia oral (LO) se apresenta como uma placa branca não raspável de risco questionável, podendo ser homogênea ou não homogênea, cuja taxa de transformação maligna varia de 0,2% até 17,5%. Além disso, a LO apresenta os mesmos fatores de riscos que são observados no desenvolvimento de carcinoma espinocelular (CEC) oral, o qual é a principal neoplasia maligna que afeta a cavidade oral. Outra DPMO importante é a leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP), a qual também se apresenta como uma placa branca não raspável, porém multifocal e possui um comportamento persistente e progressivo para malignidade, com taxa de transformação maligna de 70% até 100% dos casos. Diferente da LO, os fatores de risco como tabaco, álcool e noz de areca não parecem estar associados com o desenvolvimento da LVP. Adicionalmente, a LVP apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento, sofre rápida disseminação pelos sítios orais e muitas vezes demonstra recorrência. Os graus de displasias identificados nas DPMOs são utilizados atualmente como preditores de risco para transformação maligna, no entanto diversos estudos têm mostrado que este não é um preditor fiel. Estudos recentes sugerem ainda que o infiltrado inflamatório associado as DPMOs pode estar associado a sua etiologia e comportamento clínico. Além disso, recentemente, tem-se estudado as alterações epigenéticas envolvendo histonas e metilação de DNA em diferentes tipos de câncer, bem como em algumas DPMOs a fim de descobrir alvos para medidas terapêuticas efetivas. Dentre os diversos fatores indutores de alterações epigenéticas, a inflamação crônica tem sido apontada como um destes fatores. Assim, o presente estudo teve como objetivos específicos: (1) comparar os níveis de acetilação de histona H3, o acúmulo de danos no DNA e os níveis de metilação global de DNA entre LO e LVP; (2) avaliar se os níveis de acetilação de histona H3 em linhagens celulares displásicas e tumorais sofrem alterações pelo contato com as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs); e (3) avaliar se tais alterações são acompanhadas de alterações na proliferação celular e transição epitélio- mesenquimal (TEM). Para alcançar estes objetivos, os níveis de acetilação de histona H3, dano de DNA e metilação foram avaliados por imumofluorescência. Adicionalmente, ensaios de co-cultura celular com PBMCs e linhagens de queratinócitos orais (NOK-SI, DOK, SCC-25 e Detroit 562) foram realizados para avaliar a influência dos PBMCs na aquisição de vantagens para a progressão tumoral. Os resultados da imunofluorescência mostraram que ambas as DPMOs estavam hipoacetiladas em relação ao controle. Contudo, quando realizada uma comparação somente entre LO e LVP, observamos que o grupo LVP está mais hiperacetilado do que LO. Foram observados também que os níveis de dano de DNA e metilação estavam aumentados no grupo LO em relação a LVP. Os experimentos com cultura de células revelaram que o contato dos queratinócitos orais displásicos e normais com os PBMCs, foi capaz de favorecer a TEM. Nossos resultados revelaram dois pontos importantes: 1) ambas as DPMOs apresentam perfil epigenético distintos; 2) o contato direto de PMBCs com queratinócitos orais normais, displásicos e tumorais parece ser importante em eventos iniciais da tumorigênese como a TEM. Palavras – chave: Leucoplasia oral. Histonas. Acetilação. Barbeiro CO. Evaluation of the acetylation status of H3 histone and its contribution to genomic instability in oral leukoplakia and proliferative verrucous leukoplakia [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. ABSTRACT Oral potentially malignant disorders (OPMDs) are clinical presentations that present an increased risk of cancer development in the oral cavity, whether in a clinically definable precursor lesion or clinically normal oral mucosa. Among the main OPMDs, oral leukoplakia (OL) presents itself as a non-scratchable white plaque of questionable risk, which can be homogeneous or non-homogeneous, whose malignant transformation rate varies from 0.2% to 17.5%. In addition, OL has the same risk factors that are observed in the development of oral squamous cell carcinoma (OSCC), which is the main malignant neoplasm affecting the oral cavity. Another important OPMD is proliferative verrucous leukoplakia (PVL), which also presents itself as a white, non-scratchable, but multifocal plaque and has a persistent and progressive behavior for malignancy, with a malignant transformation rate of 70% to 100% of the cases. Unlike OL, risk factors such as tobacco, alcohol and areca nut do not appear to be associated with the development of PVL. Additionally, PVL has a poor response to all treatment modalities, suffers rapid dissemination