1 FLÁVIA FREDDI RODRIGUEZ Estabelecimento de um processo de bioimpressão de um gel a partir da associação de alginato e células estromais mesenquimais de tecido adiposo ASSIS 2022 2 FLÁVIA FREDDI RODRIGUEZ Estabelecimento de um processo de bioimpressão de um gel a partir da associação de alginato e células estromais mesenquimais de tecido adiposo Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências e Letras de Assis, para a obtenção do diploma no curso de Engenharia Biotecnológica Orientador: Prof. Dr. João Tadeu Ribeiro Paes ASSIS 2022 3 AGRADECIMENTOS Agradeço à Deus, aos meus pais e minha família por me incentivarem sempre e fazer com que a realização da graduação fosse possível. Ao meu orientador, Dr. João Tadeu minha gratidão especial pela oportunidade de participar do laboratório e me apresentar o meio acadêmico. Aos meus colegas de laboratório GenTeCel, especialmente a Maria Malagutti por me ajudar em todas as horas e pela amizade. A todos meus professores pelo conhecimento e a Unesp, por incentivar a ciência e levar os cursos a diversos lugares aumentando as oportunidades para todos os alunos. 4 “There are more things in heaven and earth, Horatio, than are dreamt of in your philosophy”. (Shakespeare) 5 RODRÍGUEZ, Flávia Freddi. Estabelecimento de um processo de bioimpressão de um gel a partir da associação de alginato e células estromais mesenquimais de tecido adiposo. 2022. 33 f. TCC (Graduação) – Curso de Engenharia Biotecnológica, Universidade Estadual Paulista, Assis, 2022. RESUMO No contexto da medicina regenerativa (RM) a associação de diferentes tipos celulares e biomateriais, como o alginato, tem sido empregada como alternativa terapêutica em várias condições patológicas. Há, no entanto, um número restrito de publicações sobre a associação de alginato com células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSC) e bioimpressão 3D. Considerando, portanto, as propriedades do alginato e o papel regenerativo e anti-inflamatório das ADSC, formulou-se a hipótese que essa associação poderá resultar num efeito aditivo ou sinérgico na regeneração tecidual, particularmente, em úlceras cutâneas e que o estabelecimento de um processo de bioimpressão 3D poderá otimizar a obtenção de um biogel/biocurativo resultante dessa associação. Assim, realizou-se a adequação de uma metodologia para obtenção das ADSC por meio de um processo semiautomatizado e, em seguida, a impressão e análise do biogel. A análise comparativa entre os métodos convencional e semiautomatizado evidencia um rendimento celular equivalente, mantendo os atributos celulares das ADSC, como diferenciação multipotencial e antígenos de superfície. Dessa forma, permite concluir que as metodologias propostas neste estudo representam um processo biotecnológico reprodutivo e com potencial de aplicação em medicina regenerativa. Entretanto, faz-se necessário avaliar a viabilidade translacional do processo como uma nova abordagem terapêutica em úlceras cutâneas. 6 Palavras Chave: Bioimpressão 3D, Células – tronco, Fração Estromal Vascular, Método Semiautomatizado. RODRÍGUEZ, Flávia Freddi. Estabelecimento de um processo de bioimpressão de um gel a partir da associação de alginato e células estromais mesenquimais de tecido adiposo. 2022. 33 f. TCC (Graduação) – Curso de Engenharia Biotecnológica, Universidade Estadual Paulista, Assis, 2022. ABSTRACT In the field of regenerative medicine (RM) the association of different types of cells and biomaterials, such as alginate, has been applied as a therapeutical alternative in various pathological conditions. However. There are a restricted number of publications regarding the association of alginate and adipose derived stem cells (ADSC) and bioprinting. Thus, considering the properties of alginate and the regenerative and anti- inflammatory paper of the ADSC, we hypothesized that this association could result in an addictive effect or synergic in tissue regeneration, particularly in difficult wound healing scars and that using a bioprinting process would optimize the