UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFICIÊNCIA REPRODUTIVA E COMPORTAMENTO PARENTAL DE CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS E HETEROGÊNICOS PRODUZIDOS EM AMBIENTE MODIFICADO VIRGÍNIA BARRETO MOREIRA BOTUCATU - SP Junho – 2015 Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFICIÊNCIA REPRODUTIVA E COMPORTAMENTO PARENTAL DE CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS E HETEROGÊNICOS PRODUZIDOS EM AMBIENTE MODIFICADO VIRGÍNIA BARRETO MOREIRA Zootecnista Orientadora: Profa. Dra. Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura BOTUCATU - SP Junho – 2015 Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – DIRETORIA TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP – FCA – LAGEADO – BOTUCATU (SP) Moreira, Virgínia Barreto, 1974- M838e Eficiência reprodutiva e comportamento parental de ca- mundongos isogênicos e heterogênicos produzidos em am- biente modificado / Virgínia Barreto Moreira – Botuca- tu : [s.n.], 2015 ii, 106 f. : fots. Color. ,tabs. ,grafs. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Fa- culdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu 2015 Orientador: Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura Inclui Bibliografia 1. Camundongo como animal de laboratório – Reprodução 2. Animais – Proteção. 3. Animais – Experimentação. 4. Produção animal. 5. Avaliação de comportamento. I. Moura, Ana Silvia Alves Meira Tavares. II. Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” (Câmpus de Botucatu). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Titulo. i Dedicatória Aos meus pais, Maria Helena e Cícero, pelo apoio incondicional na realização deste projeto bem como, pelo amor com que me brindam todos os dias. Dedico também aos meus queridos irmãos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho e a todos os familiares que torceram muito para que esse sonho se realizasse. A todos muito obrigada! ii Agradecimentos Em primeiro lugar agradeço a Deus, a quem eu sempre recorro nos momentos de maior dificuldade e que sempre me auxilia com seu amor a superar os obstáculos mais difíceis. A Profa. Dra. Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura, minha orientadora e a Dra. Vânia Gomes de Moura Mattaraia, pela oportunidade, confiança, ensinamentos, dedicação, empenho e incentivo para o desenvolvimento desse trabalho. A todo corpo técnico do Biotério Central do Instituto Butantan pelo apoio recebido, em especial a Cynthia Zaccanini de Albuquerque e Mariana Valotta Rodrigues pela firme vontade de fazer com que tudo desse certo e por me darem força nos momentos mais difíceis. Aos funcionários do setor de camundongos isogênicos e heterogênicos Ana Maria Braga, Alex Alves Rodrigues, Allan Calarga e Élio da Silva pela dedicação. A todos os professores que ofereceram disciplina nesse período e assim contribuíram de alguma forma para a reflexão dos temas abordados nesse projeto. Aos colegas de doutorado que me receberam com muito carinho. Aos professores que participaram da banca de Qualificação e Defesa, Dra. Simone Fernandez, Dr. Paulo Sérgio Teixeira, Dra. Valderez Bastos Valero Lap – Chik, Prof. Dra. Assist. Denise Rangel da Silva Sartori e Prof. Dr. Luiz Edivaldo Pezzato, pelas sugestões e correções, que sem dúvida enriqueceram o trabalho. Aos funcionários da seção de pós-graduação Seila Cristina Cassineli Vieira, Carlos Pazini Junior e Ellen Guilhen, sempre eficientes e prestativos, e a Bibliotecária Ana Lúcia kempinas pela eficiência e atenção. iii SUMÁRIO Página CÁPITULO I CONSIDERAÇÕES INICIAIS .................................................................... 2 Referências ................................................................................................ 23 CÁPITULO II Resumo ................................................................................................. 37 Abstract ....... ......................................................................................... 39 Introdução .............. .............................................................................. 41 Materiais e Métodos......................... ......................................................43 Resultados ............................................................................................. 47 Discussão .............................................................................................. 55 Conclusão.............................................................................................. 65 Referências ........................................................................................... 67 CÁPITULO III Resumo ................................................................................................. 74 Abstract ....... .........................................................................................76 Introdução .............. ..............................................................................78 Materiais e Métodos.............................................................................. 80 Resultados .............................................................................................85 Discussão .............................................................................................. 92 Conclusão.............................................................................................. 98 EFICIÊNCIA REPRODUTIVA DE CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS E HETEROGÊNICOS PRODUZIDOS EM AMBIENTE MODIFICADO PELO FORNECIMENTO DE MATERIAL PARA NIDIFICAÇÃO. 36 COMPORATAMENTO PARENTAL DE CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS E HETEROGÊNICOS SUBMETIDOS À MODIFICAÇÃO AMBIENTAL COM O FORNECIMENTO DE MATERIAL PARA NIDIFICAÇÃO. 73 iv Referências ........................................................................................... 100 CÁPITULO III IMPLICAÇÕES .......................................................................................... 105 1 CAPÍTULO 1 2 CONSIDERAÇÕES INICIAIS Histórico Desde que começaram a ser realizados estudos com animais de laboratório até os dias de hoje, muitos estudos foram realizados, não só com estes animais, como também com os métodos utilizados em sua criação (MAGALHÃES, 2009). Anteriormente à era contemporânea, os animais de laboratório eram utilizados como simples "instrumentos de trabalho", auxiliando na investigação do diagnóstico de diferentes doenças, sem levar em consideração sua condição sanitária e genética. Com o avanço da Ciência, essas condições tornaram-se exigências, levando à criação de uma autêntica especialidade, a "Ciência em animais de laboratório” (FERREIRA et al., 2005). Atualmente, os animais de laboratório são considerados reagentes biológicos e como tal devem se enquadrar em padrões de qualidade sanitária e genética que permitam sua utilização com confiabilidade e reprodutibilidade de resultados. A ampliação e o aprimoramento da pesquisa em animais deve-se, em parte, à profissionalização dos biotérios de produção. Para o desenvolvimento de modelos animais adequados à pesquisa cientifica, bem como para a produção de imunobiológicos foi necessário investir na produção de animais geneticamente definidos obtidos pela manipulação de seus genes, através de técnicas de engenharia genética e sistemas de acasalamento. Paralelamente investiu-se na estrutura física e tecnológica dos biotérios, visando à produção de animais de qualidade sanitária, Segundo Brooks et al. (2005) os resultados obtidos em pesquisas feitas com animais definidos quanto ao padrão genético e sanitário, são a base de importantes conhecimentos da medicina moderna, contribuindo enormemente para a saúde e bem- estar da população humana. A experimentação animal trouxe a possibilidade de humanos e animais viverem melhor e por mais tempo. Entre os benefícios da experimentação animal podemos citar a descoberta de doenças e de medidas profiláticas e tratamentos, o desenvolvimento de vacinas e produção de soros, de técnicas de transplantes de órgãos, de drogas, tranquilizantes, anestésicos e anti-depressores entre outros. Note-se que 70% dos cientistas que ganharam o premio Nobel na área de Fisiologia e Medicina usaram diretamente modelos animais em seus estudos 3 (MEDICAL ADVANCES AND ANIMAL RESEARCH, 2014). Desta forma, o amplo uso dos animais de laboratório como matéria-prima biológica quer seja na experimentação biomédica, quer seja na produção de imunobiológicos, atendendo às normativas da Organização Mundial da Saúde, demonstra a sua importância e os tornam essenciais para alicerçar o conhecimento advindo das pesquisas científicas. Apesar de todo o desenvolvimento tecnológico atual, ainda não há nada que substitua completamente os animais em experimentação. A grande dificuldade está em simular a complexidade de um organismo biológico com suas reações bioquímicas e as interações entre os diferentes órgãos que compõem o sistema biológico. No caso da produção de imunobiológicos, por exemplo, mesmo quando o animal é substituído por testes in vitro durante o processo de produção, há necessidade de que sejam efetuados os testes de eficácia e segurança em animais após a finalização do produto para uso humano, seguindo as normas preconizadas pela Organização Mundial da Saúde e as Farmacopeias Brasileira, Americana e Europeia. Uma mesma