JOANDES HENRIQUE FONTEQUE ESTRESSE OXIDATIVO E LIPOPEROXIDAÇÃO DEVIDO À ANEMIA INDUZIDA POR PERDA AGUDA DE SANGUE EM OVINOS Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, como requisito para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária, Área de Clínica Veterinária. BOTUCATU – SP - 2005- i JOANDES HENRIQUE FONTEQUE ESTRESSE OXIDATIVO E LIPOPEROXIDAÇÃO DEVIDO À ANEMIA INDUZIDA POR PERDA AGUDA DE SANGUE EM OVINOS Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, como requisito para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária, Área de Clínica Veterinária. Orientadora: Profa. Dra. Aguemi Kohayagawa BOTUCATU – SP - 2005- ii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS Fonteque, Joandes Henrique. Estresse oxidativo e lipoperoxidação devido à anemia induzida por perda aguda de sangue em ovinos / Joandes Henrique Fonteque. – 2005. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2005. Orientador: Aguemi Kohayagawa Assunto CAPES: 50501062 1.Ovino - Doenças 2.Hematologia veterinária 3.Lipoperoxidação 4. Anemia CDD 636.30896152 Palavras-chave: Anemia aguda; lipoperoxidação; Malondialdeído; Ovinos; Oxido nítrico; Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico iii iv A Deus Por que Dele e por Ele, e para Ele são todas as coisas... Romanos 11:36 v Dedico este trabalho: Aos meus Pais, Accacio Fonteque e Maria José Fonteque À minha irmã Joyce Cristina Fonteque Gaspar, meu sobrinho Caio José Fonteque Gaspar e Meu cunhado Eron José Gaspar À minha noiva Daniela dos Santos Corrêa Amo a todos vocês... vi Agradecimentos A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou indireta de muitas pessoas. Manifestamos nossa gratidão a todas elas de forma particular: À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu, pela oportunidade concedida para a realização do Curso de Doutorado. À Seção de Pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Campus de Botucatu, em especial aos funcionários Denise A. Fioravante Garcia, Maria Aparecida Dias de Almeida Manuel e Maria Regina Tenor Forlin. Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Cnpq) pela concessão da Bolsa de Estudo, imprescindível para a realização deste trabalho. À Profa. Dra. Aguemi Kohayagawa pelo carinho, incentivo e oportunidade de trabalhar ao seu lado. À Johnson e Johnson Ortho-Clinical Diagnostics e a Márcia Sayuri Takaasy pelo fornecimento dos kits para a realização da bioquímica sérica pela química seca. À Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo, Prof. Dr. Armindo, pós-graduandos e funcionários do Laboratório de Fisiologia do Exercício (LABEX) da Universidade de Campinas, pelo auxílio na realização das dosagens das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). À Dra. Maria Luiza Cassetari pelas dosagens de malondialdeído pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). À Profa. Dra. Eunice Oba pela autorização da utilização do Laboratório de Endocrinologia Veterinária necessária para a realização da dosagem hormonal. vii Ao Prof. Dr. Alexandre Secorun Borges pela amizade, companheirismo e pelas valiosas sugestões, observações e auxílio no desenvolvimento do experimento. Ao Prof. Dr. Rogério Martins Amorim pela amizade, companheirismo e pela prestimosa colaboração e disposição no auxílio do desenvolvimento deste trabalho. À minha noiva Daniela dos Santos Corrêa pelo amor, compreensão e incentivo. E aos seus pais, Donizete e Cidinha. À amiga e Pós-graduanda Mere Erika Saito pela amizade, companheirismo, auxílio na realização da parte experimental e dosagem das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). À amiga e Pós-graduanda Veridiana Fernandes da Silveira pela amizade, companheirismo e auxílio na realização das dosagens de malondialdeído (MDA). À amiga e Pós-graduanda Luciana Pereira Machado pela amizade, companheirismo e convívio durante esses anos. À Profa. Dra. Regina Kiomi Takahira, pela amizade, apoio e disposição sempre presentes. Ao Prof. Dr. Raimundo Souza Lopes pela amizade e convívio durante esses anos em Botucatu. À Profa. Adriane Jorge Mendonça pelo convívio e amizade que solidificamos durante o curso. À Profa. Dra. Ana Liz Garcia Alves pela amizade e auxílio durante a pós-graduação. Ao amigo Dr. Fernando de Biasi e seus pais Antônio e Lavínia pela amizade e convívio durante minha estada em Botucatu. Aos Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisbôa, Profa. Dra. Mara Regina Stipp Balarin, Prof. Dr. Peter Reichmann, Prof. Ney Carlos Reichert Netto e Prof. Dr. Augusto José Savioli de Almeida Sampaio pelo companheirismo e convívio amigável durante minha estada na Universidade Estadual de Londrina. viii Ao amigo Prof. Andrey Teixeira Borges pela amizade e convívio durante o curso. Ao Prof. Luciano Barbosa do Departamento de Bioestatística do Instituto de Biociências da UNESP – Botucatu - SP, pelo auxílio na análise estatística dos dados. Aos Pós-graduandos Rita de Cássia Collicchio Zuanaze e Marcos Yun Watanabe pela amizade e convívio durante o curso de pós- graduação. À Profa. Dra. Michiko Sakate pela amizade e ensinamentos durante o curso de pós-graduação. À secretária do Departamento de Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu, Marlene Dias Camargo pela amizade e apoio durante o curso. Aos funcionários do Laboratório Clínico Veterinário Sueli de Oliveira Emílio, Ilson Aparecido Tavares e Luiz Antônio Matiazzi pela colaboração e amizade. Às funcionárias Sônia Maria Santi do Laboratório de Enfermidades Parasitárias e Izabel Cristina Castro do Laboratório de Toxicologia pela amizade e companheirismo. Aos funcionários da Divisão de Biblioteca e Documentação da UNESP – Campus de Botucatu, Rosemary Cristina da Silva pela correção das referências bibliográficas e Selma Maria de Jesus pela confecção da ficha catalográfica. ix Irmãos, reparai, pois, na vossa vocação; visto que não foram chamados muitos sábios segundo a carne, nem muitos poderosos, nem muitos nobres de nascimento; pelo contrário, Deus escolheu as coisas loucas do mundo para envergonhar os sábios e escolheu as coisas fracas do mundo para envergonhar as fortes; e Deus escolheu as coisas humildes do mundo, e as desprezadas, e aquelas que não são, para reduzir a nada as que são; a fim de que ninguém se vanglorie na presença de Deus. Mas vós sois Dele, em Cristo Jesus, o qual se tornou, da parte de Deus, sabedoria, e justiça, e santificação, e redenção, para que, como está escrito: Aquele que se glorie, glorie-se no Senhor. I Coríntios 1:26-31 x À minha noiva Daniela (Branca) ... ...não consigo dizer se é bom ou mal assim como o ar me parece vital onde quer que eu vá, o que quer que eu faça sem você, não tem graça... Dinho Ouro Preto (Fogo - Capital Inicial) Te amo... Joandes Sumário Lista de Figuras ..................................................................................... xii Lista de Tabelas ..................................................................................... xv Lista de Abreviaturas e Símbolos ...................................................... xvii Resumo................................................................................................ xviii Abstract .................................................................................................. xx 1. Introdução ............................................................................................ 1 2. Revisão de Literatura .......................................................................... 3 2.1. RESPOSTA À ANEMIA EM OVINOS............................................................................................3 2.2. ESTRESSE OXIDATIVO, LIPOPEROXIDAÇÃO E ANEMIA.............................................................6 2.3. ANEMIA E BIOQUÍMICA SÉRICA.............................................................................................10 3. Objetivos............................................................................................. 14 3.1. OBJETIVOS GERAIS...............................................................................................................14 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................14 4. Material e métodos ............................................................................ 16 4.1. LOCAL DE EXECUÇÃO DA PESQUISA ....................................................................................16 4.2. ANIMAIS...............................................................................................................................16 4.3. PROTOCOLO DE INDUÇÃO DA ANEMIA ..................................................................................17 4.4. COLHEITA DAS AMOSTRAS ...................................................................................................17 4.5. EXAMES LABORATORIAIS ....................................................................................................18 4.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA..........................................................................................................20 5. Resultados e Discussão.................................................................... 23 5.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS......................................................................................................23 5.2. OBSERVAÇÕES CLÍNICAS ......................................................................................................24 5.3. HEMOGRAMA .......................................................................................................................25 5.3.1. Eritrograma e Proteína Total Plasmática ...................................................................25 5.3.2. Plaquetas, volume plaquetário (VP), volume plaquetário médio (VPM) e distribuição do diâmetro das plaquetas (DDP) .........................................................................................34 5.3.3. Leucograma .................................................................................................................38 5.4. ESTRESSE OXIDATIVO E LIPOPEROXIDAÇÃO .........................................................................43 5.5. BIOQUÍMICA SÉRICA.............................................................................................................48 6. Conclusões......................................................................................... 54 7. Referências Bibliográficas................................................................ 56 xii Lista de Figuras Página Figura 1- Efeitos dos radicais livres nos constituintes da membrana celular (adaptado de Sjödin et al., 1990)...................................................... 