1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA ANÁLISE DA MUTAGENICIDADE URINÁRIA E SUSCEPTIBILIDADE GENÉTICA NO MONITORAMENTO DE INDIVÍDUOS EXPOSTOS A SOLVENTES ORGÂNICOS SORAYA DUARTE VARELLA ORIENTADORA: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda ARARAQUARA - SP 2005 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA ANÁLISE DA MUTAGENICIDADE URINÁRIA E SUSCEPTIBILIDADE GENÉTICA NO MONITORAMENTO DE INDIVÍDUOS EXPOSTOS A SOLVENTES ORGÂNICOS SORAYA DUARTE VARELLA TESE PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM ANÁLISES CLÍNICAS, ÁREA DE ANÁLISES CLÍNICAS. ORIENTADORA: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda ARARAQUARA - SP 2005 3 Varella, Soraya Duarte V293a Análise da mutagenicidade urinária e susceptibilidade genética no monitoramento de indivíduos expostos a solventes orgânicos. / Soraya Duarte Varella . – Araraquara, 2005. 98 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Análises Clínicas Orientador: Eliana Aparecida Varanda . 1.Mutagenicidade urinária. 2.Polimorfismo enzimático. 3.Exposição ocupacional. 4.Teste de Arnês. I.Varanda, Eliana Aparecida, orient. II. Título. CDD: 616.-07566 Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara CAPES:40300005 1 TERMO DE APROVAÇÃO AUTOR: Soraya Duarte Varella TÍTULO DO TRABALHO: Análise da mutagenicidade urinária e susceptibilidade genética no monitoramento de indivíduos expostos a solventes orgânicos. TESE PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR PRESIDENTE E ORIENTADORA: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara -UNESP PRIMEIRO EXAMINADOR: Profa. Dra. Denise Crispin Tavares INSTITUIÇÃO: Universidade de Franca SEGUNDO EXAMINADOR: Profa. Dra. Lusânia Maria Greggi Antunes INSTITUIÇÃO: Universidade de Medicina do Triângulo Mineiro TERCEIRO EXAMINADOR: Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus INSTITUIÇÃO: Universidade Estadual de Londrina QUARTO EXAMINADOR: Profa. Dra. Christiane Pienna Soares INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara -UNESP ARARAQUARA, 04 de outubro de 2005. 2 A Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda – Grande mulher, grande pesquisadora, mestra autêntica. 3 AGRADECIMENTOS “O que somos e o que criamos é o resultado da interação entre nossos genes e o meio ambiente. Nesse sentido, gostaria de expressar minha gratidão àqueles que passaram seus genes”, Carlos e Marilda e ao meu avô Euclydes. Agradeço também aos meus irmãos Alexandre, Luciano, Daniel e Neto, que colaboraram, criando um ambiente favorável para a realização desse trabalho. Gostaria também de registrar aqui meus agradecimentos especiais para: Dra. Clarice Queico Fujimura, Ana Carolina Malaspina e Karina Andrade Prince pela disponibilidade, paciência e ensinamentos. Dra. Ilce Mara Syllos Cólus e Dra. Regislaine Burim, pela prestatividade. Dr. Wagner Vilegas, Roberta Coelho, Marcelo Telascrea e Marcelo Silva, pelo apoio na fase inicial desse trabalho. Dra. Raquel Moreira, Dra. Tais Bauab, Dr. Sandro Valentin, pelos equipamentos e Luis Eduardo dos Santos, pelo valioso auxílio. Valéria Aparecida de Araújo Mallavolta , Walclécio Lira e Cássia Regina Cardoso pela ajuda fundamental na coleta de sangue. Dra. Mara Pinto e aos alunos da 73° Turma de Farmácia e Bioquímica Noturno, pelo carinho e atenção. César Terçariol pela colaboração na avaliação dos resultados (análises estatísticas). Toda equipe do laboratório de mutagênese: Ana Paula de Oliveira, Cássia Regina Cardoso, Fabiana I. Biso, Fábio Vieira dos Santos, Flávio Romanini Tubaldini, Maira 4 Eiko. I. Nogueira, Mariana H. Passoni, Walclécio Lira. Especialmente a Raquel Aparecida Rampazo, que dividiu essa pesquisa comigo. Ednéia Fátima Corrêa, Marisa Fernades e Silvia Helena de Oliveira David, pelo respaldo técnico, e pela amizade. Ivone Shisuko Anno e Mirna Fernanda de Oliveira, amigas para todas as horas. Claúdia Lúcia Molina, Laura Rosim e Sônia Ornellas Silva, funcionárias do setor de pós-graduação Aparecida Bernadete Rocateli Jesus e a todos os outros funcionários e professores da FCFAR que colaboraram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho. Todos os voluntários que participaram dessa pesquisa. Centro Universitário Barão de Mauá, especialmente a Dra. Joyce Gabrielli, Dra. Tokico Murakawa Moryia e Maria Zuanon. CAPES pelo apoio financeiro. 5 Se as coisas são inatingíveis...ora Não é motivo para não querê-las... Que triste o caminho, se não fora à mágica presença das estrelas. Mário Quintana. 6 RESUMO A exposição ocupacional a solventes orgânicos é um sério problema para milhares de trabalhadores. A literatura demonstra a ocorrência de um elevado risco de danos no material genético desses indivíduos, no entanto, os efeitos da mistura dos solventes orgânicos não são bem conhecidos. As diferenças genéticas (polimorfismos enzimáticos) também têm um importante papel na capacidade de ativação e de detoxificação de xenobióticos, incluindo os solventes orgânicos. As mutações causadas por agentes ambientais associadas aos diferentes genótipos, são fatores relacionados ao desenvolvimento de neoplasias e outras doenças degenerativas. O ensaio de mutagenicidade urinária indica a ocorrência de possíveis lesões pré- clínicas enquanto que a determinação dos polimorfismos enzimáticos mostra um perfil genético de risco. Assim, os profissionais da saúde envolvidos com a qualidade de vida do trabalhador, podem ter subsídios para o controle da exposição ocupacional e conseqüentemente evitar o aparecimento de doença (lesão clínica), principalmente o câncer. O trabalho diário num laboratório de pesquisa onde são utilizados vários tipos de solventes é igualmente preocupante. Diante disso, este estudo teve os seguintes objetivos: caracterizar a atividade mutagênica na urina de 30 indivíduos ocupacionalmente expostos a solventes orgânicos e indivíduos sem essa exposição (controles); identificar o polimorfismo constitucional desses indivíduos para os genes GSTM1, GSTT1 e CYP2E1 ; e tentar correlacionar a influência desses genótipos com a atividade mutagênica urinária. A coleta da urina foi realizada em frascos de polietileno durante o dia de trabalho, até a obtenção de aproximadamente 1000mL. Para a concentração e extração dos compostos presentes na urina foi usada a resina XAD-2 e o solvente acetona. Diferentes concentrações (1,5; 3,0; 6,0 e 12,0 mL equivalente de urina/placa) de cada amostra foram avaliadas através do teste de Ames, com e sem ativação metabólica, usando as linhagens TA100 e YG1024. A partir do sangue total coletado de cada indivíduo, foi extraído o