RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 29/11/2026. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais (POSMAT) Otimização da detecção do fungicida carbendazim via espalhamento SERS: desempenho de equipamentos de bancada x portátil & substratos líquido x sólido Tatiana Aparecida de Oliveira Presidente Prudente / SP 2024 Tatiana Aparecida de Oliveira Otimização da detecção do fungicida carbendazim via espalhamento SERS: desempenho de equipamentos de bancada x portátil & substratos SERS líquido x sólido Dissertação apresentada como requisito à obtenção do título de Mestre junto à Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Programa de Pós- Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais (POSMAT), área de Ciência dos Materiais, sob orientação do Prof. Dr. Carlos José Leopoldo Constantino e a coorientação da Dra. Grazielle Oliveira Setti Gibin. Presidente Prudente / SP 2024 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Dados fornecidos pelo autor(a). O48o Oliveira, Tatiana Aparecida Otimização da detecção do fungicida carbendazim via espalhamento SERS: desempenho de equipamentos de bancada x portátil & substratos SERS líquido x sólido / Tatiana Aparecida Oliveira. -- Presidente Prudente, 2024 88 p. : il. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Presidente Prudente Orientador: Carlos José Leopoldo Constantino Coorientadora: Grazielle Oliveira Setti Gibin 1. SERS. 2. detecção. 3. Raman de bancada e portátil. 4. Substrato SERS líquido e sólido. ATA DA DEFESA PÚBLICA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE TATIANA APARECIDA DE OLIVEIRA, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE MATERIAIS, DA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA - CÂMPUS DE PRESIDENTE PRUDENTE. Aos 29 dias do mês de novembro do ano de 2024, às 14:00 horas, por meio de Videoconferência, realizou-se a defesa de DISSERTAÇÃO DE MESTRADO de TATIANA APARECIDA DE OLIVEIRA, intitulada Otimização da detecção do fungicida carbendazim via espalhamento SERS: desempenho de equipamentos de bancada x portátil & substratos líquido x sólido. A Comissão Examinadora foi constituida pelos seguintes membros: Prof. Dr. CARLOS JOSÉ LEOPOLDO CONSTANTINO (Orientador(a) - Participação Virtual) do(a) Departamento de Física / Faculdade de Ciências e Tecnologia/Caampus de Presidente Prudente, Prof. Dr. LEONARDO NEGRI FURINI (Participação Virtual) do(a) Departamento de Física / Universidade Federal de Santa Catarina, Prof. Dr. ITALO ODONE MAZALI (Participação Virtual) do(a) Departamento de Química Inorgânica / Universidade Estadual de Campinas. Após a exposição pela mestranda e arguição pelos membros da Comissão Examinadora que participaram do ato, de forma presencial e/ou virtual, a discente recebeu o conceito final: aprovada . Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que após lida e aprovada, foi assinada pelo(a) Presidente(a) da Comissão Examinadora. Prof. Dr. CARLOS JOSÉ LEOPOLDO CONSTANTINO Agradecimentos À minha mãe, Divina, meu pai, Roberto, e meu irmão, Rafael, pela presença constante desde o início da graduação até hoje. À minha mãe, que abdicou de muitas coisas para que eu pudesse realizar meus sonhos, ao meu pai, sempre me apoiando em cada decisão, e ao meu irmão, pelo carinho incondicional. Estou aqui por vocês. Obrigada Deus por iluminar meus dias escuros. Ao meu companheiro, Victor, por estar ao meu lado desde o começo de tudo, dando suporte nos dias felizes e nos dias difíceis. Obrigada por comemorar cada conquista e, principalmente, por apoiar cada uma de minhas decisões. Você é o meu exemplo de pesquisador dentro de casa. Obrigada por me motivar todos os dias. Ao meu orientador, Casé, por toda a orientação acadêmica desde a iniciação científica e agora no mestrado. Obrigada por cada reunião e discussão, que foram essenciais para meu desenvolvimento profissional e pessoal. À Grazielle, por aceitar me coorientar nesse trabalho e contribuir para meu crescimento científico. Sou grata a todos os membros do grupo de pesquisa, que enriqueceram meu percurso acadêmico ao longo desses anos. Aprendi com cada um de vocês lições importantes que levarei para a vida toda. Em especial, agradeço a Isabela e Vitória, por serem parceiras dentro e fora do laboratório. Aos meus amigos da república, obrigada pela paciência ao me ouvirem falar incessantemente sobre esta dissertação e por todo apoio e compreensão. A minha gata Maria que me acompanha desde 2020 me dando suporte emocional. Agradeço também à equipe do Pegasus (cheerleading), que me acolheu na maior parte do mestrado, e a todos que acreditaram em meu potencial para concluir essa etapa. Meu estágio BEPE, financiado pela FAPESP em Portugal, não só enriqueceu minha experiência acadêmica, como também me trouxe amizades valiosas. Aos meus amigos brasileiros Rafael, Pedro, Douglas e Maíza, que além de discutir resultados, foram minha família quando eu estava longe de casa. Obrigada por me esperarem para almoçar todos os dias. Ao Romeu por me ensinar que café pós almoço acaba com os nutrientes da comida. À minha amiga, Mesti, por ter cruzado o meu caminho durante o intercâmbio, pelos conselhos e por me ouvir até hoje. Aos amigos portugueses, Maria, Mariana, Luna, David, Sara, Marta, Guilherme, Cátia, Raquel, e à Zulema (mexicana), obrigada por compartilharem sua cultura e habilidades no dia a dia do laboratório. Estas "raparigas e gajos são fixes" e levarei cada um de vocês no coração. Ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia em Materiais (POSMAT), que possibilitou a realização da minha pós-graduação, e à Faculdade de Ciências e Tecnologia (FCT) UNESP, que foi o cenário dessa jornada acadêmica, deixo meus agradecimentos sinceros. Ao Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), parte do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) pela assistência na obtenção de imagens de microscopia (ID da proposta: 20210495). Ao Centro de Investigação de Materiais (CENIMAT) pela receptividade e suporte durante o estágio de intercâmbio. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Instituto Nacional de Eletrônica Orgânica (INCT/INEO) pelo suporte técnico e financeiro. O presente trabalho foi realizado com financiamento da bolsa de estudos da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processos nº 2022/04020-5 e nº 2023/04786-0, vinculado ao processo n°2018/22214-6. Muito Obrigada. If you want to go fast, go alone, if you want to go far, go together African Proverb RESUMO Essa dissertação visa a detecção do corante cristal violeta (CV) e o fungicida carbendazim (MBC) via SERS a partir da comparação entre equipamentos Raman de bancada e portátil e substratos SERS líquido e sólido. Nanopartículas de prata reduzidas por hidroxilamina (AgNPs H) foram utilizadas como substrato líquido (SL). Foram estudados dois substratos sólidos, denominados aqui SS1 e SS2. O substrato SS1 foi fabricado a partir da imersão de papel de filtro em coloide de nanopartículas de prata reduzida por citrato (AgNPs C) e o substrato SS2 foi fabricado a partir da deposição de AgNPs sobre o papel Whatman utilizando a técnica evaporação por feixe de elétrons (e-beam). As medidas realizadas nos equipamentos Raman de bancada e portátil possibilitaram comparar e otimizar parâmetros de sensibilidade (limite de detecção (LOD) e fator de amplificação (EF)) e reprodutibilidade do sinal em diferentes concentrações de CV e MBC para os substratos SERS. Os resultados com o CV mostraram que o menor valor de LODbancada foi de 4,5×10-10 mol/L para o substrato SL, seguido dos valores 6,0×10-8 (substrato SS1) e 2,6×10-7 (substrato SS2). Ao utilizar o Raman portátil, o menor valor de LODportátil também foi para o substrato SL, com um valor de 2,6×10-9 mol/L, seguido dos valores 7,9×10-7 (substrato SS1) e 1,0×10-6 (substrato SS2). Portanto, o Raman de bancada apresentou os menores valores de LOD para todos os substratos SERS. O Raman de bancada também apresentou melhor desempenho para os valores de EF: 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 2,8×104 (1,8×10-9 mol/L) e 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎= 