substância pode agir em vários locais do organismo, de forma que efeitos em um processo biológico podem ter consequências inesperadas em outros. Se por um lado há exigências quanto à qualidade e segurança dos produtos utilizados no público alvo, pelas agências reguladoras, por outro existe uma preocupação crescente dos pesquisadores com relação ao bem-estar dos animais submetidos aos seus cuidados durante o processo de experimentação. Neste sentido, em 1959, Willian Russel e Rex Burch deram um importante passo com a publicação “The principles of Humane Experimental Technique” onde buscaram trazer mais “humanismo” às técnicas de experimentação. O principio dos 3 Rs como ficou conhecido, por sua grafia em inglês (Replacement, Reduction e Refinement) propõe a adoção de algumas medidas para o uso de animais em experimentação. A primeira medida consiste em avaliar a possibilidade de substituição dos animais por métodos alternativos (desde que validados), ou a substituição por espécies de animais com sistema nervoso menos desenvolvido como, por exemplo, os invertebrados. Caso o uso de animais seja imperativo, a segunda medida indica a implantação de qualquer estratégia que resulte no uso de menor número de animais, desde que se obtenha a mesma quantidade de informações ou maximizando a informação obtida por animal. Isto poderia ocorrer com o uso de métodos estatísticos 4 adequados, que permitam inferir o resultado de uma amostra para uma população e evitando repetições desnecessárias através da melhoria das condições dos ensaios e da diminuição de variáveis que invalidem resultados como estresse e dieta. Por fim, o refinamento propõe a modificação de qualquer procedimento que seja efetuado (desde o nascimento do animal até a sua morte, o que inclui os biotérios de produção) diminuindo a dor e o sofrimento do animal através da escolha de métodos não invasivos, anestesia, analgésicos, métodos de eutanásia bem como o enriquecimento ambiental adequado a espécie. Hoje, trabalhamos com regras e leis que dão contornos bem definidos às condutas dedicadas à criação e experimentação animal, embora ainda existam dificuldades (financeiras e comportamentais) em muitas instituições brasileiras em adotar os Princípios dos 3 Rs. Segundo Braga (2009) a saída para alcançarmos a boa ciência é investir na disseminação do conhecimento da Ciência dos Animais de Laboratório, que é multidisciplinar e que tem muito a contribuir com o uso consciente e humanitário dos animais na pesquisa biomédica. Modelo Animal e Linhagens Em 1902, quando muito pouco se conhecia sobre os fundamentos da Genética, Archibald Garrod descobriu que a alcaptonuria (doença genética rara) era consequência de uma desordem metabólica que se herdava de forma mendeliana simples (apud BENAVIDES E GUÉNET, 2003). A partir daí, muitas outras enfermidades humanas foram reconhecidas como resultado de um defeito na constituição genética dos indivíduos afetados. Paralelamente ao desenvolvimento do conhecimento sobre as patologias humanas, foram identificadas várias patologias semelhantes em animais. Estes “modelos” ajudaram enormemente na compreensão dos mecanismos de ação de muitas das enfermidades estudadas (BENAVIDES E GUÉNET, 2003). Modelo animal pode ser definido como um produto experimental desenvolvido em determinada espécie com o propósito de estudar fenômenos que ocorrem em outra espécie (MCKINNEY, 1984; FERREIRA et al., 2005). Segundo Fagundes et al. (2004) um modelo deve ter características suficientes para ser semelhante ao objeto imitado e ter a capacidade de ser manipulado sem as limitações do objeto imitado. No caso de modelos animais de doenças humanas, eles se tornam válidos quando apresentam as 5 mesmas estruturas envolvidas no comportamento ou na patologia em estudo, ou seja, devem ser o mais semelhantes possível ao que se deseja estudar (KAPLAN, 1973; HOCHMAN et al., 2004; FAGUNDES et al., 2004; MASSIRONI, 2012). Geralmente, os modelos animais aparecem como resultado de mutações, espontâneas ou induzidas, que levam a uma alteração fenotípica em decorrência de um produto proteico não funcional ou ausente. Uma grande quantidade desses mutantes apresenta fenótipos que se assemelham fortemente àqueles observados em certas doenças humanas, podendo essas homologias se estender ao nível molecular (GODARD, 2008). Segundo Benavides e Guénet, (2003) durante todos estes anos de uso dos animais de laboratório em pesquisa foram descritas mais de 1500 mutações espontâneas ou induzidas. Estes modelos são úteis fundamentalmente porque permitem identificar a base molecular de uma enfermidade, bem como sua fisiologia, além de permitir o desenvolvimento de novas terapias. O desenvolvimento de drogas terapêuticas eficazes pode vir a ocorrer através do uso de modelos animais que desenvolvam patologias semelhantes às desenvolvidas em humanos, desde que se consiga identificar os alvos e as vias bioquímicas e fisiológicas envolvidas nos mecanismos de ação comuns à patologia estudada (MOORE, 1999). Entre as diferentes espécies animais utilizadas na experimentação biomédica, o camundongo é amplamente estudado (ANDERSEN et al., 2004; ABRAMOV et al., 2008; ARNDT et al., 2009; KOIKE et al., 2009). Dentre as características que o tornam adequado ao uso nas pesquisas científicas, podemos citar o tamanho corporal, a docilidade, a facilidade de manuseio, a prolificidade e o ciclo de vida curto, que possibilita a experimentação, o acompanhamento das pesquisas realizadas por várias gerações, em curto período de tempo e em espaço reduzido, além da similaridade biológica que o aproxima do ser humano. O sequenciamento completo do genoma de camundongos foi publicado em 2002. Depois do homem, o camundongo é o mamífero que possui o genoma mais bem estudado e conhecido (WATERSTON et al., 2002). O camundongo e o homem compartilham aproximadamente 99 % de seus genes, o que os torna portadores das mesmas doenças mendelianas e poligênicas (AUSTIN et al., 2004; MASSIRONI, 2012). Para Benavides e Guénet (2003) a observação da segregação de polimorfismos de várias classes é possível devido à grande quantidade de 6 marcadores genéticos e de mutações (obesidade, anemia, distúrbios metabólicos entre outras) já isoladas nesta espécie, aliados à possibilidade de se obterem proles viáveis e férteis. O modelo murino que apresenta distrofia muscular ligada ao cromossomo X decorrente de uma mutação espontânea no gene MDX, por exemplo, leva os animais a apresentar níveis elevados de creatina quinase e piruvato quinase no plasma. O lócus mdx se mostrou homólogo ao gene que codifica a distrofina. No homem, mutações nesse gene podem levar à Distrofia Muscular de Duchenne ou Becker. Segundo Godard (2008) esses mutantes foram de extrema importância porque permitiram a demonstração de que a falta de distrofina era a principal causa da doença humana. A introdução desses roedores em laboratório, com fins experimentais, se intensificou no começo do século XX. Neste período, a genética despontava como uma ciência que apresentava grande potencial para esclarecer muitos enigmas que rondavam o pensamento humano. A comunidade científica da época ainda refletia sobre o impacto das revelações de Charles Darwin com seu livro “A Origem das Espécies” (1859), no qual estabeleceu o vínculo entre as diferentes espécies animais num único processo evolutivo (apud RAYMUNDO, 2002). De acordo com a teoria de Darwin, fazia sentido que os dados obtidos em pesquisas com modelos animais fossem extrapolados para os seres humanos. Segundo Magalhães (2009), algumas condições importantes corroboraram para que o uso institucional do camundongo como modelo experimental ocorresse apenas no inicio do século XX: a redescoberta das leis de Mendel, em 1900, desencadeou um grande número de pesquisas em torno do fenômeno da hereditariedade; os trabalhos experimentais tomaram vulto com a instalação de muitos laboratórios; grande interesse em torno de pesquisas sobre câncer. Além do cenário altamente favorável ao fomento de pesquisas e descobertas na área genética, o surgimento de tumores espontâneos em algumas linhagens de camundongos os elevou a alvo prioritário nesse campo. O estudo formal da genética de camundongos teve seu início com o estabelecimento da primeira linhagem isogênica (DBA), no começo do século XX. Em 1915, Haldane publicou o primeiro mapa genético do camundongo (apud MASSIRONI, 2012). Do ponto de vista genético, há dois grandes grupos de camundongos utilizados em pesquisa e na produção de imunobiológicos: não endogâmicos ou heterogênicos e endogâmicos ou isogênicos. Os primeiros são derivados de acasalamentos não 7 consanguíneos, apresentando, portanto, alta heterozigose. Este grupo é o que melhor representa a variabilidade genética de uma população humana. Segundo Chia et al (2004) os camundongos heterogênicos podem ser definidos como uma população fechada (pelo menos 4 gerações) de animais de genética variável, criados para manter a máxima heterozigose (o incremento do coeficiente de endogamia deve ser menor que 1 % a cada geração). Para que o índice de endogamia permaneça abaixo de 1% deve-se utilizar sempre o acasalamento de animais sem parentesco entre si, o que pode ocorrer através da implantação de métodos controlados de acasalamentos randômicos (POILEY, 1960; RAPP, 1972; GUÉNET E BENAVIDES, 2003). Os