8 Figura 2- Gráfico representativo dos valores médios ( X ) do número de eritrócitos (x106/µL), concentração de hemoglobina (g/dL), volume globular (%) e concentração de proteínas plasmáticas totais (g/dL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia..................... 32 Figura 3- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do volume corpuscular médio (fL), hemoglobina corpuscular média (pg), concentração de hemoglobina corpuscular média (g/dL), distribuição do diâmetro dos eritrócitos (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia............................................................... 33 Figura 4- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) da avaliação da anisocitose, distribuição do diâmetro dos eritrócitos (%), número absoluto de reticulócitos (x106/µL), policromasia e volume globular (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia..................... 33 Figura 5- Gráfico representativo dos valores médios ( X ) do número de plaquetas (x103/µL) e volume plaquetário (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia............................................................... 36 Figura 6- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do volume plaquetário médio (fL) e distribuição do diâmetro das plaquetas (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia..................... 36 xiii Figura 7- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do número total de leucócitos (x103/µL), neutrófilos segmentados (x103/µL) e linfócitos (x103/µL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia..................... 41 Figura 8- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do número total de monócitos (x103/µL), eosinófilos (x103/µL) e basófilos (x103/µL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.............................................. 41 Figura 9- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) da relação neutrófilo:linfócito e da concentração sérica de cortisol (ng/mL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.............................................. 42 Figura 10- Gráfico representativo dos valores médios ( X ) da concentração sérica de óxido nítrico (nmol/L), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (nmol/mL) e malondialdeído (nmol/L) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6h) e 12h após a primeira flebotomia (12h+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia...................................................... 46 Figura 11- Gráfico representativo dos valores médios ( X ) da concentração sérica de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (nmol/L), volume globular (%) e concentração de cortisol sérico (ng/mL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6h) e 12h após a primeira flebotomia (12h+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia...................................................... 46 Figura 12- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) da concentração de uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6h) e 12h após a primeira flebotomia (12h+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.......................................................................................... 50 xiv Figura 13- Gráfico representativo dos valores médios ( X ) da atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e gama- glutamiltransferase (GGT) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6h) e 12h após a primeira flebotomia (12h+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.......................................................................................... 50 Figura 14- Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) da atividade enzimática da creatinofosfoquinase (UI/L) e lactato desidrogenase (UI/L) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6h) e 12h após a primeira flebotomia (12h+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia..................... 51 xv Lista de Tabelas Página Tabela 1 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) do número de eritrócitos (x106/µL), concentração de hemoglobina (g/dL), do volume globular (%), volume corpuscular médio (fL), hemoglobina corpuscular média (pg), concentração de hemoglobina corpuscular média (g/dL), distribuição do diâmetro dos eritrócitos (%), contagem de reticulócitos (x106/µL) e concentração de proteína total plasmática (g/dL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.......................................................................................... 26 Tabela 2 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) avaliação da anisocitose e policromasia em esfregaços sangüíneos corados graduados por escore, volume globular (VG) e contagem de reticulócitos (x106/µL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia..................... 31 Tabela 3 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) do número de plaquetas (x103/µL), volume plaquetário (%), volume plaquetário médio (fL) e distribuição do diâmetro das plaquetas (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia............................................................... 35 Tabela 4 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) da concentração sérica de cortisol (ng/mL), do número total de leucócitos (x103/µL), neutrófilos segmentados (x103/µL), linfócitos (x103/µL), monócitos (x103/µL), eosinófilos (x103/µL), basófilos (x103/µL) e relação neutrófilo linfócito (N:L) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.......................................................................................... 40 Tabela 5 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) da concentração sérica cortisol (ng/mL), volume globular (%), óxido nítrico (nmol/L), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (nmol/mL), malondialdeído (nmol/L) e lactato (nmol/L) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia............................................................... 45 xvi Tabela 6 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) da concentração e uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL), atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST), gama-glutamiltransferase (GGT), creatinofosfoquinase (UI/L) e lactato desidrogenase (UI/L) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia.............................................. 49 xvii Lista de Abreviaturas e Símbolos X = média ACTH = hormônio adrenocorticotrófico ADH = hormônio anti-diurético AST = aspartato aminotransferase CHCM = concentração de hemoglobina corpuscular média CK = creatinofosfoquinase DDE = distribuição do diâmetro dos eritrócitos DNA = ácido desoxirribonucléico EDTA = ácido etileno-diamino-tetracético EPO = eritropoetina ERO = espécies reativas do oxigênio FMB = Faculdade de Medicina de Botucatu FMVZ = Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia GGT = gama-glutamiltransferase GM-CFS = fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos H2O2 = peróxido de hidrogênio HCM = hemoglobina corpuscular média HPLC = cromatografia líquida de alta eficiência I125 = iodo 125 LABEX = Laboratório de Fisiologia do Exercício LDH = lactato desidrogenase MDA = malondialdeído MK-CSF = fator estimulador de colônia megacariocítica NO = óxido nítrico O2 = oxigênio O2 - = superóxido OH- = radical hidroxil OPG = ovos por gramas de fezes p = “p-value” PCT = volume plaquetário PDW = distribuição do diâmetro das plaquetas RDW = distribuição do diâmetro dos eritrócitos (“red cell distribution width) RIA = radioimunoensaio s = desvio padrão SNC = sistema nervoso central TBA = ácido tiobarbitúrico TBARS = substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TFG = taxa de filtração glomerular VCM = volume corpuscular médio VG = volume globular VPM = volume plaquetário médio xviii FONTEQUE, J.H. Estresse oxidativo e lipoperoxidação devido à anemia induzida por perda aguda de sangue em ovinos. 2005. 68p. Tese de Doutorado em Medicina Veterinária, Área de Clínica Veterinária – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. Resumo A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) é um evento presente em todas as células do organismo e pode estar aumentada em condições como hipóxia induzida pela anemia causando lesões em moléculas como DNA, lipídeos e proteínas. Com o objetivo de avaliar o estresse oxidativo na anemia induzida por perda aguda de sangue, foram utilizados 10 ovinos, mestiços da raça Texel, machos e fêmeas, com idade entre seis e oito meses, clinicamente sadios, mantidos em regime de confinamento. Os animais foram submetidos a duas flebotomias para a retirada de 30% e 20% do volume sangüíneo com intervalo de 12 horas. Amostras de sangue foram colhidas imediatamente antes da flebotomia, 6h e 12h após a primeira flebotomia, 6h, 12h, 24h, 48h, 72 horas, 4d, 5d, 6d, 10d, 14d, 21d e 28 dias após a segunda flebotomia. Foram avaliados o óxido nítrico, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, malondialdeído, cortisol e lactato séricos, hemograma e bioquímica sérica. A análise estatística dos dados foi realizada por meio do Teste de Análise de Variância de Medidas Repetidas (ANOVA) ao nível de 5% de significância. Os resultados demonstraram que o protocolo de indução de anemia foi capaz de induzir anemia 12 horas após a segunda flebotomia, estresse oxidativo e lipoperoxidação caracterizado pelo aumento das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. O cortisol elevou-se e alterou o leucograma aumentando o número de leucócitos, neutrófilos e a relação neutrófilo:linfócito. Todos os animais recuperaram-se dentro do período de 28 dias após a flebotomia. Conclui-se que a retirada de 30% e 20% do xix volume de sangue com intervalo de 12 horas provoca estresse oxidativo e lipoperoxidação em ovinos. Palavras-Chave: ovinos, anemia aguda, óxido nítrico, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, malondialdeído, lipoperoxidação. xx FONTEQUE, J.H. Oxidative Stress and, lipid peroxidation in phlebotomy-induced acute anemia in sheep. 2005. 