2,1×104 (1,0×10-8 mol/L). A exceção foi o substrato SS1, com o maior valor de EF em Raman portátil: 𝐸𝐹𝑆𝑆1 𝑝𝑜𝑟𝑡á𝑡𝑖𝑙 = 3,6×103 (1,0×10- 8 mol/L), valor próximo ao obtido no Raman de bancada (𝐸𝐹𝑆𝑆1 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 3,0×103 para a concentração 1,0×10-8 mol/L). A detecção do sinal SERS do MBC também foi realizada com os equipamentos Raman de bancada e portátil com os substratos SL e SS2 (o substrato SS1 não apresentou eficiência em detectar o MBC). O menor valor de LODbancada foi de 1,0×10-8 mol/L para o substrato SL, seguido do valor de 1,7×10-6 mol/L para o substrato SS2. Utilizando o Raman portátil, o menor valor de LODportátil também foi para o substrato SL, 6,0×10-9 mol/L, seguido do valor de 8,2×10-7 mol/L para o substrato SS2. Portanto, o Raman portátil apresentou os menores valores de LOD em todos os substratos SERS. O Raman portátil também apresentou melhor desempenho para valores maiores de EF: 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑝𝑜𝑟𝑡á𝑡𝑖𝑙 = 7,0×102 (1,8×10-7 mol/L) e 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑝𝑜𝑟𝑡á𝑡𝑖𝑙 = 2,1×103 (1,0×10-7 mol/L). Ao utilizar o Raman de bancada, os valores de EF foram de 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 5,4 × 102 (1,8×10-7 mol/L) e 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 1,8 × 103 (1,0×10-7 mol/L). Palavras chaves: SERS; detecção, Raman de bancada e portátil; substratos SERS líquido e sólido. ABSTRACT This dissertation aims at the dye detection of the crystal violet (CV) and the fungicide carbendazim (MBC) via SERS by comparing benchtop and portable Raman equipment on liquid and solid SERS substrates. Hydroxylamine-reduced silver nanoparticles (AgNPs H) were used as liquid substrate (SL) and two solid substrates, SS1 and SS2, were studied. Substrate SS1 was manufactured by immersing filter paper in colloidal citrate-reduced silver nanoparticles (AgNPs C) while substrate SS2 was made by depositing AgNPs on the Whatman paper through electron beam evaporation (e-beam). Benchtop and portable Raman analyses enabled the comparison and optimization of sensitivity parameters (limit of detection (LOD) and enhancement factor (EF)) and signal reproducibility at different concentrations of CV and MBC for the SERS substrates. The results with CV showed that the lowest value LODbench was 4.5×10-10 mol/L for SL substrate, followed by values of 6.0×10-8 (SS1 substrate) and 2.6×10-7 (SS2 substrate). Using the portable Raman, the lowest LODportable was also for the SL substrate, with a value of 2.6×10-9 mol/L, followed by values 7.9×10-7 (substrate SS1) and 1.0×10-6 (substrate SS2). Therefore, the benchtop Raman presented the lowest LOD values for all SERS substrates. The benchtop Raman also performed better in terms of EF values: 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑏𝑒𝑛𝑐ℎ𝑡𝑜𝑝 = 2.8×104 (1.8×10-9 mol/L) and 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑏𝑒𝑛𝑐ℎ𝑡𝑜𝑝 = 2.1×104 (1.0×10-8 mol/L). The exception was substrate SS1, with the highest FE value for the portable Raman: 𝐸𝐹𝑆𝑆1 𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 = 3.6×103 (1.0×10-8 mol/L), a value close to that obtained in the bench Raman (𝐸𝐹𝑆𝑆1 𝑏𝑒𝑛𝑐ℎ𝑡𝑜𝑝 = 3.0×103 for the concentration 1.0×10-8 mol/L). SERS detection of MBC was also performed using benchtop and portable Raman equipment with the SL and SS2 substrates (substrate SS1 did not effectively detect MBC). The lowest LODbenchtop value was 1.0×10-8 mol/L for the SL substrate, followed by a value 1.7×10-6 mol/L for substrate SS2. However, using the portable Raman, the lowest value of LODportable was also for the substrate SL, 6.0×10-9 mol/L, followed by a value of 8.2×10-7 mol/L for substrate SS2. Therefore, the portable Raman showed the lowest LOD values for all SERS substrates. Portable Raman also performed better with higher EF values: 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 = 7.0×102 (1.8×10-7 mol/L) and 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑝𝑜𝑟𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒 = 2.1×103 (1.0×10-7 mol/L). Using the benchtop Raman, the EF values were 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑏𝑒𝑛𝑐ℎ𝑡𝑜𝑝 = 5.4 × 102 (1.8×10-7 mol/L) and 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑏𝑒𝑛𝑐ℎ𝑡𝑜𝑝 = 1.8 × 103 (1.0×10-7 mol/L). Keywords: SERS; detection; benchtop and portable Raman; liquid and solid SERS substrates. LISTA DE FIGURAS Figura 1: diagramas dos níveis vibracionais de energia para o espalhamento Rayleigh e Raman. ..................................................................................................................................................... 17 Figura 2: representação do campo eletromagnético gerado ao redor de duas nanopartículas (dímero) a partir de uma radiação incidente (hνlaser). A região entre partículas dá origem ao chamado hot spots, onde a maior intensidade de linhas de campo elétrico possibilita uma aplicação ainda maior Raman (hνSERS). .................................................................................................... 18 Figura 3: classificação atual dos pesticidas de acordo com a ANVISA. ................................... 23 Figura 4: esquema de sínteses para (A) AgNPs H e (B) AgNPs C. ........................................... 31 Figura 5: esquema de deposição de AgNPs por (A) imersão e (B) e-beam. .............................. 32 Figura 6: esquema de preparação de amostras (A) SL e (B) SS1 e (C) SS2.............................. 36 Figura 7: (A) espectros de extinção das AgNPs C e AgNPs H obtidos após 24 horas da síntese do coloide. (B) Distribuição de tamanho de partículas e valores de potencial zeta de -33,4 e -37,9 mV para as AgNPs C e AgNPs H, respectivamente. ................................................................... 37 Figura 8: (A) espectro de extinção em diferentes concentrações CV (1,8 × 10-5, 1,6 × 10-6, 9,1 × 10-7, 3,6 × 10-7 e 1,8 × 10-9 mol/L). Inset: estrutura molecular e espectro de absorção do CV. (B) distribuição de tamanho em porcentagem de intensidade e (C) potencial zeta das AgNPs na presença de CV. ........................................................................................................................... 39 Figura 9: imagens de MEV do substrato SL (AgNPs H) com aumento de 80 mil vezes (A) escala= 100 nm e (B) escala = 200 nm..................................................................................................... 41 Figura 10: imagens de MEV dos substratos SERS sólido (A) SS1 com AgNPs C depositadas por imersão em papel e (B) SS2 com AgNPs depositadas por e-beam em papel. ............................. 41 Figura 11: espectros Raman e SERS de referência (brancos). (A) Espectros Raman do pó do CV e MBC. (B) Espectros Raman e SERS em equipamento Raman de bancada e portátil do porta amostra e substratos SERS: porta amostra de vidro; substrato SL com AgNPs H + porta amostra; substrato SS1 com AgNPs C dispersas no papel e substrato SS2 com AgNPs evaporadas por e- beam. (C) Imagem dos porta amostras e substratos SERS. ........................................................ 43 Figura 12: espectros SERS do CV obtidos com equipamento Raman de bancada em substratos SL (A), SS1 (C) e SS2 (E). Intensidade SERS vs concentração de CV, utilizando substratos SL (B), SS1 (D) e SS2 (F). Os traços pontilhados em preto são relacionados as atribuições vibracionais do CV e o retângulo pontilhado em vermelho na letra (C) representa a atribuição vibracional da celulose. ............................................................................................................... 