process. Therefore, a methodology for the isolation of ADSC in a semiautomatic process has been proposed, followed by the bioprinting and analysis of the scaffold. The comparative analysis between the conventional and semiautomatic demonstrated an equivalent cell viability, maintaining ADSC features, such as multipotential differentiation and antigens. In conclusion, the methodologies proposed in this study represent a biotechnological and reproducible process with the potential for application in the RM field. Although, in the future, it is still necessary to study the translational process from bench to bedside for difficult wound healing scars. 7 Key Words: 3D Bioprinting, Stem Cells, Stromal Vascular Fraction, Semiautomatic Method. Lista de figuras FIGURA 1. ESQUEMATIZAÇÃO DA METODOLOGIA CONVENCIONAL E SEMIAUTOMATIZADA. ..... 17 FIGURA 2. COMPARAÇÃO DO RENDIMENTO CELULAR NA EXTRAÇÃO DE ADSC ENTRE OS MÉTODOS CONVENCIONAL E SEMIAUTOMATIZADO PARA A PACIENTE 3. ................................... 18 FIGURA 3. COMPARAÇÃO DO RENDIMENTO CELULAR NA EXTRAÇÃO DE ADSC ENTRE OS MÉTODOS CONVENCIONAL E SEMIAUTOMATIZADO PARA A PACIENTE 4. ................................... 18 FIGURA 4. ANÁLISE DAS ADSC DA PACIENTE 4 POR CITOMETRIA DE FLUXO A PARTIR DO ISOLAMENTO DAS CÉLULAS PELO MÉTODO CONVENCIONAL. ..................................................... 19 FIGURA 5. ANÁLISE DAS ADSC DA PACIENTE 4 POR CITOMETRIA DE FLUXO A PARTIR DO ISOLAMENTO DAS CÉLULAS PELO MÉTODO SEMIAUTOMATIZADO .............................................. 19 FIGURA 6. CULTIVO CELULAR DAS ADSC COM 14 DIAS PELO MÉTODO CONV. ........................ 20 FIGURA 7. CULTIVO CELULAR DAS ADSC COM 14 DIAS PELO MÉTODO SEMI. .......................... 20 FIGURA 8. DIFERENCIAÇÃO DAS ADSC PELO MÉTODO SEMI. ................................................... 20 FIGURA 9. PADRONIZAÇÃO DA IMPRESSÃO 3D DE GEL (ALG/GEL). ........................................... 21 Lista de tabelas TABELA I. PACIENTES SUBMETIDOS À ABDOMINOPLASTIA QUANTO AO GÊNERO E IDADE. ........ 22 8 Lista de abreviações ADSC – Células-tronco estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo Alg – Alginato CONV – Metodologia convencional EC – Células endoteliais EPC – Células precursoras endoteliais Gel – Gelatina ISCT – Sociedade Internacional de Terapia Celular MEC – Matriz extracelular MSC – Células-tronco mesenquimais PBS – Tampão fosfato RM – Medicina regenerativa SEMI – Metodologia semiautomatizada SVF – Fração estromal vascular TE – Engenharia de tecidos TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Este trabalho foi realizado de acordo com as normas da revista Anais da Academia Brasileira de Ciências (AABC). 9 Sumário INTRODUÇÃO............................................................................................................................................ 1 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................................... 3 OBTENÇÃO DA FRAÇÃO ESTROMAL VASCULAR (SVF) ................................................................. 3 ISOLAMENTO E CULTIVO DAS ADSC PELO MÉTODO CONVENCIONAL .................................... 4 ISOLAMENTO E CULTIVO DAS ADSC PELO MÉTODO SEMIAUTOMATIZADO .......................... 4 VERIFICAÇÃO DO POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO DAS ADSC.................................................. 5 CITOMETRIA DE FLUXO ......................................................................................................................... 6 PREPARAÇÃO DO GEL DE ALGINATO E GELATINA COM ADSC PARA BIOIMPRESSÃO......... 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................................. 7 CONCLUSÃO............................................................................................................................................ 10 REFERÊNCIAS ......................................................................................................................................... 