UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL EXPRESSÃO DA METALOPROTEASE-1, DA METALOPROTEASE-9 E DO FATOR DE CRESCIMENTO OPIÓIDE, EM CÓRNEAS DE COELHOS TRATADAS COM NALBUFINA À 1%, APÓS CERATECTOMIA LAMELAR Miguel Ladino Silva Médico Veterinário 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL EXPRESSÃO DA METALOPROTEASE-1, DA METALOPROTEASE-9 E DO FATOR DE CRESCIMENTO OPIÓIDE, EM CÓRNEAS DE COELHOS TRATADAS COM NALBUFINA À 1%, APÓS CERATECTOMIA LAMELAR Miguel Ladino Silva Orientador: Prof. Dr. José Luiz Laus Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do titulo de Doutor em Cirurgia Veterinária. 2012 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Miguel Ladino Silva nasceu na cidade de Bogotá, Colômbia, no dia 24 de Março de 1982. Estudo no colégio Colégio Santo Tomas de Aquino onde se formou no ano de 1998. Durante o ano de 1999, prestou serviço militar no batalhão de armas e serviços No. 15 na cidade de Bogotá. Depois ingressou na Universidade Nacional de Colombia no ano 2000, instituição que lhe outorgou o titulo de Medico Veterinário no ano de 2006. Depois de atuar como professional autónomo, ingressou na Universidade Estadual Paulista na qual obteve o título de Mestre em Cirurgia Veterinária (2009). Neste mesmo campus desenvolveu seus estudos de doutorado prestes a sua conclusão. DEDICATORIA A meus pais, meu irmão e minha família. AGRADECIMENTOS Aos meus pais e meu irmão, minhas razões de viver, pelo apoio, pela força que sempre deram para nunca desistir, pelos conselhos, por me acalmar e pela paciência. Tudo o que eu sei e como eu sou são graças a vocês. Nunca serão suficientes as palavras para agradece-lhes e para falar quanto amo vocês. Ao Professor Laus pela oportunidade que me dera, por abrir as portas do serviço, pelos conselhos e pelas broncas, que fizeram que eu amadurasse como profissional e como pessoa. A Ge, pelo amor, pela paciência e por esse sorriso que me dá de presente todos os dias. Sem você não tivesse conseguido chegar até aqui. A minha família, minhas tias Marlen, Stella, Martha, Zoila, Alicia, meus tios Germán, Guillermo, Edgar, Miguel, Hector. Meu primo, Juan Memo, um irmão que sempre este ai quando eu preciso e que sempre me apoia. Meu primos, Carlitos, Martica, Carlos Andres, Mauricio, Rodrigo, Ricardo, Marlen, Myriam, Sofita e o restante todo da família. A senhora Maria Luiza, suas orações cuidaram de mim todos os dias. Ao pessoal da Republica “Antro do HV” aqueles que abriram as portas da sua casa me ajudaram, me apoiaram e foi minha família no Brasil. Ao pessoal de oftalmo, especialmente, ao Alexandre “Dedo”, um verdadeiro amigo, e ao Luciano, grande pessoa e grande profissional. Dunia, Giovanny e Ricardo, amigos que fizeram que a Colômbia não ficasse tão longe e que sempre estiveram quando precise do apoio deles. Pupi, Laika, Francisco, Carla, Menininha, Totto cachorrinhos que fazem que cada dia goste mais de meu trabalho e deles. Aos proprietários e seus pequenos, todo eles faz que todos os dias eu sinta orgulho e felicidade de ser médico veterinário. Aos pequenos coelhos que prestaram sua vida para o desenvolvimento desta pesquisa, sua vida vale mais que a vida de qualquer um de nós, obrigado. A todas as pessoas que fizeram do Brasil minha casa e meus amigos na Colômbia que nunca me esqueceram, muito obrigado!!!!!!!!! A FAPESP pelo auxilio à pesquisa e a CAPES pela bolsa PEC-PG. SUMÁRIO Página SUMÁRIO .....................................................................................................................I LISTA DE TABELAS....................................................................................................II LISTA DE FIGURAS....................................................................................................III RESUMO....................................................................................................................VI ABSTRACT...............................................................................................................VIII 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA.......................................................1 2. JUSTIFICATIVA.......................................................................................................5 3. OBJETIVOS.............................................................................................................6 3.1 Objetivos Gerais..........................................................................................6 3.2 Objetivos Específicos..................................................................................6 4. MATERIAL E MÉTODO...........................................................................................7 4.1 Considerações quanto à ética.....................................................................7 4.2 Pacientes.....................................................................................................7 4.3 Grupos Experimentais.................................................................................7 4.4 Solução de Nalbufina..................................................................................8 4.5 Ceratéctomia Lamelar.................................................................................8 4.6 Tempo de Reepitelização e Estesiômetria .................................................9 4.8 Histologia e Morfometria ...........................................................................10 4.9 Imunoistoquimica.......................................................................................10 4.10 Análise à estatística.................................................................................11 5. RESULTADOS.......................................................................................................13 5.1 Tempo de reepitelização...........................................................................13 5.2 Estesiometria.............................................................................................14 5.3 Histologia, Morfometria e Imunoistoquimica..............................................16 6. DISCUSSÃO..........................................................................................................27 7. CONCLUSÃO.........................................................................................................35 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................36 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Classificação da imunomarcação por índice semi-quantitativo de córneas de coelho macho adulto da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2012 ............................................................ 11 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), dos valores relativos ao tempo de reepitelização da área ulcerada em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2012 .............................................. 13 Figura 2. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto aos valores, em percentual, da área ulcerada circundada, imediatamente à ceratectomia lamelar e diariamente até a sua reepitelização, em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2012………........................... 14 Figura 3. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto aos valores basais, do limiar de sensibilidade ao toque córneal (cumprimento do estesiômetro expressado em milímetros) em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2012………………………………….…………. 15 Figura 4. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto aos valores do limiar de sensibilidade ao toque córneal (mm), em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco decorridas 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228 e 240 horas da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011.