68p. Thesis Doctor in Veterinary Medicine, Clinical Veterinary – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. Abstract Reactive oxygen species (ROS) are produced in all cells and an increase can be associated with hypoxia induced by anemia. This results in DNA, lipid and protein damage. The aim of this work was to evaluate the oxidative stress induced by experimental acute blood loss. Ten healthy cross Texel sheep underwent two phlebotomies with 12 hours interval. Blood samples were collected before the first phlebotomy (30% of blood volume) and 6 and 12 hours after. A second phlebotomy was performed 12 hours after the first one (20% of blood volume) and blood samples were collected, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 4 days, 5 days, 6 days, 10 days, 14 days, 21 days and 28 days after. Thiobarbituric acid-reactive substances, malondialdehyde, nitric oxide, lipid peroxidation, serum cortisol, serum lactate, CBC and serum biochemistry were evaluated. Statistical analysis was reformed using repeated measures ANOVA. The experimental protocol used was able to induce anemia 12 hours after the second phlebotomy resulting in oxidative stress and lipoperoxiation characterized by the thiobarbituric acid-reactive substances increase. There was also a cortisol increase causing white blood cell changes: increased number of leukocytes, neutrophils and neutrophil and lymphocyte rate. All animals were normal 28 days after the phlebotomy. In conclusion, the protocol used showed that phlebotomy causing 30 and 20% at blood loss can induce oxidative stress and, lipid peroxidation in sheep. Key Words: ovine, acute anemia, thiobarbituric acid-reactive substances, malondialdehyde, nitric oxide, lipid peroxidation. INTRODUÇÃO Introdução 1 1. Introdução A anemia é caracterizada clinicamente por decréscimos do número de eritrócitos, da concentração de hemoglobina e do volume globular. As causas de anemia incluem a perda de sangue, a destruição e a produção inadequada dos eritrócitos. A principal causa de anemia envolve a perda de sangue (ROBINSON; HUXTABLE, 1988; FELDMAN et al., 2000). Durante a anemia a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) está aumentada e pode ser tóxica a células, tecidos ou órgãos quando não é neutralizada (CHAN et al., 1999; LI; KARIN, 1999; STENVINKEL, 2003). As lesões nas membranas causadas por ERO resultam em lipoperoxidação caracterizadas por aumento da produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e malondialdeído (MDA) (HALLIWELL, 1995; NIELSEN et al., 1997; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; ZWART et al., 1999; WICKENS, 2001; SARADA et al., 2002; KÜHN; BORCHERT, 2002). Durante a hipóxia tecidual as células produzem lactato, radicais livres e fatores de inflamação que não são eliminados pela circulação sangüínea e podem causar lesão celular direta. O sistema nervoso central (SNC) é o gatilho da resposta neuroendócrina que mantém a perfusão sangüínea no coração e cérebro, diminuindo em outros tecidos (DUTTON, 2003). O rim e as glândulas adrenais são os primeiros órgãos a responderem a essas alterações com a produção de renina, angiotensina, aldosterona, cortisol, eritropoetina e catecolaminas. Devido à complexa microcirculação hepática este órgão também pode ser alvo de lesão em estados de hipóxia tecidual (DUTTON, 2003). Revisão de Literatura 2 REVISÃO DE LITERATURA Revisão de Literatura 3 2. Revisão de Literatura Objetivando aumentar os subsídios para efetuar uma melhor discussão sobre o tema desta tese e diante da escassez ou mesmo da ausência de trabalhos na literatura referentes ao assunto na espécie ovina, serão apresentados resultados de pesquisas científicas que incluem outras espécies de animais domésticos e a espécie humana. 2.1. Resposta à anemia em ovinos A anemia é a redução da habilidade do sangue em suprir os tecidos com adequada quantidade de oxigênio necessária para as funções metabólicas celulares. As principais causas de anemia envolvem a perda de sangue, a destruição dos eritrócitos e a diminuição ou ausência na sua produção (FELDMAN et al., 2000). Clinicamente, a anemia caracteriza-se por decréscimo do número de eritrócitos, da concentração de hemoglobina e do volume globular (ROBINSON; HUXTABLE, 1988). A avaliação da resposta eritrocitária e leucocitária nos processos hemorrágicos foi investigada, porém, os resultados obtidos tornam o tema ainda motivo de debates e discussões (HOWARD et al., 1998). Winter (1966; 1967) com a realização de nove flebotomias diárias em ovinos observou ao 10º dia os menores valores para hematócrito, concentração de hemoglobina e número de eritrócitos. A resposta eritrocitária da medula óssea iniciou no primeiro dia após a flebotomia e atingiu pico ao nono dia. Porém, os sinais de regeneração nos esfregaços sangüíneos foram observados ao quarto dia com a presença de reticulócitos, anisocitose, eritrócitos policromáticos, aumento do volume corpuscular médio (VCM), da hemoglobina corpuscular média (HCM), da concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) e do número de plaquetas. Após 28 dias houve retorno ao tamanho normal dos Revisão de Literatura 4 eritrócitos sem depleção das reservas de ferro. A perda de granulócitos em relação à perda sangüínea induzida não foi suficiente para modificar significativamente a proporção de maturação granulocítica. De acordo com Jain (1993) a concentração de eritropoetina (EPO) eleva-se rapidamente após a perda de sangue, alcançando concentração máxima em 24 horas e reduz ao terceiro dia, simultaneamente ao aumento do hematócrito e ao início da resposta eritropoética na medula óssea. A perda aguda de sangue determina leucocitose e neutrofilia provocada por desvio do compartimento marginal de neutrófilos para o compartimento circulante, podendo estar associada à linfopenia e à eosinopenia. O número total de leucócitos pode estar aumentado juntamente com a resposta hematopoética pelo estímulo generalizado da medula óssea. Segundo Howard et al. (1998) a retirada de 20% do volume de sangue total em ovinos diminuiu significativamente em 24 horas o número total de eritrócitos, a concentração de hemoglobina e o volume globular. Os sinais de regeneração medular, como a contagem de reticulócitos aumentou no segundo dia, seguida por ponteados basofílicos, policromasia, anisocitose e presença de eritroblastos evidenciados a partir do terceiro dia da retirada de sangue. Elevações no VCM e HCM ocorreram entre seis e 12 horas, e 12 horas após a retirada de sangue, respectivamente, devido à liberação da reserva sangüínea medular e a contração esplênica (TORRINGTON et al., 1989; HOWARD et al., 1998). Aos 12 dias após a retirada de sangue o volume globular e a concentração de hemoglobina retornaram aos valores iniciais. Quanto à resposta leucocitária, houve elevação do número de neutrófilos com inversão da relação neutrófilo:linfócito três horas após a retirada de sangue. A estimulação adrenérgica desencadeada pelo distúrbio hemorrágico determinou o deslocamento do compartimento marginal de neutrófilos para a circulação geral, bem como a mobilização das reservas medulares. Ao terceiro dia houve Revisão de Literatura 5 restabelecimento da relação entre neutrófilos e linfócitos, indicando o fim do período de estresse (HOWARD et al., 1998). A farmacodinâmica da relação entre EPO, reticulócitos e número de eritrócitos foi investigada em ovinos jovens na anemia induzida por perda aguda de sangue determinada em duas flebotomias com intervalo de quatro semanas até o período de recuperação. A flebotomia resultou em elevação rápida da concentração de EPO alcançando valores máximos do terceiro ao oitavo dia, seguido por reticulocitose. A concentração de hemoglobina retornou aos valores iniciais quatro semanas após a flebotomia (CHAPEL et al., 2000; VENG-PEDERSEN et al., 2002). Na indução de anemia fetal em ovinos por retirada de 40% de sangue no período de duas horas, observou-se que a concentração de EPO fetal elevou-se 10 a 20 vezes em relação aos valores normais dentro de 24 horas após a hemorragia. Houve pequeno aumento na produção dos eritrócitos dentro de sete dias após a indução da anemia (ZHANG et al., 2002). Widness et al. (2000) realizaram duas flebotomias em cordeiros durante dois dias consecutivos. Observou-se que a hipóxia tecidual progressiva acompanhou 60% da diminuição da hemoglobina em relação aos valores iniciais, juntamente com o aumento da concentração de EPO e do lactato plasmático dois dias após a primeira flebotomia. Os resultados demonstraram que tanto a EPO como o lactato podem ser indicadores específicos e sensíveis da hipóxia tecidual. Al-Huniti et al. (2004) ao induzirem anemia por perda aguda de sangue em ovinos observaram aumento da concentração plasmática de EPO ao segundo e quarto dias após a flebotomia. A percentagem relativa máxima de contagem de reticulócitos ficou entre 5,5% e 13,7% ao 2,5 e 5,0 dias, respectivamente, após o início da flebotomia. A contagem de reticulócitos retornou aos valores iniciais 10 a 15 dias após a flebotomia. Revisão de Literatura 6 2.2. Estresse oxidativo, lipoperoxidação e anemia O radical livre é qualquer espécie química, átomo, íon ou molécula que contém um número de elétrons não pareado na camada de valência (SINGH; JAISWAL, 1992). Duas propriedades são peculiares aos radicais livres, a alta reatividade e a instabilidade. Os radicais livres possuem vida-média muito curta, podendo reagir com qualquer molécula que esteja próxima ao seu local de formação (ARCHERS, 1993; KIECHLE; MALINSKI, 1993; THOMAS, 2000; PERCÁRIO et al., 2001). O oxigênio é fundamental para o metabolismo celular e para a produção de energia. Porém, uma pequena quantidade de oxigênio consumida é reduzida por vias específicas fornecendo uma variedade de substâncias químicas altamente reativas tais como o óxido nítrico (NO ), o ânion superóxido (O2 - ) e o radical hidroxila (OH- ), além de seus intermediários ou subprodutos como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Coletivamente essas substâncias são chamadas de espécies reativas de oxigênio (ERO) (CHAN et al., 1999; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; LI; KARIN, 1999; WICKENS, 2001; BIESALSKY, 2002). As ERO podem ser benéficas ou nocivas dependendo da concentração, quantidade e da eficácia dos mecanismos antioxidantes (BIESALSKY, 2002). Em indivíduos saudáveis existe um equilíbrio entre a formação e a proteção contra os radicais livres (STENVINKEL, 2003). Se a formação de ERO exceder a capacidade das defesas antioxidantes resultará em estresse oxidativo e lesão em macromoléculas como lipídeos, proteínas e DNA (BIESALSKY, 2002). Portanto, altas concentrações de ERO são citotóxicas e podem estar presentes em condições como inflamação, doenças imunológicas, anemia, uremia e na diminuição da concentração de vitaminas antioxidantes (CHAN et al., 1999; LI; KARIN, 1999; STENVINKEL, 2003). O mecanismo pelo qual a anemia contribui para o estresse oxidativo não está totalmente compreendido, mas a inadequada Revisão de Literatura 7 oxigenação tecidual é acompanhada por aumento na produção de radicais livres determinando alterações no metabolismo celular energético, elevação no catabolismo de catecolaminas e ativação leucocitária (SOMMERBURG et al., 1998; GRUNE et al., 2000; SARADA et al., 2002; STENVINKEL, 2003). O estado pró-oxidante está na dependência da oxigenação do organismo ou célula (HIMMELFARB; HAKIM, 2003). A anemia produz hipóxia devido à limitada capacidade de carrear o oxigênio, reduzindo a tolerância ao exercício, elevando a freqüência respiratória e o metabolismo anaeróbico resultando na produção de lactato (LEWIS et al., 1992; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). Sob essas condições, existe aumento na concentração de catecolaminas e na atividade de enzimas que metabolizam as catecolaminas produzindo mais radicais livres (JIANG; DOWNING, 1990; MOCHIZUKI-ODA et al., 1997). Outras causas da formação de radicais livres envolvem a degradação da purina pela xantina oxidase em condições de reperfusão durante a hipóxia temporária tecidual (KOGURE et al., 1982; LINAS et al., 1990; KOMATSU et al., 1992). A hipóxia altera o metabolismo celular e induz a liberação de mediadores inflamatórios que ativam leucócitos elevando a produção de radicais e oxidantes (MOORE et al., 1996). Vários derivados do oxigênio quando não neutralizados causam lesão em membranas resultando em peroxidação lipídica (SARADA et al., 2002). A lipoperoxidação causada pelas ERO é o processo mais extensivamente estudado (HALLIWELL, 1995; NIELSEN et al., 1997; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; ZWART et al., 1999; WICKENS, 2001; KÜHN; BORCHERT, 2002). A grande quantidade de fosfolipídeos presente nas membranas celulares é alvo fácil e rapidamente afetado quando as ERO são formadas. Estes radicais reagem com ácidos graxos poliinsaturados para formar lipoperóxidos que compõem a cascata de reações degenerativas dos lipídeos (Figura 1) Revisão de Literatura 8 (HALLIWELL, 1995; NIELSEN et al., 1997; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; ZWART et al., 1999; WICKENS, 2001; KÜHN; BORCHERT, 2002). Figura 1 – Efeito dos radicais livres nos constituintes da membrana celular (adaptado por Sjödin et al. 1990). A lipoperoxidação ocorre como uma reação em cadeia dividida em etapas. A etapa de iniciação corresponde ao seqüestro do hidrogênio do ácido graxo poliinsaturado da membrana celular pelo radical hidroxila ou alcoxila formando o radical lipídico. Na etapa de propagação, o radical lipídico reage rapidamente com o oxigênio, resultando em um radical peroxila que por sua vez seqüestra um hidrogênio de um novo ácido graxo poliinsaturado, formando novamente o radical lipídico. A etapa de terminação ocorre quando os radicais lipídico e peroxila produzidos anulam-se (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; GATÉ et al., 1999; ABUJA; ALBERTINI, 2001; DOTAN et al., 2004). Os hidroperóxidos formados podem se decompor em numerosos produtos aldeídos de diferentes comprimentos de cadeia, reativos ao ácido tiobarbitúrico (TBA) (HALLIWEL; GUTERIDGE, 1989; SJÖDIN et al., 1990). O peróxido lipídico formado pode acumular-se até certo grau dentro do órgão ou tecido produzindo redução irreversível da fluidez da membrana, aumentando sua permeabilidade e resultando em perda da integridade da membrana e ruptura da célula (YAGI, 1987; SJÖDIN et al., Revisão de Literatura 9 1990; SINGH; JAISWAL, 1992; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; WICKENS, 2001). Com a destruição celular, o peróxido lipídico é liberado para a circulação sangüínea elevando sua concentração sérica ou plasmática, indicando a ocorrência de lesão de membrana celular. O excesso de peróxidos lipídicos não pode ser excretado na urina e circula no sangue podendo causar lesões em outras células, órgãos e tecidos intactos, possibilitando o desenvolvimento de doenças secundárias (YAGI, 1987). A produção exacerbada de radicais livres é controlada pelo sistema antioxidante eritrocitário, representado por enzimas como a superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, porém, esse mecanismo está diminuído durante a anemia (COSTAGIOLA et al., 1989; GRUNE et al., 2000; STENVINKEL, 2003). A determinação dos radicais livres é extremamente difícil devido à curta vida-média e a tecnologia para detectar diretamente os radicais em sistemas biológicos (JANERO, 1990; HOLLEY; CHEESEMAN, 1996). Devido a esses problemas analíticos relacionados ao estresse oxidativo e do mecanismo de lesão dos radicais livres, utilizam- se os biomarcadores para monitorar o envolvimento na patogênese da lesão. A determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e o malondialdeído (MDA) são os testes mais freqüentemente utilizados para a mensuração da lipoperoxidação de membranas (HALLIWELL, 1995; HOLLEY; CHEESEMAN, 1996; NIELSEN et al., 1997; CERVATO et al., 1999; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999; ZWART et al., 1999; WICKENS, 2001; KÜHN; BORCHERT, 2002). A análise de reação envolvendo as TBARS é o método mais fácil e popular quando se pretende avaliar a lipoperoxidação e a atividade de radicais livres em amostras biológicas (HOLLEY; CHEESEMAN, 1996). Porém, os resultados são expressos em termos de quantidade de MDA produzido em um tempo pré-estabelecido. Mas, o Revisão de Literatura 10 teste não avalia apenas o MDA livre, ele determina o MDA que reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) formado pela decomposição de peróxidos lipídicos durante a fase de aquecimento do teste (HALLIWEL; GUTERIDGE, 1989; DOTAN et al., 2004). Diferentemente das TBARS a metodologia utilizada com o aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) determina com maior precisão e sensibilidade os componentes aldeídos, obtendo-se o MDA livre (WONG et al., 1987; DRAPER; HADLEY, 1990; DRAPER et al., 1993; HOLLEY; CHEESEMAN, 1996; JENTZSCH et al., 1996; KARATAS et al., 2002). 2.3. Anemia e bioquímica sérica Durante a isquemia as células hipóxicas produzem lactato, radicais livres e fatores da inflamação que não são eliminados pela circulação sangüínea e podem causar lesão celular direta. O sistema nervoso central (SNC) é o gatilho da resposta neuroendócrina ao choque que mantém a perfusão sangüínea do coração e do cérebro, diminuindo-a em outros tecidos (DUTTON, 2003). O rim e as glândulas adrenais são os primeiros órgãos a responderem às alterações neuroendócrinas com a produção de renina, angiotensina, aldosterona, cortisol, eritropoetina e catecolaminas (DUTTON, 2003). Os testes de função renal são marcadores da função glomerular e a sua avaliação seqüencial é útil para monitorar o tratamento e a progressão das doenças (MEYER; HARVEY, 1998). A uréia é sintetizada no fígado a partir da amônia que é proveniente do catabolismo de proteínas. Dois processos alteram a concentração de uréia sérica: a taxa de síntese da uréia nos hepatócitos e a taxa de eliminação da uréia pelos rins. A taxa de síntese da uréia depende da função hepática e é influenciada por alterações na dieta ou por catabolismo protéico. A taxa de eliminação depende da taxa de Revisão de Literatura 11 filtração glomerular e da taxa de reabsorção da uréia nos túbulos renais (KANEKO et al., 1997). A creatinina é formada da degradação da creatina nos músculos. Como a uréia, a concentração de creatinina depende da taxa de síntese e de excreção. A taxa de síntese, entretanto é relativamente constante, porém a excreção renal de creatinina é altamente dependente da taxa de filtração glomerular. Diferentemente da uréia a creatinina não é reabsorvida pelos túbulos renais (KANEKO et al., 1997). As concentrações de uréia e de creatinina são mensuradas rotineiramente para detectar doenças que causam azotemia devido à redução da taxa de filtração glomerular (TFG). A diminuição da TFG pode ser resultado de mecanismos pré-renais que causam alteração do fluxo sangüíneo renal como a desidratação, hipovolemia, choque endotóxico ou redução do débito cardíaco (KANEKO et al., 1997). A microcirculação hepática é complexa e sofre lesão de reperfusão no choque. As células hepáticas são metabolicamente ativas e contribuem substancialmente para a resposta inflamatória no choque descompensado (DUTTON, 2003). A circulação compreende dois suprimentos sangüíneos, a artéria hepática e a veia porta que nutre e oxigena o fígado. Esta circulação compreende aproximadamente 80% do fluxo sangüíneo hepático total que libera substâncias absorvidas do trato gastrointestinal e hormônios do pâncreas. A integridade e a função hepática podem ser alteradas secundariamente à insuficiência cardiovascular, anemia, desvio porto-sistêmico e na exposição das bactérias intestinais ou seus produtos quando a barreira intestinal for lesada. O sangue entra na tríade portal e flui através das zonas 1, 2 e 3 antes da veia terminal hepática, sendo que os hepatócitos da zona 3 são mais susceptíveis a condições hipóxicas como na insuficiência cardíaca ou no choque (MEYER; HARVEY, 1998). Os testes mais importantes utilizados para a avaliação hepática em ruminantes são os enzimáticos que detectam lesões de Revisão de Literatura 12 hepatócitos ou colestase (MEYER et al.,1995; LASSEN, 2004). Estes compreendem as enzimas aspartato aminotransferase (AST) e as que aumentam devido à acelerada produção estimulada por redução do fluxo biliar, como a gama-glutamiltransferase (GGT) (MEYER et al., 1995; KANEKO et al., 1997; KERR, 2003; LASSEN, 2004). Alguns fatores devem ser considerados ao avaliar as alterações da atividade sérica das enzimas hepáticas, tais como a localização celular, a atividade e a concentração da enzima nos diferentes tecidos, a quantidade de tecido lesado, o grau de severidade e a presença de processo regenerativo (MEYER et al., 1995; KRAMER; HOFFMANN, 1997; KERR, 2003; LASSEN, 2004). A musculatura esquelética não é metabolicamente ativa durante o choque e tolera a isquemia melhor que outros órgãos. A grande massa muscular esquelética tem importância na produção de radicais livres e lactato pelas células isquêmicas (DUTTON, 2003). O músculo esquelético contém alta atividade de creatinofosfoquinase (CK) e lactato desidrogenase (LDH). A lesão muscular com liberação dessas enzimas é a causa mais comum da elevação plasmática, sendo que a CK é tecido específica e útil na identificação de lesão muscular esquelética. (MEYER; HARVEY, 1998). Objetivos 13 OBJETIVOS Objetivos 14 3. Objetivos 3.1. Objetivos Gerais Avaliar o efeito da anemia por perda aguda de sangue sobre o estresse oxidativo e a lipoperoxidação em ovinos submetidos à flebotomia. 