DNA e foi utilizada a técnica de PCR para a amplificação dos polimorfismos dos genes GSTM1, GSTT1 e CYP2E1- PstI. Os resultados da avaliação da atividade mutagênica das amostras de urina do grupo exposto apresentaram aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) na linhagem YG1024, com metabolização quando comparado com os resultados encontrados no grupo controle.Observou-se a influência (sem significância estatística) do genótipo GSTM1/GSTT1 nulo na resposta mutagênica do grupo exposto. Das 7 amostras de urina com mutagenicidade positiva, 6 eram de indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo e, apenas 1 amostra era de um indivíduo com GSTM1 presente. Com isso, fica clara a relevância dos estudos que avaliam o risco de exposição ocupacional a solventes orgânicos, através do uso de biomarcadores biológicos e perfis genéticos e, assim promover medidas que resguardem a saúde desses trabalhadores. Palavras-chave: mutagenicidade urinária; polimorfismo enzimático; exposição ocupacional; teste de Ames. 7 ABSTRACT The occupational exposure to organic solvents is a serious problem to millions of workers. The reports shows a high risk of genetic damage on these workers. However, the effects of mixtures of solvents are not well known. The genetic differences (enzimatic polymorphisms) are very important for the capacity of activating and detoxifying carcinogens, such as organic solvents. Mutations caused by environmental agents associated with the different genotypes are related to cancer development and other degenerative diseases. The urinary mutagenicity assay shows pre-clinical damages while the enzimatic polymorphisms show a genetic risk profile. In this way, the health professionals can have subsity to occupational exposure control in order to avoid disease development (clinical damage), cancer especially. The work in a research laboratory that uses several types of solvents is equaly preocupating. In this way, in this study the genotyping approach was used to study the influence of the metabolic polymorphisms CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 on urinary mutagenicity, detected with Salmonella/microsome assay, in 30 subjects exposed to solvents, and 30 subjects without occupational exposure (controls). Urine samples were collected in polyethylene containers at the end of the work shift. For the concentration and extraction of urine samples was used the XAD-2 resin and acetone as eluting agent. Different doses of extract (1.5; 3.0; 6.0 and 12.0 mL equivalents per plate) were tested on Salmonella typhimurium strains TA100 and YG1024, with and without metabolic activation. Genomic DNA was extracted from blood and the GSTM1, GSTT1 and CYP2E1-PstI genotypes were deternined using a PCR method. The mutagenic activity of urine samples from exposed workers shows a significant difference (p≤ 0.05) when compared to those in the control group in the Salmonella typhimurium YG1024 with S9 mix. The genotype GSTM1/GSTT1 null influenced (not statistical significance) in mutagenic activity from exposed group. Among the 7 urine samples with positive mutagenicity, 6 were from volunteers with GSTM1/GSTT1 null genotype and just 1 was from volunteers with GSTM1 present genotype. These studies show the relevance of assessing the risk of occupational exposure to organic solvents, with the use of biological biomarkers and genetic profiles and to promote ways for protecting the health of the workers. Keywords: urinary mutagenicy; enzimatic polymorphism; occupational exposure; Ames test 8 SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1 1.1- Exposição ocupacional, mutagenicidade urinária e efeitos adversos à saúde........ 2 1.2- Importância dos polimorfismos genéticos (GSTM1, GSTT1 e CYP2E1) nos efeitos adversos à saúde, advindos da exposição a xenobióticos.................................. 6 2. OBJETIVOS............................................................................................................ 12 3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 13 3.1- Amostras de urina................................................................................................... 13 3.2- Avaliação da mutagenicidade urinária................................................................... 15 3.2.1- Ensaio de mutação gênica reversa....................................................................... 15 3.2.2- Linhagens de Salmonella typhimurium............................................................... 15 3.2.3- Meios de cultura.................................................................................................. 16 3.2.4- Manutenção e estoque das culturas..................................................................... 17 3.2.5- Confirmação dos genótipos das linhagens de Salmonella typhimurium............. 17 3.2.6- Sistema de ativação metabólica........................................................................... 19 3.2.7- Procedimento do ensaio de acordo com Maron e Ames (1983)......................... 19 3.2.8- Controles............................................................................................................. 20 3.3- Estudo dos polimorfismos enzimáticos.................................................................. 21 3.3.1- Extração e quantificação do DNA genômico...................................................... 21 3.3.2- Amplificação das seqüências de DNA e detecção dos genótipos....................... 21 3.3.3- Detecção dos genótipos GSTM1 e GSTT1 por PCR- multiplex.......................... 22 3.3.4- Detecção do genótipo CYP2E1 – PstI................................................................. 23 4. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS............................. 24 5. RESULTADOS........................................................................................................ 26 5.1- Caracterização das amostras estudadas.................................................................. 26 5.2- Atividade mutagênica dos extratos orgânicos de urina.......................................... 29 5.3- Distribuição das freqüências dos diferentes polimorfismos estudados.................. 48 5.4- Caracterização dos indivíduos analisados em relação a diferentes parâmetros..... 49 6. DISCUSSÃO............................................................................................................ 55 6.1- Análise da mutagenicidade urinária...................................................................... 