primeiros registros do camundongo Swiss são do Instituto Pasteur, de Paris, antes de 1920. Alguns exemplares desses animais foram cedidos à Suíça (origem de seu nome) e posteriormente, deram origem a outras linhagens como o CD-1 (RICE; O’ BRIEN, 1980; BENAVIDES E GUENÉT, 2003). São utilizados em grande quantidade nos testes pré-clinicos para a indústria farmacêutica e na produção de imunobiológicos. Também são muito requisitados para pesquisas ligadas a variabilidade genética, embora seu uso esteja sendo questionado por alguns pesquisadores. Benavides e Guénet, (2003), por exemplo, sustentam que se poderia obter maior variabilidade genética utilizando-se um conjunto de linhagens isogênicas, ou gerando essa variabilidade através da produção de híbridos F1 obtidos pelo cruzamento de duas linhagens isogênicas distantes, como, por exemplo, no cruzamento das linhagens AKR x BALB/c ou C3H x DBA e posteriormente cruzando-os entre si. Segundo os autores, nestes processos de cruzamento, o polimorfismo gerado é muito alto e se aproxima das populações humanas. Para Chia et al. (2004) a substituição de camundongos heterogênicos por um conjunto de linhagens isogênicas é viável e poderia conferir mais segurança na interpretação dos resultados obtidos, uma vez que os animais heterogênicos não são definidos geneticamente. Os endogâmicos são animais resultantes de pelo menos 20 gerações consecutivas de acasalamentos entre irmãos completos, gerando um índice de homozigose de 99%. A grande vantagem de utilização das linhagens isogênicas é a uniformidade genética que acaba por eliminar esta variável na interpretação dos resultados experimentais (BENAVIDES E GUÉNET, 2003). Segundo Ko, (2009) a primeira linhagem isogênica produzida pelo acasalamento de sucessivas gerações de irmãos foi a DBA, obtida no 8 início de 1900 por Clarence Little. Ele estudava a herança da cor da pelagem em camundongos e obteve um casal com genes recessivos de cor para diluído (d), marrom (b), e não agouti (a). Após os acasalamentos consecutivos entre irmãos descendentes do casal com genes recessivos para cor, por mais de vinte gerações, e seleção dos animais mais vigorosos, Clarence obteve a linhagem DBA. Posteriormente, outros pesquisadores repetiram o processo de acasalamentos consecutivos de irmãos completos por 20 gerações com o objetivo de produzir novas linhagens isogênicas, como por exemplo, BALB/c e C57Bl/6. As linhagens isogênicas apresentam características que as diferem umas das outras e, ao mesmo tempo, uniformidade fenotípica e genética entre os indivíduos de uma mesma linhagem, o que implica em variações experimentais restritas a fatores externos sem a influência da genética do animal (KNIGHT E ABBOT, 2002; BENAVIDES et al., 2004). Assim, cada linhagem isogênica tem um leque de características particulares como o tipo de tumores espontâneos, produção de leite, habilidade para aprender, agressividade, susceptibilidade a agentes infecciosos, entre outras, que tornam a sua escolha essencial para o desenho experimental e para a obtenção de resultados confiáveis (BENAVIDES E GUÉNET, 2003). A pressão constante da comunidade cientifica, ávida por modelos animais de doenças humanas cada vez mais específicos, resultou em reagentes biológicos cada vez mais puros. Segundo Lynch (1969) uma linhagem só pode ser considerada pura se for formada por uma população de indivíduos geneticamente idênticos e homozigóticos. Nas últimas décadas, diferentes linhagens de camundongos transgênicos (quando há acréscimo de genes clonados ou de fragmentos de DNA nos cromossomos) e knockout (quando ocorre a inativação de genes conhecidos) foram colocadas à disposição da pesquisa e experimentação animal. Estima-se que estejam disponíveis no mercado mundial mais de 2.000 linhagens de camundongos geneticamente modificados (SOARES et al, 2001) e cerca de 500 diferentes linhagens de camundongos isogênicos (KO, 2009). A linhagem BALB/c é a mais popular dentre as linhagens isogênicas, devido, principalmente, ao seu uso na produção de anticorpos monoclonais (BENAVIDES E GUÉNET, 2003) e por seu temperamento hiperativo, caracterizado por alta ansiedade 9 (BOLEIJ et al., 2012) e melhor desempenho reprodutivo, quando comparada a outras linhagens isogênicas de difícil produção. Características físicas e comportamentais O camundongo é um roedor que acompanha o homem há vários milênios. Segundo dados recentes da paleontologia, a origem do gênero Mus se situa provavelmente na Ásia e existem também provas de que esses animais habitavam a China, a Grécia e a Turquia (BENAVIDES E GUÉNET, 2003). É um mamífero da família Muridae, sub-familia Murinae, da ordem Rodentia e gênero Mus. Seu nome científico é Mus musculus. Possui corpo fusiforme coberto de pelos, com uma cauda sem pelos e orelhas eretas arredondadas também desprovidas de pelos (POOLE, 1987). Os filhotes nascem com pele avermelhada (linhagens albinas), desprovida de pelos, com exceção das vibrissas (órgãos de tato altamente sensitivos). Possuem olhos e pavilhões auriculares fechados e orelhas coladas à cabeça, com peso ao nascer entre 1,0 a 1,5 g. Devido à pele fina e à falta de pelos, após a primeira mamada pode-se visualizar o leite (mancha branca) no abdômen, mais precisamente no estômago. A presença de leite no estômago e sua quantidade são frequentemente usadas para identificar os animais mais competitivos, servindo, inclusive, como característica a ser avaliada na seleção dos animais mais fortes, com maior probabilidade de desenvolvimento e sobrevivência (KO, 2009). Com o passar dos dias, a pele vai clareando, adquirindo uma tonalidade rosa bem clara. O nascimento dos pelos se torna evidente por volta de 3 a 4 dias de idade, caracterizando-se por uma penugem. Com 7 a 8 dias seu corpo já está completamente envolto na pelagem característica da linhagem. A orelha se desprega totalmente da cabeça no quarto dia de vida, com abertura do pavilhão auricular ocorrendo, aproximadamente, aos 12 dias. Os olhos se abrem a partir do décimo terceiro dia. Os dentes superiores e os inferiores rompem a gengiva com 10 e 11 dias, respectivamente. A partir do décimo segundo dia ingerem alimentos sólidos. Podem ser desmamados entre 21 e 28 dias, quando apresentam peso entre 10g e 12 g, de acordo com o tamanho da ninhada e o padrão genético (MOREIRA et al., 2005). As fêmeas são poliéstricas com ciclo estral de 4 a 5 dias de duração. Possuem ovulação espontânea, aproximadamente 8 a 11 horas após o início do estro, cio pós- 10 parto e gestação com 19 a 21 dias de duração (KO, 2009). Nas fêmeas, a abertura vaginal e o primeiro cio podem ocorrer aos 24 dias de idade (CUNLIFFE-BEAMER, 1987). A maturidade sexual ocorre por volta de 4 a 6 semanas de idade (GUIDELINES FOR BREEDING GENETICALLY ENGINEERED MICE, 2004). São animais de pequeno porte, dóceis, sociáveis e curiosos. Os cinco sentidos são bem desenvolvidos, sendo o olfato considerado por muitos autores como o mais importante para a espécie, devido à sua complexa organização social. Segundo Rivera (2009) estes animais criam padrões de deposição de urina, para com seu odor demarcar o território e para reconhecimento, tanto individual quanto do grupo. Apresentam hábitos noturnos, e comportamentos característicos da espécie muito expressivos como a confecção de ninho e o alojamento em tocas (ALCOCK, 1993; GALLEF et al., 1993; SUCKOW et al., 2001). No entanto, os acasalamentos seletivos e a manipulação genética geraram linhagens com características fenotípicas e genéticas distintas, que promoveram gradações em alguns destes comportamentos, como por exemplo, diferenças na complexidade da construção dos ninhos e tocas para as linhagens isogênicas BALB/c, C57BL/6 e DBA (DUDEK et al., 1983; TARANTINO et al., 2000; BOND et al., 2002). O comportamento de agressão também apresenta variações entre as diferentes linhagens sendo que os camundongos DBA e Swiss são considerados bons modelos para o estudo das causas e mecanismos da agressão (FERRARI et al., 1996; CRAWLEY et al., 1997; LOO et al., 2004) enquanto a linhagem ABG é considerada de temperamento dócil (MARASHI et al., 2004). As lutas consistem em morder o adversário no dorso e na base da cauda e, muitas vezes, são severas. Normalmente, ocorrem entre machos adultos agrupados em espaços pequenos, enquanto machos agrupados logo após o desmame geralmente coexistem pacificamente na mesma gaiola (KO, 2009). Entre as fêmeas, as brigas são incomuns e, quando ocorrem, normalmente é para defesa da ninhada contra intrusos (ELWOOD et al., 1990; MAESTRIPIERI e ALLEVA, 1990; e WOLFF PETERSON, 1998). O comportamento protetor, com aumento da agressividade das fêmeas contra os invasores para defesa da cria, é bem descrito na literatura. Segundo Weber e Olsson (2008) machos e fêmeas demonstram comportamento parental. No entanto, muitas vezes, membros da mesma espécie são os potenciais 11 predadores dos filhotes. Neste cenário, as fêmeas prenhas ou lactentes assumem comportamento agressivo para proteger o ninho e os filhotes contra possíveis ataques. Entretanto, existe um comportamento mais comum entre as fêmeas conhecido como Barbering ou Barbeamento que se constitui de uma perda local de pelos (geralmente na face), sem feridas e com uma margem bem definida entre as áreas sem pelo e com pelo normal, em que o camundongo dominante, que