3.2. Objetivos Específicos Avaliar o efeito da anemia por perda aguda de sangue sobre o hemograma, o óxido nítrico, as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, o malondialdeído, o lactato, o cortisol e a bioquímica sérica. Material e Métodos 15 MATERIAL E MÉTODOS Material e Métodos 16 4. Material e métodos 4.1. Local de Execução da Pesquisa A pesquisa foi realizada no Laboratório Clínico Veterinário “Aguemi Kohayagawa” junto ao Departamento de Clínica Veterinária do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu-SP. Colaboraram para a pesquisa o Laboratório de Fisiologia do Exercício (LABEX) da Universidade de Campinas (UNICAMP), Campinas-SP, o Departamento de Nutrição da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), Botucatu-SP, e o Laboratório de Endocrinologia junto ao Departamento de Radiologia Veterinária e Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu-SP. 4.2. Animais Os animais utilizados neste experimento foram provenientes de uma propriedade localizada no município de Araçatuba, Estado de São Paulo. Foram selecionados 10 ovinos mestiços da raça Texel, de seis a oito meses de idade, cinco machos e cinco fêmeas pesando entre 15 e 20 kg, clinicamente sadios. Após a aquisição, os ovinos foram alojados no Hospital Veterinário da FMVZ - UNESP, localizada na cidade de Botucatu, Estado de São Paulo, a 48º52’ longitude oeste, 22º52’ latitude sul, altitude de 756 metros acima do nível do mar, apresentando clima temperado e temperatura média anual de 19ºC, onde foram mantidos durante todo o experimento. Anteriormente ao início das colheitas, os animais foram desverminados1 e passaram por um período de adaptação de 30 dias, quanto à nova alimentação e instalações. 1 Cydectin NF, Fort Dodge. Material e Métodos 17 Os ovinos foram mantidos em baias de piso concretado e alimentados com feno de “coast-cross” (Cynodon dactylon), ração concentrada comercial2 (500g/animal/dia), sal mineral3 e água à vontade. 4.3. Protocolo de indução da anemia Para a indução da anemia foram retirados 30% do volume sangüíneo total de acordo com o cálculo de 8% do peso corpóreo correspondendo ao volume total de sangue. Após um período de 12 horas foi realizada uma segunda flebotomia retirando-se 20% do volume sangüíneo. A retirada de sangue em ambas as flebotomias foi realizada por venipunção jugular utilizando-se agulha hipodérmica (40 x 12) acoplada a um equipo. O animal permaneceu em decúbito lateral direito sobre uma mesa e por ação da gravidade o volume sangüíneo retirado foi quantificado utilizando-se uma proveta graduada. 4.4. Colheita das amostras Considerando-se as flebotomias foram efetuadas colheitas de sangue de todos os ovinos, nos seguintes momentos: - Antes F1: antes da flebotomia; - 6hF1: 6 horas após a primeira flebotomia; - 12hF1+F2: 12 horas após a primeira flebotomia e segunda flebotomia; - 6h: 6 horas após a segunda flebotomia; - 12h: 12 horas após a segunda flebotomia; - 24h: 24 horas após a segunda flebotomia; - 48h: 48 horas após a segunda flebotomia; - 72h: 72 horas após a segunda flebotomia; 2 Cooperativa dos Cafeicultores de São Manuel, SP. 3 Premiphos. Material e Métodos 18 - 4d: quatro dias após a segunda flebotomia; - 5d: cinco dias após a segunda flebotomia; - 6d: seis dias após a segunda flebotomia; - 10d: 10 dias após a segunda flebotomia; - 14d: 14 dias após a segunda flebotomia; - 21d: 21 dias após a segunda flebotomia; - 28d: 28 dias após a segunda flebotomia; Foram obtidos mediante venipunção jugular 5mL de sangue em tubo de colheita a vácuo com anticoagulante4 EDTA a 10% para a realização do hemograma e proteína plasmática total e 10mL de sangue em tubo de colheita a vácuo5 contendo gel coagulante para a obtenção do soro. O soro foi armazenado em “freezer” à temperatura de menos 20ºC até o momento do processamento para a determinação do óxido nítrico, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, malondialdeído, cortisol, lactato e bioquímicos. 4.5. Exames Laboratoriais 4.5.1. Hemograma A hematimetria foi realizada em contador eletrônico de células6. 4.5.2. Contagem de Plaquetas A contagem total de plaquetas foi realizada em contador eletrônico de células6. 4 Hemogard® K3 Vacutainer Systems, Becton Dickinson, England. 5 Vacuum II®, Labnew, São Paulo, Brasil. 6 CELL-DYN 3500 R – Abbott Laboratories, USA. Material e Métodos 19 4.5.3. Contagem de Reticulócitos A contagem de reticulócitos foi realizada em esfregaços sangüíneos corados com azul cresil brilhante de acordo com Jain (1986). 4.5.4. Avaliação morfológica dos eritrócitos A avaliação morfológica dos eritrócitos foi realizada em esfregaços sangüíneos corados para a determinação da anisocitose, policromasia, ponteados basofílicos, corpúsculos de Howell-Jolly e eritroblastos, conforme Jain (1986). 4.5.5. Proteína Total Plasmática A determinação da proteína plasmática total foi realizada por meio da técnica de refratometria7, conforme Jain (1993). 4.5.6. Óxido Nítrico (NO ) A concentração de nitrito sérico que reflete a produção de óxido nítrico foi determinada segundo a reação de Griess, como descrito por Hawkins et al. (1998) e mensurados em leitor de ELISA a 540nm8. 4.5.7. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foram determinadas no Laboratório de Fisiologia do Exercício (LABEX) da Universidade de Campinas (UNICAMP), Campinas-SP, de acordo com Yagi (1987) e a leitura realizada em aparelho de fluoroscopia9. 4.5.8. Malondialdeído sérico (MDA) A dosagem do malondialdeído sérico foi realizada no Departamento de Nutrição da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), 7 Refratômetro ATTAGO Co. 8 Multiscan EX, Labsystems, Finland. 9 Espectrofluorômetro SLM Aminco. SPF 500TM com Nozone. Material e Métodos 20 Botucatu-SP, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)10 em fluoroscopia de acordo com Karatas et al. (2002). 4.5.9. Cortisol sérico As dosagens séricas de cortisol foram determinadas no Laboratório de Endocrinologia junto ao Departamento de Radiologia Veterinária e Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu-SP, por meio da técnica de radioimunoensaio (RIA), em fase sólida, utilizando-se kit comercial11. Não foi realizado qualquer tipo de extração química ou processo de purificação, tendo como elemento radioativo traçador o I125. A leitura foi realizada em contador gama12. 4.5.10. Bioquímica sérica O lactato, a uréia, a creatinina, a atividade da aspartato aminotransferase, da gama-glutamiltransferase, da creatinofosfoquinase e da lactato desidrogenase13 foram determinadas em equipamento de bioquímica seca automatizado14. 4.6. Análise estatística Para a verificação da normalidade do conjunto de dados, foi realizado o Teste de Kolmogorov-Smirnov (CURI, 1997). Para os dados que passaram no Teste de Normalidade, foi utilizado o teste paramétrico de Análise de Variância de Medidas Repetidas, com o objetivo de verificar a existência de diferença entre os momentos avaliados (CURI, 1997). 10 Shymadzu Corporation, Kioto, Japão. 11 Coat-a-Count-Cortisol Diagnostic Products Co., Los Angeles, CA, USA. 12 CobraTM II Auto-Gamma, Packard Instrument Company, Meriden. 13 LAC, UREA, CREA, AST, GGT, CK, LDH Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Johnson-Johnson Company. 14 750 VITROS. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Johnson-Johnson Company. Material e Métodos 21 No caso de diferenças significativas (p<0,05), foram realizadas as comparações entre os momentos por meio do Teste de Comparações Múltiplas de Student-Newman-Keuls (CURI, 1997). A correlação entre o TBARS e o VG foi realizada segundo o teste de correlação de Pearson (CURI, 1997). Em todas as análises o nível de significância utilizado foi de 5%. Para a avaliação dos ponteados basofílicos, corpúsculos de Howell-Jolly e eritroblastos foi realizada a análise descritiva dos dados. Resultados e Discussão 22 RESULTADOS E DISCUSSÃO Resultados e Discussão 23 5. Resultados e Discussão 5.1. Considerações gerais As escolhas da espécie, raça e idade dos animais basearam-se na ausência de literatura sobre a influência da anemia na produção de radicais livres e lipoperoxidação em ovinos, além de contribuir para o entendimento da resposta à perda aguda de sangue. A idade influencia a resposta à perda aguda de sangue, sendo que os animais jovens apresentam melhor resposta à anemia do que adultos (JAIN, 1993; FELDMAN et al., 2000). Além desse fator, o tamanho reduzido e a facilidade do manejo auxiliaram na escolha dos animais. Os ovinos da raça Texel e mestiços Texel estão recentemente sendo introduzidos na região e utilizados para a produção de carne em confinamentos, o que possibilita o estudo de uma raça que está em expansão no Estado de São Paulo. A metodologia empregando-se os contadores eletrônicos de células permitiu a avaliação de novos indicadores recentemente utilizados na Patologia Clínica Veterinária. A distribuição do diâmetro dos eritrócitos (DDE), o volume plaquetário (VP), volume plaquetário médio (VPM) e a distribuição do diâmetro das plaquetas (DDP) foram avaliados e auxiliaram no estudo da resposta às anemias por perda aguda de sangue em ovinos. A realização da bioquímica sérica utilizando a química seca com o emprego de equipamento automatizado é nova na Medicina Veterinária e determina valores com grande rapidez para várias espécies animais. Por ser uma metodologia recente, não existem valores de referência para animais jovens mestiços da raça Texel. Uma das preocupações surgidas durante a realização do delineamento experimental foi à definição do volume de sangue a ser retirado na flebotomia. A opção da retirada de 30% e 20% do volume Resultados e Discussão 24 sangüíneo com período de 12 horas não foi encontrada na literatura consultada. Não se optou por nenhum tipo de reposição de líquidos, solução fisiológica ou plasma, concomitantes à retirada de sangue total. Os resultados demonstraram que o intervalo de tempo de 12 horas entre as flebotomias foi suficiente para a reposição da volemia, não sendo necessário em nenhum dos animais e em momento algum, qualquer tipo de tratamento. 