11 10 Estabelecimento de um processo de bioimpressão de um gel a partir da associação de alginato e células estromais mesenquimais de tecido adiposo Flávia Freddi Rodríguez 1, Maria José Malagutti-Ferreira 2, Marta Aparecida Souza Santos 3, João Tadeu Ribeiro-Paes 4*. 1Graduação em Engenharia Biotecnológica, Universidade Estadual Paulista, Departamento de Biotecnologia, Avenida Dom Antônio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil. 2Programa de Mestrado em Biociências, Universidade Estadual Paulista, Departamento de Biotecnologia, Avenida Dom Antônio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil. 3Programa de Mestrado em Biociências, Universidade Estadual Paulista, Departamento de Biotecnologia, Avenida Dom Antônio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil. 4*João Tadeu Ribeiro-Paes. jtrpaes@yahoo.com.br. Laboratório de Genética e Terapia Celular (GenTeCel), Universidade Estadual Paulista, Departamento de Biotecnologia. Avenida Dom Antônio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil. Palavras Chave: Bioimpressão 3D, Células – tronco, Fração Estromal Vascular, Método Semiautomatizado. Bioimpressão do hidrogel de alginato com ADSCs Index Medicus Medline Autor para correspondência: João Tadeu Ribeiro-Paes, Avenida Dom Antônio, 2100, 19806-900, 011986453163. 1 Introdução Segundo Dieckmann et al. (2010), a medicina regenerativa (RM) tem por objetivo a reparação ou substituição de células, tecidos ou órgãos a fim de restaurar funções comprometidas devido a defeitos congênitos, doenças, traumas e envelhecimento. A interação do conjunto de conhecimentos e técnicas específicas da RM e engenharia de tecidos (TE), referida atualmente pelo acrônimo TERM (Fischer & Mauk 2013), tem permitido otimizar o desenvolvimento de materiais sintéticos ou biológicos, denominados de biomateriais. Os biomateriais são substâncias ou suas combinações, de origem natural ou sintética, capaz de substituir, tratar ou aumentar tecidos, órgãos ou funções do corpo e que são implantados no corpo permanentemente ou por um determinado período de tempo (Helmus & Tweden 1995, Montoya et al. 2021). Frequentemente são usados para sustentar células, originando os arcabouços ou em inglês scaffolds, no qual as células depositadas encontram um local para adesão e não se dispersam pelo tecido alvo (Levin et al. 2019, Zhang et al. 2021). Um biomaterial de destaque é o alginato, polímero natural, que devido as suas propriedades, como biocompatibilidade e não toxicidade, se torna uma escolha atraente para aplicações em feridas cutâneas de difícil cicatrização (Aderibigbe & Buyana, 2017, Fatimi et al. 2022). Além disso, como um campo eminentemente interdisciplinar a RM mobiliza e vale-se, portanto, de conhecimentos de diferentes áreas e tecnologias, onde junto aos biomateriais, as terapias baseadas em células (cell-based therapies) ocupam um papel de destaque com enfoque em células, especialmente as células-tronco estromais mesenquimais (MSC) (Arrighi 2018, Mannino et al. 2022). As MSC são células que apresentam morfologia alongada, fibroblastóide e potencial de diferenciação (NIH 2001, Salemi et al. 2022). As MSC foram inicialmente descritas por Friedenstein et al. (1974), a partir de culturas de medula óssea. Desde então, tem sido obtidas de vários tecidos e 2 órgãos, como medula óssea, cordão umbilical, polpa dentária, placenta, músculo, tecido adiposo (Simão et al. 2019, Maacha et al. 2020, Chen et al. 2020). Posteriormente, com os trabalhos de Zuk e colaboradores (Zuk et al. 2001), estabeleceu-se uma metodologia eficiente e reprodutível para o isolamento das células – tronco estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSC) oriundas da fração estromal vascular (SVF) de tecido adiposo. O tecido adiposo destaca-se como uma importante fonte de obtenção de MSC devido a sua obtenção por procedimentos poucos invasivos e grande disponibilidade de material. Dentre as abordagens metodológicas da RM, a associação de células e biomateriais têm sido usada em aplicações terapêuticas e mais recentemente, em manufatura aditiva, na área de