55 9 6.2- Análise dos polimorfismos das enzimas de metabolização de xenobióticos e, sua influência nos danos ao material genético............................................................... 59 7. CONCLUSÕES........................................................................................................ 67 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 69 ANEXOS Questionário................................................................................................................... 88 Termo de Consentimento .............................................................................................. 96 Parecer do Comitê de Ética........................................................................................... 98 10 Lista de tabelas Tabela 1: Descrição comparativa das linhagens bacterianas......................................... 16 Tabela 2: Caracterização dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação ao sexo, grupo étnico e idade ......................................................................................... 26 Tabela 3: Caracterização dos indivíduos, através da freqüência, segundo o consumo de vegetais, consumo de bebidas alcoólicas, uso de medicamentos e tempo de exposição a solventes orgânicos..................................................................................... 28 Tabela 4: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do número de revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos de urina do grupo controle (C), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens TA100 e YG1024 tanto na presença (+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação metabólica...................................................................................................................... 33 Tabela 5: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do número de revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos de urina do grupo exposto (E), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens TA100 e YG1024 tanto na presença (+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação metabólica...................................................................................................................... 37 Tabela 6: Atividade mutagênica expressa em potência (número de revertentes his+/mLequivalente urina), das amostras do grupo controle e exposto, com resposta mutagênica positiva em pelo menos um dos ensaios (TA100 ou YG1024, com (+S9) ou sem (-S9) ativação metabólica).................................................................................. 41 Tabela 7: Atividade mutagênica expressa pelo maior valor da razão de mutagenicidade (RM) nas amostras do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100 eYG1024, com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica..................................... 42 Tabela 8: Atividade mutagênica expressa pelo índice de aumento relativo no número de revertentes his+, das amostras do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100 eYG1024, com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica................................................. 43 Tabela 9: Caracterização das amostras dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação à idade, sexo, grupo étnico, atividade mutagênica da urina e polimorfismos dos genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1.................................................... 51 Tabela 10: Caracterização das amostras dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação à idade, sexo e atividade mutagênica (diferentes parâmetros de avaliação) daurina e polimorfismos dos genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1................... 53 11 Lista de figuras Figura 1: Fases da intoxicação...................................................................................... 3 Figura 2: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e exposto (B), na linhagem de S. typhimurium TA100 sem ativação metabólica.* amostras com atividade mutagênica positiva.......................... 44 Figura 3: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e exposto (B), na linhagem de S. typhimurium TA100 com ativação metabólica..................................................................................................... 45 Figura 4: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e exposto (B), na linhagem de S. typhimurium YG1024 sem ativação metabólica.* amostras com atividade mutagênica positiva.......................... 46 Figura 5: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e exposto (B), na linhagem de S. typhimurium YG1024 com ativação metabólica.* amostras com atividade mutagênica positiva.......................... 47 Figura 6: PCR multiplex para a detecção de alelos homozigotos nulos das glutationa S-transferases M1 (GSTM1) e T1 (GSTT1).................................................. 48 Figura 7: PCR - RFLP para detecção do polimorfismo CYP2E1 –PstI........................ 49 Figura 8: Média e desvio padrão dos índices de aumento relativo no número de revertentes his+, das amostras de urina dos indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo, no grupo controle (A) e no exposto (B)................................................................................................................. 54 12 Lista de abreviaturas CYPs, citocromo P450 CYP2E1, citocromo P450 DMSO, dimetilsulfato GSTs, glutationa S-transferases GSTM1, glutationa S-transferase M1 GSTT1, glutationa S-transferase T1 HPAs, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos NATs, N-acetiltransferases 1 1. Introdução A exposição ocupacional diária a uma grande variedade de compostos químicos em baixas concentrações, tem levado a efeitos crônicos na saúde do trabalhador, com sérias conseqüências toxicológicas, sendo a causa de inúmeras doenças, inclusive o câncer. A maioria das pessoas tem sido expostas a algum tipo de solvente no seu trabalho. Embora, na última década, os níveis de exposição tenham diminuído muito em países industrializados, o número de trabalhadores expostos a solventes ainda é grande (FECHNER et al., 2001; JOO et al., 2004; HEUSER et al., 2005). Diferenças individuais quanto ao risco de desenvolver câncer são provenientes, entre outros fatores, da capacidade geneticamente determinada do organismo em ativar ou detoxificar os carcinógenos. Assim sendo, a associação entre alelos específicos de genes responsáveis pela metabolização de compostos químicos e o risco aumentado ao desenvolvimento de tumores, se deve à existência de múltiplos passos enzimáticos no metabolismo, que podem resultar na ativação ou detoxificação de xenobióticos. A ativação de pró-carcinógenos é um evento fundamental para que os compostos ambientais possam interagir com o DNA. De um modo geral, mas não absoluto, a formação de agentes eletrofílicos a partir de 2 carcinógenos ambientais são catalisadas pelas enzimas do citocromo P450 (CYPs) e neutralizadas pelas glutationa S-transferases (GSTs), (RIBEIRO et al., 2003). Os fatores genéticos e ambientais são importantes determinantes, além de responsáveis pelas significativas variações individuais no desenvolvimento de doenças. A combinação do conhecimento acerca dos fatores externos relacionados ao hábito de vida e ambiente, acrescidos do minucioso entendimento de como diferenças genéticas podem causar variações nas respostas do homem aos poluentes ambientais, possibilita o esclarecimento dos mecanismos de desenvolvimento do câncer. 