infringe aos subordinados esta ação de Barbering, não apresenta perda de pelos (BENAVIDES E GUÉNET, 2003; KO, 2009). Vários transtornos relacionados à ansiedade são considerados patologias e normalmente envolvem comportamentos de defesa (ZANGROSSI e GRAEFF, 2004). Assim, os camundongos são considerados bons modelos animais de ansiedade, porque expressam comportamentos defensivos frente a situações de perigo ou a estímulos aversivos, que contribuem para a identificação e compreensão dos circuitos neuronais envolvidos nestes processos (BLANCHARD et al.,1993). Os testes usados para aferição da ansiedade em animais podem ser os modelos de condicionamento ou etológicos. Os primeiros são questionados por utilizarem a punição como condicionamento (choque elétrico, privação de água ou alimento entre outros) com potencial para gerar, por exemplo, estados motivacionais de dor, que poderiam interferir nos resultados do experimento. Os etológicos usam as reações naturais de defesa de animais expostos a estímulos naturalmente aversivos (PELLOW, 1985; GRAEFF, 2005). Segundo Graeff (2005) o modelo mais utilizado tanto para testes farmacológicos quanto comportamentais é o labirinto em cruz elevado que tem seu fundamento na aversão natural de camundongos e ratos a espaços abertos. A aferição da ansiedade neste modelo inclui a avaliação motora através do número de entradas e saídas nos braços fechados e abertos, e medições espaço temporais de esquiva nos braços abertos (PELLOW, 1985; LISTER, 1987). Algumas linhagens de camundongos expressam naturalmente maior grau de ansiedade e medo que outras (BOLEIJ et al., 2012) corroborando a extrema importância de conhecer e utilizar a linhagem de camundongos mais adequada como modelo, uma vez que os resultados experimentais podem ser influenciados negativamente por comportamentos discrepantes entre os camundongos de diferentes linhagens. 12 Comportamento Parental O cuidado parental pode ser definido como o conjunto de ações dos progenitores em relação aos descendentes, desde o nascimento até que eles desenvolvam características e habilidades que assegurem a sua sobrevivência (ALCOCK, 1993; EBISUI et al., 2009). Diferentemente de outros grupos, entre os mamíferos, a mãe é o principal cuidador, embora em algumas espécies o macho participe ativamente dos cuidados com a prole (LOSTEIN e VRIES, 2000; VIEIRA, 2003). Dentre os modelos animais usados em estudos de cuidado materno, os roedores são os mais utilizados. Os ratos foram os primeiros roedores a serem usados em estudos sobre o comportamento materno. Muitas pesquisas têm sido conduzidas na tentativa de relacionar os efeitos do comportamento materno sobre a prole. Em roedores, o comportamento materno se inicia alguns dias antes do parto com a construção de ninhos mais elaborados (BRIDGES, 1997; BROWN, 1998). O comportamento materno é desencadeado por diversos mecanismos hormonais, dentre eles a elevação de ocitocina que ocorre durante o parto; elevação de prolactina e estradiol e queda de progesterona (BRIDGES, 1997; BROWN, 1998; NUMAN et al., 1999). Quaisquer fatores que alterem a dinâmica desses processos podem provocar alterações de comportamento. No camundongo, o parto ocorre nas primeiras horas de luz, após um período de gestação de 19 a 21 dias, exceto para as fêmeas que estejam amamentando (nesta espécie isto é possível por apresentarem cio pós-parto) quando o período gestacional pode se prolongar por até 5 dias (KO, 2009). No momento do parto ocorre o primeiro vinculo mãe – filhote. Após o nascimento dos filhotes a mãe os limpa ingerindo a placenta, lambe-os e coloca-os no ninho, deita-se sobre as crias com o cuidado de deixar suas mamas acessíveis aos filhotes (postura de amamentação). Os recém-nascidos de camundongos têm capacidades sensoriais limitadas, são incapazes de ver, ouvir e se locomover de modo coordenado. Não conseguem regular a temperatura e se alimentar sozinhos (KÖNIG e MARKL, 1987; VIEIRA, 2003). Por ser uma espécie altricial, os filhotes são totalmente dependentes de intensos cuidados maternos nos primeiros dias de vida. Nesta fase, a qualidade do ninho e dos materiais empregados na sua confecção pode influir diretamente na sobrevivência da ninhada. 13 Na natureza, os camundongos utilizam pelos e plantas como material para confecção de ninhos (ALCOCK, 1993). Nos biotérios de produção, as fêmeas utilizam o material disponível na gaiola para a confecção do ninho. Este é um comportamento que contribui para manter constante a temperatura corporal das crias (BARNETT, 1975), além de intensificar o contato mãe-filhote, facilitando o emprego dos cuidados maternos através do agrupamento dos filhotes no ninho (FLEMING et al., 1999). O ato de lamber os filhotes, por exemplo, além de mantê-los limpos (BROWN, 1998), tem a função de estimular a defecação e a micção nos primeiros dias de vida, fase em que eles ainda não possuem este reflexo (BROUETTE-LAHLOU et al., 1998; EBISUI et al., 2009). Cabe destacar que, embora o filhote de camundongo seja extremamente frágil e dependente nos primeiros dias de vida, ele tem papel ativo na sua própria sobrevivência, uma vez que tem potencial para extrair o maior grau de investimento materno possível. Seu comportamento é um dos fatores responsáveis por modular a intensidade do comportamento materno (FLANNELLY e KEMBLE, 1987; ROSENBLATT et al., 1994). Segundo Rosenblatt et al. (1994) os filhotes, de uma forma geral, emitem pistas olfativas que são fundamentais para a manutenção da responsividade materna. Logo após o parto, se estabelece uma comunicação vocal entre mãe e filhotes, crucial para a manutenção dos cuidados maternos (COHEN-SALMON et al., 1985; EHRET e BERNECKER, 1986). Embora surdos nos primeiros dias de vida, os filhotes emitem uma variedade de vocalizações ultrassônicas quando isolados da presença materna atraindo sua atenção (BRANCHI et al., 1998). Apesar da potencial desvantagem da emissão de vocalização, como o aumento do risco de predação e o custo energético em produzi-las, alguns autores consideram essa comunicação essencial para a sobrevivência da ninhada (ELWOOD et al., 1990; EHRET e BERNECKER, 1986). Os filhotes também exercem influencia sobre a produção de leite de suas mães. Segundo Ko (2009), o estímulo de sucção da prole é indispensável para a manutenção da produção de prolactina e ocitocina durante o período de aleitamento. Segundo Bonsignore et al. (2006) os comportamentos característicos de cuidado materno diretos são a postura de amamentação, lambidas e manutenção da cria agrupada e aquecida. Os comportamentos indiretos correspondem aos cuidados com o ninho e a 14 defesa da cria diante de um agente agressor. Alguns autores sugerem que os comportamentos que caracterizam o investimento materno na sobrevivência dos filhotes têm, além da influência de fatores hormonais somados aos estímulos sensoriais das ninhadas, fatores neurológicos e genéticos com mecanismos ainda pouco esclarecidos (FRANCIS e MEANEY, 1999; CHAMPAGNE et al., 2003; MCFARLAND, 2008; LONSTEIN e GAMMIE, 2002; BONSIGNORE et al., 2006). Alguns estudos apontam as regiões da amígdala, núcleo acumbens e área préóptica medial como as mais relacionadas à expressão do comportamento maternal (BRIDGES et al., 1990; CALAMANDREI, 2006). Em camundongos, a divisão dos cuidados parentais não é clara. O comportamento paterno é pouco estudado em relação ao comportamento maternal, em parte devido à amamentação, período em que as mães são as únicas responsáveis pela alimentação da prole, o que faz com que elas fiquem muito mais tempo em contato com a ninhada que os pais. Segundo Brown (1998) os machos de roedores normalmente não cuidam dos filhotes e são inclusive os autores de infanticídios. No entanto, alguns estudos indicam que os cuidados empregados pelo macho contribuem para a sobrevivência e crescimento da ninhada. Dentre os comportamentos indiretos de cuidado paterno podemos citar a defesa de território, que preserva a fonte de alimento das fêmeas e evita a aproximação de outros machos, que podem representar perigo à sobrevivência da prole (VIEIRA, 2003; WEBER E OLSSON 2008). Os cuidados diretos incluem lamber e agachar sobre os filhotes favorecendo a regulação da sua temperatura corporal (CANTONI e BROWN, 1997). Entretanto, alguns estudos sugerem diferenças na modulação dos comportamentos materno e paterno. Enquanto o cuidado materno é desencadeado por mudanças hormonais durante o período de prenhez e, principalmente após o parto, aliado aos estímulos da prole, o comportamento paternal é mais influenciado pela interação com a mãe do que com a prole. Segundo Vieira (2003) a presença da mãe é mais efetiva para a manutenção da responsividade paterna devido, possivelmente, a estímulos e experiências advindos do acasalamento e coabitação com a fêmea prenha. Segundo o autor os fatores neuroendócrinos seriam mais importantes para as fêmeas do que para os machos em relação aos cuidados com a prole. No entanto, alguns estudos demonstram que hormônios como a ocitocina (GUBERNICK et al., 1995) e prolactina 15 (SCHRADIN e ANZENBERGER, 1999), com papel importante no desencadeamento e na manutenção do comportamento materno, também estão presentes na modulação do comportamento paterno (apud VIEIRA, 2003). Bem-estar animal O homem tem observado o comportamento dos animais desde os