through oral sites and often shows recurrence. The degree of epithelial dysplasia identified in OPMDs is currently used as a risk predictor for malignant transformation, however several studies have shown that it is not a reliable predictor. Recent studies also suggest that the inflammatory infiltrate associated with OPMD may be due to its etiology and clinical comportment. Furthermore, recently, epigenetic changes involving histones and DNA methylation in different types of cancer have been studied, as well as in some OPMDs in order to discover targets for effective therapeutic measures. Among the several factors inducing epigenetic changes, chronic inflammation has been identified as one of these factors. Thus, the present study had specific objectives: (1) to compare the levels of histone H3 acetylation, the accumulation of DNA damage and the levels of global DNA methylation between OL and PVL; (2) to evaluate whether the levels of histone H3 acetylation in dysplastic and tumor cell lines are altered by the contact with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); and (3) assess whether such changes are accompanied by changes in cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition (EMT). To achieve these goals, the levels of histone H3 acetylation, DNA damage and methylation were assessed by immunofluorescence. In addition, cell co-culture assays with PBMCs and oral keratinocyte lines (NOK-SI, DOK, SCC-25 and Detroit 562) were performed to assess the influence of PBMCs on the acquisition of advantages for tumor progression. The results of the immunofluorescence showed that both OPMDs were hypoacetylated compared to the control. However, when comparing only OL and PVL, we observed that the PVL group was more hyperacetylated than OL. It was also observed that the levels of DNA damage and methylation were increased in the OL group in relation to PVL. The experiments with cell culture revealed that the contact of dysplastic and normal oral keratinocytes with PBMCs was able to favor EMT. Our results revealed two main points: 1) both OPMDs have different epigenetic profiles; 2) the direct contact of PMBCs with normal, dysplastic and tumoral oral keratinocytes seems to be important in early events of tumorigenesis such as EMT. Keywords: Oral Leukoplakia. Histones. Acetylation. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 15 2 OBJETIVO ........................................................................................ 18 2.1 Objetivos Específicos .................................................................. 18 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Desordens Potencialmente Malignas da Mucosa Oral e Carcinoma Espinocelular .................................................................. 19 3.2 Epigenética e Modificação nas Histonas em Neoplasias Malignas..............................................................................................22 4 MATERIAL E MÉTODO ................................................................... 32 4.1 Aprovação do Comitê de Ética .................................................. 32 4.2 Amostras para Análise de Imunofluorescência ........................ 32 4.3 Estágio Morfológico e Classificação das Amostras ................. 32 4.4 Reação de Imunofluorescência ................................................... 33 4.5 Análise em Cultura Celular .......................................................... 34 4.5.1 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC).....................................................................34 4.5.2 Cultura celular de queratinócitos orais..................................35 4.5.3 Co-cultura de PBMCs e linhagens celulares de queratinócitos...........................................................................36 4.5.4 Avaliação dos níveis de acetilação de histona H3 por citometria de fluxo...................................................................36 4.5.5 Avaliação da proliferação celular............................................37 4.5.6 Análise do ciclo celular............................................................38 4.5.7 Análise da expressão gênica por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR).................................................................................38 4.5.7.1 Isolamento e análise da concentração de RNA total.......39 4.5.7.2 Síntese de cDNA..................................................................39 4.5.7.3 Reação de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)..40 4.5.7.4 Análise proteica por Western Blot.....................................41 4.5.7.5 Análise estatística...............................................................43 5 RESULTADO ................................................................................... 