1.1. Exposição ocupacional, mutagenicidade urinária e efeitos adversos à saúde A má qualidade do ar do ambiente de trabalho é um fator importante para o desencadeamento do câncer ocupacional. Durante pelo menos oito horas por dia os trabalhadores estão expostos ao ar poluído, colocando seriamente em risco sua saúde. Algumas substâncias como asbestos, encontrados em materiais como fibras de amianto ou cimento, as aminas aromáticas, usadas na produção de tintas e os agrotóxicos agem preferencialmente sobre a bexiga, enquanto os hidrocarbonetos aromáticos, encontrados na fuligem, parecem agir sobre as células da pele, sobre as vias respiratórias e pulmões (KLAASSEN, 2001). Uma série de processos complexos que envolvem o agente químico e o organismo resultam na manifestação do efeito tóxico. O entendimento dos mecanismos responsáveis por essas manifestações só é possível através da compreensão dos processos bioquímicos. Portanto, é fundamental o conhecimento das fases que antecedem o aparecimento dos efeitos tóxicos, que são, a fase de exposição, a fase de toxicocinética e a fase de toxicodinâmica (Figura 1). 3 Agente Químico Fase de - ar Monitoramento Exposição - água Ambiental - alimentos Vias de introdução Absorção Fase de Toxicocinética Distribuição Monitoramento Eliminação Biológico Biotransformação Fase de união a união a Toxicodinâmica moléculas moléculas críticas não críticas efeitos sem efeitos adversos adversos Fase lesões pré-clínicas Monitoramento Clínica Clínico lesões clínicas Figura 1: Fases da intoxicação (KLAASSEN, 2001, modificado). A fase de exposição corresponde à presença dessas substâncias químicas no ambiente de trabalho, que podem introduzir-se principalmente pela via respiratória. A fase de toxicocinética corresponde à absorção, distribuição, biotransformação, acúmulo e eliminação do agente químico. A substância química, uma vez absorvida pelo organismo, interage com moléculas específicas provocando desde desequilíbrios leves até morte, caracterizando assim a 4 fase de toxicodinâmica. A fase clínica corresponde ao aparecimento de sinais e sintomas que caracterizam os efeitos tóxicos e evidenciam a presença do fenômeno de intoxicação. Ocorrendo a exposição, o agente químico poderá introduzir-se no organismo através de uma ou mais vias, como a respiratória, cutânea ou digestiva. A via respiratória é a principal via de introdução dos agentes químicos no organismo humano, pois os estados físicos dos agentes químicos mais comumente encontrados no ambiente de trabalho são gases, vapores e partículas. O contato constante do sistema respiratório, que é permeável e ricamente vascularizado com o ambiente externo, permite geralmente uma absorção rápida e eficiente, fazendo com que o agente químico muitas vezes alcance outros centros vitais, como Sistema Nervoso Central e outros órgãos, sem passar pelo sistema hepático (KLAASSEN, 2001). O câncer provocado por exposições ocupacionais geralmente atinge regiões do corpo que estão em contato direto com as substâncias carcinogênicas, seja durante a fase de absorção (pele e aparelho respiratório) ou de excreção (aparelho urinário), o que explica a maior freqüência de câncer de pulmão (LEE et al.,2003), de pele (FATIMA et al., 2000) e de bexiga (PESCH et al., 2000) nesse tipo de exposição. É bem documentado que mutações gênicas atuam em etapas do processo de carcinogênese e, que ensaios que detectam componentes genotóxicos permitem identificar substâncias com risco potencial à saúde humana. O teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium, também conhecido como Salmonella/microssomo, ou Teste de Ames, é a metodologia de triagem mais utilizada atualmente para detectar substâncias genotóxicas, sendo validado em larga escala por diversos laboratórios (MORTELMANS & ZEIGER, 2000; RIBEIRO et al., 2003; VARELLA et al., 2004a). O teste de mutação gênica reversa em Salmonella typhimurium (teste de Ames) é um ensaio utilizado por mais de 20 anos para avaliar, 5 através da urina, tanto o estilo de vida como a exposição ocupacional a mutagênicos e/ou carcinogênicos potenciais (PAVANELLO et al., 2002a ; MOHAMADI et al., 2003). A análise da mutagenicidade urinária, avaliada através do teste de Ames, é bem aceita por ser um método adequado para a demonstração da exposição ocupacional a compostos químicos mutagênicos que são excretados na urina de forma inalterada, ou como conjugados, ou ainda na forma de metabólitos mutagênicos (CERNÁ et al., 1997; BOSSO, 2000; HEUSER et al., 2005). A atividade mutagênica na urina já foi demonstrada em indivíduos fumantes (MOHAMADI et al., 2003); ou naqueles que estão em tratamento medicamentoso (GABBANI et al., 1999; JUNEJA et al., 2002). Esse parâmetro também foi usado como biomarcador de exposição ocupacional em vários ambientes de trabalho (BOSSO, 2000; VERMEULEN et al., 2003; HANSEN et al., 2004). O estudo de Yin et al. (1998) demonstrou a mutagenicidade urinária em indivíduos expostos a produtos da combustão de gás liquefeito de petróleo. Trabalhadores de forno de carvão de coque também apresentaram atividade mutagênica urinária mais elevada quando comparada ao grupo controle (MIELZIYNSKA et al., 1997). Choi et al. (1995), em um estudo caso-controle, avaliaram a mutagenicidade urinária de 37 pacientes (19 com câncer de bexiga e 18 controles) através do teste de Ames, com a finalidade de detectar exposição ocupacional a diferentes químicos e/ou casos de cânceres de bexiga, e verificaram mutagenicidade urinária positiva em 52% dos indivíduos expostos contra 22% dos indivíduos não expostos. Bosso (2000), estudando a exposição ocupacional em cortadores de cana da região de Araraquara-SP, demonstrou indícios de mutagenicidade urinária nesses indivíduos. É importante reconhecer o surgimento de compostos genotóxicos no ambiente de trabalho e existe a necessidade de identificar as fontes de contaminação, de modo a apontar esforços para minimizar e controlar essa situação (HOUK, 1992). 