bioimpressão 3D, que pode ser definida como uma tecnologia que emprega componentes vivos para construção de materiais camada a camada (Panja et al. 2022). Os trabalhos até hoje desenvolvidos com alginato e MSC são associações de culturas convencionais em placas de Petri ou materiais correlatos. Há, no entanto, poucos relatos na literatura de tal combinação obtida por bioimpressão 3D. Em vista disso, a biocompatibilidade, alta viscosidade e semelhança com a matriz extracelular (MEC) do alginato (Alg), ao ser associado à gelatina (Gel), que possui composição quase idêntica ao colágeno da MEC, fornece um gel de Alg/Gel como forte candidato para aplicações em bioimpressão (Hurtado et al. 2022). Neste contexto de bioimpressão, utiliza-se a biotinta que pode ser estabelecida como uma formulação de tinta que permite a impressão de células (Wang et al. 2021). A biotinta é composta de células, biomateriais e substâncias biológicas adicionais a fim de proporcionar e sustentar a formação de tecidos por meio da constituição de um ambiente adequado à migração celular, proliferação, diferenciação e garantir a secreção da MEC (Kacarevic et al. 2018, Freeman et al. 2022). 3 Dessa maneira, busca-se com este projeto estabelecer um bioprocesso com impressão 3D de gel de alginato e gelatina associado a ADSC, considerando a possibilidade de emprego deste como uma nova alternativa para o tratamento de úlceras cutâneas de difícil cicatrização. Assim, faz-se importante não só analisar a viabilidade das ADSC, mas também dar início à caracterização de alguns parâmetros físico-químicos da associação. Estes, bem como outras análises complementares, quanto à caracterização das células, diferentes citocinas e fatores de crescimento inseridos no gel, deverão ser objeto de análises futuras na continuidade e ampliação deste projeto. Materiais e Métodos Para realizar a análise comparativa quanto à eficiência de obtenção, capacidade proliferativa e manutenção dos atributos celulares de ADSC, utilizou-se a metodologia convencional (CONV) e semiautomatizada (SEMI) com o aparato KisoProcessor (Keai Bioresearch Inc., Vancouver, Canadá). Obtenção da fração estromal vascular (SVF) A SVF foi isolada do tecido adiposo humano oriundo de procedimentos cirúrgicos estéticos de lipoaspiração, fornecidos pelaclínica Maison das Flores da cidade de Assis. O material biológico foi utilizado mediante autorização e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) proveniente de pacientes de ambos os sexos com idade máxima até 50 anos. 4 Isolamento e cultivo das ADSC pelo Método Convencional Logo após à coleta, as amostras de tecido adiposo foram submetidas a digestão enzimática. Para isso, foram fracionados cerca de 20 g de tecido adiposo, acondicionados em tubo Falcon 50 ml (BD, Nova Jersey, EUA), contendo Tampão Fosfato (PBS) pH 7,2 (LCG®, São Paulo, Brasil), suplementado com 2% penicilina, estreptomicina e fungizona (Gibco®, Nova York, EUA), permanecendo em repouso por 2 horas para desinfecção. Posteriormente o tecido foi fragmentado e submetido a digestão enzimática com colagenase tipo I a 0,075% (Sigma-Aldrich®, Missouri, EUA). O tubo foi mantido em banho-maria a 37°C por 30 minutos, em constante agitação. Após a digestão enzimática, a colagenase foi neutralizada com adição de meio de cultura Mem/Alpha, (LCG®, São Paulo, Brasil), suplementado. Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 400g por 10 minutos. Após esse período, foi retirado o sobrenadante preservando o pellet contido no tubo. O pellet foi ressuspendido em 2ml de meio de cultura Mem/Alpha suplementado. As células foram plaqueadas em frascos de cultura T25 (BD, Nova Jersey, EUA) e incubadas em estufa a 37°C e 5% de CO2 por 48 horas até a primeira troca do meio de cultura. As trocas posteriores foram realizadas a cada 72 horas. Isolamento e cultivo das ADSC pelo Método Semiautomatizado O isolamento da SVF foi realizado usando Sistema Kiso (Keai Bioreserarch Inc., Vancouver - Canadá) com base no protocolo proposto em estudos anteriores (Santos – Souza 