UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA NÍVEIS SÉRICOS DE PROTEÍNA C-REATIVA EM CÃES COM ALTERAÇÕES OCULARES PRIMÁRIAS OU ASSOCIADAS A DOENÇAS SISTÊMICAS LUÍS FELIPE FERNANDES REITER BOTUCATU - SP SETEMBRO/2021 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA NÍVEIS SÉRICOS DE PROTEÍNA C-REATIVA EM CÃES COM ALTERAÇÕES OCULARES PRIMÁRIAS OU ASSOCIADAS A DOENÇAS SISTÊMICAS LUÍS FELIPE FERNANDES REITER Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Animal para a obtenção do título de Mestre. Orientadora: Profa. Assoc. Cláudia Valéria Seullner Brandão Coorientadora: Profa. Assoc. Regina Kiomi Takahira BOTUCATU - SP SETEMBRO/2021 2 Nome do autor: LUÍS FELIPE FERNANDES REITER TÍTULO: NÍVEIS SÉRICOS DE PROTEÍNA C-REATIVA EM CÃES COM ALTERAÇÕES OCULARES PRIMÁRIAS OU ASSOCIADAS A DOENÇAS SISTÊMICAS COMISSÃO EXAMINADORA __________________________________ Profª Assoc. Cláudia Valéria Seullner Brandão Presidente e Orientadora. Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal. FMVZ/UNESP - Botucatu - SP. __________________________________ Profª. Drª. Natalie Bertelis Merlini Membro Docente na Faculdade UNIPAR – Umuarama com ênfase em Clínica Veterinária. Faculdade UNIPAR. __________________________________ Prof. Dr. Felipe Fornazari Membro Departamento de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva. FMVZ/UNESP - Botucatu - SP. Data da Defesa: 27 de Setembro de 2021 3 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar devo agradecer meus pais: Antonio Carlos Santos Reiter e Faine Del Carmen Fernandes Reiter por terem me apoiado de todas as formas possíveis desde o começo, não só na carreira profissional, como na vida. Lívia, minha amiga, namorada, parceira e apoiadora em todos os momentos de minha vida, sem você simplesmente nada seria possível. Agradeço minha orientadora, Cláudia Valéria Seullner Brandão, por me possibilitar a realização de um sonho em cursar um Mestrado Acadêmico em Oftalmologia Veterinária na Universidade em que me formei, é uma honra! Regina Kiomi Takahira, professora e comadre, obrigado pela coorientação neste mestrado. Esta fase está sendo apenas mais uma etapa que passamos juntos. Aproveito para agradecer toda equipe do Laboratório Clínico Veterinário da FMVZ por todo auxílio e acolhimento que tive nesse setor durante o projeto, em especial à comadre Marcela, Rosinha e ao Marcos, que nos ajudou nas dosagens das CRP! Agradeço também a equipe do Serviço de Zoonoses do HV/FMVZ-Botucatu pelas sorologias realizadas em parceria neste estudo. Muito obrigado ao Prof. Carlos Roberto Padovani pelo auxílio e dedicação nas análises estatística do estudo. Aos docentes: Profa. Natalie Bertelis Merlini e Prof. Felipe Fornazari, obrigado por terem aceitado o convite para participarem da banca examinadora. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Agradeço pelo suporte financeiro concedido durante o Mestrado, principalmente no atual cenário político e econômico em que o país se encontra e à Pós-Graduação da FMVZ Unesp Botucatu pela atenção prestada durante todo o período. Obrigado a equipe do Serviço de Oftalmologia Veterinária do HV/FMVZ- Botucatu pela ajuda e ensinamentos durante esses anos. Aos meus amigos e amigas que sempre me demonstraram, não apenas apoio, mas empatia, carinho, amor, gratidão e igualdade nessa jornada, em especial ao João Luis Dias Baqui – mais que um colega – um amigo. Nesses dois anos, caminhamos juntos uma jornada profissional muito sonhada e me sinto muito feliz e grato em poder dividir esses momentos contigo, inclusive as 4 noites dedicadas a escutar discos de vinil e beber vinho durante sua hospedagem em casa no período dos seus PCRs. Não posso deixar de agradecer minha família “do outro lado”, sem eles minha vida não teria sentido. Dessa forma, agradeço ao Babalorixá Salvador Maria, meu segundo pai, por ter proporcionado e me proporcionar momentos especiais e que jamais serão apagados do meu coração. Também agradeço à Lizete Rosa Lourenço e sua equipe pela qual eu possuo um carinho especial e um lugar guardado no meu coração por toda a eternidade, afinal, “o que está no coração não se apaga”. Ainda agradeço ao amigo Paulo Thiago Azevedo Quaresma de Moura pelo apoio e equilíbrio compartilhado. Minha gratidão pela pequena Madalena, um serzinho de 4 patas que chegou na hora certa e pela Mel, minha grande companheira que por 18 anos conviveu comigo e se desligou da terra no último Dia dos Pais. André Luis Filadelpho, muito obrigado por ter sido o primeiro professor com o qual me identifiquei no curso de Medicina Veterinária desta Universidade e que rendeu, além de trabalhos científicos, uma grande amizade também inesquecível. Enfim, o meu muito obrigado a todos que de alguma forma me apoiaram! 5 LISTA DE ABREVIATURAS AAQ Alfa-1-antiquimiotripsina AAT Alfa-1-antitripsina ACAID Desvio Imune Associado à Câmara Anterior AINE Anti-inflamatório não esteroides ALT Alanina aminotransferase APC Célula apresentadora de antígeno APG Alfa-1 glicoproteína ácida COX Ciclo-oxigenase CP Ceruloplasmina CRP DDVMM Proteína C-reativa Doença degenerativa mixomatosa da válvula mitral FA Fosfatase alcalina GGT Gamaglutamiltransferase HP ICC Haptoglobulina Insuficiência cardíaca congestiva IL Interleucina IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M LOX Lipoxigenase LCV PCR Leishmaniose Visceral Canina Reação em cadeia da polimerase PFA Proteína de fase aguda PIO Pressão intraocular RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta RFA Resposta de fase aguda SAA Amiloide sérica A SAM Soroaglutinação microscópica SIRS Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica 6 SST Solução saturada TGF Fator de necrose tumoral URE Uveíte Recorrente Equina 7 LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1 - Cão da raça Boxer apresentando secreção mucopurulenta, crostas e pigmentação corneal devido a ceratoconjuntivite seca. Fonte: Serviço de Oftalmologia Veterinária do HV- FMVZ/Botucatu..................................................................................................58 FIGURA 2 – Uveíte, hiperemia conjuntival, edema e vascularização corneal, rubeosis iridis, catarata hipermatura em cão da raça Fila Brasileiro reagente para Ehrlichia spp. Fonte: Serviço de Oftalmologia Veterinária do HV- FMVZ/Botucatu..................................................................................................58 8 SUMÁRIO Página CAPÍTULO 1 1 1. Introdução e Justificativa 2 2. Revisão da literatura......................................................................................3 2.1 Úvea 3 2.2 Alterações oculares primárias 5 2.2.1 Ceratites ulcerativa 6 2.2.2 Ceratoconjuntivite seca 7 2.2.3 Proptose ocular 9 2.2.4 Protrusão da glândula da terceira pálpebra 9 2.2.5 Traumas 10 2.2.6 Procedimentos cirúrgicos 10 2.3 Alterações oculares secundárias 11 2.3.1 Toxoplasmose 11 2.3.2 Erliquiose 13 2.3.3 Leishmaniose 15 2.3.4 Leptospirose 17 2.4 Proteínas inflamatórias de fase aguda 18 2.4.1 Resposta de fase aguda - processo inflamatório 21 2.4.2 Proteína C-reativa 23 3. Referências 26 CAPÍTULO 2 45 INTRODUÇÃO 48 MATERIAIS E MÉTODOS 50 Amostras 50 Método de coleta 51 Doenças infecciosas testadas 52 Técnica de detecção de toxoplasmose, leishmaniose e leptospirose 52 Técnica de detecção das hemoparasitoses 52 Método de dosagem da CRP 53 Critérios de exclusão 53 Análise estatística 53 RESULTADOS 54 DISCUSSÃO 55 9 CONCLUSÃO 60 REFERÊNCIAS 60 Anexo 1 – Resultados de IgG e IgM para Toxoplasmose (IgG-T e IgM-T), IgG e IgM para Leishmaniose (IgG-L e IgG-L), de soroaglutinação microscópica para Leptospirose, hemoparasitoses e da dosagem de CRP dos animais do G1. 67 Anexo 2 – Resultados CRP dos animais dos grupos G2 e G3. 69 10 REITER, L. F. F. NÍVEIS SÉRICOS DE PROTEÍNA C-REATIVA EM CÃES COM ALTERAÇÕES OCULARES PRIMÁRIAS OU ASSOCIADAS A DOENÇAS SISTÊMICAS. Botucatu – SP. 2021. 