6 1.2. A importância dos polimorfismos genéticos (GSTM1, GSTT1 e CYP2E1) nos efeitos adversos à saúde, advindos da exposição a xenobióticos. Vários fatores, tais como, idade, hábito tabagista, afetam os resultados da atividade mutagênica encontrada nas populações expostas. Entretanto, é evidente que o risco genético não está apenas baseado no potencial genotóxico de agentes ambientais, mas também, nas diferenças na susceptibilidade genética a esses efeitos adversos. Dessa maneira, os genótipos são responsáveis pelas diferenças interindividuais na habilidade para ativar ou detoxificar substâncias genotóxicas, sendo reconhecidos como biomarcadores da susceptibilidade para a mutação, câncer e outras doenças (RIBEIRO et al., 2003). Devido ao fato de que praticamente todos os organismos vivos estão continuamente expostos a compostos químicos, vários mecanismos de proteção foram desenvolvidos durante o processo evolutivo, sendo a metabolização a mais versátil dessas formas de proteção. Assim, os animais mais evoluídos como o homem, desenvolveram no fígado um mecanismo enzimático que intercepta os xenobióticos como, por exemplo à nicotina, transformando-os em substâncias mais hidrossolúveis, facilmente excretadas do organismo (KLAASSEN, 2001), impedindo seu acúmulo e, conseqüentemente, o surgimento de danos no material genético. A biotransformação das drogas, em especial as que se processam no fígado, são comumente agrupadas em duas fases: I e II. Na fase I, geralmente realizada pelas enzimas da super-família do citocromo P-450 (CYP), que inclui as reações de oxidação, de redução ou de hidrólise, as drogas podem ser ativadas, inativadas ou terem inalteradas suas atividades. Na fase II, que é geralmente realizada pelas enzimas da família das glutationa S- transferases (GSTs) e N-acetiltransferases (NATs) e envolve reações de conjugação, ocorre a inativação total do xenobiótico, caso este ainda não tenha sido inativado na fase I. No entanto, 7 quando os produtos formados na fase I não sofrem inativação ou são ativados a substâncias mais reativas pelas enzimas da fase II, estes intermediários reativos podem se ligar covalentemente ao DNA e causar diversas formas de dano ao organismo, pois agirão como agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos (LANG & PELKONEN, 1999; HANSEN et al., 2004; SEPEHR et al., 2004). Os genes que codificam as enzimas de fase I e II vêm sendo clonados e identificados em seres humanos e muitos deles mostram-se polimórficos dentro da população, parecendo contribuir para a susceptibilidade individual ao desenvolvimento de tumores (AKTAS et al., 2001; YOKOYAMA et al., 2002). A associação entre polimorfismos nas enzimas CYPs, GSTs e NATs com o aumento de risco cânceres de pulmão e bexiga, têm sido demonstrada em diversos estudos (BARTSCH et al., 2000; YOKOYAMA et al., 2002). Assim, entre os mecanismos envolvidos no processo de carcinogênese, podemos destacar as alterações em genes responsáveis pela metabolização de xenobióticos, de maneira que distúrbios no balanço entre ativação e detoxificação podem ser uma possível explicação as variações individuais na resposta à exposição a carcinógenos (AUTRUP, 2000; LOKTIONOV, 2004). O CYP compreende uma superfamília de hemoproteínas localizadas na membrana do retículo endoplasmático que, embora presente em todos os tecidos, são expressas em grandes quantidades pelas células hepáticas (AUTRUP, 2000). Muitas drogas eletrofílicas, assim como xenobióticos, são eliminadas por oxidação no fígado. As hemoproteínas da superfamília CYP, responsáveis por essa oxidação, são conhecidas por catalisar a ativação metabólica de muitos compostos químicos para metabólitos mais reativos, que se ligam às macromoléculas celulares (TANAKA et al., 2000; VALOTI et al., 2000; ALEYNIK & LIEBER, 2001). 8 O genoma humano possui mais de 50 genes diferentes para o CYP, subdivididos em 10 famílias, nomeadas com números arábicos (CYP1 – CYP10). Essas famílias são subdividas em subfamílias, indicadas por uma letra e suas izoenzimas nomeadas por um número arábico. As CYP1, CYP2 e CYP3 estão intimamente envolvidas no metabolismo de drogas (AUTRUP, 2000). Os polimorfismos nos genes CYP influenciam a capacidade dos indivíduos de converter diferentes compostos pró-carcinogênicos em carcinogênicos e assim, são os principais fatores para a susceptibilidade do indivíduo para o desenvolvimento de câncer induzido quimicamente (INGELMAN-SUNDBERG, 2001). Essa variabilidade na atividade enzimática pode influenciar nos efeitos tóxicos, incluindo a carcinogênese induzida por compostos químicos endógenos (AUTRUP, 2000). O CYP2E1 tem sido extensivamente estudado por estar envolvido no metabolismo do etanol (BURIM et al., 2004) e de outros xenobióticos com baixo peso molecular, incluindo as n-nitrosaminas (TANAKA et al., 2000; VALOTI et al., 2000; ALEYNIK & LIEBER, 2001). Muitos substratos da CYP2E1 são também agentes indutores, incluindo a acetona e o etanol, e a indução dos metabólitos da CYP2E1 pelo etanol é uma possível explicação para o aumento da incidência de muitos cânceres em alcoolistas (RONIS et al., 1996; MURRAY, 2002). Dentre os substratos para a CYP2E1, encontram-se vários solventes: benzeno (JUNXIANG et al., 2002), acetona (FREEMAN et al., 1992), diclorometano (LEHNEBACH et al.,1995), hexano (ALI & TARDIF, 1999), etc. O polimorfismo da CYP2E1 tem importante papel na carcinogênese pulmonar em indivíduos com hábitos tabagistas (BARTSCH et al., 2000). O gene CYP2E1 também está envolvido na interação hepatotóxica em trabalhadores expostos ao clorofórmio e ao tetraclorocarbono (KATSU et al., 1998). 9 Wan et al. (2002), observaram que trabalhadores com genótipo CYP2E1 c.-1293 C/C and c.