…………………………… 16 Figura 5. Fotomicrografias de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A, C e E) e nalbufina (GN) (B, D e F), decorridos 1 (A e B), 5 (C e D) e 9 (E e F) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e B, a ausência de epitélio e exposição das fibras de colágeno e edema estromal na região trepanada (setas). Em C e D, monocamada de células epiteliais (setas). Em E e F, reepitelização corneal evidenciando epitélio estratificado pavimentoso (setas). Hematoxilina & Eosina. Magnificação 100X. Jaboticabal, 2012 .......……………………...............................……. 17 Figura 6. Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e B células inflamatórias polimorfonucleares permeando o estroma na área trepanada (setas). Em C, observa-se epitélio corneal e célula mononuclear (seta), edema e separação das fibras de colágeno. Em D epitélio corneal sem infiltração inflamatória Hematoxilina & Eosina. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2012………................................ 18 Figura 7. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao percentil de células polimorfonucleares, em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2012…... 19 Figura 8. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao percentil de células mononucleares, em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2012.......................… 19 Figura 9. Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e C, imunomarcação da MMP-1 nas células basais (setas) e no estroma corneal. Em B e D, observar diminuição na imunomarcação da MMP-1 nas células basais. Polímero ligado a peroxidase. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2012 ................................................................ 21 Figura 10. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao escore de marcação da MMP-1 em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2012....... 22 Figura 11. Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e C imunomarcação da MMP-9 em células basais (setas) e no estroma corneal. Em B e D, diminuição na imunomarcação de MMP-9 nas células basais. Polímero ligado a peroxidase. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2012................................................................................................ 23 Figura 12. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao escore de marcação da MMP-9 em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2012....... 24 Figura 13. Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e C imunomarcação do OGF nas células basais e intracitoplasmática (setas). Ausência do OGF no estroma.. Em B e D, marcação de OGF em concentrações similares entre os grupos. Polímero ligado a peroxidase. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2012....................... 25 Figura 14. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao escore de marcação da OGF em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2012....... 26 EXPRESSÃO DA METALOPROTEASE-1, DA METALOPROTEASE-9 E DO FATOR DE CRESCIMENTO OPIÓIDE, EM CÓRNEAS DE COELHOS TRATADAS COM NALBUFINA À 1%, APÓS CERATECTOMIA LAMELAR RESUMO Estudaram-se os efeitos da nalbufina à 1% sobre a reparação e o limiar de sensibilidade ao toque córneal (LSC), em coelhos submetidos à ceratectomia lamelar. Compuseram-se dois grupos (n=6). O grupo nalbufina (GN) recebeu 30μL de nalbufina à 1%, a cada 4 horas, totalizando 4 aplicações diárias, às (7, 11, 15 e 19 horas), o controle (GC) recebeu solução fisiológica nas mesmas condições adotadas para o GN. Decorridas as ceratectomias, procedeu-se a avaliação clínica das córneas com lâmpada em fenda e estesiômetro durante 9 dias. As córneas foram colhidas para estudo histológico, imunoistoquímico (metaloprotease-1, metaloprotease-9 e Fator de Crescimento Opióide). O tempo médio de reepitelização das córneas foi de 7 ± 1,79 dias no GN e, no GC de 8,83 ± 1,17 días, sem diferença estatística entre os grupos (p=0,12). O diâmetro da área ulcerada não diferiu entre os grupos em nenhum dos períodos (p>0,05). 24 horas previas a realização da ceratectomia (valores basais) e, após a realização desta até a completa reparação corneal, o LSC não diferiu entre GC e GN (p>0,05). À histologia, não foram observadas alterações quanto a reparação tecidual. Ao décimo dia, todas as córneas mostraram estratificação do epitélio corneal e edema corneal em ambos os grupos. À imunoistoquimica, as MMP-1 e MMP-9 apresentaram um aumento quanto sua expressão nos 5 primeiros dias apos a realização da ceratectomia em ambos os grupos sem diferenças significativas (p>0,05). Os dias 7 e 9, elas sofrem uma diminuição significativa comparativamente com os dias mas continua sem apresentar diferença entre os grupos. O fator de crescimento opióide (OGF) apresentou imunomarcação constantes em todos os períodos e sempre restrito as células epiteliais mas não foram encontradas diferenças entre os grupos nem entre os períodos. Conclui-se que a o uso local de nalbufina à 1% não promoveu analgesia corneal nem alterações quanto a reparação corneal, expressão das MMP-1, MMP-9 e do Fator de Crescimento Opióide em coelhos submetidos à ceratectomia lamelar. Palavras chave: córnea, analgesia, reepitelização, dor, inflamação. EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE-1, -9 AND OPIOID GROWTH FACTOR IN KERATECTOMIZED RABBIT CORNEAS TREATED WITH 1% NALBUPHINE . ABSTRACT This study aimed to evaluate the effects of 1% nalbuphine on corneal analgesia in rabbits submitted to lamellar keratectomy until completion of the corneal wound healing and to assess the expression of matrix metalloproteinases (MMPs)-1,-9, and opioid growth factor (OGF) during the treatment. Two groups were formed (n=6). The nalbuphine-treated group (NG) received 30 µl of topical 1% nalbuphine every 4 hours while the other group received 0.9% NaCl instead (CG). After keratectomies, corneal heling were evaluated with slit lamp and the corneal touch threshold (CTT) with esthesiometer during 9 days. Corneal samples were processed for histology and immunohistochemistry (MMP-1, -9 and OGF). Mean corneal reepithelization rate was of 7 ± 1.79 days in NG and of 8.83 ± 1.17 days in the CG (P=0.12). The ulcerated area did not differed between groups at any time point (P>0.05). CTT did change from baseline, until complete healing of the corneas in both groups (P>0.05). At histology, corneal healing was uneventful. At day 10, all corneas showed corneal edema and stratification of the corneal epithelium in both groups. In both groups, MMP-1 and -9 expression increased during the first 5 days following keratectomy (P>0.05). At day 7 and 9 expression of both enzymes decreased significantly in comparison to previous time points, without changing significantly between groups (P>0.05). OGF positive labeling was observed in all time points and was restricted to the corneal epithelium of both groups (P>0.05). It was concluded that topical 1% nalbuphine did not change corneal healing rate, MMP-1, -9, and OGF expression after lamellar keratectomy in rabbits. Key words: cornea, analgesia, wound healing, pain, inflammation 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA A córnea íntegra constitui o tecido mais inervado do organismo, cuja densidade de fibras nervosas é de 300 a 600 vezes maior que a da pele (BENÍTEZ- DEL-CASTILLO et al., 2007). Destacam-se os axônios nociceptivos aferentes derivados dos nervos ciliares longos, uma divisão do nervo trigêmeo, os quais perdem o seu envoltório de mielina. Há inervação simpática, derivada do gânglio cervical superior (GELATT, 2007; MARFURT et al., 2001; BENTLEY & MURPHY, 2004). Das fibras nervosas corneais, 20% são sensíveis