81 p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP. RESUMO A proteína C-reativa (CRP) é uma importante proteína de fase aguda em cães e considerada um biomarcador precoce de lesões inflamatórias/infecciosas. Sua utilização está em ascensão na Medicina Veterinária em doenças como piometra, cardiopatia, doença periodontal e gastroenterites, porém em oftalmologia os estudos ainda são escassos. Este estudo comparou as concentrações séricas de CRP em cães com alterações oculares primárias às associadas a doenças sistêmicas, dentre elas a toxoplasmose, leishmaniose e erliquiose. Foram avaliadas 67 amostras sorológicas de cães distribuídas em 3 grupos. No G1 (n=23) - cães com alterações oculares secundárias a doenças sistêmicas testadas; G2 (n=22) - cães com alterações oculares primárias; G3 (n=22) - animais hígidos (controle) sem alterações oculares e negativos para as doenças sistêmicas testadas. Como resultados, houve diferença significativa (P<0,001) nas concentrações de CRP entre G1 e G2 e entre G1 e G3. A dosagem da CRP mostrou-se efetiva como marcador biológico de processo inflamatório ocular, principalmente quando este é secundário à doença sistêmica de origem infecciosa. A dosagem de CRP apresenta potencial para a aplicação na prática oftalmológica em cães. Palavras chave: canina, inflamação, oftalmologia, proteína de fase aguda, uveíte. 11 REITER, L. F. F. SERUM LEVELS OF C-REACTIVE PROTEIN IN DOGS WITH PRIMARY OCULAR ALTERATIONS OR ASSOCIATED WITH SYSTEMIC DISEASES. Botucatu – SP. 2021. 81 p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP. ABSTRACT C-reactive protein (CRP) is an important acute-phase protein in dogs once it is considered an early biomarker of inflammatory / infectious lesions. Its use in veterinary medicine is rising in diseases such as pyometra, heart disease, periodontal disease and gastroenteritis. This study compared serum CRP in dogs with ocular diseases associated or not with systemic diseases, including toxoplasmosis, leishmaniasis and ehrlichiosis. 67 dogs’ serological samples were divided into 3 groups: G1 - 23 dogs with ocular disorder secondary to confirmed systemic diseases; G2 - 22 dogs with primary eye disorders, negative disease tests; G3 - control group composed by 22 healthy dogs without ocular disorders nor systemic diseases. There was a statistically significant difference (P <0.001) between the CRP concentrations of G1 and G2 and between G1 and G3. The measurement of CRP was shown to be effective as a biological marker of ocular inflammatory process, especially when it is secondary to infectious origin systemic disease. CRP has potential application in ophthalmological practice in dogs. Keywords: acute phase protein, canine, inflammation, ophthalmology, uveitis. CAPÍTULO 1 2 1. Introdução e Justificativa Diversos estudos realizados desde décadas passadas valorizam o exame físico geral durante o atendimento médico veterinário como decisivo para um diagnóstico preciso de enfermidades sistêmicas e específicas, e sua elaboração habilidosa guia de forma eficiente a seleção de exames específicos, sendo mais frequentes os bioquímicos séricos e exames de imagem (LOW, 1971; HARDY, 1981). Contudo, Eckersall & Conner (1988) já indicavam que as dosagens de proteínas de fase aguda em cães, em especial a proteína C-reativa (CRP), apresentavam como importante vantagem o fato de serem marcadores precoces de lesões. A CRP trata-se de um biomarcador produzido predominantemente no fígado em resposta às citocinas pro-inflamatórias do processo inflamatório (NAKAMURA, 2008). Apesar desta ser a mais estudada em cães (NAKAMURA, 2008), destaca-se que suas dosagens ainda não são frequentemente realizadas na rotina devido principalmente à escassez de estudos aprofundados sobre a sua concentração nas várias doenças (NAKAMURA et al., 2008); inclusive nas doenças oftalmológicas. Casos de uveíte, na espécie canina, comumente ocorrem por doenças sistêmicas infecciosas tendo como agentes principais a Ehrlichia spp., Leishmania spp., Babesia spp., Toxoplasma gondii e fungos (HENDRIX, 2011). Isto ocorre devido à elevada taxa de fluxo sanguíneo na retina e úvea, o que possibilita a disseminação destes agentes (CULLEN & WEBB, 2013). Em cães, as causas mais comuns de uveíte de origem exógena incluem cirurgia intraocular, trauma, ceratite ulcerativa e feridas penetrantes (COLITZ, 2005; HENDRIX, 2011). Na Medicina, a CRP foi descrita como indicadora da gravidade e do prognóstico de diversas doenças, como linfomas não-Hodgkin’s e leucemia linfocítica crônica (PAVLIDIS et al., 1993), artrite reumatoide (JANSEN et al., 2001), carcinoma de células renais (KOMAI et al., 2006), e câncer colorretal avançado (READ et al., 2006). A aplicabilidade desta proteína ainda está em ascensão na Medicina Veterinária, visando indicar a resposta ao tratamento e prognóstico em diversas doenças (OHNO et al., 2007; SIMÕES, 2016; CYRINO, 2020). 3 O diagnóstico etiológico preciso da uveíte em cães é imprescindível na prevenção da perda visual destes animais, pois trata-se de uma doença potencial causadora de cegueira na espécie (HENDRIX, 2014). A utilização das proteínas de fase aguda (PFA) em comparação à análise do leucograma objetivando avaliação de processos inflamatórios/infecciosos apresenta como vantagens sua maior estabilidade em contraste a análise dos componentes celulares sanguíneos e menor influência de estímulos fisiológicos passageiros, como ocorre no caso de recrutamento de leucócitos marginais; além da possibilidade do congelamento do material (MARTÍNEZ-SUBIELA et al., 2001). A hipótese do trabalho foi identificar maior nível sérico de CRP nos cães apresentando uveítes com doenças sistêmicas infecciosas concomitantes quando comparado a cães portadores de lesões oculares primárias ou sem lesão. A escassez de relatos na literatura, especialmente na área da oftalmologia, a respeito de dosagens da CRP em cães acometidos por uveíte, estimulou seu desenvolvimento, uma vez que pode ser aplicável como uma importante ferramenta diagnóstica nos casos desafiadores dessa afecção comum em cães. O objetivo foi comparar os níveis de CRP entre cães com alterações oculares primárias ou secundárias às doenças sistêmicas e animais hígidos. 2. Revisão da literatura 2.1. Úvea A úvea, também denominada túnica vascular do olho, é composta pela íris, corpo ciliar e coroide. Sua inflamação, uveíte, ocorre quando todas ou alguma combinação destas estruturas são afetadas e, comumente, ocorre em conjunto com várias doenças intraoculares e sistêmicas (HENDRIX, 2011). A íris é composta por três camadas: a camada da borda anterior, que consiste em fibroblastos e melanócitos; o estroma, o qual possui fibras colágenas dispostas frouxamente com fibroblastos e cromatóforos; e o epitélio posterior, que é contínuo com o epitélio do corpo ciliar (SAMUELSON, 1999). O corpo ciliar é composto pela pars plicata anterior, o qual consiste em processos ciliares e vales intermediários nos quais a lente se fixa, através das zônulas lenticulares (tanto no cão como no gato) e a pars plana posterior. A 4 acomodação do cristalino é dada pelo músculo ciliar, pouco desenvolvido no cão e no gato em comparação com humanos. O epitélio não pigmentado do corpo ciliar – contínuo com a retina sensorial - é responsável pela produção do humor aquoso e o epitélio pigmentado do corpo ciliar é contínuo com o epitélio pigmentado da retina (GUM et al., 1999). A coroide é a estrutura altamente vascularizada responsável pela nutrição e termorregulação da retina metabolicamente ativa. É constituída por coriocapilares, uma camada de tamanho médio com o tapete, camadas de vasos grandes e suprecoroidea (GUM et al., 1999). Alguns autores defendem que, antigamente, a introdução de tecidos estranhos nas câmaras oculares, quando comparado a outros sistemas, estimulava uma resposta de rejeição tardia, mínima ou ausente (STREILEIN et al., 2002; ENGLISH & GILGER, 2013). Estes mesmos autores citam que, atualmente, ocorre um processo ativo e dinâmico arranjado por