45 Figura 13: o LOD foi estimado a partir da equação: SR ≥ 3, em todos os casos, utilizando Raman de bancada. Posteriormente, foi utilizado um cálculo de proporção linear (regra de três) para identificar a concentração de CV que teria o valor de SR = 3. Valor do LOD equivalente ao (A) substrato SL, (B) substrato SS1 e (C) substrato SS2 com CV..................................................... 48 Figura 14: espectros SERS do CV com equipamento Raman portátil em substratos SL (A), SS1 (C) e SS2 (E). Intensidade SERS vs concentração de CV, utilizando substratos SL (B), SS1 (D) e SS2 (F). O asterisco (*) nas letras C e D indicam que essas medidas não tiveram os mesmos parâmetros de tempo de exposição e acumulação, ou seja, as medidas não foram controladas pelo software. Os traços pontilhados em preto são relacionados as atribuições vibracionais do CV e o retângulo pontilhado em vermelho nas letras (C) e (D) representam a atribuição vibracional da celulose. ....................................................................................................................................... 50 Figura 15: o LOD foi calculado a partir da equação: SR ≥ 3, em todos os casos, utilizando Raman portátil. Posteriormente, foi utilizado um cálculo de proporção linear (regra de três) para identificar a concentração de CV que teria o valor de SR = 3. Valor do LOD equivalente ao (A) substrato SL com CV, (B) substrato SS1 com CV e (C) substrato SS2 com CV. O asterisco (*) na letra B indica que essas medidas não tiveram os mesmos parâmetros de tempo de exposição e acumulação, ou seja, as medidas não foram controladas pelo software. ..................................... 53 Figura 16: variação dos valores de EF determinados usando o pico em 1620 cm-1. Equipamento Raman de bancada usando substratos (A) SL e (B) SS1 e (C) SS2 e Raman portátil em substratos (D) SL e (E) SS1 e (F) SS2. O asterisco (*) na letra (E) indica que essas medidas não tiveram os mesmos parâmetros de tempo de exposição e acumulação, ou seja, as medidas não foram controladas pelo software. ........................................................................................................... 54 Figura 17: (A) espectros SERS do CV nas concentrações de 1,8 × 10-5 a 1,8 × 10-9 mol/L (diluídas) com o equipamento Raman de bancada em substrato SL. Espectros obtidos nas mesmas condições experimentais e plotados com correção de linha de base, offset correction e normalizados. (B) Médias das intensidades do pico em 1620 cm-1 (altura do pico). .................. 57 Figura 18: (A) ilustração esquemática das condições que favorecem a geração das isotermas S. Soluto monofuncional sobre substrato polar em solvente polar. Uma molécula de soluto é mais estável e adsorvida em “a”, adjacente a outras moléculas já adsorvidas, do que em “b” sozinha. Resultado: isoterma S. (B) Sistema de classificação isotérmica de Giles. .................................. 58 Figura 19: adsorção do CV na superfície das AgNPs. ............................................................... 60 Figura 20: (A) espectro de extinção em diferentes concentrações MBC (6,5 × 10-6, 2,5 × 10-6, 1,3 × 10-6, 6,5 × 10-7, 6,5 × 10-8 e 6,5 × 10-10 mol/L). Inset: estrutura molecular e espectro de absorção do MBC e extinção das AgNPs H. (B) distribuição de tamanho em porcentagem de intensidade e (C) potencial zeta das AgNPs na presença de MBC. .................................................................. 60 Figura 21: espectros SERS do MBC com equipamento Raman de bancada em substrato SL (A) e (B) intensidade SERS vs concentração de MBC. Os traços pontilhados em preto são relacionados as atribuições vibracionais do MBC. ..................................................................... 62 Figura 22: avaliação do SS1 com AgNPs C e AgNPs H para a detecção do MBC (10-4 mol/L) em substratos SERS sólido. Espectro Raman do pó do MBC (linha preta) para identificar as atribuições dos picos do MBC nos substratos SERS sólidos. As linhas pontilhadas em preto indicam os picos atribuídos ao MBC, comparadas ao espectro Raman do pó do MBC, enquanto os retângulos em azul destacam os picos relacionados à celulose do papel. ............................... 63 Figura 23: espectros SERS do MBC obtidos com equipamento Raman de bancada em substratos SS2 (A) e (B) intensidade SERS vs concentração de MBC. Os traços pontilhados em preto são relacionados as atribuições vibracionais do MBC e o retângulo pontilhado em azul na letra (A) representa a atribuição vibracional da celulose. .......................................................................... 64 Figura 24: (A) espectros SERS do MBC (10-4 mol/L) obtidos em três substratos SERS (SS2 I, SS2 II e SS2 III). (B) Análise de reprodutibilidade do substrato SS2 III ao longo de 60 dias. Os espectros foram coletados periodicamente, e o gráfico de barras exibe a média da intensidade do pico SERS em 1226 cm-1 de 10 espectros. .................................................................................. 67 Figura 25: Região delimitada para realizar o mapeamento SERS do substrato SS2 na presença de MBC a 10-4 mol/L com o laser 633 nm. ................................................................................. 68 Figura 26: mapeamento bidimensional dos espectros SERS nos picos (A) 590 a 650 cm-1 (B) 975 a 1020 cm-1 (C) 1200 a 1250 cm-1 (D) 1250 a 1300 cm-1 (E) 1415 a 1480 cm-1 e (F) 1480 a 1555 cm-1. ............................................................................................................................................. 69 Figura 27: o LOD foi estimado a partir da equação: SR ≥ 3, em todos os casos, utilizando Raman de bancada. Posteriormente, foi utilizado um cálculo de proporção linear (regra de três) para identificar a concentração de MBC que teria o valor de SR = 3. Valor do LOD equivalente ao (A) substrato SL e (B) substrato SS2 com MBC. .............................................................................. 70 Figura 28: espectros SERS do MBC com equipamento Raman portátil em substratos SL (A) e SS2 (C). Intensidade SERS vs concentração de MBC, utilizando substratos SL (B) e SS2 (D). Os traços pontilhados em preto são relacionados as atribuições vibracionais do MBC e o retângulo pontilhado em azul na letra (C) representa a atribuição vibracional da celulose. ....................... 71 Figura 29: o LOD foi estimado a partir da equação: SR ≥ 3, em todos os casos, utilizando Raman portátil. Posteriormente, foi utilizado um cálculo de proporção linear (regra de três) para identificar a concentração de MBC que teria o valor de SR = 3. Valor do LOD equivalente ao (A) substrato SL e (B) substrato SS2 com MBC. .............................................................................. 73 Figura 30: variação dos valores de EF determinados usando o pico em 1226 cm-1 em Raman de bancada usando substratos (A) SL e (B) SS2. Variação dos valores de EF determinados usando o pico em 1229 cm-1 em Raman portátil usando substratos (C) SL e (D) SS2. ............................. 75 Figura 31: (A) amostra após a diluição de MBC em AgNPs H (substrato SL). (B) Amostra após as medidas realizadas no Raman de bancada e portátil. (C) Amostras após 24 horas de diluição. ..................................................................................................................................................... 77 Figura 32: estruturas otimizadas de diferentes espécies químicas de MBC que podem existir em solução aquosa dependendo do pH. ............................................................................................ 78 Figura 33: adsorção do MBC na superfície das AgNPs H. ........................................................ 78 FIGURAS DO ANEXO Figura A1: (A) espectro SERS do MBC nas concentrações 10-4 a 10-7 mol/L, utilizando o laser 633 nm do Raman de bancada. (B) Intensidade SERS em relação a concentração no pico em 1226 cm-1 (estiramento C-C e deformação N-H)....................................................................................87 Figura A2: mapeamento tridimensional do substrato SS2 com MBC na concentração 10-4 mol/L. Análise completa do mapeamento dos espectros SERS em diferentes regiões do substrato SS2................................................................................................................................................88 LISTA DE TABELAS Tabela 1: revisão bibliográfica da detecção do CV via SERS (Web of Science outubro de 2024). ..................................................................................................................................................... 