-1293 G/C são mais susceptíveis a ação tóxica do benzeno. O Instituto Nacional de Câncer (Universidade do Colorado) e investigadores chineses determinaram o fator de risco para doenças hematológicas em indivíduos expostos ao benzeno e puderam observar que elevada concentração da enzima CYP2E1 tem papel fundamental nessas doenças. O gene CYP2E1 faz a conversão do benzeno em óxido de benzeno, que espontaneamente originará o fenol; este sofrerá nova metabolização da CYP2E1, formando hidroquinonas, que darão origem as benzohidroquinonas, que são conhecidas pelo seu potencial hematotóxico e genotóxico (ROTHMAN et al., 1997). Além da ativação dos procarcinógenos, a CYP2E1 é responsável pela produção de radicais livres que causam injúria tecidual, e são formados tanto na presença como na ausência dos substratos (MURRAY, 2002). Muitos desses radicais, formados pelas reações de fase I, são detoxificados por vários complexos enzimáticos, destacando-se as glutationa-S-transferases. Dentre os sistemas de detoxificação já descritos, as GSTs possuem importante papel, fornecendo proteção contra compostos eletrofílicos e produtos do estresse oxidativo, pois vem sendo sugerido que estas enzimas fazem parte de um mecanismo de resposta adaptativa aos danos causados por compostos químicos (BROCKSTEDT et al., 2002; SCHNEIDER et al., 2004). As GSTs estão amplamente distribuídas na natureza, encontradas desde as bactérias até o homem, e são expressas em tecidos de mamíferos (HAYES & PULFORD, 1995). Indivíduos com genótipo nulo para GSTM1, ocupacionalmente expostos ao estireno, apresentaram um aumento na troca entre cromátides irmãs, além de terem um aumento significativo na concentração de metabólitos urinários, quando comparados com indivíduos com GSTM1 presente (TEIXEIRA et al., 2004). 10 Pitarque et al. (2002), monitorando trabalhadores expostos a solventes orgânicos, observaram que os indivíduos com hábitos tabagistas com genótipo nulo para o GSTM1 apresentaram um aumento significativo na frequência de micronúcleos. Danos cromossômicos e concentrações elevadas de aductos de DNA foram detectados nos linfócitos de fumantes e de motoristas de ônibus com genótipos GSTM1 e GSTT1 nulos (NORPPA, 2001). Outros estudos também encontraram aumento significativo nos aductos de DNA de indivíduos com genótipo GSTM1 nulo ocupacionalmente expostos a hidrocarbonetos policíclicos aromáticos - HPAs (BUTKIEWICZ et al., 2000; ROJAS et al., 2000; PAVANELLO et al., 2004). Estudos recentes demonstram que os genótipos nulos de GSTM1 e GSTT1, separadamente ou combinados, são fatores genéticos de alto risco para o desenvolvimento de tumores. O genótipo GSTM1 nulo já foi associado ao desenvolvimento de diversos tipos de cânceres, como o de pulmão (GASPAR et al., 2004); bexiga (JOHNS & HOULSTON, 2000); mama (MITRUNEN et al., 2001) e de cabeça e pescoço (BUSCH et al., 2002; MATTHIAS et al., 2002; AU et al., 2003). Por outro lado, Roddi et al. (2004), demonstraram aumento estatisticamente significativo no risco de câncer de mama de indivíduos com genótipo GSTM1 +/+, comparado com o genótipo GSTM1 -/-. Gudmundsdottir et al. (2001) não encontrou aumento no risco de câncer de mama associado a nenhuma combinação dos polimorfismos GSTM1, GSTT1 e GSTP1. Dentre os tumores mais freqüentemente associados à ausência do gene GSTM1, destaca-se o câncer de pulmão, pelo fato de GSTM1a e a GSTM1b serem ativos na detoxificação de certos epóxidos dos HPAs encontrados na fumaça do cigarro e em outros produtos de combustão (HAYES & PULFORD, 1995). Assim sendo, HPAs presentes no cigarro, incluindo o carcinógeno benzo(a)pireno, requerem primeiramente ativação metabólica pelas enzimas da fase 11 I (citocromo P450 e suas formas ativadas) que produzem um intermediário que se constitui no substrato de detoxificação para as enzimas GSTM1 da fase II. A freqüência do gene GSTM1 nulo em pacientes chineses com adenocarcinoma de pulmão, segundo Gao & Zhang (1999), foi de 76,9% contra 49,2% em indivíduos saudáveis. Aktas et al. (2001) estudaram a relação entre o genótipo GSTM1 nulo e o câncer superficial e invasivo de bexiga. A deleção do gene GSTM1 foi encontrada em 54,3% de todos os pacientes com câncer e em 64,3% dos pacientes que apresentam a forma invasiva do câncer de bexiga. Rossi et al. (1999), avaliaram a excreção de ácido fenilmercaptúrico e t,t-MA (metabólito do benzeno) em motoristas de ônibus municipais, correlacionando com o polimorfismo genético das enzimas de fase I e II, demonstrando altos níveis de excreção urinária do t,t –MA em indivíduos com o genótipo GSTM1 nulo. Resultados semelhantes foram mostrados por Bergamaschi et al. (1999) analisando a urina de ciclistas, e também demonstraram que altos níveis de tolueno e benzeno foram encontrados nos ciclistas com deleção do gene GSTM1. Os diferentes estudos desenvolvidos em vários países, com genes responsáveis pela metabolização de xenobióticos, são de grande importância para a determinação da susceptibilidade genética e poderão futuramente ser utilizados como biomarcadores no auxílio à prevenção e tratamento de várias doenças. 12 2. Objetivos 1- Caracterizar a atividade mutagênica dos compostos eliminados na urina de indivíduos expostos ocupacionalmente a solventes orgânicos, em laboratórios de pesquisa do Instituto de Química – UNESP- Araraquara e seus respectivos controles. 2- Identificar o polimorfismo constitucional desses indivíduos para dois genes da super família glutationa-S-transferase (GSTM1 e GSTT1) e da família citocromo- P450 (CYP2E1). 3- Associar, sempre que possível, a influência desses genótipos (GSTM1, GSTT1 e CYP2E1) com a atividade mutagênica urinária dos grupos expostos e controles. 4- Fornecer um melhor entendimento sobre os riscos à saúde decorrentes da exposição aos compostos em questão. 13 3. Material e métodos A coleta e avaliação da mutagenicidade das amostras de urina foi realizada em colaboração com o Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química, UNESP - Campus de Araraquara. 3.1. Amostras de urina A avaliação da mutagenicidade urinária foi realizada em 30 indivíduos saudáveis e não fumantes, sendo funcionários, alunos e professores com atividade diária nos diversos laboratórios do Instituto de Química – UNESP - Araraquara (grupo exposto – E) e 30 indivíduos controles, não fumantes (grupo controle – C), pareados por sexo e idade. Dentre os diversos solventes que estes indivíduos são expostos estão: acetato de etila, acetonitrila, metanol, acetona, etanol, hexano, benzeno, etc. Todos os indivíduos responderam a um questionário detalhado incluindo informações sobre a história pessoal e ocupacional e saúde em geral (Anexo 1), além de assinarem um termo de consentimento para participação neste estudo (Anexo 2). Esse trabalho foi realizado após a aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, UNESP (Anexo 3). 