5.2. Observações clínicas Apesar do exame clínico não ter sido realizado durante o experimento, os animais foram diariamente observados nos períodos da manhã e tarde por ocasião da alimentação. Não foram observadas alterações comportamentais como depressão e decúbito lateral permanente em nenhum dos animais do experimento. Todos apresentaram apetite e comportamento normais durante o período de avaliação. Os ovinos foram mantidos em baias com restrição do exercício, boa alimentação e água à vontade. A administração de vermífugo no início do experimento manteve em níveis mínimos aceitáveis (300 OPG), a infestação parasitária por nematódeos gastrointestinais. Resultados e Discussão 25 5.3. Hemograma 5.3.1. Eritrograma e Proteína Total Plasmática O transporte de líquidos para a reposição da volemia causou decréscimo do número de eritrócitos, concentração de hemoglobina, volume globular e concentração de proteína plasmática total seis horas após a retirada de 30% do volume sangüíneo (primeira flebotomia). Após 12 horas houve redução de 37,51% para o número de eritrócitos, 37,19% na concentração de hemoglobina e 37,11% no volume globular (Tabela 1 e Figuras 2 e 3). A partir da segunda flebotomia com a retirada de 20% do volume sangüíneo, observou-se após 12 horas (12h) acentuada redução do número de eritrócitos, concentração de hemoglobina e volume globular de 53,30%, 52,80% e 53,98%, respectivamente. A concentração de proteína total diminuiu 24,74% e 27,53%, seis horas após a primeira flebotomia (6hF1) e seis horas após a segunda flebotomia (6h), respectivamente. A anemia foi observada seis horas após a primeira flebotomia (6hF1) e acentuou-se 12 horas após a segunda flebotomia (12h) de acordo com os valores de referência determinados por Feldman et al. (2000). Alterações na avaliação da anisocitose, policromasia e presença de reticulócitos indicando sinais de regeneração medular foram evidentes 48 horas após a segunda flebotomia (48h). Re su lta do s e D isc us sã o 26 Ta be la 1 - V al or es m éd io s e de sv io s- pa dr ão ( X ±s ) do n úm er o de e rit ró ci to s (x 10 6 /µ L) , c on ce nt ra çã o de h em og lo bi na ( g/ dL ), do v ol um e gl ob ul ar ( % ), vo lu m e co rp us cu la r m éd io ( fL ), he m og lo bi na c or pu sc ul ar m éd ia ( pg ), co nc en tra çã o de h em og lo bi na c or pu sc ul ar m éd ia ( g/ dL ), di st rib ui çã o do d iâ m et ro d os e rit ró ci to s (% ), co nt ag em d e re tic ul óc ito s (x 10 6 /µ L) e c on ce nt ra çã o de p ro te ín a to ta l p la sm át ic a (g /d L) d e ov in os m es tiç os T ex el , i m ed ia ta m en te a nt es d a fle bo to m ia (A nt es F1 ), 6h ( 6h F1 ) e 12 h ap ós a p rim ei ra fl eb ot om ia ( 12 hF 1+ F2 ), 6h ( 6h ), 12 h (1 2h ), 24 h (2 4h ), 48 h (4 8h ), 72 h (7 2h ), 4 di as ( 4d ), 5 di as ( 5d ), 6 di as ( 6d ), 10 d ia s (1 0d ), 14 d ia s (1 4d ), 21 d ia s (2 1d ) e 2 8 di as (2 8d ) a pó s a se gu nd a fle bo to m ia . Er itr og ra m a R et ic ul óc ito s Pr ot eí na M om en to s R B C (x 10 6 /µ L) H b (g /d L) VG (% ) VC M (f L) H C M (p g) C H C M (g /d L) D D E (% ) x1 06 /µ L PT P (g /d L) An te s F1 10 ,4 5a ± 1, 29 11 ,5 9a ± 1, 00 33 ,7 9a ± 3, 01 33 ,0 4de ±1 ,8 9 11 ,1 6d ± 0, 79 34 ,2 8b ± 0, 61 23 ,8 6ab cd ±1 ,7 0 0, 00 2c ± 0, 00 4 5, 74 a ± 0, 39 6h F1 6, 67 e ± 1, 11 7, 42 c ± 0, 98 21 ,3 0de f ± 2, 90 32 ,1 5e ± 2, 21 11 ,2 2d ± 0, 80 34 ,8 6b ± 0, 49 21 ,5 5cd e ± 1, 86 0, 00 3c ± 0, 00 8 4, 32 f ± 0, 36 12 hF 1+ F2 6, 53 e ± 1, 18 7, 28 cd ±1 ,1 4 21 ,2 5de f ± 3, 41 32 ,7 3e ± 2, 14 11 ,2 5d ± 0, 78 34 ,3 0b ± 0, 51 21 ,1 3de ±1 ,7 0 0, 00 7c ± 0, 01 2 4, 59 e ± 0, 40 6h 5, 20 gh ±0 ,8 3 5, 90 ef g ± 0, 81 16 ,6 6gh ±2 ,3 1 32 ,2 0e ± 2, 13 11 ,4 2cd ±0 ,8 7 35 ,4 0ab ±0 ,9 31 21 ,3 2cd e ± 2, 01 0, 00 7c ± 0, 01 8 4, 16 f ± 0, 22 12 h 4, 88 h ± 0, 81 5, 47 g ± 0, 89 15 ,5 5h ± 2, 17 32 ,0 7e ± 2, 35 11 ,4 2cd ±0 ,8 5 35 ,5 8ab ±0 ,5 8 20 ,6 8e ± 2, 05 0, 00 8c ± 0, 00 8 4, 18 f ± 0, 41 24 h 4, 90 h ± 0, 98 5, 77 fg ±0 ,7 8 15 ,9 1gh ±2 ,8 0 32 ,7 3e ± 2, 83 12 ,0 2ab cd ±1 ,6 2 36 ,6 7a ± 3, 73 20 ,5 5e ± 1, 13 0, 02 0c ± 0, 05 4 4, 30 f ± 0, 25 48 h 5, 17 gh ±0 ,8 1 6, 23 de fg ±0 ,7 0 17 ,4 7g ± 2, 27 34 ,9 7cd e ± 2, 66 12 ,1 9ab c ± 1, 48 35 ,8 2ab ±1 ,5 7 20 ,5 1e ± 1, 63 0, 07 7b ± 0, 05 0 4, 70 e ± 0, 25 72 h 5, 55 fg ±0 ,7 4 6, 81 cd ef ±0 ,7 6 19 ,6 0f ± 2, 30 35 ,5 0ab c ± 2, 51 12 ,3 3ab ±1 ,0 0 34 ,7 4b ± 0, 65 21 ,2 9cd e ± 2, 17 0, 16 6a ± 0, 06 3 4, 94 d ± 0, 32 4d 5, 76 f ± 0, 68 7, 26 cd e ± 0, 58 20 ,7 6ef ±2 ,0 0 36 ,2 5ab ±2 ,6 1 12 ,6 9a ± 1, 11 35 ,0 9b ± 2, 48 22 ,5 1bc de ±2 ,4 7 0, 15 2a ± 0, 10 7 4, 97 d ± 0, 35 5d 6, 24 e ± 0, 65 7, 73 c ± 0, 54 22 ,4 4de ±1 ,6 6 36 ,1 2ab ±2 ,6 0 12 ,4 5ab ±0 ,9 9 34 ,4 7b ± 0, 59 23 ,1 4bc de ±2 ,4 3 0, 06 5b ± 0, 05 3 5, 23 c ± 0, 36 6d 6, 28 e ± 0, 59 7, 87 c ± 0, 57 22 ,6 3d ± 1, 67 36 ,1 6ab ±2 ,6 6 12 ,5 9a ± 1, 06 34 ,8 2b ± 0, 48 26 ,1 9a ± 5, 46 0, 04 9bc ±0 ,0 52 4, 90 d ± 0, 32 10 d 7, 75 d ± 0, 76 9, 43 b ± 0, 71 27 ,2 6c ± 1, 97 35 ,2 9ac ±2 ,7 2 12 ,2 1ab c ± 1, 05 34 ,6 0b ± 0, 53 25 ,1 6ab ±4 ,1 7 0, 00 5c ± 0, 00 6 5, 25 bc ±0 ,3 7 14 d 8, 70 c ± 0, 65 10 ,2 0b ± 0, 68 30 ,1 0b ± 1, 75 34 ,6 8bc d ± 2, 42 11 ,7 6bc d ± 0, 97 33 ,9 1b ± 0, 52 24 ,3 2ab c ± 3, 13 0, 00 0c ± 0, 00 0 5, 36 bc ±0 ,3 5 21 d 9, 95 b ± 0, 71 11 ,3 7b ± 0, 75 33 ,0 4a ± 1, 89 33 ,3 1de ±2 ,1 1 11 ,4 4cd ±0 ,7 9 34 ,3 5b ± 0, 41 24 ,1 4ab cd ±2 ,0 8 0, 00 0c ± 0, 00 0 5, 72 a ± 0, 27 28 d 10 ,0 7ab ±0 ,6 2 11 ,4 1a ± 0, 71 32 ,5 3a ± 1, 71 32 ,3 7de ±1 ,8 2 11 ,3 4d ± 0, 75 35 ,0 2b ± 0, 61 23 ,5 7ab cd e ± 1, 90 0, 00 1c ± 0, 00 3 5, 52 b ± 0, 19 a P ar a le tra s ig ua is n ão h á di fe re nç a si gn ifi ca tiv a (p <0 ,0 5) e nt re o s m om en to s. Resultados e Discussão 27 Os mecanismos de reposição de líquidos induziram a hemodiluição num período de 12 horas após a segunda flebotomia caracterizada pelos menores valores do número de eritrócitos, concentração de hemoglobina e do volume globular. Porém, não houve aumento no VCM, HCM, CHCM, DDE e número de reticulócitos. O VCM e o DDE não aumentaram após à perda de sangue porque a pequena quantidade de reticulócitos liberados da medula óssea não foi suficiente para determinar sua elevação (MEYER; HARVEY, 1998). Segundo Howard et al. (1998) três horas após a retirada de 20% do volume sangüíneo houve redução significativa do número de eritrócitos, concentração de hemoglobina e volume globular com os menores valores observados após 24 horas. Os resultados desse experimento diferiram de Howard et al. (1998) que relacionaram a causa da elevação do HCM e VCM entre seis horas e 12 horas após a perda de sangue em ovinos, à liberação de eritrócitos imaturos e de maior diâmetro pela contração esplênica devido ao estímulo adrenérgico e liberação das reservas medulares de eritrócitos. Após a perda aguda de sangue, ocorrem alterações nos sistemas cardiovascular e respiratório com ativação de respostas neuroendócrinas compensatórias para a reposição da volemia. A restauração do volume plasmático ocorre com o movimento de líquido do espaço intersticial para a circulação, ingestão de água, redução da perda de água e sódio no sistema renal e absorção de líquido no trato digestório (MALIKIDES et al., 2001). A redução da pressão arterial, pressão capilar e o decréscimo do volume sangüíneo causam intensa atividade simpática dentro de segundos após a perda de sangue. Essa resposta é mediada por barorreceptores (presentes arco aórtico e seio carotídeo) e quimiorreceptores causada inicialmente pela liberação de catecolaminas Resultados e Discussão 28 da medula adrenal resultando em alterações cardíacas e vasculares (MALIKIDES et al., 2001). O reflexo barorreceptor e o reflexo receptor de volume atrial atuam juntos e em poucos segundos restauram a pressão sangüínea após a perda de sangue. Outros mecanismos compensatórios entram em atividade minutos a horas após a hemorragia a fim de restaurar o volume de sangue perdido (CUNNINGHAM, 2004). A hemorragia reduz a pressão sangüínea e a pressão hidrostática e oncótica, favorecendo a reabsorção de líquidos para os capilares sangüíneos. Porém, o líquido do espaço intersticial não possui células ou proteínas, diluindo os constituintes sangüíneos causando redução do volume globular e da concentração de proteínas plasmáticas, fenômeno conhecido como hemodiluição (CUNNINGHAM, 2004). O aumento da atividade simpática associada à redução da pressão arterial atua nos rins estimulando a liberação de renina que atua em conjunto com a angiotensina e a aldosterona para diminuir a excreção de sódio renal. Os reflexos barorreceptor e de volume atrial também estimulam a hipófise a secretar o hormônio antidiurético (ADH) que reabsorve maior quantidade de água no néfron distal. Esses mecanismos conservam o volume de sangue, mas não restabelecem o volume sangüíneo normal. A restauração do volume requer ingestão de água que é estimulada por barorreceptores e receptores de volume atrial que atuam no hipotálamo e no centro da sede. A reposição dos líquidos devido à ingestão de água ocorre dentro de dois a três dias. A compensação final inclui a reposição das células sangüíneas e proteínas plasmáticas perdidas (CUNNINGHAM, 2004). Após 24 horas da segunda flebotomia (24h) iniciou-se a elevação do número de eritrócitos, da concentração de hemoglobina e do volume globular, sendo mais intenso após 48 horas da segunda flebotomia (48h) com a presença dos reticulócitos, anisocitose e policromasia indicando início da resposta eritropoética observada na Resultados e Discussão 29 circulação sangüínea periférica (Tabelas 1 e 2; Figura 4). A maior concentração de reticulócitos foi observada 72 horas (72h) após a segunda flebotomia e reduziu posteriormente até 10 dias (10d). Os ponteados basofílicos foram encontrados em maior concentração 48 horas (48h), 72 horas (72h) e quatro dias (4d), e em pequena quantidade aos cinco dias após a segunda flebotomia (5d). Os corpúsculos de Howel-Jolly e os eritroblastos foram observados em pequena quantidade 24 horas (24h), 48 horas (48h) e 72 horas (72h) após a segunda flebotomia. Com a redução do número dos eritrócitos e conseqüente diminuição da oxigenação tecidual e desenvolvimento de hipóxia, há estímulo para a produção de eritropoetina (EPO) sintetizada pelas células adjacentes aos túbulos proximais renais. A EPO é o principal fator de regulação das células progenitoras eritróides e exerce seu efeito sobre as células alvo da medula óssea interagindo com receptores específicos da superfície celular. Na medula óssea a EPO age sobre o compartimento de células progenitoras conhecido como células formadoras de colônia eritróide (CFU-E) multiplicando o número de eritrócitos e promovendo seu desenvolvimento para eritrócitos maduros (ADAMSON, 1996; ERSLEV, 1991). Em ovinos, a liberação de EPO inicia-se 24 horas após a perda de sangue, alcançando valores máximos ao terceiro e oitavo dia (CHAPEL et al., 2000; VENG-PEDERSEN et al., 2002). Eritrócitos imaturos e policromasia estão ausentes no sangue periférico de ovinos sadios e a resposta reticulocitária depende da magnitude da perda sangüínea e da idade do animal (JAIN, 1993; FELDMAN et al., 2000). A presença de reticulócitos é observada a partir do terceiro dia da perda de sangue (MEYER; HARVEY, 1998) e de acordo com Winter (1967) o número aumenta rapidamente até cinco dias, desaparecendo 21 dias após a perda de sangue acompanhada por alterações no VCM, HCM, CHCM e número de plaquetas. Resultados e Discussão 30 A reticulocitose ou policromasia são os melhores indicadores de intensa eritropoese. A resposta