a estímulos mecânicos (mecano-nociceptores), 70% a altas temperaturas, a estímulos químicos externos e a mediadores inflamatórios endógenos (receptores polimodais), e 10% sensíveis a baixas temperaturas (BELMONTE et al., 2004). Dois tipos de estesiômetros para avaliação da sensibilidade corneal são encontrados. O estesiômetro de contato (COCHET & BONNET, 1960) e os estesiômetros de não contato (MURPHY et al., 1996; BELMONTE et al., 1999; STAPLETON et al., 2004). Alterações na sensibilidade corneal podem decorrer de neuropatias, como a paralisia do nervo trigêmeo e as disautonomias (NIESSEN et al., 2007; TERZIS et al., 2010); de cirurgias refrativas (BENÍTEZ-DEL-CASTILLO et al., 2001; STACHS et al., 2010); de processos inflamatórios virais crônicos (herpes-vírus) (GALLAR et al., 2010) e doenças sistêmicas como Diabete Mellito e a Sindrome de Sjögren (BOURCIER et al., 2005; BENÍTEZ-DEL-CASTILLO et al., 2007; COUSEN et al., 2007). Os seres humanos e os animais frequentemente desenvolvem ceratites ulcerativas de origem traumática (van der WOERDT, 2004; WILLIAMS & KIM, 2009), infecciosa (YANG et al., 2006; GALLAR et al., 2010; GOULD, 2011), auto-imune (ANDREW, 2008; JONSSON et al., 2011), por ação direta de agentes químicos (GICQUEL, 2011), neurogênica (TERZIS et al., 2010; IOANNIDIS et al., 2011;) e espontânea (MURPHY et al., 2001; LEDBETTER et al., 2006). As ceratites ulcerativas ensejam desconforto e dor, pela ativação de nociceptores localizados predominantemente na camada superficial da córnea. A dor a elas atribuída é de difícil controle (STILES et al., 2003). São reconhecidos dois tipos de conduta (direta e indireta), visando ao seu manejo. Na indireta, busca-se acelerar a reepitelização, evitando-se a exposição, por longo tempo, dos nociceptores (STILES et al., 2003). Na direita, procura-se o controle da dor pela utilização de fármacos antiinflamatórios ou de opióides (STILES et al., 2003; BELMONTE et al., 2004) Defeitos córneo-epiteliais espontâneos crônicos são afecções corneais comuns, que obrigam a manobras de desbridamento e a ceratotomias (WHITLEY & GILGER, 1999; MURPHY et al., 2001; LEDBETTER et al., 2006). Indivíduos acometidos habitualmente manifestam dor de duração variável (STILES et al. 2003; LEDBETTER et al., 2006). Em córneas sadias e nas ulceradas, a ação local de antiinflamatórios não esteroidais (AINES) pode produzir algum grau de analgesia (ARAGONA et al., 2000; SZUCS et al., 2000; ACOSTA et al., 2005; ACOSTA et al., 2007; DONNENFELD et al., 2007). Não obstante, sua administração local ou sistêmica pode retardar a reparação corneal, induzir “melting” e perfurações (LIN et al., 2000; FLACH, 2001; GUIDERA et al., 2001; BEKENDAM et al., 2007; FEIZ et al., 2009; MASUDA et al., 2010; KHALIFA & MIFFLIN, 2011). O uso tópico de anestésicos não é indicado, notadamente por suas propriedades epiteliotóxicas (ROSENWASSER et al, 1990; MOREIRA et al., 1999; PHARMAKAKIS et al, 2002). Ball et al. (2010), mostraram, todavia, que em lesões corneais agudas, uma única aplicação local de proparacaína à 0,05% pode diminuir a dor, sem induzir efeitos colaterais. Há décadas, os opióides são utilizados parenteralmente como analgésicos. Eles se ligam a receptores endógenos, produzindo efeitos anti-nociceptivos no sistema nervoso central. Dados sugerem que a aplicação local de opióides pode produzir analgesia e efeitos antiinflamatórios, uma vez que há receptores opióides em tecidos periféricos (STEIN et al., 1988; STEIN et al., 1989; WENK & HONDA, 1999; STILES et al., 2003; WENK et al., 2003). A nalbufina é um opióide agonista κ/antagonista μ, que produz analgesia de moderada a severa. Seus efeitos assemelham-se aos dos opióides agonistas, porém não invocam alterações comportamentais (HOSKIN & HANKS, 1991). Reporta-se sobre o uso da nalbufina na pré-medicação, no trans-operatório e no pós-operatório de práticas obstétricas, pediátricas e no controle da dor em queimaduras (GLANVILLE, 1990; CALENDA et al, 1999, van den BERG et al., 1999; MINAI & KHAN, 2003; CALENDA et al, 2004; VAVRINKOVÁ et al., 2005; MOYAO- GARCÍA et al., 2009; RENNER et al., 2010; TOURTIER et al., 2010; LIAO et al., 2011). Estudos têm sido desenvolvidos para o melhor entendimento da ação anti- nociceptiva sistêmica e local da nalbufina. Resultados têm demonstrado que ela é dependente da dose utilizada, do sexo do paciente e do sítio de aplicação (GEAR et al, 1996; GEAR et al, 1999; SMITH & FRENCH, 2002; AQUINO et al. 2005; LOMAS et al, 2007; KSHIRSAGAR et al., 2008). Mostrou-se que a instilação oftálmica de nalbufina aumenta o limiar de tolerância, quanto à sensibilidade corneal, em cães saudáveis (AQUINO et al. 2005). Não obstante, em um estudo realizado com cavalos demonstrou que a aplicação tópica de 0,2mL de nalbufina à 1% não alterou o limiar de sensibilidade ao toque em córneas saudáveis (WOTMAN & UTTER, 2010) A reparação cicatricial da córnea decorre de eventos que envolvem a migração celular centrípeta, a diferenciação e a proliferação de células, bem como a sua adesão (ZAGON, et al, 1998; ZAGON et al, 2000). Tratam-se de condições moduladas por mediadores presentes na matriz extracelular do estroma, pela força mecânica exercida pelos movimentos palpebrais (BENTLEY & MURPHY, 2004), pela viabilidade da membrana basal do epitélio (MURPHY et al., 2001) e pelas condições do filme lacrimal pré-corneal (BROOKS & OLLIVER, 2004). Por sua importância na manutenção e na recuperação do epitélio e do estroma corneais, as metaloproteases da matriz extracelular (MMPs) têm sido estudadas nos âmbitos da oftalmologia médica (SMITH et al., 2001; DANIELS et al., 2003; LEONARDI et al., 2003; REVIGLIO et al., 2003; SAKIMOTO et al., 2003; MULHOLLAND et al., 2005) e da veterinária (STRUBBE et al., 2000; OLLIVIER et al., 2003; OLLIVIER et al., 2004; COUTURE et al., 2006; BARROS et al., 2007). As MMPs são proteases endógenas pertencentes a uma família de enzimas dependentes de zinco e de cálcio, necessárias em processos homeostáticos. Elas estão envolvidas na remodelação tecidual e na sua reparação, bem como na destruição de tecidos (BROOKS & OLLIVER, 2004). As metaloproteases são compostas por quatro classes de enzimas: colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromalisinases (MMP-3, MMP-10 e MMP-11) e as “membrane type” (MMP-14, MMP-16, MMP-17, MMP-24 e MMP-25) (BROOKS & OLLIVER, 2004). No curso da reparação cicatricial da córnea, elas desempenham considerável atividade na lágrima (STRUBBE et al., 2000; SMITH et al., 2001; OLLIVIER et al., 2003; OLLIVIER et al., 2004; COUTURE et al., 2006; WANG et al., 2008) e no tecido corneal lesado (DANIELS et al., 2003; MULHOLLAND et al., 2005), induzindo a efeitos diversos, como sobre a vascularização (EBRAHEM et al., 2010) . Mostrou-se atividade da MMP-1 em células epiteliais e da MMP-9 na remodelação do estroma corneal, em coelhos que passaram por ceratectomia lamelar (MULHOLLAND et al., 2005). Peptídeos opióides foram primeiramente reportados por Hughes em 1975 (ZAGON et al, 2002). O Fator de Crescimento Opióide (OGF) ou [Met5] Encefalina é um peptídeo natural endógeno encontrado em diferentes tecidos do corpo, que interage com o receptor zeta ou OGFr (ZAGON et al., 1995, ZAGON et al., 2003). Nas espécies domésticas, o OGF e o seu receptor foram identificados em cães, em gatos e em cavalos, em grande concentração no epitélio corneal (ROBERTSON & ANDREW, 2003). Relativamente às suas funções, reportam-se a inibição do crescimento de células normais e tumorais, a remodelação celular, a reparação de lesões e a angiogênese (ZAGON et al., 1998; BLEBEA et al., 2000; ZAGON & MCLAUGHLIN, 2005; ZAGON et al., 2005). Na córnea, células basais e parabasais do epitélio o possuem. O OGF se encontra no interior do citoplasma, junto à membrana nuclear e no interior do núcleo. O OGFr, por sua vez, é encontrado exclusivamente no citoplasma (ZAGON et al., 2003). A instilação de naltrexona, um antagonista não específico de receptores opióides, acelerou a reepitelização corneal em coelhos (ZAGON et al., 1998), em seres humanos (ZAGON et al., 2000) e em ratos diabéticos, por inibição do Fator de Crescimento Opióide (ZAGON et al., 2002). 