tempos primitivos. A grande quantidade de pinturas rupestres que retratam animais torna evidente a estreita ligação entre as diferentes espécies, caracterizando o domínio do homem (FUMDHAM, 2006). Ao longo do tempo, com o progresso cientifico e tecnológico, essa ligação foi se intensificando e resultou na completa subjugação dos animais de produção pelo homem. Concomitantemente a esse processo, vieram à tona questionamentos éticos sobre o uso de animais, quer seja em produção, quer seja em experimentação. A publicação do livro-denúncia Animal Machine (1964) de Ruth Harrison, causou comoção e indignação ao descrever o sofrimento e a crueldade a que eram submetidos os animais criados e mantidos em confinamento, contribuindo de modo significativo para o interesse da população pelo tema bem-estar em animais. O impacto produzido na opinião pública levou o parlamento britânico a instituir, em 1965, o comitê Brambell. Ao tomar conhecimento desses fatos, a comunidade leiga passou a se manifestar, exigindo mudanças nos processos de produção e experimentação. Com a crescente pressão de certos setores da sociedade, alguns países passaram a adotar leis de proteção aos animais. O parlamento inglês instituiu, em 1979, o Conselho de Bem Estar de Animais de Produção (FARM ANIMAL WELFARE COUNCIL – FAWC), que teve suas diretrizes baseadas nas cinco liberdades: manter os animais livres de fome e sede; livres de desconforto físico e dor; livres de injúrias e doenças; livres de medo e estresse e livres para que manifestem os padrões comportamentais característicos da espécie. Atualmente, o debate sobre o bem-estar animal tem apresentado crescente relevância na comunidade internacional e no Brasil e tem influenciado, cada vez mais, o comportamento da sociedade e seus hábitos de consumo. É um tema polêmico que traz à tona a questão da senciência. A senciência tem sido um dos critérios mais utilizados para legitimar o direito do animal ao bem-estar (DUNCAN, 2006; HUNTINGFORD et 16 al., 2006; DAWKINS, 2006). De acordo com pesquisas científicas, existem evidências genéticas, evolutivas, anatômicas, fisiológicas e comportamentais que indicam que os animais, mais especificamente os vertebrados, são dotados da capacidade de sentir e apresentam consciência de sensações e sentimentos. Segundo Dawkins (2006), entre os diferentes níveis que formam a consciência, o mais rudimentar é a senciência, evidenciando a existência de gradações entre as diferentes espécies de animais, de acordo com a evolução. No Brasil, a instituição da Lei Arouca (nº 11794 de 08 de outubro de 2008), estabeleceu regras para a criação e a experimentação animal. O texto instituiu o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e regulamentou a constituição de Comissões de Ética no Uso de Animais – CEUAs; condição indispensável para o credenciamento das instituições com atividades de ensino ou pesquisa com animais de laboratório. O conceito de bem-estar é subjetivo e, num primeiro momento, esteve ligado mais à saúde física dos animais. Posteriormente, passou a ser definido de maneira mais ampla, incluindo, além do bem-estar físico, os aspectos mentais relacionados a sentimentos subjetivos. Segundo Broom (1986), bem-estar é o estado do animal em suas tentativas de se adaptar ao meio. Hughes e Duncan (1998) foram os primeiros a associar bem-estar à saúde física e psicológica, definindo-o como um estado de completa saúde física e mental em que o animal está em harmonia com o ambiente que o rodeia. Hurnik (1992) afirmou que bem-estar é o estado de harmonia caracterizado por condições físicas e fisiológicas ótimas e pela alta qualidade de vida do animal. Diante do exposto, torna-se evidente que o termo bem-estar está sujeito a constante evolução. Mas como afirmar, apoiado em dados científicos, que o animal está em condições de bem-estar físico e psicológico, completamente adaptado ao meio? A preocupação dos pesquisadores, usuários e mantenedores de animais de laboratório, de se apoiarem em observações subjetivas, os levou a buscar dados concretos que comprovassem o bem-estar dos animais sob os seus cuidados. Atualmente, alguns indicadores fisiológicos e comportamentais vêm sendo utilizados para demonstrar esse fato. É o caso de alterações fisiológicas, como aumento de batimentos cardíacos e dos níveis de hormônios supra-renais associados ao estresse 17 (cortisol), bem como comportamentos estereotipados e de aversão que caracterizam baixo grau de bem-estar (MELLEN e MACPHEE, 2001). Os testes de preferência, muito usados em peixes, também podem contribuir para uma avaliação mais criteriosa do estado de bem-estar do animal. No momento em que o animal tem a possibilidade de manifestar sua preferência, a avaliação do estado de bem- estar deixa de ser externa e passa a emergir do próprio animal, ou seja, sua escolha reflete seu estado interno que é, então, assumido como seu estado de bem-estar num determinado momento (VOLPATO, 2007). Ainda segundo este autor, alguns cuidados na interpretação destes testes devem ser levados em consideração como, por exemplo, o número de opções a que o animal terá acesso, quantificação e intensidade da preferência, ritmo biológico e condição social entre outros; como forma de se evitar conclusões equivocadas. Segundo Dawkins (1983), tão importante quanto os testes de preferência na avaliação do bem-estar é a motivação que leva a determinada escolha, bem como a sua mensuração. Quanto mais criteriosos forem esses estudos mais chances de se chegar a conclusões que se aproximem do estado real de bem-estar dos animais. A implantação de técnicas de manejo, que não ignorem essas escolhas ou preferências e motivações, podem auxiliar na busca por um estado de bem-estar permanente. Enriquecimento ambiental As pesquisas sobre enriquecimento ambiental têm como objetivo conhecer a influência do ambiente sobre o comportamento dos animais. Estão alicerçadas nos conhecimentos da zoologia, psicologia e, principalmente, da etologia. As necessidades comportamentais e suas motivações têm sido abordadas com o intuito de desenvolver sistemas de manejo alternativos, que englobem os comportamentos adequados para a espécie, preservando assim o bem-estar dos animais cativos (GONYOU, 1993). Um dos primeiros pesquisadores a perceber os efeitos do enriquecimento do ambiente sobre o comportamento de roedores foi Donald O. Hebb. Na década de 40, ele observou que ratos mantidos em ambientes maiores e com variedade de objetos, com os quais interagiam, demonstravam claramente habilidade superior de aprendizagem que ratos criados e mantidos em ambientes padronizados de laboratório (HEBB, 1947). 18 Em 1964, Marian Diamond et al, retomaram as observações de Hebb e demonstraram, anatomicamente, algumas diferenças cerebrais entre os roedores criados com ou sem enriquecimento. Segundo a autora, os animais criados em ambiente enriquecido (gaiolas com rodas, escadas, rampas e mobília), desenvolviam um córtex cerebral mais espesso do que aqueles criados em ambiente pobre em objetos. Esse aumento da espessura do córtex se traduzia no aumento expressivo do número e ramificações de seus dendritos e das interconexões com outras células, beneficiando os processos de intercomunicação nas células do córtex, o que explicaria a maior capacidade de aprendizado dos animais criados em ambiente enriquecido. Pesquisadores conhecedores das características comportamentais do camundongo desenvolveram algumas formas de enriquecer a gaiola ou ambiente. Chamove (1989) criou, em gaiolas de camundongos, repartições transparentes, horizontais e verticais, formando tocas com acesso entre elas, permitindo aos roedores que se escondessem quando se sentissem ameaçados, ou simplesmente seguros em seus ninhos, possibilitando também atividade locomotora. A presença de galerias de túneis, ou plataformas com diferentes níveis de acesso, além de proporcionar atividade locomotora, têm a finalidade de entreter os animais, possibilitando a manifestação de comportamentos mais próximos do que seria considerado natural. Outra forma de enriquecer o ambiente é utilizar objetos inanimados (mobília) dentro das gaiolas, de modo que o animal possa interagir com eles como, por exemplo, rodas de atividades, canos e brinquedos (MELLEN e MACPHEE, 2001; ZIMMERMANN et al., 2001). Segundo Shepherdson et al., (1998), se os conhecimentos obtidos recentemente nos campos da etologia, psicologia e ciência animal forem aplicados, o enriquecimento ambiental pode ser uma forma alternativa e interessante de olhar para os ambientes que oferecemos aos animais cativos. Nesse contexto, ele pode ser definido como uma ferramenta usada com o objetivo de promover o bem-estar, diminuindo a incidência de comportamentos considerados anormais à espécie. Os camundongos são animais sociáveis, com um sistema de hierarquia complexo. Ambientes que permitam o contato e o estabelecimento da hierarquia favorecem a organização social, evitando brigas e agressões. Camundongos machos, agrupados em pequenas gaiolas, é uma condição social altamente artificial, situação em que os animais 19 derrotados ou subordinados são impedidos de sair do território do dominante (MATTARAIA, 2009). Nesse cenário, os comportamentos estereotipados também são estimulados. É comum, em situações com número excessivo de animais por gaiola, observá-los, principalmente