moléculas e células específicas. Este fenômeno consiste numa maneira especializada de adaptação ocular às injúrias inflamatórias objetivando-se a preservação das funções, evitando assim consequências deletérias, como cicatrizes, adesões, pigmentações (STREILEIN et al., 2002; ENGLISH & GILGER, 2013). A natureza da inflamação destas estruturas oculares relaciona-se diretamente com a elevada vascularização do tecido, sua sensibilidade imunológica e sua proximidade anatômica com outras estruturas. A uveíte, semelhante à inflamação em outros tecidos, consiste em três eventos básicos: elevado suprimento sanguíneo, aumento da permeabilidade vascular e migração de leucócitos para o local da lesão (HENDRIX, 2013). Três nomenclaturas são utilizadas para distinguir, anatomicamente, o processo inflamatório da túnica vascular. A inflamação da íris e do corpo ciliar é denominada uveíte anterior ou iridociclite. Já a inflamação da coroide, é definida por uveíte posterior ou coroidite. Caso os três componentes da úvea sejam afetados, o processo denomina-se panuveíte. O termo uveíte anterior é amplamente utilizado na rotina clínica devido à inflamação da íris e do corpo ciliar ocorrerem, com frequência, simultaneamente; caso estes estejam individualmente inflamados, irite e ciclite são as nomenclaturas empregadas, respectivamente (HENDRIX, 2011). 5 Hendrix (2013) afirma que a etiopatogenia da uveíte na espécie canina pode ser secundaria à alterações em cristalino, doenças na córnea, como ceratites ulcerativas ou lesões em esclera, sendo assim, associada a uma lesão ocular primária ou ser secundária a neoplasias, agentes infecciosos ou imunomediada. A divisão da etiologia do processo inflamatório pode ser definida como sendo endógena ou exógena. Causas de uveíte endógenas são aquelas que se originam dentro da estrutura ocular ou a afetam por meio da corrente sanguínea ou de estruturas contíguas. Essas etiologias são as responsáveis pela maioria dos casos de uveíte, incluindo infecções sistêmicas, neoplasias, agentes tóxicos, metabólicos e doenças autoimunes. (HENDRIX, 2013). As causas exógenas de uveíte incluem traumas, procedimentos cirúrgicos, lesões perfurantes ou contundentes além de poderem estarem associadas a infecções secundárias (COLITZ, 2005; HENDRIX, 2013). Embora existam diversas causas de uveíte nos cães, a sequência dos eventos inflamatórios é similar independentemente da etiologia (SHUKLA & PINARD, 2012). Os sinais clínicos de uveíte anterior são numerosos, inespecíficos e dependentes da causa. Comumente incluem-se hiperemia conjuntival, flare, edema corneano, diminuição da pressão intraocular (PIO), hifema, precipitados ceráticos, hipópio, blefaroespasmo, miose, epífora, irregularidade na superfície da íris e mudança na coloração da mesma, neovascularização (rubeosis iridis) além da diminuição ou perda da acuidade visual (COLITZ, 2005; TOWNSEND, 2008). 2.2. Alterações oculares primárias Entende-se por alteração ocular primária aquela que não possui uma influência sistêmica por agentes infecciosos, metabólicos, autoimunes, neoplásicos, mas sim causada por fatores externos como traumas, procedimentos cirúrgicos, ceratoconjuntivites imunomediadas e lesões perfurantes ou não perfurantes (COLITZ, 2005). 6 2.2.1. Ceratites ulcerativas A córnea saudável, estrutura localizada no polo anterior do bulbo ocular, juntamente com a lente, é provida de uma propriedade anatômica única, a transparência. Esta permite a entrada de luz em direção ao eixo visual, uma vez que há ausência de vasos sanguíneos, pigmentos e queratinização do epitélio superficial, baixa densidade celular e regularidade no arranjo das fibras de colágeno no estroma (SAMUELSON, 1999; MAGGS, 2008). Além da transparência, a córnea normal é uma superfície lisa, lustrosa e altamente resistente a deformações e traumas (TOWNSEND, 2009; KIERSZENBAUM & TRES, 2012). Histologicamente, em corte transversal, Junqueira & Carneiro (2004) descreveram a córnea em cinco camadas teciduais: epitélio, estroma, membrana de Descemet e endotélio. A presença da cápsula de Bowman, anatomicamente localizada entre o epitélio e o estroma, é variada dentre os vertebrados (SHIVELY & EPLING, 1970). O mesmo autor afirma que a cápsula de Bowman encontra-se intimamente ligada ao estroma, podendo ser considerada como constituinte dele. A córnea canina, desprovida da cápsula de Bowman bem definida, apresenta espessura de 1 a 2 μm (DIESEM, 2006). A ulceração em córnea é uma ocorrência comum no atendimento médico veterinário e pode ter consequências que afetam a integridade total do bulbo ocular, uma vez que a espessura da córnea é inferior a 1 mm e é definida como uma quebra ou ruptura do epitélio corneano (POWELL, 2001; MAGGS, 2008). A inflamação corneal causada por uma úlcera pode desencadear um espasmo ciliar e um processo de iridociclite reflexa – uveíte anterior – devido ao compartilhamento anatômico dos vasos límbicos, estimulação da inervação sensitiva da córnea e, consequentemente, um aumento da vascularização da íris (KERN, 1990; SLATTER, 2005). De acordo com Maggs (2008), as causas mais comumente associadas a ceratites ulcerativas consistem em fatores que diminuem mecanismos de proteção como ceratoconjunitivite seca, deficiências qualitativas do filme lacrimal, meibomites, disfunções palpebrais como lagoftalmia e paralisia dos nervos facial e trigêmeo, além de fatores que culminam em excesso de abrasão, como entrópio, distiquíase, cílios ectópicos, triquíases, tumores palpebrais e blefarites e fatores externos como traumas, corpo estranho e fatores irritantes. 7 Após sofrer uma agressão, a córnea sofre adaptações protetoras semelhantes à pele, com a qual divide a mesma origem embrionária, como queratinização, pigmentação e vascularização, tornando-se opaca (WILCOCK, 2008). Manifestações agudas de inflamação corneal após uma agressão estão relacionadas a processos ulcerativos. Como a córnea é avascular, esta não pode sofrer um processo inflamatório até que haja envolvimento de vasos sanguíneos, uma vez que a inflamação é um processo vascular. Sendo assim, a reação inflamatória perante uma injúria corneal ocorre, primeiramente, no leito vascular disponível mais próximo, normalmente do limbo. Vasos sanguíneos da íris e conjuntiva podem participar da resposta inflamatória dependendo do grau de difusão dos mediadores inflamatórios. No local da lesão há migração de neutrófilos através dos vasos límbicos e conjuntivais. Em casos de contaminação bacteriana ou fúngica esta migração pode ser aumentada (WILCOCK, 2008). 2.2.2. Ceratoconjuntivite seca O filme lacrimal pré corneano é composto por três distintas camadas: lipídica, aquosa e mucoide (BAUNGARTEN et al., 2008). A camada lipídica, mais externa, é composta por ésteres graxos e colesterol, sendo produzida pelas glândulas de meiobômio (glândulas tarsais) e pelas glândulas de Zeiss e possui como função retardar a evaporação da camada aquosa (CABRAL et al., 2005). A camada intermediária é constituída pela parte aquosa, produzida pela glândula lacrimal principal (75%) e pela glândula da terceira pálpebra (25%) e é composta, principalmente, por glicose, sais inorgânicos, proteínas, glicoproteínas e ureia (OHASHI et al., 2006). Sua função é remover corpos estranhos e manter a atividade óptica da córnea (TAFFAREL et al., 2002). A camada interna é constituída pela mucina, produzida pelas células caliciformes da conjuntiva e tem como função auxiliar a porção aquosa a se fixar na superfície ocular, tornando-a hidrofílica, o que resulta em maior hidratação (OHASHI et al., 2006). A ceratoconjuntivite seca ou olho seco é uma enfermidade ocular resultante da deficiência da porção aquosa do filme lacrimal (deficiência quantitativa) ou decorrente da produção inadequada da camada lipídica, resultando na 8 evaporação excessiva da lágrima (deficiência qualitativa). Essa enfermidade é responsável por ocasionar mudanças inflamatórias progressivas na córnea e conjuntiva