2. JUSTIFICATIVA Um único trabalho, quanto ao uso tópico da nalbufina e à sua ação sobre a sensibilidade corneal, foi encontrado na literatura consultada (AQUINO et al, 2005). Devido a isto, procura-se avaliar os efeitos da nalbufina sobre o limiar de sensibilidade ao toque corneal em coelhos submetidos a ceratectomia lamelar tratados com nalbufina à 1%. Não existem trabalhos, na literatura consultado, que avaliam os efeitos da instilação oftálmica de nalbufina à 1% e seus efeitos sobre a reepitelização corneal. Todavia, pretende-se avaliar os efeitos sobre a reepitelização corneal baseando-se nos possíveis efeitos antagonistas da nalbufina sobre a expressão do fator de crescimento opióide e das metaloproteases-1 e -9. 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVOS GERAIS Avaliar a expressão de metaloproteases da matriz estromal (MMPs) e do Fator de Crescimento Opióide (OGF), após ceratectomias lamelares e tratamento local com nalbufina à 1%, em coelhos machos, adultos da raça Nova Zelândia Branco. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar se a nalbufina à 1% interfere com a reparação corneal, valendo-se, para a investigação, da biomicroscopia com lâmpada em fenda, do tingimento da córnea pela fluoresceína, da histopatologia e da imunoistoquímica. Adjunto, empregando-se marcadores específicos para MMP-1, MMP-9 e para o Fator de Crescimento Opióide, paralelamente à avaliação do limiar de sensibilidade ao toque córneal à estesiômetria. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 CONSIDERAÇÕES QUANTO À ÉTICA A pesquisa foi realizada atendendo-se às normas da Association for Research in Vision and Ophthalmology – ARVO (National Institutes of Helth Publications No 85-23: Revised 1985), de consoante com o código de NÜREMBERG (GOLDIM, 1995). Outrossim, sob expressa autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de Jaboticabal (Protocolo nº 028793-08). 4.2 PACIENTE Setenta e dois coelhos (Oryctolagus cuniculus; Linnaeus 1758), da raça Nova Zelândia Branco, adultos, machos, com peso médio de 3 kg foram utilizados na consecução da pesquisa. Os animais foram submetidos a avaliação clínica e oftalmológica, realizando-se o teste da lágrima de Shirmer1, a biomicroscopia com lâmpada em fenda2, a tonometria de aplanação3, a oftalmoscopia binocular indireta4 e a prova da fluoresceína5. Selecionados os hígidos, eles foram mantidos em ambiente ventilado, individualmente, em gaiolas apropriadas, limpas e higienizadas, com dieta à base de ração comercial e de água potável “ad libitum”. 4.3 GRUPOS EXPERIMENTAIS Constituiram-se dois grupos, compostos por 36 animais. No grupo nalbufina (GN), instilou-se, posteriormente à ceratectomia lamelar, 30µL da solução de nalbufina à 1%, 4 vezes ao dia a intervalos regulares. O grupo controle (GC) recebeu 1 Teste da Lágrima de Schirmer – Ophthalmos Ltda. 2 Slit Lamp SL-14 – Kowa Company Ltda. 3 TonoPen XL, Medtronic 4 Oftalmoscópio binocular indireto FOH-5 – Eyetec S.A. 5 Fluoresceína strips – Ophthalmos Ltda. 30µL de solução fisiológica à 0,9%, nos mesmos horários e sob os mesmos critérios. Em ambos, os tratamentos tiveram início um dia antes da cirurgia (valores basais), e seis horas após a ceratectomia lamelar (M0). Para profilaxia da infecção, todos os olhos foram tratados com colírio de tobramicina à 0,3%6. (HENDRIX et al. 2002). Instilaram-se 30µL da preparação, imediatamente ao final do procedimento cirúrgico e a intervalos regulares de 4 horas, totalizando quatro aplicações diárias, 20 minutos após a instilação da nalbufina no GN e da solução fisiológica no GC, até a reparação corneal. 4.4 SOLUÇÃO DE NALBUFINA Soluções oftálmicas de nalbufina à 1%, sem conservante, foram manipuladas por fabricante credenciado7. O pH foi ajustado em 6,95, pela adição de solução tampão fosfato. As soluções foram mantidas à temperatura de 4°C e protegidas da luz. 4.5 CERATECTOMIA LAMELAR Após a indução da anestesia, por injeção intramuscular de 15mg/kg de cetamina8 associada a 0.5 mg/kg de midazolam9 (BORKOWSKI & KARAS, 1999), realizou-se tricotomia periocular e instilação de uma gota de colírio de proximetacaína10. Procedeu-se à antissepsia da córnea, do saco conjuntival e da conjuntiva com solução de polivinil-pirrolidona, na diluição 1:50. A anestesia foi mantida empregando-se máscara com isofluorano11, diluído em oxigênio 100%, em circuito aberto. Após preparo rotineiro do campo operatório, realizou-se a ceratectomia axial lamelar, em um dos olhos, empregando-se trépano de 200 µm de profundidade e 6 mm de diâmetro12 e bisturi crescente angulado em 60 graus13. Todas as 6Tobrex, Alcon®, São Paulo, SP. 7 Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos®, Campinas, SP. 8 Cetamina – S(+), Cristalia Produtos Químicos e Farmacêuticos®, Campinas, SP 9 Dormire®, Cristalia, São Carlos, SP 10 Proximetacaína – Anestalcon, Alcon, São Paulo, Brasil. 11 Isofluorano Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos®, Campinas, SP. 12Trépano para cornea 6mm, Steel Inox, São Paulo, SP . intervenções foram realizadas pelo mesmo cirurgião, sob magnificação de 20X, em microscópio cirúrgico14. 4.6 TEMPO DE REEPITELIZAÇÃO E ESTESIÔMETRIA Doze animais, 6 de cada grupo, foram avaliados diariamente à biomicroscopia com luz em fenda e em filtro azul cobalto, após instilação de fluoresceína, sempre às 20h e pelo mesmo observador, que desconhecia qual o tratamento que fora aplicado, desde a consecução das úlceras à sua reepitelização corneal (teste de fluoresceína negativa). Para o monitoramento da evolução, quanto à reepitelização, os olhos foram fotografados, em iluminação com filtro azul cobalto, sem “flash”, a uma distância fixa de 10 cm. As imagens foram avaliadas em software15, para a quantificação da área ulcerada (STERN et al., 2006; WILLIAMS et al., 2007, 2008; KIM et al., 2009). Após a seleção das imagens (ferramenta file/open), a área ulcerada foi circundada com ferramenta free hand selections, e o valor transformado em percentagem de área ulcerada. O limiar de sensibilidade ao toque córneal (LSC) foi avaliado à estesiômetria16 por um mesmo observador que igualmente desconhecia qual o tratamento que fora aplicado em 6 animai de cada grupo (STILES et al., 2003). Considerou-se a região axial, por seu maior quantitativo de terminações axonais. (KAPS et al., 2003; GOOD et al., 2003). Valores basais foram colhidos um dia antes da realização das manobras cirúrgicas. Dez minutos após cada tratamento com nalbufina à 1%, (GN) ou com solução salina à 0,9% (GC) avaliações foram feitas em quatro momentos e a intervalos regulares. Decorridas 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228 e 240 horas das ceratectomias, o limiar de sensibilidade ao toque córneal foi avaliado decorridos 10 minutos de cada tratamento (RIBEIRO et al., 2012). 13Bisturi Cresccente Angulado Ziemer Ophthalmic Systems AG - SWISS. 14MC-M902®, DF Vasconcelos, São Paulo, SP. 15Image J, disponivel em: http://rsbweb.nih.gov/ij/ 16Cochet-Bonett® - Lunaeu, França. 