14 A coleta da urina foi realizada em frascos de polietileno durante o dia de trabalho, até a obtenção de aproximadamente 1000mL. Entre as coletas a urina foi mantida sob refrigeração. A concentração e extração dos compostos presentes na urina seguiu a metodologia descrita por Yamasaki e Ames (1977), utilizando a resina XAD-2, com algumas modificações. A resina foi previamente lavada por agitação e decantação várias vezes com água MilliQ, seguida de metanol. Depois de lavada, a resina passou por soxhlet com metanol em ebulição por 16 horas, e foi armazenada no mesmo solvente a temperatura ambiente até seu uso. As colunas de vidro com 0,7cm de diâmetro x 10cm foram previamente lavadas com água destilada e na seqüência adicionou-se 0,7g de resina. Para ambientar a resina, foi percolada água milliQ, em seguida a amostra de urina (previamente filtrada e com pH corrigido para 7,0 com NaOH 0,5M) foi percolada com fluxo de 2-3mL de urina/minuto. Os compostos adsorvidos pela resina foram eluídos em 10 mL de acetona. Usou-se o rotaevaporador (45°C) e Concentrator 5301 (Eppendorf®), para evaporar todo o solvente. O extrato seco foi dissolvido na proporção de 0,4mL de DMSO para cada 100mL equivalente urina, e armazenado a -20°C até o uso. Foram avaliadas 4 concentrações de cada amostra de urina, a saber: 1,5; 3,0; 6,0 e 12,0mL equivalente urina/placa (EINISTÖ, et al. 1990). Anteriormente, aos ensaios de mutagenicidade com as amostras de urina, a resina XAD-2 foi testada. Adotou-se o mesmo procedimento para a adsorção, eluição e concentração das amostras de urina, no entanto, a urina foi substituída por água milliQ. Em seguida, esse extrato (branco da resina XAD-2) foi também avaliado nos ensaios com Salmonella/microssomo. 15 3.2. Avaliação da mutagenicidade 3.2.1. Ensaio de mutação gênica reversa O ensaio de mutação gênica reversa utilizado nesse trabalho foi o Teste de Ames que baseia-se na utilização de linhagens de Salmonella typhimurium auxotróficas para o aminoácido histidina, as quais revertem à prototrofia pelo tratamento com agentes mutagênicos (MARON & AMES,1983). 3.2.2. Linhagens de Salmonella typhimurium Foram utilizadas linhagens de Salmonella typhimurium TA100, gentilmente fornecida pelo Prof. Dr. Bruce Ames da Universidade de Berkeley, California, EUA e a cepa YG1024 gentilmente cedida pelos Drs. Takehito Nohmi e Watanabe Masahiko do Instituto Nacional de Ciências Higiênicas, Tókio, Japão. Essas linhagens (Tabela 1) são auxotróficas em relação à histidina, que detectam preferencialmente mutágenos que causam deslocamento do quadro de leitura ou substituição de pares de bases do DNA. Essas cepas possuem várias mutações no operon da histidina que são os alvos para mutação reversa, bem como mutações do tipo rfa que causam perda parcial da barreira lipopolissacarídica da parede bacteriana, facilitando a difusão de moléculas grandes para o interior da célula, a deleção do gene uvrB que causa deficiência do sistema de reparo por excisão e fator R plasmidial (plasmídio pKM101) que confere resistência à ampicilina e contém os genes muc AB, cuja expressão causa estímulo no sistema de reparo suscetível ao erro (error prone). Essas mutações lhes conferem maior sensibilidade na detecção de diversos mutágenos. A linhagem YG1024 apresenta mutação no gene hisD (his D3052) que codifica para histidinol desidrogenase, apresentando como ponto preferencial para reversão oito resíduos 16 repetitivos de GC e detecta compostos mutagênicos que causam deslocamento do quadro de leitura do DNA, além de superproduzir O-acetiltransferases. É uma linhagem mais sensível na detecção de compostos hidroxilaminos, nitro aromáticos e aminas aromáticas (WATANABE et al., 1990). A TA100 detecta mutágenos que causam substituição de pares de bases no DNA. Contém uma mutação no gene hisG (hisG46) que codifica para a primeira enzima da biossíntese da histidina, tendo o par GC como ponto preferencial para a reversão (MARON & AMES, 1983). Tabela 1: Descrição comparativa das linhagens bacterianas Linhagem bacteriana Descrição TA100 – rfa, ∆ uvrB, hisG46, bio− , PKM101 Linhagem que tem o par GC como ponto preferencial para a reversão YG1024 –TA98 com pYG219 Linhagem derivada da TA98 com plasmídio que aumenta a atividade da O-acetiltransferase. 3.2.3. Meios de cultura Os meios de cultura foram preparados de acordo com as especificações de Maron & Ames (1983). O crescimento das linhagens de S. typhimurium foi realizado em caldo nutriente Oxoid n.2 e o ágar nutriente foi elaborado a partir do caldo nutriente, com ou sem ampicilina, dependendo do ensaio, solidificado com 1,5% de ágar (Difco). 17 Nos ensaios de mutagenicidade foi usado ágar mínimo glicosado com traços de histidina/biotina, constituído de ágar glicose (20g de glicose, 15g de ágar e 930 mL de àgua destilada) e meio Vogel Bonner E 50x concentrado (10g de sulfato de magnésio heptahidratado, 100g de ácido cítrico, 175g de fosfato de sódio de amônio, 500g de fosfato de potássio dibásico e 670 mL de água respectivamente, acrescido de 10 mL de uma solução de L-histidina 0,096 mg/mL (Sigma) e D-biotina 0,123 mg/mL (Sigma). O ágar de superfície (top agar) foi composto de 0,5% de cloreto de sódio e 0,6% de ágar. Os meios de cultura foram preparados e esterilizados em autoclave a 121º C por 15 minutos quando não especificados. 3.2.4. Manutenção e estoque das culturas As cepas de S. typhimurium foram armazenadas em freezer -80º C, em frascos para congelamento com 0,9 mL de cultura e 0,1 mL de DMSO como agente crioprotetor. 3.2.5. Confirmação dos genótipos das linhagens de S. typhimurium a) Auxotrofia para histidina As culturas bacterianas foram estriadas com alça de platina em placas controle de ágar mínimo acrescidas de histidina e biotina e em placas testes contendo apenas biotina. A biotina é requerida, uma vez que a deleção do gene uvrB se estende até o gene responsável por sua síntese. Após incubação por 24h a 37ºC, as placas testes contendo apenas biotina não devem apresentar crescimento, enquanto as placas suplementadas com histidina e biotina apresentam crescimento. b) Mutação rfa 18 A mutação no gene rfa confere sensibilidade ao cristal violeta. As culturas de S. typhimurium foram inoculadas em placas de ágar nutriente utilizando-se de cotonetes estéreis de forma a se obter um crescimento homogêneo. A seguir, foi colocado no centro da placa, um disco de papel de filtro de 5mm de diâmetro embebido com 10 µL de uma solução de cristal violeta a 1%. As cepas devem apresentar um halo de inibição de, no mínimo 14 mm de diâmetro após incubação a 37º C por 24h. c) Plasmídeo pKM101 A presença do plasmídeo pKM101 foi confirmada através da resistência ao antibiótico ampicilina. As culturas bacterianas foram semeadas perpendicularmente a uma estria de solução de ampicilina 8mg/mL em placas de ágar nutriente. Após incubação a 37ºC por 24h, as cepas portadoras do