que, dependendo da gravidade, pode ocasionar cegueira (RIBEIRO et al., 2008). A etiologia da enfermidade não é exata. Possíveis causas de ceratoconjuntivite seca são anomalias congênitas, infecções locais, traumas, inflamação crônica da glândula lacrimal, efeitos tóxicos de fármacos além de causas idiopáticas, neurogênicas e processos autoimunes com predileção racial nos cães da raça Cocker Spaniel (LAUS, 2008). Tanto a conjuntiva como a glândula lacrimal, abundantes em plasmócitos, linfócitos T (maioria CD8), linfócitos B e vasos sanguíneos, são capazes de desenvolverem respostas inflamatória e imune intensas (YAMAMOTO et al., 2006). A inflamação crônica da superfície ocular, nestes casos, é definida, por alguns autores, como sendo secundária à lesão das células epiteliais, causada pela deficiência no filme lacrimal e abrasão conjuntival pelas pálpebras (JONES et al., 1994; BRIGNOLE et al., 2000). Avunduk et al. (2003) admitem que a inflamação da conjuntiva presente na ceratoconjuntivite seca é primária na patogênese da enfermidade, uma vez que após a utilização de lacrimomiméticos e AINEs não se observou a redução da expressão de marcadores inflamatórios na conjuntiva, apenas regressão dos sinais clínicos da enfermidade. Entretanto, em ceratoconjuntivite seca humana foram observados infiltrados linfocitários em biópsias incisionais da glândula lacrimal com predominância de linfócitos T (maioria CD4+) (JABS et al., 2001). Stern et al. (2002) defendem que a presença dessas células contribui para disfunção e eventual destruição da glândula lacrimal, devido à liberação de citocinas pró- inflamatórias. No que se refere às citocinas mediadoras e reguladoras de processos imune e inflamatório na ceratoconjuntivite seca, destacam-se a interleucina 1 (IL- 1) e a interleucina 6 (IL-6) como mediadores da resposta inflamatória de fase aguda, estimulando a síntese de proteínas de fase aguda e a proliferação celular de linfócitos T (GRÖNE et al., 1998; ABBAS & LICHTMANN, 2005). 9 2.2.3. Proptose ocular Por definição, proptose ocular é o deslocamento súbito anterior do bulbo ocular com simultâneo encarceramento pelas pálpebras atrás da região do equador (GELATT, 2003). Dentre as causas mais comum de ocorrência podem ser citadas traumas, problemas dentários, corpos estranhos, neoplasias e predisposições raciais (SMYTHE, 1956; COTTRELL, 1989; BONAGURA, 2000; MANDELL, 2000; GELATT, 2003). Slatter (1990) defende que casos de proptose ocular requerem assistência emergencial por oclusão venosa por compressão palpebral resultando em glaucoma congestivo por estase venosa, além de poder ocorrer necrose em córnea, úlceras em córnea por exposição, irites, coriorretinites, descolamento de retina, luxação de lente e estrabismo. Brandão et al. (2005) em estudo retrospectivo com 45 cães vítimas de proptose ocular observaram que as complicações mais comuns associadas ao quadro foram ceratite ulcerativa, estrabismo, hifema, quemose, hiperemia, hemorragia de conjuntiva e periocular, ressecamento e opacidade da córnea além de fratura nos ossos da face. 2.2.4. Protrusão da glândula da terceira pálpebra Presente na maioria dos animais, exceto em macacos, serpentes e na maioria dos peixes, a terceira pálpebra – também denominada membrana nictitante – é uma estrutura localizada no canto medial interno do olho, entre a córnea e a pálpebra inferior, em cães. Sua função, além de proteção do olho, é produzir, através da glândula localizada em seu interior, parte da camada aquosa do filme lacrimal e distribuí-lo (HERRERA, 2005; HAMOR, 2007; CUNHA, 2008). Também conhecida por cherry eye, é uma afecção que acomete principalmente filhotes de cães com menos de 1 ano de idade frequentemente observada em raças braquicefálicas (MOORE, 1998). Hammor (2007) defende que a etiologia da alteração se relaciona com a frouxidão nas fixações do tecido conjuntivo entre a terceira pálpebra e os tecidos periorbitais. O mesmo autor acredita que é um defeito anatômico com influências genéticas. 10 Hedlund (2008) associa a patologia à adenite primária ou secundária, anormalidades de adesão facial ou a patógenos específicos que comprometem a glândula. Clinicamente esta alteração apresenta-se como uma massa avermelhada no canto medial do olho, com sinais inflamatórios de hiperemia, epífora, hipertrofia glandular, secreção purulenta e conjuntivite (WARD, 1999). 2.2.5. Traumas Lesões oculares traumáticas são a causa frequente do atendimento oftálmico em cães sendo, na maioria das vezes, a causa das úlceras de córnea podendo resultar em perfuração ocular (MAZZI, 2018). Uma ferida penetrante consiste naquela na qual há rompimento parcial de um tecido indo em direção a outro. Já a ferida perfurante consiste numa interrupção total da espessura do tecido (CAMERON, 2006). Galera et al. (2017) identificaram como causas das perfurações oculares na espécie canina: mordeduras, arranhaduras, perfurações por corpos estranhos além de complicações de quadros de ceratoconjuntivite seca. Os mesmos autores definiram achados condizentes com processo inflamatório nos bulbos perfurados de animais submetidos a enucleação como hiperplasia epitelial em córnea, edema corneal, neovascularização corneal superficial e profunda, hifema e infiltrado neutrofílico e linfoplasmocítico. Histologicamente em um trauma perfurante-penetrante agudo ou subagudo há presença de edema nas bordas da ferida e, na interrupção tecidual, oclusão por um plug de fibrina (TURNER, 2010). 2.2.6. Procedimentos cirúrgicos Processos inflamatórios como a endoftalmite ocorrem após trauma ocular, ceratites ulcerativas, secundários a infecções perioculares, ou após cirurgias oculares de forma geral, principalmente as intraoculares, sendo resultado do rompimento da barreira hematoaquosa, permitindo o acesso de agentes infecciosos (VALLE et al. 2010). Na endoftalmite após cirurgias oculares agudas, relata-se como principais microorganismos envolvidos o Staphylococcus coagulase-negativos, Staphylococcus aureus, Streptococcus grupo viridans e, em menor proporção, 11 outros cocos gram-positivos e bacilos gram-negativos. Em casos tardios, os patógenos envolvidos são de baixa virulência, como Propionibacterium acnes, algumas espécies de Streptococcus sp. e fungos (READ, 2011). Comparativamente com a oftalmologia humana, poucos relatos sobre uveítes e endoftalmites secundários a processos cirúrgicos são descritos na oftalmologia veterinária. Bohigian & Olk (1986) descreveram procedimentos cirúrgicos oculares como causadores de endoftalmite em humanos entre 60-66% dos casos. Clinicamente, os pacientes possuíam hiperemia conjuntival, hipópio, edema corneal, quemose, edema palpebral, secreção e diminuição da acuidade visual. Na Medicina Veterinária, Estanislau et al. (2015) relataram um caso de endoftalmite bacteriana severa bilateral em cão após facectomia intracapsular devido à luxação anterior e subluxação da lente, respectivamente nos bulbos direito e esquerdo. Como sinais clínicos observou-se hipópio severo nos dois bulbos oculares, com intensa hiperemia, blefaroespasmo, secreção purulenta no olho direito, bem como hipópio moderados e úlcera em melting no bulbo ocular esquerdo. 2.3. Alterações oculares secundárias Assim como defendido por Hendrix (2013), as neoplasias, agentes tóxicos, metabólicos, doenças autoimunes e infecções sistêmicas são as responsáveis pela maioria dos casos de uveíte na espécie canina. O mesmo autor afirma que as manifestações oculares desencadeadas por doenças sistêmicas consistem, frequentemente, em infecções por T. gondii, Ehrlichia spp., Leishmania spp., Babesia spp., e fungos (HENDRIX, 2011). 