4.7 HISTOTOLOGIA E MORFOMETRIA Decorridos 1, 3, 5, 7, e 9 dias das ceratectomias lamelares, seis animais de cada grupo foram submetidos a eutanásia ativa, por injeção intramuscular de 20mg/kg de cetamina17 associada a 0,75 mg/kg de midazolam18, e posterior injeção intra-tecal de cloridrato de lidocaína à 2%19, sem vasoconstritor (RIBERIO et al., 2011). As córneas foram colhidas e fixadas em formaldeído tamponado à 10%. Decorridas 24 horas, elas foram lavadas em água corrente e mantidas em álcool à 70%. Posteriormente, foram submetidas a desidratação, a diafanização e a inclusão em blocos de parafina. Para a histologia, as lâminas foram coradas pela hematoxilina e eosina e avaliadas sob magnificação de 400X em microscópio de luz. Foram escolhidos dez campos para realização de perfil celular. 4.8 IMUNOISTOQUIMICA Visando à avaliação da distribuição tecidual da metaloprotease-1 (MMP-1)20, da metaloprotease-9 (MMP-9)21 e do Fator de Crescimento Opióide (OGF)22, empregou-se a técnica de polímero ligado a peroxidase. Lâminas previamente preparadas foram submetidas ao bloqueio da peroxidase endógena utilizando-se uma solução de álcool metílico23 e peróxido de hidrogênio24, à concentração final de 8% (92mL metanol – 8mL peróxido de hidrogênio), por 20 minutos. Adicionou-se bloqueador de proteína25 por mais 20 minutos. A incubação do anticorpo primário MMP 1 (1:200), MMP 9 (1:100) e fator de crescimento opioide (1:100) se fez em câmara úmida por 18 horas, a temperatura de 4°C. Ato continuo, adicionou-se anticorpo secundário26 e, para a revelação empregou-se tetra-hidrocloreto de 17 Cetamina – S(+), Cristalia Produtos Químicos e Farmacêuticos®, Campinas, SP 18 Dormire®, Cristalia, São Carlos, SP 19 Xylestesin®, Cristalia, São Carlos, SP 20 Anti-MMP 1 Rabit pAb® – Cabiochem, Darmstad, Alemanha 21 Anti-MMP 9(Ab-3) Mouse mAb (56-2A4)® – Cabiochem, Darmstad, Alemanha 22 Anti-Enkephalin, Clone NOC1® – Cabiochem, Darmstad, Alemanha 23 Alcool Metílico Comercial 100%®, Synth, Diadema, SP 24 Peroxido de Hidrogenio 50%®, Synth, Diadema, SP 25 Protein Block, sérum free 110mL®, DAKO, Carpinteria, EUA 26 ADVANCE™ / HRP, Rabbit/Mouse, DAKO, Carpinteria, EUA diaminobenzidina (DAB)27 por três minutos, em cada lâmina. Empregou-se Hematoxilina de Harris28 como contra-coloração e, posteriormente, as lâminas foram desidratadas e montadas em meio de montagem liquido29. Todos os passos foram precedidos por lavagens com solução tampão tris-HCL pH 7,430. As lâminas foram fotografadas em microscópio de luz31(400X) e as imagens processadas em software32. Para a contabilização da intensidade e do percentil de células marcadas, empregou-se índice semi-quantitativo (STERN et al., 2006) (Tabela 1). Tabela 1. Classificação da imunomarcação por índice semi-quantitativo de córneas de coelho macho adulto da raça Nova Zelândia Branco Índice Marcação 0 Ausência de marcação 1 Marcação focal 2 até 25% do campo marcado 3 de 25-50% do campo marcado 4 mais de 50% do campo marcado 5 mais de 75% do campo marcado 6 mais de 95% do campo marcado Fonte: Stern et al. (2006) 4.10 ESTATÍSTICA Os resultados foram avaliados quanto à sua normalidade, aplicando-se o teste de Kolmogorov-Smirnov. Aplicou-se o teste t-Student para avaliação da média de dois grupos, quanto ao tempo de reparação corneal. Empregou-se, ainda, Análise de Variância para Medidas Repetidas e, posteriormente, o de Teste de Bonferroni nas avaliações relativas a estesiômetria. Quanto aos parâmetros avaliados à histologia e à imunoistoquimica, foram avaliados pelo teste de Kruskal Wallis, com 27 DAB Chromogen® Rabbit/Mouse, DAKO, Carpinteria, EUA 28 Solução de Hematoxilina de Harris®, Sigma Aldrich do Brasil, São Paulo, Brasil 29Meio de Montagem Aquoso, Fluoromount® – Sigma Aldrich do Brasil, São Paulo, Brasil 30Solucao tampão pH 7,0 Synth, Diadema, SP 31Nikon Eclipse E200®, Nikon, Melville, NY, EUA 32Motic Image Plus 2.0, Hong-Kong, China posterior avaliação pelo teste de Dunn, considerando-se o nível mínimo de significância p ≤ 0,0533. 33GraphPad Prism 4.0®, GraphPad Software, Inc, La jolla, CA, USA 5. RESULTADOS 5.1 TEMPO DE REEPITELIZAÇÃO Imediatamente à consecução da ceratectomia lamelar, todos os individuos foram positivos à fluoresceína. Relativamente ao tempo de reepitelização, aos 8 dias após a ceratectomia, 83,33% (5/6) dos animais do GN apresentavam suas córneas reepitelizadas. Com relação aqueles do GC, 33,33% (2/6) apresentaram-se com a reepitelização completada. Aos 9 dias, 100% dos animais do GN foram negativos à fluoresceína. Os do grupo controle mostraram negatividade ao teste da fluoresceína decorridos 10 dias do procedimento cirúrgico. O tempo médio de reepitelização das córneas no GN foi de 7 ± 1,79 dias e, no GC de 8,83 ± 1,17 dias. Não se encontrou diferença significativa entre ambos (p=0,12) (Figura 1). Figura 1. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), dos valores relativos ao tempo de reepitelização da área ulcerada em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2011 * Teste t-Student (p < 0.05) Relativamente ao diâmetro da área submetida à trepanação (6 mm), aos 8 dias após a ceratectomia lamelar um único individuo do grupo nalbufina (olho GN GC 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 GRUPOS TE M PO (D IA S) esquerdo) ainda apresentava 0,4% da área positiva à fluoresceína. Nos pacientes do grupo controle (olho direito), quatro ainda apresentavam positividade aos seis dias do pós-operatório (3,1%, 1%, 0,5% e 3,6%, respectivamente). Não foram encontradas diferenças significativas entre os percentuais das áreas ulceradas entre os dois grupos (Figura 2). Figura 2. Mediana nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto aos valores, em percentual, da área ulcerada circundada, imediatamente à ceratectomia lamelar e diariamente até a sua reepitelização, em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2011 * Teste Dunn (p < 0.05) 5.2 ESTESIÔMETRIA Relativamente aos valores basais 24 horas previas à realização da ceratectomia lamelar, e aos 10 minutos após tratamento com nalbufina à 1% (GN) ou com solução salina à 0,9% (7h, 11h, 15h e 19h), não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos (Figura 3). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GC GN DIAS % A RE A UL CE RA DA Figura 3. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto aos valores basais, do limiar de sensibilidade ao toque córneal basal (comprimento do estesiômetro expressado em milímetros) em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco. Jaboticabal, 2011 * Teste Bonferroni (p < 0.05) Em todos os momentos, após as ceratectomias, não foram encontradas diferenças significativas, quanto à sensibilidade corneal (mm), entre os grupos controle (GC) e nalbufina (GN) (Figura 4). 7 11 15 19 0 5 10 15 20 25 30 35 GC GN HORA CO M PR IM EN TO D O F IO D O N YL O N DO E ST EN SI Ô M ET RO (m m ) Figura 4. Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto aos valores do limiar de sensibilidade ao toque córneal (mm), em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, decorridas 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228 e 240 horas da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011 * Teste Bonferroni (p < 0.05) 5.3 HISTOLOGIA, MORFOMETRIA E IMUNOISTOQUÍMICA Evidenciaram-se ausência do epitélio, exposição e separação das fibras colágenas que compõem o estroma corneal, edema estromal e células inflamatórias na região trepanada, em 100% das córneas no primeiro dia da ceratectomia lamelar. Três dias após o procedimento, todos os indivíduos de ambos os grupos mostraram reparação tecidual em fase inicial, evidenciada pela presença de uma monocamada de células epiteliais migrando da borda da ferida cirúrgica para o centro da lesão. O estroma corneal manteve-se edematoso, com separação das fibras colágenas. Verificou-se, ao nono dia e em todos os indivíduos, proliferação de células epiteliais formando camadas, a não exposição das fibras de colágeno, mas edema e separação de algumas das fibras (Figura 5). 