regenerativa com policromasia é esperada na anemia por perda aguda de sangue, especialmente em animais jovens (FELDMAN et al., 2000). A magnitude da resposta reticulocitária em ruminantes é menor que em cães e gatos. Portanto a presença de alguns reticulócitos é suficiente para evidenciar resposta regenerativa nesta espécie (FELDMAN et al., 2000). A presença de anisocitose, policromasia e ponteados basofílicos em animais anêmicos indicam aumento na porcentagem de reticulócitos e intensa resposta regenerativa medular (MEYER; HARVEY, 1998; FELDMAN et al., 2000). O VCM e o DDE devem ser avaliados em conjunto, pois refletem alterações na população eritrocitária. O VCM avalia o diâmetro dos eritrócitos e o DDE o grau de variação do diâmetro dos eritrócitos. Para que o DDE se altere é necessária uma quantidade considerável de eritrócitos grandes. O VCM alterou-se primeiramente aos quatro dias (4d) em relação ao DDE, seis dias (6d), porém, o VCM permaneceu dentro dos valores de referência citados por Feldman et al. (2000) durante todo o experimento. Resultados e Discussão 31 Tabela 2 – Valores médios e desvios padrão ( X ±s) avaliação da anisocitose e policromasia em esfregaços sangüíneos corados e graduados por escore, volume globular (VG) e contagem de reticulócitos (x106/µL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Momentos Anisocitose Policromasia VG (%) Reticulócitos x106/µL Antes F1 0,00f±0,00 0,00c±0,00 33,79a±3,01 0,002c±0,004 6hF1 0,00f±0,00 0,00c±0,00 21,30def±2,90 0,003c±0,008 12hF1+F2 0,00f±0,00 0,00c±0,00 21,25def±3,41 0,007c±0,012 6h 0,00f±0,00 0,00c±0,00 16,66gh±2,31 0,007c±0,018 12h 0,00f±0,00 0,00c±0,00 15,55h±2,17 0,008c±0,008 24h 0,10f±0,32 0,20c±0,42 15,91gh±2,80 0,020c±0,054 48h 1,00bc±0,67 1,00b±0,67 17,47g±2,27 0,077b±0,050 72h 1,70a±0,48 1,70a±0,48 19,60f±2,30 0,166a±0,063 4d 1,80a±0,42 1,80a±0,42 20,76ef±2,00 0,152a±0,107 5d 1,80a±0,42 1,80a±0,42 22,44de±1,66 0,065b±0,053 6d 1,00bc±0,67 0,80b±0,79 22,63d±1,67 0,049bc±0,052 10d 0,50de±0,53 0,00c±0,00 27,26c±1,97 0,005c±0,006 14d 0,70cd±0,48 0,00c±0,00 30,10b±1,75 0,000c±0,000 21d 0,20ef±0,42 0,00c±0,00 33,04a±1,89 0,000c±0,000 28d 0,00f±0,00 0,00c±0,00 32,53a±1,71 0,001c±0,003 aPara letras iguais não há diferença significativa (p<0,05) entre os momentos. Graduação por escore sendo: 0 = negativa; 1 = + Leve; 2 = ++ Moderada; 3 = +++ Acentuada; Nos últimos anos, aumentou o interesse na utilização da análise computadorizada do DDE como auxílio diagnóstico. No homem, esta técnica é de valor na quantificação da anisocitose e tem sido usada para identificar e avaliar o comportamento de várias anemias macrocíticas e microcíticas. Esta tecnologia tem sido cada vez mais utilizada na moderna prática veterinária (WEISSER, 1982; WEISSER; KOCIBA, 1983). Aos 28 dias após a segunda flebotomia (21d) o número de eritrócitos, concentração de hemoglobina, volume globular, VCM, HCM Resultados e Discussão 32 e proteína plasmática total retornaram aos valores iniciais (Antes F1). Isso difere dos relatados de Meyer; Harvey (1998) em que a concentração de proteína plasmática total retornou mais rapidamente aos valores iniciais, sendo que mais tempo foi requerido para o retorno do volume globular. 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos Va lo re s 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 Va lo re s Eritrócitos x 1.000.000/mL Hemoglobina (g/dL) Volume Globular (%) PPT (g/dL) (x10) Figura 2 – Gráfico representativo dos valores médios ( X ) do número de eritrócitos (x106/µL), concentração de hemoglobina (g/dL), volume globular (%) e concentração de proteínas plasmáticas totais (g/dL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Resultados e Discussão 33 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos V al or es 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 V al or es VCM (fL) HCM (pg) CHCM (g/dL) DDE (%) Figura 3 – Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do volume corpuscular médio (fL), hemoglobina corpuscular média (pg), concentração de hemoglobina corpuscular média (g/dL), distribuição do diâmetro dos eritrócitos (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos V al or es 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 V al or es Anisocitose (x10) DDE (%) Reticulócitos (1000/mL) Policromasia (x10) Volume Globular (%) Figura 4 – Gráfico representativo dos valores médios ( X ) da avaliação da anisocitose, distribuição do diâmetro dos eritrócitos (%), número absoluto de reticulócitos (x106/µL), policromasia e volume globular (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Resultados e Discussão 34 5.3.2. Plaquetas, volume plaquetário (VP), volume plaquetário médio (VPM) e distribuição do diâmetro das plaquetas (DDP) A retirada de 30% seguida por 20% do volume sangüíneo total com intervalo de 12 horas foi suficiente para determinar trombocitopenia (Tabela 3 e Figuras 5 e 6) devido à hemodiluição, de acordo com os valores de referência de Feldman et al. (2000). Após 24 horas da segunda flebotomia (24h) o número de plaquetas aumentou, porém, aos 28 dias após a segunda flebotomia (28d) não havia retornado aos valores observados inicialmente (Antes F1). As variações mais importantes observadas durante o experimento incluíram a contagem total do número de plaquetas e o volume plaquetário. O VPM e o DDP se alteraram significativamente ao longo do experimento, porém sem importância clínica. Depois dos eritrócitos as plaquetas são as mais numerosas células circulantes no sangue, sendo essenciais para a coagulação, manutenção da integridade e controle da hemostasia. Essas pequenas células anucleadas originam-se da fragmentação do citoplasma de megacariócitos maduros presentes na medula óssea. Os maiores fatores responsáveis pela regulação da megacariocitopoese e trombocitopoese incluem o fator estimulador de colônia megacariocítica (MK-CSF), fator estimulador de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF), interleucina-3, interleucina-6, interleucina-1, eritropoetina e trombopoetina. Trombocitopenia leve a moderada pode ocorrer após a perda aguda de sangue, sendo reversível sem necessidade de tratamento (MEYER; HARVEY, 1998; FELDMAN et al., 2000). A utilização de contadores automáticos de células proporcionou a obtenção de valores plaquetários específicos que incluem o volume plaquetário (VP), volume plaquetário médio (VPM) e a distribuição do diâmetro das plaquetas (DDP). Resultados e Discussão 35 Tabela 3 - Valores médios e desvios padrão ( X ±s) do número de plaquetas (x103/µL), volume plaquetário (%), volume plaquetário médio (fL) e distribuição do diâmetro das plaquetas (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Momentos Plaquetas (x103/µL) VP (%) VPM (fL) DDP (%) Antes F1 1255,60a±298,52 0,57a±0,14 4,76a±0,40 19,3a±1,15 6hF1 701,70ef±177,27 0,29cd±0,07 4,15b±0,35 17,2c±0,73 12hF1+F2 689,60ef±182,04 0,28cd±0,08 4,05b±0,34 16,8c±0,66 6h 561,30g±155,67 0,23d±0,06 4,03b±0,41 17,1c±0,78 12h 555,30g±153,88 0,24d±0,06 4,26b±0,44 16,8c±0,47 24h 599,20fg±123,45 0,25cd±0,05 4,19b±0,48 17,0c±0,49 48h 766,20e±186,47 0,31c±0,06 4,12b±0,37 17,1c±0,61 72h 925,10cd±217,12 0,39b±0,08 4,25b±0,42 17,2c±0,54 4d 1022,20bcd±202,99 0,43b±0,09 4,22b±0,45 17,5c±0,72 5d 1073,20b±207,50 0,44b±0,10 4,11b±0,44 17,3c±0,59 6d 1058,50bc±212,53 0,43b±0,09 4,07b±0,34 17,3c±0,61 10d 1045,90bc±271,49 0,42b±0,12 4,05b±0,32 17,6c±0,81 14d 941,50bcd±170,56 0,39b±0,08 4,09b±0,38 18,3b±1,14 21d 1008,00bcd±243,39 0,43b±0,12 4,07b±0,39 19,1ab±1,47 28d 888,80d±182,52 0,40b±0,09 4,21b±0,29 19,0ab±1,18 aPara letras iguais não há diferença significativa (p<0,05) entre os momentos. O volume plaquetário é mensurado pelos analisadores hematológicos eletrônicos e representa a porcentagem do volume de sangue ocupado pelas plaquetas (STOCKHAM; SCOTT, 2002). O volume plaquetário médio (VPM) é a estimativa do tamanho das plaquetas (fL) realizada pelo contador eletrônico de células e pode ser uma informação útil em animais trombocitopênicos. O aumento do VPM sugere aumento da trombopoese (STOCKHAM; SCOTT, 2002). Resultados e Discussão 36 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos Pl aq ue ta s x1 0 3 / µ L 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 % Plaquetas PCT (%) Figura 5 – Gráfico representativo dos valores médios ( X ) do número de plaquetas (x103/µL) e volume plaquetário (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos fL 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 % VPM (fL) PDW (%) Figura 6 – Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do volume plaquetário médio (fL) e distribuição do diâmetro das plaquetas (%) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Resultados e Discussão 37 O PDW representa o índice de variação do tamanho das plaquetas (MEYER; HARVEY, 1998; FELDMAN et al., 2000; STOCKHAM; SCOTT, 2002; LATIMER et al., 2003). De acordo com Winter (1967) o número de plaquetas no sangue periférico elevou-se após quatro a cinco dias seguidos ao início da perda sangüínea e retornou ao aos valores iniciais após 31 dias. As alterações no número de plaquetas e no volume plaquetário estão relacionadas, da mesma maneira descrita para os eritrócitos, com a hemodiluição causada pela reposição da volemia após a retirada de sangue. A resposta medular com aumento na produção de plaquetas foi evidente após 48 horas da segunda flebotomia (48h) diferindo dos observados por Winter (1967). Resultados e Discussão 38 5.3.3. Leucograma A perda aguda de sangue determinada pela flebotomia promoveu alterações na concentração de cortisol e no número total de leucócitos, neutrófilos segmentados, monócitos e eosinófilos (Tabela 4 e Figuras 7, 8 e 9). Seis horas (6h) e 12 horas após a primeira flebotomia (12h) e seis horas após a segunda flebotomia (6h) observou-se o aumento nas concentrações de cortisol. As maiores concentrações de cortisol coincidiram com as elevações do número total de leucócitos, neutrófilos e monócitos, com a inversão da relação neutrófilo:linfócito e com a redução dos eosinófilos. Porém, durante todo o experimento os valores do leucograma permaneceram dentro do intervalo de referência citados por Feldman et al. (2000). A anemia causa estímulo ao sistema nervoso central (SNC) iniciando a resposta neuroendócrina, mantendo a perfusão sangüínea no coração e no cérebro e diminuindo em outros tecidos. O rim e as glândulas adrenais são os primeiros órgãos a responderem às alterações neuroendócrinas com a produção de renina, angiotensina, aldosterona, vasopressina, hormônio do crescimento, glucagon, cortisol, eritropoetina e catecolaminas (DUTTON, 2003). A excitação produz liberação de epinefrina induzindo leucocitose fisiológica caracterizada por