22 Tabela 2: revisão bibliográfica da detecção do MBC via SERS (web of Science outubro de 2024). ..................................................................................................................................................... 25 Tabela 3: resumo das equações de EF. ....................................................................................... 28 Tabela 4: valores referentes a diluição de CV e MBC e suas respectivas concentrações finais. 34 Tabela 5: parâmetros de análises de substratos SERS para a detecção de CV e MBC. ............. 35 Tabela 6: atribuições dos picos vibracionais do espectro SERS do CV em SL. ........................ 46 Tabela 7: valores das intensidades absolutas do sinal SERS do CV em 1620 cm-1 no equipamento Raman de bancada em substratos (A) SL, (B) SS1 e (C) SS2. ................................................... 46 Tabela 8: valores das intensidades absolutas do sinal SERS do CV em 1620 cm-1 no equipamento Raman portátil em substratos (A) SL, (B) SS1 e (C) SS2. ......................................................... 51 Tabela 9: dados utilizados para calcular o valor de EF em diferentes concentrações de CV em substratos SL, SS1 e SS2 utilizando (A) Raman de bancada e (B) Raman portátil. ................... 56 Tabela 10: atribuições dos picos vibracionais do espectro SERS do MBC em substratos SL e SS2. ..................................................................................................................................................... 65 Tabela 11: valores das intensidades absolutas do sinal SERS do CV em 1229 cm-1 no equipamento Raman de bancada em substratos (A) SL e (B) SS2. .................................................................. 66 Tabela 12: valores das intensidades absolutas do sinal SERS do MBC em 1229 cm-1 no equipamento Raman portátil em substratos (A) SL e (B) SS2. ................................................... 72 Tabela 13: dados utilizados para calcular o valor de EF em diferentes concentrações de MBC em substratos SL e SS2 utilizando (A) Raman de bancada e (B) Raman portátil. ............................ 76 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LMR Limite Máximo de Resíduos ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária MBC Carbendazim SERS Surface-Enhanced Raman Scattering AgNPs Nanopartícula de prata AuNPs Nanopartícula de ouro CV Cristal violeta WT Papel Whatman AgNPs H Nanopartícula de prata, hidroxilamina AgNPs C Nanopartícula de prata, citrato SL Substrato SERS líquido SS1 Substrato SERS sólido 1 SS2 Substrato SERS sólido 2 e-beam Evaporação térmica assistida por feixe de elétrons UV–Vis Espectroscopia no ultravioleta visível DLS Espalhamento dinâmico de luz MEV Microscopia eletrônica de varredura PdI Índice de polidispersividade R6G Rodamina 6G EF Fator de amplificação LOD Limite de detecção SiO2@Ag Nanoesferas de dióxido de silício revestidos de nanopartículas de prata ZnO NRs Nanobastões de óxido de zinco MAg NPs Nanopartículas de prata multiformes Au@Ag-4ABT NP Nanopartículas de ouro revestidas de prata com núcleo-casca funcionalizado com 4-aminobenzenotiol AuNS@Ag Nanoestrelas de ouro revestidas com prata (formato final esférica) Au@PB@Ab Nanoesferas de ouro revestidas com azul da Prússia Au@MB@Au@Ab Nanoesferas de ouro revestidas com 4-mercaptobenzonitrila AuNRs Nanobastões de ouro Au@Au@Ag Nanopartículas de casca dupla de ouro e prata PSS-Au BPs Nanobipirâmides de ouro funcionalizadas com sulfonato de poliestireno GO-Ag-Ll Nanopartículas de prata com óxido de grafeno depositados por imersão em Ll. Hag/Ag Nanocompósito de hidroxiapatita dopado com prata SUMÁRIO 1. Introdução .......................................................................................................................... 16 1.1. Apresentação da dissertação ..................................................................................... 16 1.2. Técnica de detecção ................................................................................................... 16 1.3. Substratos SERS líquido e sólido ............................................................................... 19 1.5. Molécula alvo ............................................................................................................ 21 1.5.1. Cristal violeta .................................................................................................... 21 1.5.2. Carbendazim ..................................................................................................... 22 1.6. Limite de detecção ..................................................................................................... 26 1.7. Fator de amplificação ................................................................................................ 26 2. Objetivos ............................................................................................................................ 29 2.1. Objetivo geral ............................................................................................................ 29 2.2. Objetivos específicos .................................................................................................. 29 3. Procedimento experimental .............................................................................................. 29 3.1. Materiais .................................................................................................................... 29 3.2. Síntese de nanopartículas de prata (AgNPs) como substratos SERS líquido ............ 30 3.3. Preparação dos substratos SERS sólidos em papel ................................................... 31 3.4. Medidas de UV–Vis, potencial zeta e tamanho de partícula ..................................... 33 3.5. Medidas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) ......................................... 34 3.6. Medidas Raman e SERS ............................................................................................. 34 4. Resultados e discussões ..................................................................................................... 36 4.1. Caracterização no UV–Vis, DLS e potencial zeta do substrato SL com AgNPs H e AgNPs C .................................................................................................................................. 36 4.2. Imagens de MEV dos coloides de AgNPs H e AgNPs C e dos substratos SS1 e SS2. 40 4.3. Espectros Raman e SERS “branco” .......................................................................... 43 4.4. Raman de bancada..................................................................................................... 44 4.4.1. Comparação dos espectros SERS do CV em substratos SERS líquidos (SL) e sólido (SS1 e SS2). .............................................................................................................. 44 4.4.2. Limite de detecção do CV ................................................................................. 48 4.5. Raman portátil ................................................................................................................. 49 4.5.2. Limite de detecção .................................................................................................... 52 4.6. Fator de amplificação do CV para Raman de bancada e portátil ............................. 54 4.7. Mecanismo de adsorção do CV ................................................................................. 57 4.8. Caracterização no UV–Vis, DLS e potencial zeta do substrato SL com AgNPs H e MBC 60 4.9. Raman de bancada ........................................................................................................... 61 4.9.1. Comparação dos espectros SERS do MBC em substratos SERS líquidos (SL) e sólido (SS1 e SS2). ......................................................................................................................... 61 4.9.2. Limite de detecção .................................................................................................... 70 4.10. Raman portátil ....................................................................................................... 