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 216 228 240 0 5 10 15 20 GN GC HORAS CO M PR IM EN TO D O F IO D E NY LO N DO E ST EN SI Ô M ET RO (m m ) Figura 5. Fotomicrografias de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A, C e E) e nalbufina (GN) (B, D e F), decorridos 1 (A e B), 5 (C e D) e 9 (E e F) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e B, a ausência de epitélio e exposição das fibras de colágeno e edema estromal na região trepanada (setas). Em C e D, monocamada de células epiteliais (setas). Em E e F, reepitelização corneal evidenciando epitélio estratificado pavimentoso (setas). Hematoxilina & Eosina. Magnificação 100X. Jaboticabal, 2011 Não houve diferença significativa relativamente ao total das células inflamatórias (p=0,11). Ao primeiro dia, observaram-se células polimorfonucleares, com predominância de neutrófilos, infiltrando o estroma na região lesionada. Aos 7 e aos 9 dias, comparativamente aos 1, 3 e 5 dias, não houve diferença entre os grupos (p<0,05) (Figura 6 e 7). Ao nono dia, todas as córneas mostraram epitélio refeito e edema estromal (Figura 8). Observou-se menor porcentagem de células mononucleares no grupo nalbufina (p<0,05) (Figura 9). Figura 6. Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e B células inflamatórias polimorfonucleares permeando o estroma na área trepanada (setas). Em C, observa-se epitélio corneal e célula mononuclear (seta), edema e separação das fibras de colágeno. Em D epitélio corneal sem infiltração inflamatória Hematoxilina & Eosina. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2011 Figura 7.Mediana nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao percentil de células polimorfonucleares, em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011 * Teste Dunn (p < 0.05) Figura 8.Mediana nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao percentil de células mononucleares, em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011 * Teste Dunn (p < 0.05) 1 3 5 7 9 0 25 50 75 100 GC GN DIAS % C EL UL AS P O LI M O RF O NU CL EA RE S 1 3 5 7 9 0 25 50 75 100 GC GN DIAS % D E CE LU LA S M O NO NU CL EA RE S Relativamente à imunoistoquimica, observou-se imunomarcação da MMP-1 distribuída entre o espaço celular intersticial, nas células basais e externas, no estroma e sobre a lâmina basal em um 75% do campo avaliado, sem diferença significativa entre os grupos. O padrão que manteve até o quinto dia (p>0,05). No sétimo e nono dia, observou-se que a expressão da MMP-1 diminuiu em comparação com os dias anteriores (p<0,01) (Figura 9), ainda, sem apresentar diferenças significativas entre os grupos (p>0,05) (Figura 10). Nos momentos finais a MMP-1 se restringiu a uma distribuição epitelial basal. O grupo nalbufina apresentou imunomarcação mais expansiva, todavia sem diferença significativa relativamente ao grupo controle. Figura 9. Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e C, imunomarcação da MMP-1 nas células basais (setas) e no estroma corneal. Em B e D, observar diminuição na imunomarcação da MMP-1 nas células basais. Polímero ligado a peroxidase. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2011 Figura 10.Mediana nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao escore de marcação da MMP-1 em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011 * Teste Dunn (p < 0.05) No que concerne à MMP-9, tanto no GC quanto no GN, observou-se o mesmo padrão de marcação descrito para MMP-1, do primeiro ao quinto dia da avaliação (p>0,05) (Figura 11). Nos dias 1, 3 e 5 houve diferença significativa comparativamente aos dias 7 e 9 (p<0,001), onde a imunomarcação restringiu-se à lâmina basal e ao espaço intersticial em células epiteliais próximas a esta. Não houve diferença significativa entre os grupos em nenhum dos períodos (p>0,05) (Figura 12). 1 3 5 7 9 0 1 2 3 4 5 6 GC GN DIAS ES CO RE D E IM M UN O M AR CA ÇÃ O Figura 11.Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e C imunomarcação da MMP-9 em células basais (setas) e no estroma corneal. Em B e D, diminuição na imunomarcação de MMP-9 nas células basais. Polímero ligado a peroxidase. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2011 Figura 12.Média e desvio padrão nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao escore de marcação da MMP-9 em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011 * Teste Kruskal Wallis (p < 1,0) Relativamente ao Fator de Crescimento opióide, observou-se, em todos os períodos, imunomarcação citoplasmática em células basais e parabasais (Figura 13). Não se observou diferença significativa nem entre os períodos e nem entre os grupos (p=1,0) (Figura 14). 1 3 5 7 9 0 1 2 3 4 5 6 GC GN DIAS ES CO RE D E IM M UN O M AR CA ÇÃ O Figura 13.Fotomicrografías de córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, dos grupos controle (GC) (A e C) e nalbufina (GN) (B e D), decorridos 1 (A e B) e 9 (C e D) dias da ceratectomia lamelar. Observar, em A e B imunomarcação do OGF nas células basais e intracitoplasmática (setas). Ausência do OGF no estroma. Em C e D, marcação de OGF em concentrações similares entre os grupos. Polímero ligado a peroxidase. Magnificação 400X. Jaboticabal, 2011 Figura 14.Mediana nos grupos controle (GC) e nalbufina (GN), quanto ao escore de marcação da OGF em córneas de coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da ceratectomia lamelar. Jaboticabal, 2011 * Teste Dunn (p < 0.05) 1 3 5 7 9 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 GC GN DIAS ES CO RE D E IM UN O M AR CA ÇÃ O 6. DISCUSSÃO Os tempos de reepitelização nos grupos nalbufina e no grupo controle foram de 7 ± 1,79 dias e de 8,83 ± 1,17 dias, respectivamente. Não há, na literatura compulsada, estudos sobre os efeitos locais da nalbufina à 1%, quanto ao tempo de reparação corneal. Não se encontrou diferença significativa entre os grupos. A reepitelização corneal desenvolve-se seguindo diferentes fases. Na primeira, decorre destruição de hemidesmossomos, síntese de proteínas do citoesqueleto e de laminínas que aderem temporariamente às células e à membrana basal. As células epiteliais se achatam e migram como um folheto intacto para cobrir a área lesada (AGRAWAL & TSAI, 2003). Decorridas, aproximadamente, 5 horas do insulto, inicia-se a proliferação das células desde a margem ulcerada, repovoando a área desnuda, a uma velocidade média de 60-80 µm/hora. Ao final, hemidesmossomos e matriz extracelular são reconstituídos (AGRAWAL & TSAI, 2003). Intercorrências podem alterar o tempo de reepitelização corneal. Citam-se a ação de fármacos, de conservantes (ex - cloreto de benzalcônio), de contaminação bacteriana secundária (Pseudomona spp.), expressão de metaloproteases (MMP-1, MMP-2, MMP-9) e a liberação de fatores do crescimento e de citocinas (Fator de Crescimento Opióide, Fator de Crescimento Epidermal, Interleucina-1, Fator de Necrose Tumoral-α) (ZAGON et al., 1998; BEKENDAM et al., 2007; SAIKA, 2007; WANG et al., 2008; EPSTEIN et al., 2009; WILSON & ESPOSITO, 2009; CHANG et al., 2010; UEMATSU et al., 2010; WADA et al., 2010; YU et al., 2010; MÁRQUEZ et al., 2011). Zagon et al. (2002) verificaram que a naltrexona, um antagonista opióide puro, acelerou a reepitelização de córneas de coelhos diabéticos. A diminuição do tempo de reepitelização decorreu dos efeitos na expressão do Fator de Crescimento Opióide ou [Met5] - Encefalina e de seu receptor. A nalbufina, um opióide agonista κ/antagonista µ, foi avaliada na presente pesquisa visando-se a estudar se o seu efeito antagonista opióide poderia suscitar alterações no tempo de reepitelização. Donahue et al. (2011) reportaram que os efeitos da naltrexona sobre o OGF e o seu receptor, e sobre a proliferação e a reparação teciduais, são dependentes da dose e da frequência das administrações. Optou-se pela utilização da nalbufina à 1%, sem