2020, Mbiine et al. 2022). A amostra de lipoaspirado foi separada em dois tubos Falcon de 50 ml. Cerca de 60 ml do tecido foi aspirado por uma seringa modelo cateter 5 (BD, Nova Jersey, EUA) e reservada. Em seguida, conectou-se uma Solução de Ringer Lactato (Solução de cloreto de cálcio 2H2O a 0,02%, cloreto de potássio a 0,03%, cloreto de sódio a 0,6%, JP Indústria Farmacêutica S.A., Ribeirão Preto, Brasil) de 500 ml na Bandeja Buffer, o compartimento superior da máquina que aloja a bolsa. Posteriormente, a bolsa processadora Kiso (Keai Bioreserarch) foi conectada ao aparato. Duas seringas foram encaixadas em seus respectivos lugares, uma com 6 ml da enzima colagenase tipo I a 0,15% (Gibco, Nova Iorque, EUA) e uma outra para sucção da solução de Ringer Lactato durante o processamento. A amostra de 50 ml de tecido adiposo, previamente reservada, foi injetada na bolsa de processamento, lentamente. A extração da SVF teve a duração de aproximadamente 50 minutos. Após término do processo, o volume final de cerca de 60 ml de SVF, foi dividido em dois tubos Falcon de 50 ml. A suspensão de células foi centrifugada por 10 min a 900g para separar os adipócitos (flutuantes) da SVF. Após, a SVF foi incubada em gelo (10 min) com 1 ml de tampão de lise, lavada com solução salina tamponada – PBS (LGC Biotecnológica, São Paulo, Brasil) e centrifugada. Logo em seguida, o pellet formado foi homogeneizado, em 1 ml de meio Alpha MEM (LGC Biotecnológica, São Paulo, Brasil). Para o cultivo celular, as células foram semeadas em frascos de cultura T25 (BD, New Jersey, EUA) com 5 ml de meio Alpha MEM. Após 48 horas foi realizada a primeira troca de meio de cultura e, devido a característica de adesão ao fundo do frasco de cultivo celular, apenas as ADSC foram selecionadas para cultura e os demais tipos celulares provenientes da SVF foram descartados com a troca de meio. Verificação do potencial de diferenciação das ADSC 6 Com o propósito de averiguar a potencial de diferenciação das ADSC, foi realizada a diferenciação adipogênica, verificada pela coloração Oil Red StemPro® (Gibco®, Nova York, USA). A diferenciação condrogênica verificada pela coloração Alcian Blue StemPro® (Gibco®, Nova York, USA), e osteogênica pela coloração Alizarin Red S StemPro® (Gibco®, Nova York, USA), sendo que foram utilizados os Kits StemPro® específicos (Gibco®, Nova York, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Citometria de fluxo A imunofenotipagem foi conduzida através da citometria de fluxo utilizando o citômetro FACSCalibur (BD, New Jersey, USA) e foram analisados 10.000 eventos para cada amostra. As ADSC cultivadas foram marcadas com anticorpos de alta expressão CD90, CD73, CD105 e de baixa expressão CD34, CD45, HLA-DR (BD, New Jersey, USA). Preparação do gel de alginato e gelatina com ADSC para bioimpressão A definição do protocolo teve como referencial o trabalho de Celestino et al. (2017). Após experimentos prévios definiu-se o seguinte protocolo: o gel de alginato (Alg) e gelatina (Gel) foi preparado em uma proporção de 10% (Alg/Gel) em solução de tampão fosfato (PBS) estéril de pH 7.4, para uma concentração final de 8% ao associar com ADSC. As ADSC na concentração 1x106 foram adicionadas ao gel (Chae et al. 2017). Após a associação, o gel foi introduzido na seringa de forma cuidadosa para não formar bolsas de ar e conectado à impressora 3D para a produção do scaffold de Alg/Gel 7 com morfologia oval programada na impressora (4 cm x 2 cm) sobre uma placa de Petri por um bico de extrusão utilizando a impressora ZMorph 2.0 VX (ZMorph S.A, Vroclaw, Polônia). Resultados e Discussão As ADSC podem ser isoladas da SVF do tecido adiposo lipoaspirado. A SVF é composta por ADSC, células precursoras endoteliais (EPC), células endoteliais (EC), macrófagos, células musculares lisas, linfócitos, pericitos e pré-adipócitos, entre outros (Lee et al. 2021, Stachura et al. 2021, Bellei et al. 2022). O isolamento de SVF a partir de lipoaspirado é realizado por digestão da porção gordurosa com colagenase, separando, após