71 4.10.1. Comparação dos espectros SERS do MBC em substratos SERS líquidos (SL) e sólido (SS2). ........................................................................................................................ 71 4.10.2. Limite de detecção............................................................................................. 73 4.11. Fator de Amplificação do MBC para Raman de bancada e portátil ......................... 74 4.12. Mecanismos de adsorção do MBC ........................................................................ 77 5. Conclusões .......................................................................................................................... 79 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 81 ANEXO A ................................................................................................................................... 87 ANEXO B ................................................................................................................................... 88 16 1. Introdução 1.1. Apresentação da dissertação Os resultados apresentados e discutidos nesta dissertação abrangem as medidas com o corante cristal violeta (CV) e o carbendazim (MBC) como moléculas alvo para o efeito de otimização dos substratos SERS (surface-enhanced Raman scattering). O CV foi escolhido por ser amplamente conhecido pela sua capacidade de amplificar o sinal Raman, sendo comumente utilizado na avaliação de substratos SERS. O MBC, foi selecionado devido às suas implicações e relevância ambiental e de saúde, especialmente após sua proibição no Brasil em 2022. Devido a importância de monitorar seus impactos, foi interessante estudar essa molécula. Foram realizadas medidas no UV–Vis, distribuição de tamanho e potencial zeta com AgNPs na presença de CV e MBC. As medidas de SERS para CV e MBC, foram realizadas tanto em equipamentos Raman de bancada quanto em Raman portátil, utilizando três tipos de substratos SERS: líquido (SL) e sólidos (SS1 e SS2). O substrato SL consiste em um coloide de nanopartículas de prata reduzidas por hidroxilamina (AgNPs H). O substrato SS1 foi produzido em papel de filtro por imersão em nanopartículas de prata reduzidas por citrato (AgNPs C). O substrato SS2 foi produzido através da deposição de AgNPs por evaporação térmica assistida por feixe de elétrons (e-beam) em papel Whatman. O substrato SS2 foi desenvolvido no Centro de Investigações de Materiais (CENIMAT) da Universidade Nova de Lisboa – Portugal, devido aos resultados insatisfatórios obtidos com o substrato SS1 na detecção do MBC via SERS. 1.2. Técnica de detecção A luz, ao incidir em um material, pode sofrer vários fenômenos, entre eles os espalhamentos Rayleigh e Raman. O espalhamento Rayleigh (elástico) ocorre quando a luz interage com a matéria e não ocorre a troca de energia entre os fótons e as moléculas da amostra, ou seja, a luz espalhada tem a mesma frequência que a luz incidente (Figura 1). No entanto, o espalhamento Raman (inelástico) ocorre quando há uma troca de energia entre os fótons da luz incidente e as moléculas da amostra. Nesse caso, a luz espalhada possui uma frequência diferente da luz incidente, correspondente às mudanças na energia vibracional ou rotacional das moléculas [1–3]. Essas mudanças permitem obter informações sobre a estrutura molecular e as interações químicas da amostra (impressão digital). No espalhamento Raman, o espalhamento pode apresentar uma menor ou maior 17 frequência do que a radiação de excitação e, nesses casos, são chamados de espalhamento Raman Stokes e anti-Stokes, respectivamente (Figura 1) [1,4]. Além disso, quando o comprimento de onda da radiação incidente coincide com a banda de absorção eletrônica do analito, é chamado de Raman ressonante, aumentando a seção de choque do espalhamento Raman para um fator de até 106 [4]. Figura 1: diagramas dos níveis vibracionais de energia para o espalhamento Rayleigh e Raman. Fonte: adaptado do livro Aplicaciones láser en la Ingeniería [5]. A espectroscopia Raman apresenta várias vantagens de detecção de moléculas, como corantes, porém possui uma limitação devido à sua baixa seção de choque para algumas moléculas, o que resulta em sinais de espalhamentos muito fracos. Essa limitação pode ser superada com a técnica Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) que permite uma amplificação significativa do sinal Raman. O SERS ocorre quando as moléculas-alvo estão adsorvidas em superfícies metálicas rugosas ou nanopartículas metálicas, como de cobre (CuNPs), prata (AgNPs) ou ouro (AuNPs) para de fontes de excitação (lasers) no visível, onde o campo eletromagnético local é intensificado devido à excitação das ressonâncias localizadas do plasmon de superfície (LSPR – localized surface plasmon ressonances) [6]. Esse efeito pode resultar em um aumento de 106 até 1010 vezes na intensidade do sinal Raman, permitindo a detecção de moléculas em concentrações extremamente baixas, até mesmo em nível de uma única molécula [6]. A amplificação SERS ocorre predominantemente devido a dois mecanismos principais. O mecanismo eletromagnético ocorre devido a excitação de plasmons de 18 superfície localizados nas nanopartículas metálicas (geralmente ouro ou prata) utilizadas como substratos [7]. Quando uma molécula é adsorvida ou próxima à superfície de uma nanopartícula metálica e um feixe de luz laser incide sobre essa superfície, os elétrons livres na superfície do metal começam a oscilar de maneira coerente com o campo eletromagnético incidente [8]. Essas oscilações geram um campo eletromagnético amplificado ao redor das nanopartículas, especialmente em hot spots. Os hot spots são regiões de intenso acúmulo de campo próximo a junções de partículas, como representado pela Figura 2. O mecanismo químico, ocorre quando há uma interação direta entre a molécula analisada e a superfície metálica, que pode levar a mudanças nos estados eletrônicos da molécula ou na transferência de carga entre a molécula e o metal [8]. Figura 2: representação do campo eletromagnético gerado ao redor de duas nanopartículas (dímero) a partir de uma radiação incidente (ℎ𝜈𝑙𝑎𝑠𝑒𝑟). A região entre partículas dá origem ao chamado hot spots, onde a maior intensidade de linhas de campo elétrico possibilita uma aplicação ainda maior Raman (ℎ𝜈𝑆𝐸𝑅𝑆). Fonte: a autora A quimissorção e a fisissorção são processos de adsorção que podem afetar diretamente a intensidade do sinal Raman. A quimissorção ocorre devido a interação entre a molécula e a superfície metálica que pode aumentar a contribuição do mecanismo químico, onde a modificação dos estados eletrônicos da molécula pode aumentar a eficiência do espalhamento Raman [9]. A fisissorção é uma ligação fraca na qual se beneficia pelo campo eletromagnético amplificado nas proximidades das nanopartículas metálicas [9]. 19 1.3. Substratos SERS líquido e sólido As nanopartículas metálicas, como CuNPs, AgNPs ou AuNPs, podem ser utilizadas como substratos SERS em duas formas principais: líquidos (coloidais) e sólidos. Nos substratos SERS líquidos, as nanopartículas estão dispersas em coloides, facilitando a interação entre as moléculas–alvo e a superfície das nanopartículas [8]. Por outro lado, os substratos SERS sólidos oferecem maior estabilidade no tempo, uma vez que as nanopartículas são imobilizadas sobre superfícies, criando hot spots estáticos onde o campo eletromagnético é intensificado, resultando em uma amplificação significativa do sinal Raman [8]. A escolha entre substratos SERS líquidos ou sólidos depende das características da amostra e do objetivo da análise, sendo que ambos apresentam alta eficiência no aumento do sinal Raman. Embora os substratos SERS sólidos permitam um controle mais preciso e reprodutível das condições experimentais, os substratos SERS líquidos se destacam pela flexibilidade em análise em soluções complexas. Os substratos SERS sólidos despertam grande interesse na produção de sensores para diversas aplicações de detecção. Em particular, os substratos flexíveis baseados em papel tem se mostrado promissor na área de SERS, pois é possível variar diferentes estruturas e arranjos [10]. Esses substratos oferecem diversas vantagens, como boa resistência mecânica, facilidade para obter um layout desejado, flexibilidade e baixo custo [11–13]. Além disso, sua versatilidade torna–os ideais para aplicações em campo, especialmente quando combinados com equipamentos Raman portátil. 