2.3.1. Toxoplasmose A toxoplasmose é uma coccidiose zoonótica causada pelo protozoário T. gondii (NICOLLE & MANCEAUX, 1909) de caráter mundial que afeta os animais homeotérmicos (ACHA & SZYFRES, 1995; ULMAN et al., 2008). Os felídeos domésticos e silvestres – hospedeiros definitivos da doença – eliminam os oocistos nas fezes, que após esporularem tornam-se infectantes e são a única fonte de infecção dos animais herbívoros (ULMAN et al., 2008). O ciclo extraintestinal, ou seja, aquele no qual há proliferação de taquizoítos nos órgãos 12 e desenvolvimento de cistos teciduais, ocorre em suínos, caprinos, ovinos e roedores. Uma vez viáveis, os cistos são infectantes tanto para os felinos como para os hospedeiros intermediários, como os seres humanos e cães. Os cães, para se infectarem, ingerem os oocistos presentes no solo (ou alimentos de origem vegetal) ou através dos cistos teciduais presente na carne de animais contaminados (SPARKES, 1998). A transmissão congênita pode ocorrer quando a infecção aguda coincide com a prenhez (VANDERWAGEN et al., 1974). SALB et al. (2008) ressaltaram a importância dos cães acometidos pela doença como sentinelas para avaliação da contaminação ambiental uma vez que, se há uma elevada soropositividade em determinada região, o ambiente em que estes animais vivem provavelmente está contaminado por oocistos ou pelo alimento ofertado a eles. Este alimento, carne crua ou mal-cozida, contendo os cistos do parasita, podem, inclusive, ser a mesma fonte alimentar de humanos. A manifestação clínica da doença varia conforme a imunocompetência do animal, carga parasitária infectante do microrganismo e doenças concomitantes sendo que, os órgãos mais afetados pelo protozoário incluem os olhos, cérebro, pulmão, fígado e músculos esqueléticos (AZEVEDO, 2017). Apesar dos estudos neste assunto serem escassos, a toxoplasmose destacou-se como uma importante doença causadora de uveíte em estudo realizado por Rodrigues (2020), no qual se observou dentre 75 cães com alterações oculares que 52% foram reagentes para as imunoglobulinas IgM e IgG, por meio de Reação de Imunofluorescência Indireta. Dentre estes, 72% apresentaram anticorpos da classe IgG e 87% para a classe IgM. Chavikin et al. (1994) afirmam que a uveíte secundária à toxoplasmose é, geralmente, induzida por citólise decorrente da replicação da forma taquizoíta do parasita e pela deposição intraocular de imunocomplexos, assim como migração para os olhos de linfócitos B e plasmócitos sensibilizados produzindo assim, anticorpos. Em estudo realizado por Abreu et al. (2001) no qual se realizou infecção experimental de diferentes cepas de T. gondii em cães jovens e então avaliação de sinais clínicos, análises clínicas e a correlação entre os títulos de anticorpos obtidos, observou-se em exame de fundoscopia ocular, áreas de hiperrefletividade, papiledema, edema perivascular e exsudato peripapilar bilateral. Neste mesmo trabalho notou-se alterações no perfil bioquímico de 13 proteína total, albumina e glicose porém, os autores relataram a restrição de estudos que analisam exames hematológicos e perfis bioquímicos da infecção toxoplásmica canina dificultando assim, avaliações comparativas de resultados obtidos. 2.3.2. Erliquiose Em diferentes regiões do Brasil as doenças transmitidas por carrapatos possuem grande impacto na saúde animal dada a ampla distribuição das hemoparasitoses no Brasil (COSTA et al., 2015; GOTTLIEB et al., 2016). O principal vetor das hemoparasitoses no Brasil é o carrapato da espécie Riphicephalus sanguineus – popularmente conhecido por carrapato vermelho do cão - transmissor dos agentes etiológicos como Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Babesia vogeli, Babesia spp, Rangelia vitalii, Rickettsia spp, Hepatozoon canis e Bartonella vinsonii (SANTOS et al., 2009; ARAES-SANTOS et al., 2015; GUEDES et al., 2015). A erliquiose canina é uma doença transmitida por carrapatos tendo como agente etiológico a bactéria Rickettsia Ehrlichia canis – bactéria gram-negativa intracelular obrigatória com tropismo por células hematopoiéticas - e é mundialmente distribuída, principalmente em áreas tropicais e subtropicais (GOLDMAN et al., 1998; SKOTARCZAK, 2003; GAFF et al., 2013). Sua primeira descrição é datada de 1935 em Algeria (DONATIEN & LESTOQUARD, 1935). Embora a E. canis seja a espécie com a maior distribuição mundial, outras espécies do mesmo gênero são causadoras da doença: E. chaffeensis, E. muris, E. ruminatium e E. ewingii (LITTLE, 2010). Os cães acometidos pela erliquiose possuem uma grande variedade de sinais clínicos, podendo se categorizar a doença em fase aguda (1-3 semanas), subclínica (média de 11 semanas) e crônica (SKOTARCZAK, 2003). Os sinais clínicos mais descritos consistem em depressão, letargia, perda de peso, anorexia, pirexia, linfadenomegalia, esplenomegalia e sinais oculares (BREITSCHWERDT, 1995). As lesões oculares, segundo Martin (1999), são uma característica comum da erliquiose canina e podem estar presentes em todas as fases da doença, embora sejam dependentes da severidade da enfermidade e não ocorrem em todos os pacientes. 14 As lesões nos tecidos oculares em cães com o diagnóstico confirmado de erliquiose ocorreram em aproximadamente 37% dos casos, segundo estudo de Leiva et al. (2005). As lesões oftalmológicas secundárias podem ser encontradas em quase todas as estruturas oculares, incluindo conjuntivites, petéquias/equimoses em íris e/ou conjuntiva, edema corneal, panuveíte, hifema, glaucoma secundário, neurite óptica, hemorragias retinianas e descolamento de retina (COLLINS & MOORE, 1991; BREITSCHWERDT, 1995). Leiva et al. (2005) destacaram que as principais lesões oculares encontradas em seu estudo retrospectivo com 46 cães acometidos pela erliquiose foram a panuveíte e descolamento de retina. Os mesmos autores ressaltam que 11 cães dos 46 estudados (23,9%) apresentavam apenas lesões oculares como queixa pelos tutores e não possuíam sinais sistêmicos identificáveis da doença pelo exame físico e clínico- patológico, o que consolida a importância dos sinais oculares como, muitas vezes, o único sinal clínico identificável, além da possibilidade da erliquiose estar se apresentando sob a forma subclínica. Como mecanismo da patogenia e subsequente sangramento intraocular causado pela erliquiose, sugere-se envolvimento da hiperviscosidade sanguínea, elevação da pressão oncótica, vasculite e disfunção plaquetária (HARRUS et al., 1998). Os efeitos da hiperviscosidade sérica favorecem a tendência ao sangramento por meio da interferência física com plaquetas e fatores de coagulação sanguínea, danos ao endotélio vascular e estase venosa (HARRUS et al., 1998). Clinicamente os efeitos da hiperviscosidade refletem em dilatação e tortuosidade dos vasos sanguíneos retinianos, sangramento tanto em segmento anterior como posterior além do descolamento da retina (BREITSCHWERDT, 1995). O hifema e retinopatia hipertensiva, nesses casos, podem estar secundariamente associados aos fatores de alterações isquêmicas promovidas pela hiperviscosidade e elevação da pressão oncótica (CURTIS et al.; 1991). Ainda se ressalta a importância da deposição de imunocomplexos nas paredes dos vasos oculares como causa de lesões oftálmicas (PANCIERA et al., 2001). 15 As alterações hematológicas comumente associadas à erliquiose, segundo Breitschwerdt (1995) incluem trombocitopenia, anemia e leucopenia discretas durante o estágio agudo, trombocitopenia discreta no estágio subclínico, e pancitopenia no estágio crônico grave, enquanto no perfil bioquímico, as alterações mais comuns foram a hipoalbuminemia e hiperglobulinemia, associadas a resposta imune exacerbada e hiperviscosidade sérica (WOODY & HOSKINS, 1991). A anemia, nos quadros de erliquiose, relaciona-se a diversos mecanismos, incluindo hemólise, hipoplasia ou aplasia medular após supressão de citocinas da hematopoiese na medula óssea (DE TOMMASI et al., 2014). Já a trombocitopenia, que muitas vezes contribui para quadros de sangramento em cães com doença aguda ou crônica, está associada à diminuição na produção das plaquetas, ao sequestro das mesmas, aumento do consumo e ainda à redução da migração plaquetária por aumento da secreção inibitória pelos linfócitos expostos aos patógenos (LITTLE, 2010). Panciera et al. (2001), em estudo histopatológico ocular em cães portadores de erliquiose, observaram como infiltrados inflamatórios predominantes o linfocítico, monocítico e plasmocítico sendo que as estruturas mais acometidas pela inflamação tanto em prevalência como intensidade foram, respectivamente, o corpo ciliar, coróide, íris e retina. 