centrifugação ou decantação, o conteúdo em duas fases distintas: a fração de adipócitos maduros do sobrenadante e os outros tipos celulares situados na fase inferior (Zuk et al. 2001, Orgun & Mizuno 2017, Ong et al. 2021). Esta separação é mais eficiente por centrifugação, porém todas as células sofrerão sedimentação. No início do trabalho buscou-se adaptar o uso do aparelho semiautomatizado Kiso (Keai Bioreserarch Inc., Vancouver – Canadá) para realizar o isolamento das ADSC. Alguns parâmetros tiveram que ser adequados para que se obtivesse reprodutibilidade e eficiência dos resultados. Dentre esses parâmetros vale citar, sobretudo, a temperatura ideal para maior eficiência de ação da colagenase e maior rendimento celular a partir da SVF. 8 Para comprovar, a eficiência de extração pelo processador Kiso, realizou-se a extração celular do material de descarte lipoaspirado de quatro pacientes do sexo feminino com idade entre 30 e 60 anos (Tabela I). As células em cultivo apresentaram aderência à superfície plástica das garrafas de cultura e morfologia fibroblastóide, conforme apresentado nas (Fig. 6) e (Fig. 7). Conforme apresentado na (Fig. 6), para metodologia convencional no 14º dia de cultivo, foram observadas células com morfologia fusiforme, semelhante a fibroblastos e uma confluência de 80% a 90%. Na (Fig. 7), que apresenta células cultivadas após o processamento pelo método semiautomatizado, pode-se verificar que as células no 14º dia de cultivo, em A, apresentam aspecto fibroblastóide e uma área de confluência de, aproximadamente 70 a 80 %. O teste de diferenciação das ADSC apresentou os requisitos básicos descritos na metodologia, quanto ao potencial de diferenciação em linhagens adipogênica, condrogênica e osteogênica. Conforme demonstrado na (Fig. 8), a diferenciação adipogênica foi confirmada por presença de vacúolos lipídicos indicados pela coloração Oil Red O (8A). A diferenciação condrogênica com coloração Alcian Blue (8B), onde o azul indica a síntese de proteoglicanos e a diferenciação osteogênica foi verificada mediante a coloração da matriz óssea com Alzarin Red S (8C). A análise de citometria de fluxo confirmou a caracterização da população celular composta por células mesenquimais. Para metodologia convencional, foi confirmada nas amostras 8marA (001, 002, 003) a caracterização da população celular composta por células mesenquimais, apresentando marcadores de superfície positivos para CD 73 (96.58%), CD 90 (88.96%) /e CD 105 (37.42%) e negativos para CD 34 (0.27%), CD 45 (11.94%) e HLA classe II (0.31%), conforme a (Fig. 4). 9 Para a metodologia semiautomatizada, amostras 8marC (001, 002, 003), os marcadores de superfície (CD) apresentaram valores positivos acima de 90% para CD 73 (99.58%), CD 90 (99.98%) e CD 105 (92.96%) e negativos para CD 34 (0.06%), CD 45 (3.33%) e HLA classe II (0.27%), conforme apresentado na (Fig. 5). Estes dados são compatíveis com os critérios de validação para células estromais mesenquimais, conforme preconizado pela Sociedade Internacional de Terapia Celular – ISCT (Dominici et al. 2006). A análise comparativa entre os métodos CONV e SEMI, evidencia um rendimento celular equivalente, mantendo os atributos celulares das ADSC, como diferenciação multipotencial (Fig. 6) e antígenos de superfície (Fig. 4 e 5). O tempo médio para isolamento da SVF foi de 90 minutos para o método CONV e de 60 minutos para o método SEMI. Os resultados obtidos permitem concluir que o aparato Kiso Processor representa uma alternativa eficiente para isolamento da SVF, tendo como vantagens: menor manipulação, tempo de isolamento da SVF e menor risco de contaminação das culturas de ADSC. Em relação ao processo de adequação da bioimpressão do gel resultante da associação de alginato e ADSC., foi realizada a padronização da impressão 3D de gel (Alg/Gel) obtido com diferentes concentrações. A associação foi testada na concentração de 8%, de acordo com a metodologia proposta e, nas concentrações de 4% até 10% para avaliar a capacidade do gel para bioimpressão (Freeman et al. 2017, Liu et al. 2019, Böttcher et al. 2022). À medida que a concentração era reduzida, observou-se que o gel resultante perdia fidelidade da forma ao passo que com o aumento da concentração a consistência era mantida. Entretanto em concentrações acima de 8% o processo de impressão era dificultado, pois a força necessária para a extrusão excedia a força que a 10 bioimpressora era capaz de exercer, como também foi relatado por Freeman et al (2017) e Zhang et al (2019; 2021). Foram realizados também diferentes testes para padronização dos parâmetros da impressora variando os valores de preenchimento das camadas do gel de 100% e 50% e análise da quantidade de camadas, duas ou quatro camadas. Assim, observou-se que o preenchimento de 100% em duas camadas viabilizou a obtenção de um hidrogel, demonstrado na (Fig.9), reprodutível com as características desejadas para bioimpressão como printabilidade, fidelidade da forma, biocompatibilidade, viscosidade e biodegradabilidade (Valot et al. 2019). Conclusão Os resultados obtidos permitem concluir que a metodologia proposta neste estudo, tanto para isolamento de ADSC pelo método semiautomatizado, quanto para obtenção de um biogel por meio de impressão 3D, representa um processo biotecnológico reprodutível e com grande potencial de aplicabilidade em medicina regenerativa, particularmente como uma nova abordagem terapêutica em úlceras cutâneas de difícil cicatrização. Deve-se, no entanto, enfatizar que serão necessários estudos adicionais e introdução de novas metodologias que permitam refinar e confirmar a reprodutibilidade dos resultados, bem como avaliar a viabilidade translacional do processo de emprego do biogel resultante da associação de alginato e ADSC como uma nova abordagem terapêutica em úlceras cutâneas. 11 Referências ADERIBIGBE BA, BUYANA B. 2018. Alginate in wound dressings. Pharmaceutics 10: 1- 19. ARRIGHI, N. 2018. Stem Cells at the Core of cell therapy. In: Stem Cells: Therapeutic Innovations under Control. ISTE Press Elsevier, 1: 73 - 100. BELLEI, B.; MIGLIANO, E.; PICARDO, M. 2022. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology, 00: 1 – 16. BÖTTCHER, B.; PFLIEGER, A.; SCHUMACHER, J.; JUNGNICKEL, B.; FELLER, K. H. 2022. 3D Bioprinting of Prevascularized Full-Thickness Gelatin-Alginate Structures with Embedded Co-Cultures. Bioengineering, 9: 1 - 25. 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A: (A) Tecido adiposo ou lipoaspirado de tecido adiposo; (2) Fragmentação e limpeza do tecido adiposo; (3) Tecido fragmentado; (4) Digestão enzimática do tecido com colagenase; (5) Filtração; (6) Centrifugação e formação do precipitado; (7) Proliferação celular. B: (1) Lipoaspirado de tecido adiposo; (2) Processador Kiso (Keai Bioresearch Inc., do Canadá); (3) Colagenase e solução de ringer lactato; (4) SVF; (5) Seleção de ADSC em cultivo; (6) Proliferação celular. B A 18 Figura 2. Comparação do rendimento celular na extração de ADSC entre os métodos convencional e semiautomatizado para a Paciente 3. Figura 3. Comparação do rendimento celular na extração de ADSC entre os métodos convencional e semiautomatizado para a Paciente 4. 19 Figura 4. Análise das ADSC da paciente 4 por citometria de fluxo a partir do isolamento das células pelo método convencional. Figura 5. Análise das ADSC da paciente 4 por citometria de fluxo a partir do isolamento das células pelo método semiautomatizado. 20 Figura 6. Cultivo celular das ADSC com 14 dias pelo método CONV. Figura 7. Cultivo celular das ADSC com 14 dias pelo método SEMI. Figura 8. Diferenciação das ADSC pelo método SEMI. (A) Diferenciação adipogênica corada com Oil Red O, aumento de 400 x; (B) Diferenciação condrogênica, corada com Alcian Blue, aumento de 400x; (C) Diferenciação osteogênica, corada com Alzarin Red S, aumento de 400 x. 21 Figura 9. Padronização da impressão 3D de gel (Alg/Gel). (A), (B) e (C) são impressões consecutivas com a mesma concentração de gel (Alg/Gel) a 8%. 22 Tabela I. Pacientes submetidos à abdominoplastia quanto ao gênero e idade.