1.4. Equipamentos Raman de bancada e portátil O uso de espectrômetros Raman de bancada ou portátil apresenta características específicas que impactam diretamente o desempenho analítico, dependendo da aplicação e das condições experimentais. Os equipamentos Raman de bancada se destacam por sua alta sensibilidade e resolução espectral, permitindo a detecção de picos Raman bem definidos e análise de amostras em concentrações extremamente baixas. Esses equipamentos oferecem maior controle dos parâmetros experimentais, como a escolha do laser, objetiva e distância focal. Além disso, o software associado ao equipamento permite a alteração no tempo de exposição do laser, quantidade de acumulação e a potência no laser na amostra que podem influenciar na relação sinal/ruído dos espectros obtidos. Outra vantagem é a capacidade de realizar mapeamentos tridimensionais e bidimensionais das amostras, possibilitando a identificação da distribuição espacial dos analitos em um 20 substrato. O equipamento Raman de bancada (Renishaw in-Via) utilizado nessa dissertação possui lasers com comprimentos de onda em 515, 633 e 785 nm. Por outro lado, o Raman portátil apresenta menor sensibilidade e resolução espectral em relação ao Raman de bancada, mas se destaca com sua portabilidade e praticidade, tornando–se ideal para análises rápidas e aplicações em campo. No entanto, alguns equipamentos portáteis possuem controle limitado de parâmetros experimentais, como o tempo de exposição do laser, quantidade de acumulação e a potência no laser na amostra. No caso do Raman portátil da Bruker modelo Bravo utilizado nesta dissertação, essas configurações podem ser ajustadas quando o equipamento está conectado à base (doking stage), o que, apesar de permitir configurações nos parâmetros, compromete sua portabilidade. Quando operado de forma independente, o Bravo utiliza configurações automáticas para melhorar a relação sinal/ruído, escaneando a amostra até adquirir um espectro adequado. Uma característica relevante do Bravo é o DuoLASERTM (785/832 nm), que amplia a faixa espectral de 300 a 3200 cm-1, garantindo alta sensibilidade em toda a faixa espectral e minimizando os desafios associados à fluorescência. A comparação entre o Raman de bancada e o portátil utilizando a mesma amostra apresenta desafios técnicos e metodológicos. As diferenças na potência e estabilidade do laser impactam diretamente a intensidade dos picos Raman. Os equipamentos de Raman bancada operam com potências mais altas e maior controle, enquanto os Raman portáteis utilizam potências reduzidas por razões de segurança. Além disso, os Raman portáteis geralmente utilizam lasers com comprimentos de onda fixos, enquanto os de bancada oferecem maior variedade. A sensibilidade dos detectores também difere, pois os Raman de bancada utilizam detectores CCDs (Charge-Coupled Device) de alta eficiência, enquanto os Raman portáteis possuem detectores mais simples, limitando a detecção de picos de baixa intensidade. Além disso, os filtros ópticos e os algoritmos de processamento de dados são mais avançados nos equipamentos Raman de bancada, resultando em espectros com menor interferência da linha Rayleigh e maior qualidade. Por fim, os espectrômetros portáteis, ao serem operados em campo, estão sujeitos a variações de luz ambiente, poeira e vibrações, enquanto os de bancada funcionam em condições controladas, o que garante maior estabilidade e precisão. Todas essas diferenças tornam a comparação entre os dois equipamentos complexa, exigindo ajustes criteriosos e a padronização dos parâmetros experimentais em cada caso. 21 1.5. Molécula alvo 1.5.1. Cristal violeta Cristal Violeta (CV) é um corante catiônico sintético amplamente utilizado em diversas áreas, como tingimento de tecidos, formulação de tintas, coloração microbiológica e aplicações laboratoriais [14]. O CV pode ser utilizado em análises biológicas [15], em eletroquímica [16] e UV–Vis [17]. Apesar de sua utilidade, preocupações têm surgido sobre os possíveis riscos à saúde associados à exposição prolongada ao CV. Estudos indicam que a exposição prolongada ao CV pode causar irritações na pele, reações alérgicas e possíveis efeitos tóxicos. [18]. Além disso, há uma crescente preocupação com o impacto ambiental dos resíduos de CV na água [18]. Por essas razões, e como o CV continua sendo amplamente utilizado no cotidiano, há a necessidade de métodos sensíveis para sua detecção e de práticas mais seguras e sustentáveis em seu uso. Na espectroscopia Raman ou SERS, o CV destaca–se como molécula sonda, devido às suas bandas Raman bem definidas e à adsorção a superfícies metálicas. Essa característica torna o eficiente para avaliar o desempenho de substratos SERS [19]. Devido a sua aplicabilidade em SERS, existem uma variedade de artigos que reportam a detecção do CV em substratos SERS líquido e sólidos. Assim, a Tabela 1 apresenta resumidamente alguns artigos da literatura que reportam a detecção do CV via SERS. A base de dados utilizada na consulta foi a Web of Science em outubro de 2024. É possível notar que a técnica SERS foi utilizada para detectar o CV em diferentes tipos de nanopartículas, limites de detecção (LOD), laser e em substratos SERS líquido ou sólido. 22 Tabela 1: revisão bibliográfica da detecção do CV via SERS (Web of Science outubro de 2024). Cristal violeta Nanopartícula Forma LOD (mol/L) Laser [nm] Substrato SERS Ano Referência Au AuNRs nanobastões 1,0×10-12 632 sólido 2016 [20] AuNRs nanobastões 2,9×10-9 785 sólido 2017 [21] AuNCs nanocubos 2,7×10-7 785** sólido* 2019 [22] Au/AgNPs nanoesferas 8,1×10-8 785 sólido* 2020 [23] Au@Au@Ag nanoesferas 1,0×10-10 532 líquido 2021 [24] PSS-Au BPs nanobipirâmides 3,3×10-11 785 líquido 2023 [25] Ag AgNP nanoesferas *** 514 líquido 2015 [26] AgNPs nanoesferas 1,0×10-10 532 sólido 2017 [27] GO-Ag-L.I. nanoesferas 5,0×10-10 532 sólido 2018 [28] HAp/Ag nanoesferas 1,0×10-5 785 sólido 2021 [29] AgNPs@PDMS nanoesferas 1,0×10-9 532 sólido 2022 [30] AgNPs nanoesferas *** 532 sólido 2024 [31] * o substrato SERS sólido é fabricado em plataforma de papel. ** o artigo reporta a detecção SERS do CV em Raman portátil *** o artigo não reporta o valor do LOD. Fonte: a autora. 1.5.2. Carbendazim O aumento expressivo da população global tem intensificado a necessidade de produção de alimentos, resultando em justificativa para um uso crescente de pesticidas na agricultura visando controlar a proliferação de pragas e doenças nas lavouras. Os pesticidas são subdivididos em várias categorias, incluindo herbicidas, inseticidas, fungicidas e bactericidas, cada um com uma função específica no combate a plantas invasoras, insetos, fungos e bactérias, respectivamente [32]. Para garantir a segurança no uso desses produtos, é fundamental que sua aplicação siga estritamente os critérios estabelecidos por órgãos reguladores de cada país. No entanto, quando essas normas não são cumpridas ou há falta de fiscalização adequada, torna-se difícil mensurar a extensão da contaminação ambiental causada por esses produtos. A exposição a pesticidas, tanto no ambiente quanto no local de trabalho, representa um risco significativo à saúde pública, especialmente considerando que aproximadamente 1,1 bilhão de pessoas 23 trabalham no setor agrícola mundialmente, correspondendo a cerca de 34% da população global [33]. A quantidade permitida de pesticidas e o Limite Máximo de Resíduos (LMR) em alimentos e bebidas são determinados por agências reguladoras para prevenir possíveis riscos à saúde [34]. Na Europa, os países seguem as diretrizes da União Europeia, enquanto no Brasil, a responsabilidade é da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Os pesticidas são classificados pela ANVISA conforme sua toxicidade, categorizando–os como