neutrofilia, aumento de linfócitos e monócitos e redução de eosinófilos (FELDMAN et al., 2000). Sob condições de estresse, há liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) pela glândula pituitária anterior o qual estimula o córtex adrenal a aumentar a síntese e a secreção de cortisol, elevando a concentração sérica (ROTH; KAEBERLE, 1982). A dosagem de cortisol em amostras colhidas antes, durante e após um período de estresse em grandes animais, de maneira geral, pode fornecer importantes informações sobre a magnitude dessa condição (STOTT, 1981). Resultados e Discussão 39 Alterações relacionadas ao estresse em ruminantes incluem leucocitose, neutrofilia, linfopenia, eosinopenia e monocitose (FELDMAN et al., 2000). De acordo com Howard et al. (1998) três horas após a perda aguda de sangue houve elevação do número de leucócitos e inversão da relação neutrófilo:linfócito. Após três dias a relação neutrófilo:linfócito retornou aos valores iniciais. Diferentemente de Howard et al. (1998), após 24 horas da segunda flebotomia o leucograma, a relação neutrófilo:linfócito e a concentração de cortisol retornaram aos valores observados no início do experimento indicando o término do período de estresse causado pela perda aguda de sangue. As observações deste experimento estão de acordo com a ação da alta concentração de cortisol sobre a medula óssea e sobre os neutrófilos presentes na circulação sangüínea. Na medula óssea, o cortisol tem o efeito de promover a liberação dos neutrófilos segmentados do compartimento de estocagem, determinando elevação dos leucócitos circulantes. Nos leucócitos presentes na circulação periférica, o cortisol diminui a expressão das moléculas de adesão na superfície dos neutrófilos, reduzindo sua ligação com as células endoteliais. Com isso, ocorre diminuição do número de neutrófilos do compartimento marginal e aumento no compartimento circulante (MADDUX; KEETON, 1987). Segundo Roth; Kaeberle (1982) os glicocorticóides têm efeito incerto na cinética dos monócitos bovinos induzindo monocitose ou não produzindo alterações. Re su lta do s e D isc us sã o 40 Ta be la 4 – V al or es m éd io s e de sv io s- pa dr ão ( X ±s ) da c on ce nt ra çã o sé ric a de c or tis ol ( ng /m L) , do n úm er o to ta l de l eu có ci to s (x 10 3 /µ L) , ne ut ró fil os se gm en ta do s (x 10 3 /µ L) , l in fó ci to s (x 10 3 /µ L) , m on óc ito s (x 10 3 /µ L) , e os in óf ilo s (x 10 3 /µ L) , b as óf ilo s (x 10 3 /µ L) e re la çã o ne ut ró fil o lin fó ci to (N :L ) d e ov in os m es tiç os Te xe l, im ed ia ta m en te a nt es d a fle bo to m ia ( An te s F1 ), 6h ( 6h F1 ) e 12 h ap ós a p rim ei ra fl eb ot om ia ( 12 hF 1+ F2 ), 6h ( 6h ), 12 h (1 2h ), 24 h (2 4h ), 48 h (4 8h ), 72 h (7 2h ), 4 di as (4 d) , 5 d ia s (5 d) , 6 d ia s (6 d) , 1 0 di as (1 0d ), 14 d ia s (1 4d ), 21 d ia s (2 1d ) e 2 8 di as (2 8d ) a pó s a se gu nd a fle bo to m ia . C or tis ol Le uc og ra m a x1 03 /µ l R el aç ão M om en to s (n g/ m L) Le uc óc ito s N . S eg to s. Li nf óc ito s M on óc ito s Eo si nó fil os B as óf ilo s N :L A nt es F 1 21 ,7 6bc ±1 0, 95 5, 68 ef ±1 ,7 0 1, 88 de f ± 0, 82 3, 69 a ± 1, 31 0, 03 c ± 0, 01 0, 07 bc ±0 ,0 5 0, 01 c ± 0, 01 0, 54 cd e ± 0, 22 6h F1 23 ,2 6b ± 11 ,8 3 7, 47 bc d ± 2, 44 3, 77 b ± 1, 37 3, 63 a ± 1, 81 0, 05 bc ±0 ,0 2 0, 02 f ± 0, 02 0, 01 c ± 0, 01 1, 21 b ± 0, 54 12 hF 1+ F2 38 ,6 5a ± 19 ,8 2 7, 86 ab c ± 2, 20 3, 09 c ± 1, 55 4, 59 a ± 1, 89 0, 11 ab c ± 0, 10 0, 04 de f ± 0, 02 0, 03 ab c ± 0, 01 0, 78 c ± 0, 53 6h 37 ,9 3a ± 26 ,6 6 8, 70 a ± 2, 73 4, 99 a ± 1, 37 3, 49 a ± 1, 49 0, 16 a ± 0, 11 0, 02 f ± 0, 01 0, 04 ab ±0 ,0 2 1, 59 a ± 0, 50 12 h 21 ,9 8bc ±1 1, 13 8, 13 ab ±2 ,1 8 4, 18 b ± 1, 66 3, 73 a ± 1, 33 0, 16 a ± 0, 12 0, 03 de f ± 0, 02 0, 03 bc ±0 ,0 2 1, 22 b ± 0, 51 24 h 22 ,4 5bc ±1 2, 26 6, 71 cd ef ±2 ,3 7 2, 51 cd ±1 ,6 8 3, 93 a ± 1, 10 0, 19 a ± 0, 08 0, 05 cd e ± 0, 03 0, 03 ab c ± 0, 02 0, 64 cd ±0 ,3 2 48 h 16 ,7 1bc ±8 ,8 4 7, 03 bc de ±1 ,7 3 2, 14 de f ± 0, 67 4, 59 a ± 1, 27 0, 17 a ± 0, 14 0, 07 bc d ± 0, 04 0, 06 a ± 0, 06 0, 49 cd e ± 0, 16 72 h 14 ,5 1bc ±1 0, 63 5, 72 ef ±1 ,6 9 1, 48 ef ±0 ,5 5 4, 08 a ± 1, 28 0, 09 ab c ± 0, 08 0, 05 cd e ± 0, 03 0, 03 bc ±0 ,0 2 0, 37 de ±0 ,1 2 4d 11 ,5 8bc ±7 ,4 9 5, 96 ef ±1 ,3 7 1, 24 f ± 0, 35 4, 55 a ± 1, 10 0, 09 ab c ± 0, 11 0, 05 cd e ± 0, 02 0, 03 bc ±0 ,0 3 0, 28 e ± 0, 07 5d 10 ,7 8bc ±1 1, 38 5, 90 ef ±1 ,6 0 1, 33 ef ±0 ,5 7 4, 35 a ± 1, 25 0, 13 ab c ± 0, 08 0, 06 cd ±0 ,0 4 0, 03 ab c ± 0, 02 0, 32 de ±0 ,1 6 6d 10 ,5 4bc ±9 ,3 0 6, 04 ef ±1 ,7 9 1, 22 f ± 0, 48 4, 57 a ± 1, 56 0, 15 ab ±0 ,1 3 0, 06 cd ±0 ,0 3 0, 05 ab ±0 ,0 3 0, 28 e ± 0, 10 10 d 7, 48 c ± 9, 80 5, 47 ef ±1 ,1 3 1, 38 ef ±0 ,7 9 3, 90 a ± 0, 96 0, 10 ab c ± 0, 06 0, 07 cd ±0 ,0 3 0, 03 ab c ± 0, 02 0, 38 de ±0 ,2 5 14 d 12 ,0 2bc ±9 ,8 3 5, 71 ef ±1 ,2 8 1, 56 ef ±0 ,7 2 3, 96 a ± 1, 08 0, 09 ab c ± 0, 06 0, 06 cd ±0 ,0 4 0, 03 bc ±0 ,0 2 0, 42 de ±0 ,2 5 21 d 13 ,3 6bc ±1 1, 08 6, 41 de f ± 1, 49 1, 74 de f ± 0, 69 4, 47 a ± 1, 24 0, 08 ab c ± 0, 13 0, 10 a ± 0, 05 0, 02 bc ±0 ,0 1 0, 41 de ±0 ,2 0 28 d 14 ,1 3bc ±1 3, 70 6, 79 cd ef ±1 ,4 9 2, 17 de ±1 ,1 3 4, 08 a ± 1, 21 0, 11 ab c ± 0, 08 0, 09 ab ±0 ,0 4 0, 04 ab ±0 ,0 4 0, 56 cd e ± 0, 30 a P ar a le tra s ig ua is n ão h á di fe re nç a si gn ifi ca tiv a (p <0 ,0 5) e nt re o s m om en to s. Resultados e Discussão 41 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos C él ul as x 1 0 3 / µ L Leucócitos Neutrófilos Linfócitos Figura 7 – Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do número total de leucócitos (x103/µL), neutrófilos segmentados (x103/µL) e linfócitos (x103/µL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos C él ul as x 1 0 3 / µ L 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 C él ul as x 1 0 3 / µ L Monócitos Eosinófilos Basófilos Figura 8 – Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) do número total de monócitos (x103/µL), eosinófilos (x103/µL) e basófilos (x103/µL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Resultados e Discussão 42 0,00 0,40 0,80 1,20 1,60 2,00 Antes F1 6h F1 12hF1 + F2 6h 12h 24h 48h 72h 4d 5d 6d 10d 14d 21d 28d Momentos R el aç ão N :L 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 ng /m L Relação N:L Cortisol Figura 9 – Gráfico demonstrativo dos valores médios ( X ) da relação neutrófilo:linfócito e da concentração sérica de cortisol (ng/mL) de ovinos mestiços Texel, imediatamente antes da flebotomia (Antes F1), 6h (6hF1) e 12h após a primeira flebotomia (12hF1+F2), 6h (6h), 12h (12h), 24h (24h), 48h (48h), 72h (72h), 4 dias (4d), 5 dias (5d), 6 dias (6d), 10 dias (10d), 14 dias (14d), 21 dias (21d) e 28 dias (28d) após a segunda flebotomia. Segundo Feldman et al. (2000) o cortisol induz redução no número de eosinófilos sangüíneos pela inibição da eosinopoese na medula óssea e/ou migração destas células para outros tecidos (baço e linfonodos). Essas informações são importantes porque durante 24 horas após a perda aguda de sangue o leucograma pode estar alterado devido à influencia do cortisol. Resultados e Discussão 43 5.4. Estresse oxidativo e lipoperoxidação A realização de duas flebotomias com retirada de 30% e 20% do volume sangüíneo com intervalo de 12 horas não foram capazes de determinar alterações significativas (p<0,05) na produção de MDA (Tabela 5). Houve diferença significativa (p<0,05) para o NO em alguns momentos durante o experimento, sendo os menores valores observados entre 48h (48h) e cinco dias (5d) após a segunda flebotomia. Os resultados diferiram dos relatados por Sarada et al. (2002) e Stenvinkel (2003) onde a anemia foi associada ao aumento das concentrações plasmáticas de biomarcadores de lipoperoxidação como o malondialdeído (MDA) plasmático devido à ação dos radicais livres. Durante o período de indução da anemia houve aumento da concentração de TBARS concomitante à diminuição do número de eritrócitos, concentração de hemoglobina e volume globular (Tabela 5 e Figuras 10 e 11). Observou-se correlação negativa (r= - 0,59) entre as TBARS e o volume globular indicando que houve estresse oxidativo e lipoperoxidação. O aumento na produção de radicais livres é controlado pelo sistema antioxidante eritrocitário, representado pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. Os eritrócitos representam o maior componente da capacidade antioxidante do sangue e a diminuição desse sistema antioxidante enzimático na anemia pode levar ao estresse oxidativo e lipoperoxidação (COSTAGIOLA et al., 1989; GRUNE et al., 2000; LUDAT et al., 2000; STENVINKEL, 2003). Porém, neste experimento a concentração de MDA não se alterou, indicando que outro fator que não o MDA pode ter aumentado as concentrações séricas das TBARS. A resposta a essa possível alteração é que o teste de reação ao ácido tiobarbitúrico é amplamente utilizado para determinar o índice de lipoperoxidação através da mensuração do MDA. Porém, as TBARS não avaliam o MDA livre (MEAGHER; FITZGERALD, 1999). O Resultados e Discussão 44 ácido tiobarbitúrico reage com uma variedade de compostos incluindo ácido siálico, prostaglandinas, desoxirribose e certos aldeídos produzindo interferência nos resultados (HONG et al., 2000b). Apesar das interferências analíticas, o teste das TBARS tem mostrado grande utilidade e não difere da dosagem do MDA pelo método do HPLC na determinação da lipoperoxidação em fluidos corporais (STRADAIOLI; MAGISTRINI, 2002). Neste experimento o NO pode ter demonstrado seu efeito antioxidante nos momentos em que sua concentração sérica atingiu os menores valores concomitantes à elevação da concentração das TBARS. A molécula de óxido nítrico tem papel regulador de várias funções biológicas. Induz vasodilatação, liberação de renina, regula a adesão plaquetária, está envolvida no remodelamento vascular, atua como neurotransmissor, mediador do crescimento celular e apoptose, e possui atividade antitumoral e antimicrobiana (MONCADA et al., 1991; POSTOVIT et al., 2005). Além dessas funções, pode ser considerado um radical livre capaz de interagir com produtos intermediários do oxigênio e causar lesões em moléculas ou possuir atividade antioxidante, protegendo contra os ataques das ERO. A sua propriedade pró-oxidante ou antioxidante dependerá de onde e quando ele for formado (WINK et al., 1995; ERDOGAN et al., 2002; ANDRADE JUNIOR et al., 2005). Embora existam resultados conflitantes, evidências indicam que o NO pode conferir efeito pró-oxidante e antioxidante sobre a lipoperoxidação. O papel do NO na lipoperoxidação depende de um delicado equilíbrio de efeitos que podem alterar subitamente as concentrações e a taxa de produção de NO. Re su lta do s