2.3.3. Leishmaniose O agente etiológico da leishmaniose, descoberto e descrito por William Boog Leishman e Charles Donovan em 1903 – em humanos - é um protozoário do gênero Leishmania (LEISHMAN, 1903). Contudo, no Brasil, a leishmaniose canina foi observada por Evandro Chagas a partir da demonstração da existência da doença no homem e no cão e a infecção do flebótomo Lutzomyia longipalpis. O parasita foi, então, classificado como Leishmania chagasi (CHAGAS, 1936; CHAGAS et al., 1938). A distribuição geográfica da doença abrange todos os continentes, com exceção da Antártica e Oceania (WHO, 1990) e a notificação obrigatória de casos positivos para leishmaniose no Brasil começou em 1978 (FUNASA, 1999). Lewis (1971) definiu que as Leishmanias spp são transmitidas aos animais e ao homem pela picada do inseto da ordem Díptera e família Psychodidae, 16 denominados popularmente por flebótomos por pertencerem ao gênero Phlebotomus; insetos presentes na Europa. Já na América Central e América do Sul a espécie transmissora da leishmaniose visceral canina (LVC) é a Lutzomyia longipalpis (GONTIJO & MELO, 2004). Os sinais clínicos nos cães acometidos são bem documentados, apesar de inespecíficos, e incluem apatia, anorexia, perda de peso, dermatopatias (descamações, úlceras, pústulas, alopecia, onicogrifose), artropatias como poliatrite e nefropatias (CIARAMELLA et al., 1997). Os sinais oculares são frequentes na leishmaniose canina e incluem ceratoconjuntivite seca (PEÑA et al., 2000), uveíte (ANDRADE et al., 2009) e coriorretinite (BRITO et al., 2010). Contudo, diferentemente dos sinais da erliquiose canina descritos anteriormente, a manifestação ocular não é a queixa principal dos tutores uma vez que ocorrem, majoritariamente, associadas aos outros sinais sistêmicos da doença (PEÑA et al., 2000). A patogenia das alterações oculares na doença não é completamente estabelecida. A presença do parasita no local da lesão justifica o padrão inflamatório sendo frequente o padrão linfoplasmocítico, principalmente na conjuntiva dos cães, provavelmente pela atividade linfóide que o tecido possui (BRITO et al., 2010). O mesmo autor sugere como mecanismo fisiopatológico das lesões oculares a formação de imunocomplexos, também responsáveis por lesões vasculares periféricas - pontas de orelhas, cotovelos, coxins plantares – além da produção de anticorpos a partir do estímulo antigênico das formas amastigotas. O depósito de imunocomplexos em estruturas oculares pode ser o desencadeador dos sinais de lesões oculares como blefarite, ceratoconjuntivite, edema de córnea, formação de sinéquias, lesões em corpo ciliar e íris, uma vez que há presença de anticorpos específicos para Leishmania em vários tecidos intraoculares, podendo significar lesões de origem imunopatológica (GARCIA- ALONSO et al., 1996; CIARAMELLA et al.,1997; FERRER, 1999; BRITO et al., 2010). Eguchi et al. (2017) relataram um caso de ceratoconjuntivite nodular em leishmaniose canina após apresentação clínica de nódulo bilateral em conjuntiva bulbar (região de limbo) e em terceira pálpebra além de linfoadenomegalia em linfonodos pré-escapulares e poplíteos. Após realização de punções aspirativas 17 por agulha fina do nódulo conjuntival e de terceira pálpebra foram identificadas formas amastigotas de Leishmania spp., intracitoplasmáticas e livres. Em relação à produção de citocinas inflamatórias na LVC, tanto a IL-10 como a TGF-β estiveram presentes em animais sintomáticos e assintomáticos em estudo de Corrêa et al. (2006). Destaca-se a IL-6, como um dos mais importantes mediadores de resposta inflamatória aguda, produzida em níveis mais expressivos em animais com leishmaniose em comparação a animais não infectados (LIMA & PEIRÓ, 2006). 2.3.4. Leptospirose A leptospirose é uma antropozoonose direta causada por bactérias espiroquetas do gênero Leptospira spp. (GREENE et al., 2006), que acomete diversas espécies de animais domésticos e silvestres, de forma aguda ou crônica (LEMOS et al., 2012), podendo resistir no meio ambiente por até 180 dias, em condições adequadas para sua sobrevivência (PICARDEAU, 2013; POLACHINI & FUJIMORI, 2015). Esta doença é classificada por Mascolli et al. (2016) entre aquelas relacionadas ao saneamento ambiental inadequado, associada ao crescimento desordenado dos centros urbanos, falta de saneamento básico, migrações, e acúmulo de lixo, fatores estes que favorecem o crescimento da população de roedores (reservatórios naturais da doença) (LIMA et al., 2018), enquanto os cães são considerados animal sentinela no ciclo biológico da leptospirose (BIER et al., 2013; ORNELLAS, 2017). Os sinais clínicos da doença variam de acordo com a faixa etária, imunidade e virulência do sorovar, sendo que os casos menos graves exibem febre, anorexia, desidratação, vômito e apatia; e a forma crônica não é aparente, levando à insuficiência renal crônica, uma vez que a doença se mantém nos túbulos renais dos hospedeiros (SANTIM et al., 2006). A microaglutinação (microscopic agglutination test – MAT) é a prova diagnóstica de referência para a leptospirose canina, realizada com antígenos vivos e objetivando detectar anticorpos nos soros dos indivíduos (HARRMAN et al., 1984). 18 Foi relatado por Polachini & Fujimori (2015), transmissão conjuntival de leptospirose entre a urina de um cão positivo para a doença e uma pessoa, durante a contenção física do paciente. Em cães, juntamente com outros agentes infecciosos, a Leptospira spp. é uma causa de uveíte (SLATTER, 2005), e a sintomatologia ocular pode se manifestar como lacrimejamento, descarga ocular mucopurulenta, reflexos pupilares diminuídos, conjuntivite, panuveíte, injeção escleral, flare aquoso, hifema, descolamento e hemorragia retiniana (SCHULLER et al., 2015). Em equinos, as infecções por Leptospira spp. são as mais relevantes dentre as causas infecciosas de Uveíte Recorrente Equina (URE), uma patologia multifatorial e causa frequente de cegueira em cavalos e mulas (SOUSA JÚNIOR, 2020). Já foram identificados no fluido ocular destas espécies, anticorpos específicos contra duas proteínas encontradas na Leptospira spp. (LruA e LruB) (VERMA et al., 2005; KHURANA et al., 2016). 2.4. Proteínas inflamatórias de fase aguda As proteínas, base da estrutura de células, tecidos e órgãos, são substâncias essenciais à vida. Dentre as suas variadas funções desempenhadas, destacam-se a catalização enzimática em reações bioquímicas, o transporte de constituintes séricos como a tiroxina e a bilirrubina não conjugada e na defesa do organismo sob a forma de anticorpos (ECKERSALL, 2008; GARCIA et al., 2002). As proteínas plasmáticas totais compreendem a albumina, globulina e o fibrinogênio. Esta última está ausente nas proteínas séricas totais, em decorrência de seu consumo durante o processo de coagulação sanguínea. As globulinas são constituídas pelas frações proteicas alfa, beta e gamaglobulinas (α, β e γ), as quais ainda podem ser subdivididas em duas bandas (α1, α2, β1, β2, γ1 e γ2) (ECKERSALL, 2008). A síntese de todas as proteínas supracitadas dá-se, principalmente, no fígado, com exceção das imunoglobulinas, que são sintetizadas pelos plasmócitos no tecido linfoide em resposta à estimulação antigênica, sendo inclusas nas frações beta e gamaglobulina (β e γ) (BUSH, 2004). As proteínas de fase aguda (PFA), identificadas no início do século XX como principais reagentes a doenças infecciosas, consistem em um grupo de proteínas cuja concentração sanguínea se altera rapidamente em decorrência 19 de processos infecciosos, estresse e danos teciduais (CANOVA et al. 1999; CRAY, 2012). As PFA fazem parte da