extremamente tóxico, altamente tóxico, medianamente tóxico, pouco tóxico e improvável de causar dano agudo [35]. Além disso, os pesticidas são classificados de acordo com o seu nível de toxicidade por classe e cor, como representado na Figura 3. Figura 3: classificação atual dos pesticidas de acordo com a ANVISA. Fonte: adaptado das normas da ANVISA [35]. Dentre os inúmeros pesticidas, o carbendazim (MBC, metil benzimidazol-2- ilcarbamato) é um fungicida sistêmico do grupo benzimidazol utilizado para o controle de fungos nas plantações de algodão, arroz, feijão, milho e soja. Em 2019, a ANVISA iniciou a reavaliação da comercialização e utilização do MBC na agricultura com base nos critérios de avaliação de risco à saúde humana. No início de 2022, o MBC era utilizado no tratamento de sementes como o algodão (0,1 mg/kg), arroz (0,05 mg/kg), feijão (2,0 mg/kg), milho (0,05 mg/kg) e soja (0,5 mg/kg) [36]. Neste período, o MBC era classificado como “produto altamente perigoso ao meio ambiente” (Classe I) [35]. Em agosto de 2022, a ANVISA proibiu o uso do MBC no Brasil, pois as pesquisas relacionadas ao LMR do MBC não convergiram sobre qual seria a dose segura para a população [37]. A eliminação do MBC ocorreu de forma gradual, devido a muitos produtos serem formulados à base deste composto, os quais são amplamente utilizados devido ao seu baixo custo de aquisição para os agricultores. Além do Brasil, o MBC é atualmente proibido na União Europeia, Reino Unido, Suíça, Estados Unidos, Canadá, Marrocos, Moçambique e Egito [37]. Nesses países, o MBC foi banido porque pode 24 induzir alterações genéticas, prejudicar a fertilidade e o feto, além de ser muito tóxico para a vida aquática [37]. O MBC apresenta baixa solubilidade em água em pH 7,0 e temperatura de 20°C, no entanto, sua solubilidade aumenta em temperaturas altas [38]. Na presença de luz e em diferentes condições ambientais, o MBC pode sofrer mudanças na sua estabilidade, como por exemplo, em meio alcalino e na presença de oxigênio torna–se mais instável e sua degradação é acelerada. Além disso, o MBC apresenta moderada persistência considerando sua estabilidade frente a processos de hidrólise e fotólise em condições ambiente [39]. Portanto, é essencial monitorar rigorosamente o uso de pesticidas e identificar esses compostos em baixas concentrações. Assim, torna–se necessário o uso de técnicas que permitam sua detecção tanto em meios aquosos quanto sólidos, com o objetivo de investigar seus impactos no meio ambiente, assim como na saúde humana e animal. Existem alguns métodos analíticos que proporcionam a detecção rápida da presença de poluentes ambientais como o MBC: sensor com detecção eletroquímica [40], via espectroscopia de massa [41,42], via desempenho cromatográfico [43] e via SERS [44–46]. A Tabela 2 apresenta uma relação de artigos da literatura que reportam a detecção do MBC via SERS. A base de dados utilizada na consulta foi a Web of Science em outubro de 2024. É possível notar que a técnica SERS foi utilizada para detectar o MBC em diferentes tipos de nanopartículas, LOD, laser e em substratos SERS líquido ou sólido. 25 Tabela 2: revisão bibliográfica da detecção do MBC via SERS (web of Science outubro de 2024). Carbendazim Nanopartícula Forma LOD (mol/L) Laser [nm] Substrato SERS Ano Referência Au AuNPs nanoesferas 5,2×10-7 785 líquido 2015 [47] AuNPs nanoesferas 5,2×10-7 633 sólido 2019 [48] Au@Ag-4ABT NP nanoesferas 1,9×10-7 785 sólido 2020 [49] AuNS@Ag nanoesferas 8,6×10-10 785 sólido 2024 [50] Au@PB@Ab1 e Au@MB@Au@Ab2 nanoesferas 1,5×10-10 785 nm sólido 2024 [51] Ag AgNPs nanoesferas 6,5×10-8 785/532 líquido 2015 [45] AgNPs nanoesferas * 785/532 líquido 2016 [44] AgNPs nanoesferas 7,3×10-8 785 líquido 2016 [52] AgNPs nanoesferas 1,0×10-8 785 sólido 2019 [53] AgMs microesferas 5,2×10-8 785 sólido 2021 [54] AgNPs nanoesferas 1,0×10-5 785 sólido ** 2021 [55] MAg NPs/ZnO NRs nanoesferas em nanobastões 5,2×10-9 532 sólido 2022 [56] SiO2@Ag nanoesferas 5,2×10-7 785 sólido 2024 [57] * o artigo não reporta o valor do LOD. ** o artigo reporta a detecção SERS do MBC em AgNPs via Raman portátil, os demais artigos são referentes ao Raman de bancada. Fonte: a autora. Em termos de detecção, conforme as técnicas apresentadas, com exceção do SERS, envolvem procedimentos experimentais relativamente complexos na preparação das amostras. A vantagem da técnica SERS é realizar o procedimento experimental de detecção do MBC em quantidade reduzida de amostra e muitas vezes com baixo custo no preparo ou simplicidade. Além disso a técnica SERS permite uma análise rápida com a possibilidade de detecção em tempo real. Nesses casos, as amostras não são destruídas após a detecção, o que é vantajoso em estudos ambientais ou alimentares. Nesse contexto, a busca por métodos de detecção mais simples e eficiente, justifica a utilização do SERS, que se destaca por sua alta sensibilidade, seletividade e praticidade na preparação das amostras. Um dos principais desafios dessa técnica é a reprodutibilidade da intensidade do sinal Raman. A produção de substratos SERS com uma distribuição espacial uniforme de nanopartículas é complexa, e a morfologia das partículas (forma e tamanho) precisa 26 ser a mais homogênea possível. Variações nesses parâmetros podem resultar em diferenças significativas na intensidade do sinal prejudicando a repetibilidade e, portanto, a precisão e exatidão dos resultados. Além disso, os substratos metálicos, são suscetíveis à oxidação ao longo do tempo. Em amostras complexas, a interferência de sinais de outras moléculas também pode limitar a seletividade, dificultando a identificação da molécula alvo. Esta dissertação contempla a detecção do MBC via SERS em Raman de bancada e portátil em substratos SERS (líquido e sólido), com nanopartículas de prata (AgNPs). 1.6. Limite de detecção O limite de detecção (LOD) é a concentração mais baixa que o analito pode ser detectado [58]. Em alguns trabalhos de SERS, o LOD é calculado conforme estabelecido pela União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) [59]. Considerando uma região linear do gráfico da intensidade SERS vs concentração da molécula alvo, o LOD pode ser calculado a partir da equação 3 𝑥 𝑆𝐷 𝑠 , onde SD é o desvio padrão (amostra em branco) e S é a inclinação da região linear (um desafio para a área). No SERS, as intensidades do sinal SERS em baixas concentrações podem ser fracas e o ruído de fundo pode variar, prejudicando os cálculos do LOD por 3 𝑥 𝑆𝐷 𝑠 . Assim, foi utilizado a relação �̅� �̅� ≥ 3, onde 𝑆̅ é a média das intensidades do sinal espectroscópico (SERS) em um determinado número de onda e �̅� é a média da intensidade do sinal espectroscópico do branco (ruído) no mesmo número de onda em que foi medida a intensidade do sinal SERS [60]. Essa condição implica que o sinal SERS deve ser pelo menos 3 vezes maior que o ruído no mesmo número de onda para ser considerado detectável naquela concentração (pico diferencia-se do ruído) [60]. 