nas linhagens isogênicas, em intensa agitação, andando de um lado para outro da gaiola, escalando a tampa de maneira repetitiva, sem interrupção, por longos períodos. Por outro lado, há relatos de comportamentos anormais em camundongos mantidos sozinhos desde a desmama, mais notadamente relacionados à ansiedade e ao medo (SCHRIJVER et al., 2002). Nos biotérios, os roedores são alimentados de forma previsível, com nenhum ou pouco esforço para obter comida. Segundo Neuringer (1969), quando esses animais têm a oportunidade de trabalhar para conseguir comida, em oposição a tê-la ad libitum, muitos optam pela primeira alternativa. Estes resultados sugerem que eles podem ter a necessidade biológica de buscar comida, e privá-los desta oportunidade pode ser uma causa de frustração e estresse. Nesse sentido, usar a técnica de alimento escondido pode ser um bom tipo de enriquecimento para a espécie. O comportamento exploratório está intimamente relacionado com o recolhimento de informações do ambiente, a respeito da disponibilidade de recursos, tais como: pontos de fuga, esconderijos, além de alimento para o futuro (MENCH, 1998). Segundo Griffin (1991), as informações recolhidas do ambiente formam processos mentais, onde a memória de situações passadas se junta ao presente e até mesmo à antecipação de situações futuras; levando o animal a decidir sobre que comportamento adotar em determinado momento. A organização do comportamento exploratório mostrou-se mais diversificada e complexa, com maior exposição aos predadores nos animais criados em ambiente enriquecido, caracterizando assim, um comportamento exploratório mais exacerbado que nos animais criados sem enriquecimento (KLEIN et al., 1994; FERNÁNDEZ-TERUEL et al., 2002). Em 1993, Galef questionou o conselho regulador (CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE), que determinou o aumento da altura das gaiolas de ratos de 16,8 cm para 20 cm. Ele alegou que os ratos de laboratório daquela região eram descendentes de ratos selvagens que, em ambiente natural, vivem em galerias subterrâneas compostas por túneis de aproximadamente 7,5 cm de altura, ligadas a câmaras de ninho com cerca de 14,5 cm de altura. Dessa forma, o excesso de altura poderia ter o efeito inverso ao 20 desejado, configurando um efeito negativo sobre o bem-estar desses animais. De fato, o simples aumento do tamanho da gaiola não implica necessariamente em bem-estar do animal, uma vez que no espaço vazio (ambiente pobre) o animal fica completamente exposto. A exposição pode tornar o animal propenso a desenvolver comportamentos de medo e ansiedade. Nesse sentido, o enriquecimento do ambiente pode ser útil e tornar o aumento do tamanho da gaiola benéfico ao bem-estar, na medida em que o animal possa ter a oportunidade de se esconder quando se sentir ameaçado por qualquer motivo. Nesse contexto, o “abrigo” dentro da gaiola torna-se um item de grande importância para roedores. Embora muitas pesquisas demonstrem o sucesso do enriquecimento ambiental, deve-se ter cuidado com as implicações dos tipos de instalações sobre a qualidade de vida dos animais, pois muitas vezes um ambiente construído sob um “olhar humano” pode não ser o mais adequado ao bem-estar da espécie (MELLEN e MACPHEE, 2001). Para que a escolha do tipo de enriquecimento seja a mais adequada possível à espécie e, efetivamente, cumpra com o seu objetivo de promover o bem-estar animal, algumas características e comportamentos específicos devem ser analisados. O cuidado corporal é um comportamento característico do camundongo e um forte indicador de saúde física e psicológica desses animais. Dentre os comportamentos do camundongo, talvez o que mais o caracterize seja o ato de confeccionar ninho. Essa ação de fazer ninho completa um dos mais básicos comportamentos desta espécie, pois não só o ajuda a proteger seus filhotes, mas também na termorregulação, ou quando desejam escapar da luz forte, para se esconder de predadores, companheiros ou outros estímulos (RIVERA, 2009). Nesse contexto, pode- se afirmar que fornecer material para confecção do ninho é um dos melhores métodos de enriquecimento ambiental para a espécie. A escolha do material oferecido ao animal deve obedecer alguns requisitos: permitir autoclavação, evitando o risco de contaminações; ser econômico, uma vez que será utilizado em larga escala nos biotérios de produção; ser isento de riscos à saúde dos neonatos. Materiais duros e ásperos, ou que absorvam demais a umidade, devem ser evitados, pois a pele desses animais é muito fina e suscetível a ferimentos. É imprescindível que o material seja fornecido inteiro, de modo que o animal possa moldá-lo, roendo-o ou rasgando-o para fazer o ninho. Esta atividade proporcionará 21 entretenimento por um longo período de tempo, evitando a monotonia característica dos ambientes empobrecidos. A escolha do material adequado pode proporcionar, também, a melhora dos índices produtivos, pois permite à fêmea a construção de um ninho mais rico e mais protegido, estimulando o cuidado parental e assim aumentando as chances de sobrevivência dos filhotes nos primeiros dias de vida. Contudo, alterações ambientais, mesmo que cuidadosas, implicam em mudanças comportamentais dos animais. Segundo Nithianantharajah e Hannan (2006) o enriquecimento ambiental tem promovido efeitos celulares, moleculares e comportamentais em ratos e camundongos. Alguns estudos sugerem que, além da alteração do peso do cérebro como já descrito, os efeitos podem incorrer principalmente sobre a plasticidade neuronal em vários níveis do cérebro (FERNANDEZ et al., 2003; DHANUSHKODI, 2008; MADROÑAL et al., 2010). Estudos demonstram que as diferentes linhagens de camundongos apresentam reações comportamentais distintas frente à modificação ambiental, particularmente nas que envolvem agressividade (MARASHI et al., 2003) medo ou ansiedade (VAN DE WEERD et al., 1994). Os biotérios de produção são ambientes controlados, com espaço limitado, onde se mantêm os animais em gaiolas, restringindo assim as possibilidades de enriquecer o ambiente. Nestas condições, o sucesso do enriquecimento ambiental para roedores em confinamento está estreitamente ligado ao sistema de acasalamento, à questão de segurança sanitária, à funcionalidade e à viabilidade econômica. Espera-se que o ambiente enriquecido contribua para melhorar os índices reprodutivos e minimizem a condição de estresse em confinamento, promovendo o bem-estar animal. A adoção do enriquecimento ambiental adequado pode ser considerada como um refinamento na prática de criação de animais de laboratório e é uma importante etapa da implantação dos princípios dos 3 R s em Biotérios. Além disso, o enriquecimento do ambiente, com o fornecimento de material para nidificação, pode diminuir o número de matrizes em produção caso efetivamente aumente a produtividade e diminua a mortalidade, conforme demonstrado por MOREIRA et al. (2015). Assim, as mudanças ambientais para fêmeas em produção devem ser conduzidas pelos bioteristas com enfoque no bem-estar animal, mas buscando, paralelamente, o aumento da produção e levando em consideração as diferenças fenotípicas, genéticas e 22 comportamentais exibidas pela variada gama de linhagens produzidas e mantidas atualmente nos biotérios de produção de camundongos. Desta forma, optamos por estudar as linhagens BALB/c e Swiss devido à alta demanda destes animais na produção de imunobiológicos e pela falta de pesquisas comparativas entre eles que atrelem o desempenho reprodutivo, bem - estar e comportamento. O capítulo 2, denominado “Eficiência reprodutiva de camundongos isogênicos e heterogênicos produzidos em ambiente modificado pelo fornecimento de material para nidificação”, apresenta-se de acordo com as normas do Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. O objetivo deste estudo foi avaliar a preferência e o impacto do fornecimento de dois tipos de materiais de nidificação sobre o desempenho produtivo de camundongos isogênicos e heterogênicos em sistema de acasalamento intensivo monogâmico. O capítulo 3, denominado “Comportamento parental de camundongos isogênicos e heterogênicos submetidos à modificação ambiental, com o fornecimento de material para nidificação”, apresenta-se de acordo com as normas da revista Applied Animal Behaviour Science. O objetivo deste estudo foi avaliar a interferência da modificação ambiental no comportamento materno e paterno de camundongos isogênicos e heterogênicos em sistema de acasalamento intensivo monogâmico, através da avaliação comportamental e teste de ansiedade. 23 Referências ABRAMOV, U. et al. Behavioural differences between C57BL/6 and 129S6/SvEv strains are reinforced by environmental enrichment. Neuroscience Letters, v. 443, n. 3, p. 223-227, 2008. ALCOCK, J. Animal behavior: an evolutionary approach. 5 th ed. Sunderland: Sinauer Associates Inc, 1993. ANDERSEN, M. L.; D’ALMEIDA, V.; KO, G. M.; KAWAKAMI, R.; MARTINS, P. J. F.; MAGALHÃES. L. E.; TUFIK, S. Princípios éticos e práticos do uso de animais de experimentação. 