resposta de fase aguda, sendo fundamental para imunidade inata e demonstram ser importantes biomarcadores em processos de inflamação, infecção, neoplasia, estresse e trauma (CRAY, 2012). As PFA são produzidas, principalmente, pelos hepatócitos após estímulo de citocinas pró- inflamatórias liberadas em maior número pelos macrófagos (CERÓN et al., 2005). Entretanto, o mesmo autor relata outros sítios menos comuns de produção de PFA, incluindo rins, intestinos, coração, pulmão, baço, tecido adiposo e leucócitos. Embora o fato de a denominação destas proteínas remeter a processos inflamatórios/infecciosos agudos, em casos de cronicidade das lesões, os níveis das PFA permanecem alterados em comparação aos animais saudáveis (GRUYS et al., 2005). Em relação à idade e sexo dos animais, não há indícios de influência nas concentrações de PFA, com exceção de gestantes, devido ao estado inflamatório induzido pela presença embrionária no endométrio (CALDIN et al., 2009). A classificação das PFA pode ocorrer de acordo com sua concentração plasmática, seu mecanismo de ação ou de síntese (JAIN et al., 2011) e dimensão da resposta perante o estímulo inflamatório (ECKERSALL & BELL, 2010). Proteína C-reativa (CRP), haptoglobulina (Hp), ceruloplasmina (Cp), amilóide sérica A (SAA), alfa-1-antitripsina (AAT), alfa-1-antiquimiotripsina (AAQ), alfa-1 glicoproteína ácida (APG), fibrinogênio, protrombina, fator de Von Willebrand, plasminogênio e fatores do complemento (C2, C3, C4, C5) são exemplos de PFA positiva cujas concentrações sanguíneas se elevam a partir do aumento de sua produção pelos hepatócitos por estímulo específico de citocinas (IL-1, IL-6 e TNF-α). As proteínas cujas concentrações sanguíneas diminuem durante o processo inflamatório são chamadas PFA negativa – albumina, transferrina, transtiretina, a transcortina e a proteína de ligação do retinol (CERÓN et al., 2005; ECKERSALL, 2008; JAIN et al., 2011). De acordo com o modo de ação das PFA, Jain et al. (2011) as classificam em inibidoras das proteases: AAT e AAQ; proteínas da coagulação: fibrinogênio 20 e protrombina; proteínas do sistema complemento: C2, C3, C4, C5; proteínas de transporte: Hp e Cp; e em demais proteínas são inclusas a CRP, SAA e AGP. Como mecanismo de síntese, Jain et al. (2011) classificam as PFA como sendo proteínas produzidas devido a resposta de fase aguda, que estimula sua produção pelos hepatócitos e pela estimulação extra-hepática com a produção pelas células epiteliais, células endoteliais e tecido conjuntivo. A classificação das proteínas de fase aguda de acordo com a dimensão da resposta a um estímulo inflamatório pode ser realizada considerando “major” as que são encontradas em baixas concentrações basais séricas (<1μg/L) em cães saudáveis e aumentam de 100 a 1000 vezes a partir de um estímulo, com seu pico de 24h a 48h e declínio rápido na fase de recuperação. As proteínas classificadas como “moderate” aumentam de cinco a 10 vezes a partir de sua ativação, com pico de dois a três dias e declínio mais lento que as PFA “major”. As PFA “minor” alcançam um aumento entre 50% e 100% dos valores basais (ECKERSALL & BELL, 2010). Os biomarcadores são definidos como características biológicas que podem ser objetivamente mensuradas e avaliadas como indicadores de processos biológicos fisiológicos ou patogênicos, de acordo com o National Institutes of Health (agência governamental do departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos da América) (ETTINGER & PROSEK, 2010), ou seja, são tecnologias que podem auxiliar na previsão, diagnóstico, causa, progressão, regressão ou o resultado do tratamento de uma doença (ECKERSALL & BELL, 2010). Nas últimas décadas, as PFA têm sido utilizadas como biomarcadores para diferenciar estágios de doenças assim como para fornecer informações sobre a evolução da enfermidade e resposta ao tratamento clínico e/ou cirúrgico utilizado (CALDIN et al., 2009). Um teste bioquímico deste tipo deve apresentar elevada sensibilidade, ou seja, deve detectar pelo menos 85% do(s) grupo(s) alvo. Deve também apresentar um nível razoável de especificidade sendo este discutível, mas assume-se que será razoável se exceder 80-85% (OYAMA, 2009). Recentemente tem-se demonstrado interesse no uso das PFA na Medicina Veterinária devido a sua aplicabilidade clínica como marcador biológico em diversas situações patológicas como pancreatites, resposta inflamatória 21 sistêmica, neoplasia mamária, piometra, doença periodontal, linfoma, doenças cardíacas, gastrite, anemia hemolítica imunomediada, alterações endócrinas e outras situações (CALDIN et al., 2009; ECKERSALL & BELL, 2010; SIMÕES, 2016; CYRINO, 2020). Contudo, observa-se que a concentração sérica das PFA está estritamente relacionada à gravidade do processo inflamatório, sendo assim, utilizá-la como biomarcador inflamatório ainda que de forma inespecífica, facilita o diagnóstico precoce da inflamação, prognóstico e monitoramento da doença, proporcionando o retorno da homeostase de forma mais rápida, principalmente nos casos nos quais os sinais clínicos não são observados (GARCIA et al., 2002). Na Medicina Veterinária, variações nos níveis das PFA em resposta a quadros inflamatórios nas diferentes espécies têm sido motivos de estudo. As principais PFA em bovinos são a SAA e Hp, e em equinos, a SAA (MARTÍNEZ- SUBIELA et al., 2001). Em cães, as principais PFA descritas são a proteína C-reativa, albumina, transtirretina, transferrina, fibrinogênio, ferritina, Hp, GPA, SAA e Cp (JAIN et al., 2011). Entretanto, a PFA considerada uma das mais importantes nos seres humanos e na espécie canina é a CRP, sendo caracterizada por apresentar baixos níveis fisiológicos e um rápido e acentuado aumento em casos de um estímulo inflamatório sistêmico (KJELGAARD-HANSEN, 2004). 2.4.1. Resposta de fase aguda - processo inflamatório A reposta de fase aguda (RFA) consiste em um conjunto de reações locais e sistêmicas as quais têm por objetivo limitar a lesão tecidual, isolar e destruir microrganismos além de ativar processos para restaurar a homeostase no organismo (GARCIA et al., 2002). As reações sistêmicas desencadeadas por uma RFA são geradas por meio de mediadores – interleucinas e interferons - que atuam em receptores específicos de diferentes células alvo os quais são produzidos e liberados após o estímulo desencadeado pela agregação plaquetária, vasodilatação, acúmulo e ativação de granulócitos e células mononucleares numa reação local promovendo aumento da quimiotaxia proporcionando efeitos imunomoduladores 22 auxiliando na redução de danos oxidativos (GARCIA et al., 2002; NAKAMURA et al. 2008; CRAY, 2012). No local da lesão, macrófagos, monócitos, neutrófilos, linfócitos, fibroblastos, células endoteliais e epiteliais estimulam a liberação principalmente da interleucina 1 (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF), consideradas as interleucinas primárias. Estas, por sua vez induzem a liberação de mais interleucinas, com destaque para a IL-6, considerada a principal indutora da produção da proteína C-reativa pelos hepatócitos na espécie canina (GABAY & KUSHNER, 2001; GARCIA et al., 2002). Dentre os efeitos sistêmicos da RFA observa-se dor, febre, leucocitose, aumento da velocidade de hemossedimentação, ativação do sistema complemento e da cascata de coagulação e mudança e mudanças na concentração de proteínas sanguíneas – PFA (NAKAMURA et al., 2008). O processo inflamatório na estrutura ocular é particularmente especial uma vez que danos que gerariam pouca ou nenhuma sequela em demais órgãos, podem causar grandes consequências nas estruturas do bulbo. Para tanto, o olho possui um mecanismo organizado de sinalização e ativação de células inflamatórias denominado Desvio Imunológico Associado à Câmara Anterior (ACAID). O ACAID baseia-se na liberação local de citocinas as quais são responsáveis por modificar a expressão de moléculas específicas em células apresentadoras de antígenos (APCs). Assim, ocorre um desvio na resposta inflamatória comparativamente àquela que ocorreria em demais órgãos (ENGLISH & GILGER, 2013). Neste processo, as APCs presentes no olho recebem influência de citocinas locais liberadas após injúrias inflamatórias de baixa severidade e migram para órgãos linfóides primários e coativam linfócitos CD8+ regulatórios, os quais são capazes de modular a resposta de hipersensibilidade tardia e assim, minimizar efeitos colaterais da imunidade inata e adaptativa (ESSON et al., 2009; ENGLISH & GILGER, 2013). No caso de uma injúria ocular severa, ocorre um desbalanço inflamatório e a ruptura da barreira hematoaquosa juntamente com a neovascularização permitem a infiltração de APCs do sangue periférico, conferindo uma resposta inflamatória semelhante à de outros órgãos (ENGLISH & GILGER, 2013). 