44 5.1 Características Clínico-Patológicas dos Pacientes com LO e LVP ....................................................................................... 44 5.2 Amostras de LO e LVP Apresentam Hipoacetilação de H3K9 ......................................................................................... 45 5.3 Os Níveis de γH2A.X estão reduzidos nas Lesões Leucoplásicas de LVP ................................................................. 47 5.4 Os Níveis de Metilação Global do DNA estão Reduzidos em Lesões Leucoplásicas de LVP .............................................. 49 5.5 A influência dos PBMCs nos Níveis de Acetilação de Histona H3 e na Proliferação Celular de Queratinócitos Orais .................... 51 5.6 A influência dos PBMCs Sobre Marcadores de TEM em Diferentes linhagens de queratinócitos orais ........................... 57 6 DISCUSSÃO .................................................................................... 61 7 CONCLUSÃO .................................................................................. 69 REFERÊNCIAS ............................................................................... 70 ANEXO ....................................................................................................... 80 15 1 INTRODUÇÃO As desordens potencialmente malignas orais (DPMOs) são apresentações clínicas que carregam um risco de transformação para uma neoplasia maligna, mais comumente o carcinoma espinocelular (CEC) oral. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), são consideradas DPMOs a leucoplasia, eritoplasia, eritroleucoplasia, queilite actínica, líquen plano, queratose do tabaco sem fumaça, lesões no palato associadas ao fumo invertido, candidíase crônica, além de outras como fibrose submucosa oral, disqueratose congênita, lúpus eritematoso discóide e glossite sifilítica1. Existem diferentes fatores de risco que podem levar ao aparecimento das DPMOs, bem como o uso de tabaco e consumo de álcool no caso das leucoplasias, nóz de areca nos casos de fibrose submosa, porém várias DPMOs não possuem um fator etiológico conhecido. As diferentes DPMOs podem acometer qualquer sítio da cavidade oral, porém cada lesão parece apresentar uma predileção por um sítio específico1. A leucoplasia oral (LO) apresenta uma taxa de incidência que varia de 1 a 4%, sendo clinicamente caracterizada como uma placa branca não raspável que pode ser homogênea ou não homogênea, de risco questionável, após a exclusão de outras lesões conhecidas1. Portanto, o termo LO é apenas um termo clínico e o diagnóstico final depende estritamente da realização de uma biópsia e pode ser modificado após a análise histopatológica2. Os sítios mais acometidos são o vermelhão do lábio, mucosa jugal e gengiva, sendo os homens acima de 40 anos de idade os mais afetados, embora alguns trabalhos mostrem que não há predileção pelo sexo3. Os fatores de risco associados a LO são similares aos associados com os CECs orais como tabagismo, consumo excessivo de álcool, idade avançada, nóz de betel e exposição a radiação ultravioleta nos casos que acometem o vermelhão do lábio2. A leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP), assim como a LO, apresenta-se clinicamente como uma placa branca não raspável, porém de aspecto não homogêneo, verrucoso, exofítico e de acometimento multifocal na cavidade oral, afetando principalmente a gengiva, mucosa alveolar e palato1. Contudo, diferentemente das LO convencional, esta DPMO distinta e rara, apresenta comportamento clínico mais agressivo e persistente. Segundo dados da literatura, a LVP possui altas taxas de recorrência e um índice de transformação maligna que varia 16 de 70 até 100% dos casos após acompanhamento a longo prazo4-6. Interessantemente, esse tipo de lesão é mais comumente observado em mulheres na sexta década de vida que nem sempre são fumantes e o diagnóstico é baseado em múltiplas biopsias periódicas, em locais diferentes que revelam diferentes graus de displasias ou até mesmo a presença de um CEC6. Devemos destacar que o perfil epidemiológico da LVP difere do observado nas lesões de LO convencionais e, por isso, atualmente ela é classificada pela OMS como uma entidade distinta da LO, sendo considerada a DPMO com maior risco de progressão para CEC oral1. Entretanto, o diagnóstico diferencial e precoce entre lesões de LO e LVP tem sido um desafio pois não existem características clínicas e microscópicas evidentes da doença nas fases iniciais, bem como não existem características microscópicas especificas que detectam alterações que indiquem um maior risco de transformação maligna6. No caso das lesões de LVP, o