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Utilizou-se um sistema composto de quatro gaiolas, com livre acesso a água e ração, interligados por tubos de PVC que permitiam que os animais se locomovessem entre todas as gaiolas. Quatro tipos de materiais foram oferecidos para a construção do ninho: algodão, gaze, rolinho de papelão, e touca de polipropileno descartável. Cada um dos quatro materiais foi oferecido simultaneamente em uma das quatro gaiolas que compunham o sistema. Foram usados 10 sistemas iguais e cada um abrigou um casal da linhagem BALB/c, desde os 28 dias de idade até o terceiro ciclo reprodutivo. Os mais encontrados na confecção do ninho, em ordem decrescente, foram a touca, rolinho, algodão e gaze (P< 0,0083). Com base nestes resultados foram selecionados dois tipos de materiais para fornecimento aos animais no experimento 2. Embora o rolinho tenha sido o segundo material mais utilizado optou-se pelo algodão devido a inviabilidade de fornecimento do item durante todo o período de duração do experimento 2. O segundo experimento avaliou a eficiência reprodutiva em cinco ciclos reprodutivos do nascimento até o desmame. Usou-se 60 casais de irmãos completos da linhagem BALB/c (isogênica) e 60 casais formados por acasalamentos aleatórios da linhagem Swiss (heterogênica) de padrão sanitário controlado, criados e mantidos em ambiente padronizado. Eles foram distribuídos, num delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2x2 (duas linhagens em alojamento com ou sem material para nidificação). Como forma de enriquecimento da gaiola foram utilizados os materiais mais encontrados na composição dos ninhos durante o teste de preferência (touca descartável de polipropileno cortada em 8 pedaços de aproximadamente 1 cm cada e um pedaço de algodão de aproximadamente 3 g), previamente embalados e autoclavados. Foram avaliadas: idade ao primeiro parto, intervalo entre partos, mortalidade pré-desmama, número de nascidos e desmamados totais. Também as características relacionadas ao peso: peso da ninhada ao nascer e a 38 desmama (21 dias), peso médio da ninhada ao nascer e a desmama (21dias) e ganho de peso diário do nascimento a desmama. A linhagem influenciou todas as características estudadas (P< 0,005) com exceção do peso médio a desmama (P=0,1871). Houve efeito da interação entre a linhagem e a modificação ambiental sobre o peso médio ao nascer (P < 0,0001). O fornecimento de dois tipos de materiais para nidificação aumentou o peso médio ao nascer na linhagem BALB/c e diminuiu a mesma característica na linhagem Swiss (P < 0,0001 e P = 0,0036). A interação linhagem x ordem de parto teve efeito sobre o número de nascidos e desmamados (P<0,0001) e taxa de mortalidade (P = 0,0232). Ocorreram efeitos de interação tripla (linhagem, ordem de parição e enriquecimento) sobre os pesos ao nascer (P = 0,0234) e ao desmame (P = 0,0232) e o ganho de peso do nascimento a desmama (P = 0,0270). O peso médio a desmama foi influenciado apenas pela ordem de parição. Os resultados sugerem que esta modificação ambiental com pedaços de touca e algodão não afeta o desempenho reprodutivo dos animais e que as diferenças genéticas devem ser levadas em consideração na definição das condições de habitação destes animais. Palavras chave: Bem-estar, Habitação, Produção Animal, Teste de Preferência. 39 Abstract The objective of this study was to evaluate the preference and effect of nesting materials provision on performance of inbred mice of the BALB/c strain and of heterogenic Swiss in intensive monogamous mating system. Firstly, a study was conducted to evaluate the preference of mice for the material offered for nesting. A system composed of four cages was used, with free access to water and food, connected by PVC tubing, which allowed animal displacement among all cages. Four types of materials were available for construction of the nest: cotton, gauze, cardboard rolls, and disposable polypropylene cap. Each of the four materials was offered simultaneously in one of four cages that formed the system. Ten identical system were used and each one housed a BALB/c couple, from 28 days of age up to the third reproductive cycle. The most commonly found materials in nest making were cap, roll, cotton and gauze (P <0.0083). Based on these results, two types of materials were selected to be offered to the animals in experiment 2. Although the roll was the second most used material, we chose cotton due to unfeasibility supplying of the item throughout the duration of the second experiment. The second experiment evaluated the reproductive efficiency in five reproductive cycles from birth to weaning. Sixty BALB / c full siblings pairs (inbred) and 60 pairs formed by random mating of Swiss strain (outbred), bred and maintained in a standardized environment were used. They were distributed in a completely randomized design in a 2x2 factorial arrangement (two strains in housing with or without nesting material). As a way of cage enrichment, polypropylene disposable cap cut into 8 pieces of approximately 1 cm each and one piece of cotton about 3 g were used after being previously packaged and autoclaved . The following characteristics were evaluated: age at first parturition, litter intervals, pre-weaning mortality and number born and weaned. Traits related to weight: litter weight at birth and weaning (21 days), mean weight of litter from birth to weaning (21 days) and daily weight gain from birth to weaning. The strain influenced all variables (P <0.005) except for the average weaning weight (P = 0.1871). There was a significant interaction between the strain and environmental change on the average birth weight (P <0.0001). The provision of two types of material for nesting increased the average birth weight in BALB / c strain and decreased the same trait in the Swiss strain (P <0.0001 and P = 0.0036). The interaction strain x birth order had an effect on the number of born and weaned (P <0.0001) and on 40 mortality rate (P = 0.0232). There was triple interaction effects (strain, parity order and enrichment) on weight at birth (P = 0.0234) and weaning (P = 0.0232) and weight gain from birth to weaning (P = 0.0270). The average weaning weight was influenced only by parity order. The results suggest that environmental modification does not affect the reproductive performance of animals and that genetic differences must be taken into account in determining the housing conditions of these animals. Key words: Animal Production, Housing, Preferably Test, Welfare. 41 1. Introdução O desenvolvimento de vacinas para doenças infectocontagiosas requer modelos geneticamente adequados. Atendendo às exigências da Farmacopéia Americana e Brasileira e da Organização Mundial da Saúde (OMS), os camundongos são utilizados em grande quantidade nos testes pré-clínicos realizados pela indústria farmacêutica e na produção de imunobiológicos. Atualmente, a linhagem isogênica BALB/c e a linhagem heterogênica Swiss são muito utilizadas tanto na pesquisa biomédica quanto na produção de imunobiológicos. O enriquecimento do ambiente tem sido utilizado pelos bioteristas como uma ferramenta para minimizar os danos físicos e psicológicos causados aos animais cativos, aumentando o seu grau de bem-estar através do desenvolvimento de sistemas de manejo alternativos, que promovam os comportamentos adequados à espécie (GONYOU, 1993; BAUMANS, 2000). Entre os vários tipos de enriquecimento utilizados para camundongos, o fornecimento de material para nidificação estimula um dos mais básicos comportamentos desta espécie (ESKOLA e KALISTE - KORHONEN, 1998; LOO, 2004). Segundo Rivera (2009), a construção do ninho permite a proteção e termorregulação dos filhotes, além de funcionar como abrigo para proteção contra predadores, companheiros e outros estímulos como luz forte, por exemplo. Estudos sobre o cuidado materno têm mostrado a importância do ambiente adequado para o desenvolvimento saudável, pois diversos fatores ambientais, psicológicos, biológicos e neurais interagem para promover e manter o cuidado maternal (FRANCIS e MEANEY, 1999; CHAMPAGNE et al. 2003). No entanto, ainda permanece em discussão o impacto da modificação ambiental, com o fornecimento de material para nidificação, sobre a produtividade e o comportamento e de como este impacto pode influenciar as pesquisas realizadas com estes animais. O tipo de material mais adequado para a confecção do ninho, que promova o bem–estar dos animais e, simultaneamente, melhore os índices de produção, bem como a avaliação criteriosa sobre o comportamento de diferentes linhagens de camundongos e sua interação com o material fornecido necessitam ser evidenciados. O objetivo deste estudo foi avaliar a preferência e efeito do fornecimento de materiais de nidificação sobre o desempenho reprodutivo de camundongos isogênicos 42 da linhagem BALB/c e da linhagem heterogênica Swiss em sistema de acasalamento intensivo monogâmico. 