23 No mecanismo inflamatório de uma lesão ocular ocorre, através da ação da enzima fosfolipase A2, a liberação do ácido araquidônico pelo tecido celular que, após ação das enzimas cicloxigenase (COX-1) e lipoxigenase (LOX) é convertido em prostaglandinas (PGD2, PGE, PGF2-alfa), tromboxanos e prostaciclinas (PGI2), enquanto a LOX o converte em leucotrienos, hidroperóxido e hidroxieicosatetranóicos (SPARKES et al., 2010). As prostaglandinas são responsáveis pela quebra da barreira hematoaquosa pela dilatação e justaposição do epitélio do corpo ciliar, desencadeando os sinais inflamatórios como dor, redução da pressão intraocular (PIO), hiperemia conjuntival, miose e aumento de permeabilidade vascular, gerando um acúmulo de proteínas plasmáticas e componentes celulares denominado flare aquoso, o qual é responsável pela característica turva no humor aquoso (RIBEIRO & SCHRODER, 2015) sendo que a PGE2 é a prostaglandina mais importante, pois atua como mediadora dos sinais típicos da inflamação (STAREK, 2011). Em relação aos infiltrados inflamatórios perante uma lesão ocular aguda ocorre, geralmente, exsudato proteináceo eosinofílico nas câmaras oculares e/ou no espaço subretiniano. Simultaneamente, após ativação da cascata de coagulação, há extravasamento de fibrina nestes locais com usual associação a infiltrado neutrofílico. Estas alterações são mais comumente notadas em tramas penetrante-perfurantes com infecção bacteriana, septicemia e infecções fúngicas (ENGLISH & GILGER, 2013). Em processos crônicos com maior associabilidade a doenças autoimunes geralmente os infiltrados linfoplasmocíticos são mais prevalentes. Estas células, por localizarem-se na periferia dos vasos, preserva o tecido conjuntivo adjacente, sem haver destruição tecidual evidente, como num processo séptico (DUBIELZIG et al., 2010). Os infiltrados granulomatosos ocular estão relacionados a processos fúngicos, micobacterioses e corpos estranhos (DUBIELZIG et al., 2010). 2.4.2. Proteína C-reativa A proteína C-reativa (CRP) foi a primeira proteína de fase aguda identificada com níveis aumentados após um processo inflamatório/infeccioso 24 (CERÓN et al., 2005). Sua denominação provém de sua capacidade em se ligar à fração C de polissacarídeos de Pneumococcus, fato este que levou à sua descoberta, em humanos (CERÓN et al., 2005). Como mecanismos de proteção ao organismo, a CRP atua degradando conteúdo nuclear de células danificadas, eliminação de agentes infecciosos por meio da ativação do sistema complemento, secundariamente à ativação da imunidade humoral e celular do organismo (CERÓN et al., 2005). Aumento nas concentrações de CRP em cães já foi relatado em casos de piometra, parvovirose e outras enterites, doença periodontal, dentre outras situações patológicas (ECKERSALL & BELL, 2010; SIMÕES, 2016). Contudo, não foi demonstrada diferença nas concentrações de CRP em cães de diferentes idades (BATHEN-NOETHEN et al., 2008). Classificada como PFA “major”, a CRP tem sido relatada como a mais comumente avaliada em humanos (ECKERSALL & BELL, 2010) e em diversas outras espécies, como o cão, sua concentração sérica pode aumentar rapidamente de <1mg/L a >100mg/L, em resposta a diversas doenças infecciosas (babesiose, leishmaniose, leptospirose, parvovirose e endotoxemia por Escherichia coli) (CERÓN et al., 2005) e a quadros de artrite, linfoma, enterites endotoxêmicas (JERGENS et al., 2003). Partindo de relatos da literatura da Medicina descrevendo aumento da CRP em doenças cardiovasculares, Reimann et al. (2016) relataram discretos aumentos desta em cães com insuficiência cardíaca congestiva, no entanto a severidade da doença valvar mitral mixomatosa assintomática não mostrou associação com as concentrações de CRP. Em cães portadores de leishmaniose a CRP apresentou níveis superiores em animais sintomáticos comparados aos assintomáticos e, em ambos, maiores em relação aos saudáveis (MARTÍNEZ-SUBIELA et al., 2002). Na Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) em cães também foi significativamente maior quando comparada a cães saudáveis e a cães com alterações inflamatórias locais (TORRENTE et al., 2015). Em estudo realizado em cães com doença periodontal de diferentes graus, foi notada aumento da CRP, com posterior redução após tratamento periodontal (SIMÕES, 2016). 25 A CRP foi dosada em cães com diversas desordens e traumas cirúrgicos, e os resultados foram elevados de forma importante de 1 a 2 dias após a cirurgia, na maioria dos cães, e estes níveis foram rapidamente reduzidos quando as suturas foram removidas (YAMAMOTO et al., 1993). Neste estudo, em cães com comorbidades, observou-se maiores valores de CRP na primeira abordagem do paciente, em sua maioria diminuindo conforme a remissão da doença e em raros casos, houve o aumento da CRP mesmo após a melhora do quadro. Os procedimentos cirúrgicos avaliados foram: ovariohisterectomia devido à piometra, ovariohisterectomia eletiva, cirurgias ortopédicas, extrações dentárias e excisões de tumores superficiais, enquanto as desordens não cirúrgicas foram: gastroenterites, enterites bacterianas e hemorrágicas, leptospirose, tumores, dermatopatias, doenças oculares, caquexia e nefrite (YAMAMOTO et al., 1993). Em estudo realizado por Rikihisa et al. (1994), com infecção experimental por E. canis em cães, os autores detectaram aumento gradativo da CRP entre quatro e seis dias pós-inoculação até atingirem o pico entre 15 e 42 dias, quando os sinais da doença estavam instalados. Deste modo, os autores propuseram a hipótese clínica de suspeita de erliquiose quando os níveis de CRP estiverem elevados. Munhoz et al. (2009) avaliaram a CRP na infecção experimental por Ehrlichia canis após o tratamento com cloridrato de doxiciclina e descreveram aumento da CRP antes da manifestação clínica da doença. Essas informações denotam uma importante característica da utilização da CRP, a qual pode ser usada não somente como fator preditivo, mas também pode informar a gravidade do processo patológico. Mylonakis et al. (2011) demonstraram aumento mais intenso de CRP em cães mielossuprimidos perante infecção por erliquiose, em comparação aqueles sem mielossupressão. Com possibilidade de instalação na prática clínica futura, as proteínas de fase aguda possuem importante aplicabilidade na Medicina Veterinária, uma vez que podem ser interpretadas como fatores de morbidade e mortalidade dos pacientes inclusive como parâmetro de monitoração da saúde de animais sadios, detectando doenças subclínicas assim como já ocorre na Medicina (EKCERSALL & BELL, 2010). 26 3. Referências* ABBAS, A. K.; LICHTMANN, A. H. Citocinas. In: ABBAS, A. K.; LICHTMANN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. cap. 11, p. 251-282. ABREU, C. B.; NAVARRO, I. T.; BALAARIN, M. R. S.; BRACARENSE, A. P. F. R. L.; MARANA, E. R. M.; TRAPP, S. M.; TSUTSUI, V. S. Aspectos clínicos, patológicos e sorológicos da toxoplasmose experimental em cães jovens. Semina: Ciências Agrárias. v. 22, n. 2, p.123-130, 2001. ACHA, P. N.; SZYFRES, B. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. 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