diagnóstico se dá retrospectivamente, com base na observação temporal das lesões por meio de acompanhamentos e biópsias periódicas, além da correlação clínico-patológica, porém em nenhuma dessas lesões é possível prever quais irão de fato progredir para o CEC oral7. As características histopatológicas das biopsias de lesões de LO e de LVP podem variar desde hiperplasia epitelial até CEC, embora existam inúmeras nomenclaturas histológicas que são utilizadas para descrever os diversos estágios das lesões de LVP7. Atualmente, o grau de displasia encontrado nessas DPMOs (displasia leve, moderada e severa) é utilizado como fator prognóstico, sendo que os graus de displasia estão associados ao risco de progressão para CEC, porém nem todas as lesões que apresentam displasia irão necessariamente sofrer transformação maligna8. Embora tenham sido alcançados muitos avanços nas pesquisas sobre as neoplasias malignas, a incidência do CEC oral continua aumentando e a taxa de sobrevida de 5 anos permanece para apenas 50% dos casos9. Várias alterações moleculares subjacentes, bem como mudanças genéticas e fatores de risco podem estar associadas ao desenvolvimento inicial do CEC oral assim como podem também estar envolvidas neste processo as alterações epigenéticas7. Sabe-se que o CEC oral representa mais de 95% de todas as neoplasias malignas que acometem a cavidade oral10, sendo uma doença multifatorial cujos fatores de risco mais importantes são o consumo excessivo de álcool e tabaco, além de outros como inflamações crônicas, inflamações virais, predisposição genética, entre outras. A expressão gênica 17 desregulada, bem como as mutações genéticas de oncogenes e protoncogenes participa claramente do processo de carcinogênese, porém as fases iniciais deste processo ainda não são bem elucidadas11. Na última década tem-se estudado as alterações epigenéticas que podem estar associadas ao desenvolvimento e estágios iniciais da carcinogênese11-15. Essas alterações são modificações do genoma, herdáveis durante a divisão celular, mas que não envolve mudança na sequência do DNA e são reversíveis. Normalmente ocorre em resposta a fatores extrínsecos/ambientais, afetando a regulação da expressão de genes. As alterações epigenéticas mais comuns são a metilação do DNA e as modificações nas histonas16,17. Estas proteínas são as principais auxiliadoras no empacotamento do DNA e atuam na regulação da expressão gênica. Dentre as modificações que ocorrem nas histonas, a acetilação e desacetilação são comuns e normalmente estão em equilíbrio. O descontrole desses eventos epigenéticos interferem na expressão e no silenciamento de genes, por meio da modificação conformacional da cromatina, podendo contribuir desta maneira para a transformação maligna18,19. Os fatores de risco ambientais para o desenvolvimento do CEC, como tabaco e álcool, são fatores importante que atuam como gatilho no desenvolvimento de alterações epigenéticas, propiciando eventos importantes na carcinogênese11,20. Neste contexto, a utilização de técnicas de biologia molecular em estudos com LO e LVP poderiam melhorar acentuadamente a detecção de alterações moleculares relacionadas com estas DPMOs, melhorando a eficácia na identificação dos pacientes com maior risco de transformação maligna21. Assim, o entendimento mais aprofundado da natureza molecular e do comportamento destas DPMOs é fundamental para que seja possível o desenvolvimento de potenciais ferramentas diagnósticas e prognósticas em casos de LO e LVP. Além disso, a LVP frequentemente apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento e muitas vezes sofre recorrência. Então, o melhor entendimento dos mecanismos moleculares relacionados a ela, incluindo os mecanismos relacionados as alterações epigenéticas, podem auxiliar no desenvolvimento de medidas terapêuticas mais eficientes. 69 7 CONCLUSÃO • Os níveis de acetilação de histona H3K9 foram menores nas lesões de LO; • Houve maior dano de DNA nas lesões de LO caracterizado pela fosforilação de H2A.X e redução em LVP; • Os níveis de metilação foram maiores no grupo LO; • Este estudo evidencia que ambas as DPMOs apresentam perfil epigenético distintos; • O contato direto de PBMCs com linhagens celulares de queratinócitos normais, displásicos e tumorais não parece influenciar o potencial proliferativo destas células, embora tenha existido uma modulação nos níveis proteicos de proteínas reguladoras do ciclo celular que favorecem a inibição da proliferação celular; • O contato direto de PBMCs de modo geral interferiu na modulação de TEM quando em contato com as diferentes culturas de queratinócitos orais, sendo mais evidente em NOK-SI e DOK. 70 REFERÊNCIAS* 1. 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