cloreto de benzalcônio, como conservante, para se evitarem os efeitos citotóxicos do conservante (EPSTEIN et al., 2009; UEMATSU et al., 2010). A toxicidade do cloreto de benzalcônio tem sido estudada, mas não se conhece em completude o seu mecanismo. Zhou et al. (2011) encontraram que ele diminui a fosforilação da β-catenina e aumenta a concentração total de β-catenina no citoplasma das células epiteliais, com ativação da via Wnt. Trata-se de via relacionada a eventos fisiológicos de diferenciação, desenvolvimento e proliferação celulares, assim como a eventos patológicos como inflamação e fibrose. Uematsu et al. (2010) relataram que quanto maior é o número de carbonos da região álcali na molécula do cloreto de benzalcônio, maior a sua toxicidade sobre as células corneais. O pH da solução de nalbufina foi ajustado a 6,95. Para tal, empregou-se solução buffer tampão, sem que decorresse precipitação do princípio ativo. Tsai et al. (2010) encontraram que células epiteliais corneais humanas não sofrem efeitos citotóxicos, quando em meios com pH 5, comparativamente a outras de pH neutro (7,3). Fármacos que, para agir, necessitam de pH ácidos, podem se precipitar na superfície corneal ao contatarem com filme lacrimal, ensejando alterações na reepitelização e induzindo a perfurações (KONISHI et al., 1998; TSAI et al., 2010) Peyman et al. (1994) reportaram a ocorrência de infecção após ceratectomias lamelares, em coelhos que não receberam antibioticoterapia profilática. Efeito imunossupressor decorrente do uso crônico de opióides foi relatado (BUDD, 2006; SHARP, 2006; STEIN & MECHELSKA, 2011). Empregou-se profilaticamente a tobramicina. A tobramicina mantem amplo espetro de ação contra microrganismos gram negativos e sua citotoxicidade, comparativamente à gentamicina e às fluoroquinolonas, é menor (NELSON et al., 1990; HENDRIX et al, 2001, TSAI et al., 2010, AYAKI et al., 2012). Colírios à base de morfina, um agonista opióide puro, e seus efeitos sobre a reepitelização corneal têm sido discutidos. (STILES et al., 2003; FAKTOROVICH & BASBAUM, 2010; RIBEIRO et al., 2012). Ribeiro et al. (2012) reportaram aumento no diâmetro de áreas corneais trepanadas que receberam morfina localmente. Pesquisas em cães com ulceras corneais e em seres humanos submetidos a cirurgias refrativas mostraram, todavia, que a morfina não alterou a reparação corneal (STILES et al., 2003; FAKTOROVICH & BASBAUM, 2010). Previamente às ceratectomias lamelares, a avaliação quanto ao limiar de sensibilidade ao toque córneal (LSC) não mostrou diferenças comparativamente e após a instilação de Nalbufina à 1%. Tais resultados não divergem dos reportados por Wotman & Utter (2010), em córneas de cavalos antes e após a utilização da Nalbufina à 1%. O evento inflamatório que decorre da injuria corneal permite a ação do fármaco opióide, relativamente aos seus efeitos anti-nociceptivos, pelo incremento da síntese de seus receptores (ativação do STAT-6 pela interleucina 4 e a proteína 1), pelo aumento no transporte axonal (interleucina 1β aumenta o transporte de receptores opioides produzidos no gânglio da raiz dorsal até as terminações nervosas periféricas), condições do meio (prostaglandinas e baixo pH levam a união do opióide com a proteína P, aumentando a adenosina monofosfato cíclico neuronal) e pelo aumento das fibras nervosas sensitivas terminais, adjunto à quebra da barreira perineuronal (penetração do fármaco opióide e exposição dos receptores) (STEIN et al., 1988; WENK et al., 2003). Pelas observações, é fatível pensar que a nalbufina à 1% não enseja efeitos anti-nociceptivos em córneas hígidas. Clark et al. (2011) não lograram êxito no controle da dor em pacientes da espécie canina submetidos a ceratectomia lamelar e tratados com nalbufina à 1%, Aquino et al. (2005) referiram que o limiar de sensibilidade ao toque córneal em córneas sadias de cães aumenta decorridos 30 minutos de uma única instilação de nalbufina à 1%. Resultados díspares podem ser admitidos, considerando-se que os métodos de avaliação empregados não foram os mesmos. Aquino et al. (2005) avaliaram a sensibilidade corneal empregando o estesiômetro de Cochet-Bonett, enquanto Clark et al. (2011) o fizeram valendo-se de avaliação visual subjetiva e de diferentes escores, de consoante com comportamento dos pacientes após as ceratectomias. Optou-se por se avaliar a região central da córnea, conquanto é a que mantem o maior quantitativo de inervação nocioceptiva (RÓZSA et al., 1982). Em seres humanos, mostrou-se que o limiar de sensibilidade ao toque córneal (LSC) pode ser alterado por fatores como idade, ciclo hormonal, hora do dia, cor da íris, condições ambientais (temperatura e umidade), doenças endócrinas (diabete tipo 1 ou 2), fármacos, cirurgias refrativas, tipo de estesiômetro empregado na avaliação (Cochet-Bonett ou Belmonte), e doenças oculares como ceratites herpéticas e ceratoconjuntivite seca, além de outras (du TOIT et al., 2003; ACOSTA et al., 2005; BOURCIER et al., 2005; ACOSTA et al., 2006; GOLEBIOWSKI et al., 2008; GALLAR et al., 2010; NEIRA-ZALENTEIN et al., 2011). Reportaram-se, em cães, alterações no LSC em pacientes acometidos por doenças como o diabete mellito, o glaucoma e em outros submetidos a procedimentos como a ciclofotocoagulação a laser (WEIGT et al., 2002, CULLEN et al., 2005, BLOCKER et al., 2007). O limiar de sensibilidade ao toque córneal, na presente pesquisa, foi avaliado utilizando-se o estesiômetro de Cochet-Bonett. Trata-se de equipamento que produz estímulo mecânico na superfície ocular, pelo contato de um fio de nylon com a córnea. Considerando-se que o método possibilita estimular apenas mecano- nociceptores (20% do quantitativo de nociceptores da córnea), outras modalidades passaram a ser desenvolvidas, como o CRCERT-Belmonte, que permite a avaliação quanto a mecano-nociceptores e a receptores polimodais (GOLEBIOWSKI et al., 2008). Golebiowski et al. (2011) compararam o Cochet-Bonett e o CRCERT- Belmonte. Os resultados foram inconclusivos, pelas diferenças quanto à modalidade do estímulo e ao modo de estimulação, fazendo pensar em possível mobilização de duas vias sensitivas diferentes. Na presente pesquisa, empregou-se o estesiômetro de Cochet-Bonett e não se encontraram diferenças significativas entre os grupos. Oportuna seria a utilização de mais de um tipo de estesiômetro para a melhor elucidação dos efeitos da nalbufina à 1% sobre a sensibilidade corneal. Períodos de 30 segundos, entre cada estímulo, devem ser respeitados quando da realização da estesiômetria, para diminuírem-se as chances de adaptação dos nociceptores e para que haja a repolarização das fibras (GOLEBIOWSKI et al., 2008). Várias avaliações tiveram que ser realizadas para que se obtivessem resultados confiáveis. Em decorrência, induziu-se a uma possível “fadiga” dos receptores. O uso de agonistas e de antagonistas opióides, pelas vias parenteral e local, tem mostrado efeitos sobre a inflamação (van LOON et al., 2010). Estudos avaliando a nalbufina, quanto aos seus efeitos sobre eventos inflamatórios, não foram encontrados. Nesta pesquisa, preparações de córneas de coelhos tratadas com nalbufina foram coradas pela hematoxilina & eosina, e avaliadas quanto à infiltração de polimorfonucleares e de mononucleares. Diferenças significativas entre tratados e controles não foram encontradas. A existência de receptores opióides e sua ação sobre a inflamação, como a diminuição na produção de citocinas pro-inflamatórias, moléculas de adesão, edema e extravasamento de plasma, na proliferação e na quimiotaxia de diferentes fenótipos celulares do sistema imune (monócitos, linfócitos, macrófagos, granulócitos e neutrófilos) foi reportada em seres humanos, em macacos e em ratos (SHARP, 2006). Tratam-se