1.7. Fator de amplificação O fator de amplificação (EF) também é utilizado para realizar análises quantitativas, pois ele fornece a eficiência com que um substrato SERS é capaz de amplificar o sinal Raman. O EF do sinal Raman que leva ao SERS depende de alguns parâmetros como: funções dielétricas do metal e do meio no entorno das nanopartículas no comprimento de onda do laser de excitação e, portanto, do comprimento de onda do laser de excitação, adsorção da molécula alvo na superfície metálica (dependência de 27 distância), e tamanho, forma e distribuição (agregação) das nanopartículas metálicas (NPs) [8,61,62]. Os valores de EF são da ordem de 103 a 106 em média, podendo ser alcançado valores próximos a 108 a 1010 em condições específicas [8,9]. Em geral, esses valores são obtidos através da razão de intensidades ISERS/IRaman para determinado pico (altura ou área do pico SERS/altura ou área do pico Raman), ambas obtidas sob a mesma condição experimental e normalizadas por suas concentrações ([SERS] e [Raman]), como na equação abaixo [9]: 𝐸𝐹 = 𝐼𝑆𝐸𝑅𝑆 [𝑆𝐸𝑅𝑆] 𝐼𝑅𝑎𝑚𝑎𝑛 [𝑅𝑎𝑚𝑎𝑛] Essa equação representa um valor de EF analítico, que depende de vários fatores como as propriedades de adsorção do analito, sua concentração, a cobertura da superfície (sub - monocamada vs multicamada) e o método de preparação da amostra (spin – coating, dipping ou drying) [8]. Vale destacar que a concentração [SERS] pode não refletir diretamente o número de moléculas adsorvidas na superfície do substrato SERS. Por exemplo, moléculas que não se adsorvem ao substrato SERS resultam em um EF igual a zero, o que não implica que o substrato seja ineficaz para outros analitos [8]. Dessa forma, o EF não é um parâmetro ideal para caracterizar o desempenho de um substrato SERS, nem a comparação entre diferentes substratos SERS de forma direta é definitiva [8]. O EF fornece uma medida prática e reprodutível para o fator de amplificação médio em SERS, sendo particularmente adequado para concentrações moleculares volumétricas, como em sistemas líquidos (dispersões coloidais), onde essa abordagem se aplica melhor do que em substratos SERS sólidos [8]. Le Ru et al. [8] discutem diferentes métodos para o cálculo do EF, variando conforme as condições experimentais, a orientação e a dinâmica molecular, bem como aplicações práticas e sensoriamento analítico. A Tabela 3 resume algumas das principais abordagens para o cálculo do EF. 28 Tabela 3: resumo das equações de EF. Nome Sigla Equação Definição SERS substrate EF SSEF SSEF = ISERS NSERS⁄ IRaman NRaman⁄ ISERS: Intensidade do sinal SERS; IRaman: Intensidade do sinal Raman; NSERS: Número de moléculas na superfície SERS; NRaman: Número de moléculas na amostra sem o substrato SERS. Single - molecule EF SMEF SMEF = dσSERS dΩS⁄ dσRaman dΩR⁄ dσSERS: Intensidade do sinal SERS de uma única molécula na superfície SERS; dσRaman: Intensidade do sinal Raman de uma molécula sem substrato SERS; dΩS: Número de uma molécula adsorvida no substrato SERS; dΩR: Número total de moléculas na amostra sem substrato SERS. Orientation - Averaged SMEF OASMEF OASME = 〈SMEF (θ, ∅〉 SMEF (θ, ∅): EF de uma única molécula em uma orientação específica, com θ e ∅ representando ângulo de orientação da molécula em uma relação ao campo eletromagnético; < >: Média de todas as orientações possíveis. Fonte: adaptado do livro Principles of Surface Enhanced Raman Spectroscopy [8]. SERS substrate EF (SSEF): o fator de amplificação do substrato SERS mede a capacidade de um substrato de amplificar o sinal Raman de várias moléculas e é usado para avaliar a eficácia geral de substratos SERS [8]. Single – molecule EF (SMEF): o fator de amplificação de uma única molécula mede a amplificação do sinal Raman de uma molécula isolada, sendo essencial para estudos de sensoriamento em nível molecular, como detecção ultrassensível [8]. Orientation – Averaged (SMEF): o fator de orientação média SMEF considera a variação na orientação das moléculas em relação ao substrato, fornecendo uma média da amplificação SERS para diferentes orientações moleculares e sendo útil para caracterizar substratos em que onde a orientação molecular pode afetar a intensidade do sinal detectado [8]. 79 5. Conclusões Esse trabalho foi dedicado em estudar o desempenho dos equipamentos Raman de bancada e portátil para a detecção do corante cristal violeta (CV) e o pesticida carbendazim (MBC) em substratos SERS líquido (SL) e sólido (SS1 e SS2). A caracterização das nanopartículas (AgNPs H e AgNPs C) foram realizadas por UV–Vis, DLS, potencial zeta e SEM. As medidas de UV–Vis das nanopartículas são consistentes com nanopartículas de formato esférico, confirmado por imagens de SEM. Os substratos SS1 e SS2 foram caracterizados por SEM e foi possível identificar que a distribuição das AgNPs sobre o papel do substrato SS2 são mais homogêneas ao comparar com as imagens de SEM do substrato SS1. A detecção do sinal SERS do CV foi realizada através dos equipamentos Raman de bancada e portátil com os substratos SL, SS1 e SS2. Os valores de LOD foram calculados com base na relação S̅ R̅⁄ ≥3 para ambos os equipamentos. O menor valor de LODbancada foi de 4,5 × 10-10 mol/L para o substrato SL, seguindo dos valores 6,0 × 10-8 (substrato SS1) e 2,6 × 10-7 (substrato SS2). No entanto, ao utilizar o Raman portátil o menor valor de LODportátil também foi para o substrato SL com um valor de 2,6 × 10-9 mol/L, seguindo dos valores 7,9 × 10-7 para o substrato SS1 e 1,0 × 10-6 para o substrato SS2. Destacando que o Raman de bancada apresentou os menores valores de LOD em todos os substratos SERS. O Raman de bancada apresentou valores de EF maiores em comparação com os valores obtidos no Raman portátil, para os substratos SL e SS2, com valores de 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 2,8 × 104 (1,8 × 10-9 mol/L) e 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎= 2,1 × 104 (1,0 × 10-8 mol/L), respectivamente. No entanto, ao utilizar o substrato SS1, o maior valor de EF foi obtido no Raman portátil com 𝐸𝐹𝑆𝑆1 𝑝𝑜𝑟𝑡á𝑡𝑖𝑙 = 3,6 × 103 (1,0 × 10-8 mol/L), valor próximo ao obtido no Raman de bancada (𝐸𝐹𝑆𝑆1 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 3,0 × 103 para a concentração 1,0 × 10-8 mol/L). A interação do CV com as AgNPs ocorre devido ao mecanismo eletromagnético. Para a menor concentração de CV (1,8 × 10-9 mol/L e zeta = -30 mV) e para as maiores concentrações de CV (1,6 × 10-6 mol/L; 1,8 × 10-5 mol/L e zeta = +28 mV) o coloide de AgNPs H não sofre agregação significativa induzida pelo CV, consequência da repulsão eletrostática entre as AgNPs H. Porém, para concentrações intermediárias de CV observa-se a agregação do coloide: 3,6 × 10-7 mol/L (zeta = +3 mV) com maior nível de agregação do coloide e máxima intensidade do sinal SERS e 9,1 × 10-7 mol/L (zeta = +14 mV) com menor nível de agregação do coloide e a diminuição da intensidade do sinal SERS. A detecção do sinal SERS do MBC também foi realizada através dos equipamentos Raman de bancada e portátil com os substratos SL e SS2. O substrato SS1 80 não apresentou eficiência em detectar o MBC em altas concentrações, por isso, o MBC não foi estudado com esse substrato SERS sólido. O menor valor de LODbancada foi de 1,0 × 10-8 mol/L para o substrato SL, seguindo do valor de 1,7 × 10-6 mol/L para o substrato SS2. No entanto ao utilizar o Raman portátil o menor valor de LODportátil também foi para o substrato SL com um valor de 6,0 × 10-9 mol/L, seguindo do valor de LOD para o substrato SS2 de 8,2 × 10-7 mol/L. Neste caso, o Raman portátil apresentou os menores valores de LOD em todos os substratos SERS. Analisando os valores de EF, o Raman portátil apresentou valores maiores em comparação com os valores obtidos no Raman de bancada, para o substrato SL e SS2 com valores de 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑝𝑜𝑟𝑡á𝑡𝑖𝑙 = 7,0 × 102 (1,8 × 10-7 mol/L) e 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑝𝑜𝑟𝑡á𝑡𝑖𝑙 = 2,1 × 103 (1,0 × 10-7 mol/L), respectivamente. Ao utilizar o Raman de bancada, os valores de EF foram de 𝐸𝐹𝑆𝐿 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 5,4 × 102 (1,8 × 10-7 mol/L) 𝐸𝐹𝑆𝑆2 𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎𝑑𝑎 = 1,8 × 103 (1,0 × 10-7 mol/L). É possível observar uma relação entre os valores do EF e os equipamentos e substratos SERS utilizados. A interação do MBC com as AgNPs ocorre devido ao mecanismo eletromagnético. Além disso, em concentrações mais elevadas de MBC (1,8 × 10-5 e 1,8 × 10-6 mol/L) ocorre a degradação do coloide e consequentemente reduz a eficiência da amplificação do sinal SERS. 81 REFERÊNCIAS [1] C. V. RAMAN, K.S. KRISHNAN, A New Type of Secondary Radiation, Nature. 121 (1928) 501–502. https://doi.org/10.1038/121501c0. [2] I.E. Wachs, M.A. Bañares, eds., Springer Handbook of Advanced Catalyst Characterization, Springer International Publishing, Cham, 2023. https://doi.org/10.1007/978-3-031-07125-6. [3] Raman Spectroscopy, in: Pract. Guid. to Mater. Charact., Wiley, 2022: pp. 43–76. https://doi.org/10.1002/9783527838820.ch3. [4] C.S.R. Holler F. J., Skoog D. A., Princípios de Análise Instrumental, 6th ed., Bookman, Porto Alegre, 2009. [5] S.J. Coordinadora, Handbook T-I Aplicaciones láser en la Ingeniería, n.d. [6] R. 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