43 Material e Métodos 2.1. Condições gerais de ambiente e manejo O experimento foi realizado na Área de Produção de Camundongos Isogênicos e Heterogênicos do Biotério Central do Instituto Butantan – SP – Brasil. As salas dos animais apresentavam fluxo de pessoas e insumos definidos e eram protegidas com barreiras sanitárias (autoclave de barreira, sistema de filtração de ar e diferencial de pressão). A temperatura ambiente era controlada em 22 + 2ºC, existia sistema de exaustão na altura das gaiolas que impedia a dispersão da amônia no ambiente, ocorriam 15 a 20 trocas de ar/h e o ciclo de luz era definido (12L:12E). Todo o sistema era ligado a um gerador, que garantia sua manutenção em caso de falta de energia elétrica. Os modelos biológicos utilizados foram o camundongo isogênico BALB/c e o de linhagem heterogênica Swiss, ambos oriundos do Biotério Central do Instituto Butantan. Os animais tinham padrão sanitário controlado e foram mantidos em gaiolas de policarbonato com dimensões de 30x20x13cm (Beira-mar®, São Paulo), que permitiam livre acesso à água potável e à ração balanceada. As gaiolas foram forradas com cama de maravalha autoclavada. A rotina de manejo dos animais compreendeu duas trocas semanais de gaiola e água fresca três vezes por semana. A ração comercial peletizada, própria para a espécie (Quimtia®, Curitiba), foi oferecida ad libitum, com os seguintes níveis de garantia: proteína bruta mínima de 22%, matéria fibrosa máxima de 8%, umidade máxima de 12,5%, extrato etéreo mínimo de 4%, matéria mineral máxima de 10%, cálcio máximo de 1,4% e fósforo mínimo de 0,8%. A formulação obedeceu às recomendações do National Research Council (1995). Todos os procedimentos obedeceram às recomendações do Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience (2003) e foram aprovados pela Comissão de Ética e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, sob protocolo nº 103/2012. 44 2.2. Experimento 1: Teste de Preferência Protocolo experimental Foi realizado um estudo para avaliar a preferência dos camundongos pelo material oferecido para nidificação. Para isto, desenvolveu-se um aparato composto de quatro gaiolas, com livre acesso a água e ração, interligados por tubos de PVC que permitiam que os animais se locomovessem entre todas as gaiolas. Figura 1. Foto do aparato utilizado no teste de preferência. Quatro tipos de materiais foram oferecidos para a construção do ninho: algodão (Cremer®, São Paulo), gaze (Clean®, São Paulo), rolinho de papelão (Cia Paduana de papeis®, Rio de Janeiro) e touca (Embramac®, São Paulo) de polipropileno descartável. Todos os materiais foram previamente embalados e autoclavados, certificando-se sua esterilidade com o uso de bioindicadores. Cada um dos quatro materiais foi oferecido simultaneamente em uma das quatro gaiolas que compunham o sistema. Foram usados 10 aparatos iguais e cada sistema abrigou um casal da linhagem BALB/c, desde os 28 dias de idade até o terceiro ciclo reprodutivo. Os materiais foram oferecidos a cada troca de gaiola, uma vez por semana, no período da tarde. A partir do acasalamento inicial, após 24hs os ninhos eram verificados por dois observadores. Os materiais mais utilizados para nidificação indicaram a preferência pelo tipo de enriquecimento. Para a análise dos resultados do teste de preferência foi usado o teste de Qui-quadrado e a correção de Bonferroni para múltiplos testes. Com base nos resultados foram selecionados dois tipos de materiais para fornecimento aos animais no experimento 2. 45 2.2. Experimento 2: Desempenho Reprodutivo Protocolo experimental Os materiais de preferência dos animais no primeiro experimento (toucas descartáveis de polipropileno cortadas em pedaços de aproximadamente 1 cm e algodão em pedaços de aproximadamente 3 g) foram esterilizados e usados como materiais de nidificação neste experimento. Os animais receberam como material para nidificação oito pedaços de touca e um pedaço de algodão, introduzidos na gaiola a cada troca de gaiola, ou seja, duas vezes por semana. Foram utilizados 60 casais de irmãos completos da linhagem BALB/c (isogênica) e 60 casais formados por acasalamentos aleatórios da linhagem Swiss (heterogênica). Estes animais foram distribuídos, num delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2x2 (duas linhagens e alojamento com ou sem material para nidificação): Esta formação foi mantida, desde o acasalamento aos 28 dias até o encerramento do experimento. O experimento foi encerrado quando 80% das fêmeas completaram o quinto ciclo reprodutivo (desmame da ninhada), que correspondeu a 254 dias para a linhagem BALB/c e 232 dias para a linhagem Swiss. Os animais utilizados para formação dos casais eram todos da mesma idade, mas provenientes de diferentes ninhadas. Os animais utilizados para formação dos grupos com nidificação foram provenientes de parentais que também receberam touca e algodão como forma de enriquecimento. Ou seja, pertenciam a ninhadas que permaneceram desde o nascimento até o desmame em ambiente enriquecido, diferentemente dos animais formadores do grupo sem nidificação, que permaneceram durante o mesmo período em gaiolas que continham apenas cama de maravalha. Para manter a isogenicidade da linhagem BALB/c, os acasalamentos foram realizados entre irmãos completos, da mesma ninhada. Todos eles (120 animais) foram desmamados no mesmo dia, com idade de 28 dias, alojados separadamente por sexo, em gaiolas identificadas por fichas e dispostas lado a lado, permitindo a identificação dos irmãos. Neste mesmo dia foram sorteados, aleatoriamente, 60 machos e 60 fêmeas (irmãos), que foram acasalados imediatamente. Os sorteios ocorreram tanto em relação à formação dos grupos (com ou sem material de nidificação), quanto em relação à posição das gaiolas nas estantes. Repetiu-se o mesmo processo para a linhagem Swiss 46 observando-se a heterogenia característica desses animais. Desta forma, os acasalamentos foram aleatórios evitando-se o acasalamento de animais aparentados. Todos os casais foram mantidos em sistema monogâmico intensivo, até completarem cinco ciclos reprodutivos consecutivos. Não houve descarte de animais ao nascer para limitar as ninhadas, todos os filhotes nascidos vivos permaneceram nas gaiolas. Durante esse período foram avaliadas as seguintes características reprodutivas e de sobrevivência: idade ao primeiro parto, intervalo de partos, taxa de mortalidade, taxa de mortalidade transformada (arco seno da raiz quadrada). Foram ainda consideradas as seguintes características relacionadas ao peso: peso da ninhada ao nascer, peso da ninhada à desmama (21 dias), peso médio da ninhada ao nascer, peso médio da ninhada à desmama (21dias) e ganho de peso diário do nascimento à desmama. Os nascimentos foram verificados e as ninhadas pesadas 2 vezes ao dia (uma vez no período da manhã e outra no período da tarde) e características relacionadas à produtividade numérica total: nascidos e desmamados totais. 2.3 Análise Estatística As características de desempenho de ninhadas nos primeiros cinco ciclos reprodutivos foram analisadas de acordo com modelos de medidas repetidas (ordens de parição) implementado no procedimento MIXED do SAS (2003). Estes modelos incluíram os efeitos fixos de linhagem, presença de material de nidificação, ordem de parição e todas as interações. Uma estrutura de covariância autorregressiva [AR(1)] foi adotada. Somente as ninhadas que tiveram pelo menos um filhote desmamado foram consideradas nestas análises. Para as características avaliadas à desmama, a idade à desmama foi incluída no modelo de análise como covariável. Contrastes apropriados foram computados quando necessário. 47 Resultados Experimento 1 Os animais interagiram com todos os materiais oferecidos para nidificação (Figura 1). Os mais utilizados para a confecção do ninho foram, em ordem decrescente de preferência, a touca, o rolinho e o algodão. O teste de qui-quadrado comparando o número de interações com os quatro materiais foi significativo (P< 0,0083). As comparações dos materiais dois a dois são apresentadas na Tabela 1. Tabela 1. Número de vezes que o material oferecido para nidificação foi utilizado na construção do ninho. Material (nº de interações) Significância1 Touca (75) x algodão (35) * Touca (75) x rolinho (49) ns Touca (75) x gaze (21) * Algodão (35) x gaze (21) ns Rolinho (49) x gaze (21) * Rolinho (49) x algodão (35) ns 1 Usado teste de qui-quadrado e a correção de Bonferroni para múltiplos testes (P< 0,0083). Experimento 2 O número de partos por fêmea por linhagem não diferiu entre os tratamentos. O experimento foi encerrado quando 80% das fêmeas alcançaram o quinto parto o que correspondeu a um período de 254 dias na linhagem BALB/c e 232 dias na linhagem Swiss, com uma variação de 7% entre os tratamentos para o período e linhagens estudados (Tabela 2). 48 Tabela 2. Número de fêmeas por parto com ou sem material de nidificação nos cinco primeiros ciclos reprodutivos para as linhagens BALB/c e Swiss. Material de nidificação Número de fêmeas Linhagem Partos Início 0 1 2 3 4 5 BALB/c Com 30 1 0 1 0 2 26 BALB/c Sem 30 3 1 0 0 1 25 Swiss Com 30 1 1 0 0 2 26 Swiss Sem 30 1 1 1 1 2 24 A idade ao primeiro parto diferiu entre as linhagens (P = 0,0101) com 94,10±3,69 dias para a linhagem BALB/c enquanto as fêmeas Swiss apresentaram idade ao primeiro parto aos 80,53±3,63 dias. Houve efeito da interação entre a linhagem e a modificação ambiental sobre o peso médio ao nascer (P < 0,0001). O fornecimento de dois tipos de material para nidificação aumentou o peso médio ao nascer na linhagem BALB/c e diminuiu a mesma característica na linhagem Swiss (P < 0,0001 e P = 0,0036) (Tabela 3). Tabela 3. Efeito da interação de linhagem e material para nidificação (P<0,0001) sobre o peso médio ao nascer. Material de Nidificação Linhagem Sim Não BALB/c 1,76 ± 0,02a 1,62 ± 0,02b Swiss 1,51 ± 0,02b 1,60 ± 0,02a Unidade: gramas ab: médias seguidas de diferentes letras na mesma linha diferem entre si a 5%.