de efeitos decorrentes da diminuição na liberação da substancia P e de alterações na expressão do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, em neurônios terminais sensitivos periféricos (STEIN & MACHELSKA, 2011). Estudos mostraram que opióides tópicos inibem fatores mitogênicos (substância P e neurocininas - 1 e - 2) de células da musculatura lisa, de ceratinócitos, de fibrócitos e de células endoteliais, alterando a reparação tecidual. Sabe-se que o contingente de células inflamatórias no local da lesão diminui e que o quantitativo de bactérias aumenta (ROOK et al., 2009, MARTIN et al., 2010). Rook, et al. (2009) encontraram que o efeito da morfina sobre o tempo de reparação tecidual depende do tempo em que a terapia é iniciada. Observaram alterações no tempo de reparação quando o tratamento fora iniciado imediatamente à lesão. Alterações quanto à espessura do epitélio e o quantitativo tecido de granulação foram encontradas. No presente estudo, observou-se maior percentil de células mononucleares ao nono dia no GN, comparativamente ao GC. Flores et al. (1995), Roy et al. (2001) e Zeinalinejad et al. (2011) reportaram resultados similares em córneas tratadas com morfina, relativamente ao numero de células mononucleares. Antagonistas opióides têm sido estudados quanto aos efeitos sobre a reparação tecidual. Não se encontraram, na presente pesquisa, diferenças quanto ao tempo de reparação, tampouco alterações à histologia entre os grupos. A naltrexona, um antagonista opióide, produz efeitos benéficos sobre a reparação tecidual (ZAGON et al., 2002). Ceratites ulcerativas e lesões cutâneas decorrentes de diabete melito são de difícil controle. O uso de naltrexona, nestes casos, tem mostrado resultados promissores (KLOCEK et al., 2007; KLOCEK et al., 2009; ABDELKADER et al., 2011; McLAUGLHIN et al., 2011). Efeitos similares foram encontrados na presente pesquisa, comparativamente aos de Klocek et al. (2007) e Klocek et al. (2009), que reportaram ausência de alterações quanto à morfologia corneal em coelhos diabéticos submetidas à ceratectomia e tratados com naltrexona. Zagon et al. (2002) e Donahue et al. (2011) relacionaram o evento à inibição, pela naltrexona, de peptídeos opióides endógenos (Fator de Crescimento Opióide) envolvidos no crescimento celular. Metaloproteases da matrix extracelular (MMP) são endopeptidases dependentes do zinco, secretadas como pró-enzimas e ativadas no meio extracelular (BROOKS & OLLIVIER; 2004). Elas são classificadas em colagenasas, gelatinasas, estromalisinas e MMP da matrix extracelular. Na córnea são sintetizadas pelos ceratocitos, pelas células epiteliais, pelos fibroblastos, pelos monócitos e pelos macrófagos (BROWN et al., 1991; FINI, 1999; WEBSTER & CROWE, 2006; OLLIVIER et al., 2007). A principal função está relacionada à remodelação e à reparação corneais (SIVAK & FINI, 2002; BROOKS & OLLIVIER, 2004). A manutenção e o reparação da matrix extracelular da córnea requerem equilíbrio entre síntese de componentes da matrix extracelular, a degradação e a remodelação. (OLLIVIER et al., 2007). A avaliação imunoistoquimica não permite a avaliação de formas ativas e inativas das MMP, porem o desenvolvimento de técnicas como a zimografia permitiriam esclarecer a existência de possíveis diferencias quanto a expressão destas MMP (SNOEK-VAN BEURDEN & VON DEN HOFF, 2005) Inibidores teciduais de enzimas líticas, como o inibidor de protease alfa-1, a alfa-2 macroglobulina e inibidores de metaloproteases são encontrados no tecido corneal saudável e na lágrima (OLLIVIER et al., 2007). Não se encontraram estudos quanto à ação da nalbufina sobre a expressão das metaloproteases. Considerando- se que fármacos podem produzir efeitos sobre a sua expressão, decidiu-se por se estudarem os possíveis efeitos da nalbufina à 1%. Não foram encontradas alterações quanto à expressão de metaloproteases. Tratam-se de resultados que diferem dos encontrados por Chang et al. (2010), em que a morfina, antagonista opióide puro, produziu aumento na expressão das MMP em lesões cutâneas de ratos. Estudos realizados em outros tecidos e linhagens celulares têm mostrado efeito inibitório de MMP com a utilização de morfina (GACH et al., 2011). Fini et al. (1996) e Ye & Azar (1998), ao produzirem lesões corneais em ratos, em cães e em seres humanos, respectivamente, encontraram que as MMP se expressavam notadamente na membrana basal e no estroma superficial. Resultados similares foram encontrados na presente pesquisa, relativamente ao padrão de imunomarcação para a MMP-1 e para a MMP-9. Mulholland et al. (2005) encontraram imunomarcação de MMP somente na região subepitelial. À imunoistoquímica, não se distinguiram diferenças significativas quanto à imunomarcação para a metaloprotease-1 e para a metaloprotease-9 entre os grupos. Verificou-se diminuição ao sétimo e nono dias, comparativamente aos outros períodos. O tempo de reepitelização não divergiu entre os grupos. Tais achados corroboram com os de Ollivier et al. (2004), de Mulholland et al. (2005) e de Wang et al. (2008). O Fator de Crescimento Opióide (OGF) ou [Met5] Encefalina é um peptídeo natural endógeno encontrado em diferentes tecidos do corpo, que interage com o receptor zeta (ζ) ou OGFr (ZAGON et al., 1995, ZAGON et al., 2003). Esta relacionada a processos fisiológicos de remodelação e de reparação teciduais (ZAGON et al., 1995). Cheng et al. (2009) observaram que a sua ação sobre a proliferação celular deve-se à ativação de cinases inibitórias dependentes de ciclina. Robertson & Andrew (2003) e Zagon et al. (2003) reportaram a existência de OGF em córneas sadias de coelhos, de cães, de gatos e de cavalos. No presente estudo, encontrou-se que a imunomarcação de OGF não divergiu entre os grupos. Zagon et al. (2002) e McLaughlin et al. (2011) relataram que ao inibirem o OGF, pela aplicação local de naltrexona, o tempo de reparação tecidual diminuiu. Tratam-se de resultados que diferem dos obtidos no presente estudo, em que a ação antagonista da nalbufina à 1% não permitiu alterar a sua expressão. Mesmo que sem diferença significativa, a media quanto no tempo de reparação no grupo tratado com nalbufina foi menor. Não há como confirmar, todavia, que tal tenha decorrido da ação da nalbufina sobre o OGF. Donahue et al. (2011) encontraram que o efeito de antagonistas opióides sobre a expressão do OGF depende da dose e das frequências de aplicação. Doses elevadas aumentaram a proliferação celular e doses baixas induzem a efeitos inibitórios. Efeitos sobre a proliferação celular não foram encontrados na presente pesquisa. Estudos desenvolvidos com modelos inflamatórios na cavidade abdominal demostraram que a aplicação de morfina produz aumento nas concentrações de peptídeos opióides endógenos (CHADZINSKA et al. 2005). No presente estudo encontrou-se que a fração agonista da nalbufina não interferiu com a expressão de peptídeos endógenos (OGF). 7. CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos com a pesquisa, na forma como ela fora concebia, é factível admitir que a aplicação local de nalbufina à 1% não ensejou analgesia corneal em coelhos machos, adultos, da raça Nova Zelândia Branco, que passaram por ceratectomia lamelar; e que a substancia não alterou a reparação epitelial da córnea, a expressão das metaloproteases-1, -9 e do Fator de Crescimento Opióide. 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDELKADER, H.; PATEL, D.V.; McGHEE, C.N.J.; ALANY, R.G. New therapeutic approaches in the treatment of diabetic keratopathy: a review. Clinical & Experimental Ophthalmology, v. 39, n. 3, p. 259-270, 2011 ACOSTA, M.C.; BERENGUER-RUIZ, L.; GARCÍA-GÁLVEZ, A.; PEREA-TORTOSA, D.; GALLAR, J.; BELMONTE, C. 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