plasmídeo pKM101 apresentam crescimento contínuo através das estrias da solução de ampicilina. d) Deleção uvrB A mutação uvrB confere sensibilidade à radiação ultravioleta, devido à deficiência no mecanismo de reparo por excisão. As culturas de Salmonella foram semeadas em placas de ágar nutriente utilizando-se cotonetes estéreis. A seguir, metade da placa foi coberta com papel alumínio e irradiada com lâmpada germicida (ultravioleta) de 15watts a uma distância de 33cm por 8 segundos. Após incubação a 37ºC por 24h, as cepas portadoras dessa deleção crescem apenas na metade da placa não irradiada (coberta). e) Taxa de reversão espontânea A taxa de reversão espontânea foi determinada inoculando-se 100µL de cada cultura (109 bactérias) em 2 mL de ágar de superfície estabilizado a 45ºC e vertendo-se essa mistura, após homogeneização, sobre uma placa de ágar mínimo. O ensaio foi realizado em 19 triplicata e o número de colônias revertentes espontâneas obtidas após 48h de incubação a 37º C deve estar dentro da faixa esperada para cada cepa, a saber : TA100: 75 - 225 revertentes/ placa YG1024 : 20 - 75 revertentes /placa. 3.2.6. Sistema de ativação metabólica Os testes de mutagenicidade foram realizados em presença e ausência de ativação metabólica. O sistema utilizado foi a fração microssomal S9 (S9 mix ) preparada a partir de homogeneizados de fígado de ratos Sprague Dawley, previamentes tratados com Arocloror 1254, adquiridos sob a forma liofolizada da Moltox Molecular Toxicology Inc., Annapolis, USA. Volumes adequados da mistura de ativação S9 foram preparados no momento do ensaio e mantidos em gelo durante sua execução. Após o ensaio, a mistura não utilizada foi descartada. Foi utilizada a mistura padrão recomendada por Maron & Ames (1983), constituída de 4% de fração S9; 1% de cloreto de magnésio 0,4M; 1% de cloreto de potássio 1,65M; 0,5% de D-glicose-6-fosfato 1 M; 4% de B- nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato 0,1 M; 50 % de tampão fosfato de sódio 0,2 M pH 7,4 (81% de fosfato de sódio dibásico 0,2 M e 19 % de fosfato de sódio monobásico 0,2 M) e 39,5% de água destilada estéril. Todos os reagentes, quando não especificados foram procedentes da Sigma e Merck. 3.2.7. Procedimento do ensaio de acordo com Maron e Ames (1983) Para a realização experimental do teste de mutagenicidade foi utilizado o método de pré-incubação, empregando as linhagens TA100 e YG1024. O método de pré- incubação é uma modificação do ensaio padrão de incorporação em placa, primeiramente introduzido por Yahagi et al. (1975) a fim de detectar a atividade mutagênica de tinturas 20 carcinogênicas. Nessa técnica, a bactéria, a substância teste e a mistura S9, quando usada, são incubadas antes de serem transferidas para a placa com ágar. Para o início dos ensaios as bactérias foram inoculadas com a alça de platina em 30mL de caldo nutriente e mantidas a 37ºC, sob agitação constante (160rpm) durante 14 h, de modo a se obter uma densidade de 1 a 2x 109 bactérias/mL. Em tubos de ensaio foram colocados 0,1mL da cultura (pernoite) de bactérias, a concentração adequada do extrato seco dissolvido em DMSO e 0,5mL de tampão fosfato pH 7,4 nos ensaios sem metabolização. Nos ensaios com ativação metabólica foi adicionado 0,5mL da mistura S9 (fração pós-mitocondrial, suplementada com cofatores e preparada a partir de fígado de ratos tratados com agentes indutores de enzimas Arocloror 1254). A mistura S9 revela se a substância ou amostra é mutagênica em sua forma original ou se necessita ser metabolizada ou ativada para ser mutagênica. Os tubos assim compostos foram incubados a 37º C durante 20 minutos. Após esse tempo, foram adicionados 2mL de ágar superfície acrescido de uma solução de histidina/biotina 0,05mM na proporção de 10/100 mL. Em seguida, os tubos foram agitados e vertidos em placas de Petri que já continham o meio mínimo glicosado. Estas placas foram incubadas por 48 horas a 37º C. Transcorrido o tempo necessário, foi efetuada a contagem das colônias revertentes. Todas as concentrações testadas (que foram em número de 4), controles positivos e negativos foram realizados em triplicata. 3.2.8. Controles Paralelamente a cada ensaio, foram realizados controles positivo e negativo. Como controle negativo foi usado o DMSO, o solvente do extrato. O volume de DMSO usado foi de 50µL. Os controles positivos são compostos mutagênicos específicos para cada cepa e condição do ensaio, sendo: 4-nitro-fenilenediamina para cepa YG1024 e azida sódica para 21 TA100, em ensaios sem fração S9; 2-antramina para TA100 e YG1024 em ensaios com ativação metabólica. 3.3. Estudo dos polimorfismos enzimáticos 3.3.1. Extração e quantificação do DNA genômico A extração do DNA foi feita de sangue total (EDTA) fresco, utilizando o Kit WIZARD (Genomic DNA Purification Kit) da Promega, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A quantificação do DNA foi feita por absorbância UV, de modo a ser estocado em alíquotas de 25 µl, à concentração de 50 ng/µl, e mantido à -4°C até o uso. 3.3.2. Amplificação das seqüências de DNA e detecção dos genótipos Para todos os polimorfismos estudados, os fragmentos foram amplificados no termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc) e submetidos à eletroforese (95V) em cuba contendo tampão TBE 0,5X (LGG Biotecnologia), para a detecção dos genótipos GSTM1, GSTT1 e CYP2E1. As reações foram visualizadas em gel de agarose (Labtrade) 2,0% feito também com tampão TBE 0,5X e corado com 2 µl de brometo de etídio (na concentração de 10 mg/ml), e 4 µl de tampão de amostra (0,25% de azul de bromofenol, 15% de Ficoll em água) para a visualização da corrida. Na eletroforese para a detecção dos genótipos GSTM1 e GSTT1 usou-se 95V, assim como na primeira eletroforese para o genótipo CYP2E1. Após a digestão dos produtos da PCR para o CYP2E1 a eletroforese foi feita em 60V. 22 Para comparar o peso das bandas foi usado marcador de peso molecular de 100 pares de base (pb) diluído. Em todos os casos, foi usado também um branco (todos os reagentes exceto o DNA), com o intuito de assegurar que não houve contaminação das amostras. Os géis foram observados e fotografados com filme polaróide em transiluminador de luz ultravioleta. 3.3.3. Detecção dos genótipos GSTM1 e GSTT1 por PCR- multiplex A reação de co-amplificação em cadeia foi realizada baseada no protocolo para PCR Multiplex de Abdel-Rahman et al. (1996) modificado, onde foram utilizados: 21,5µl de PCR mix (Invitrogen); 1,0 µl (100ng/µl) de cada primer (Invitrogen): GSTM1 (5’- GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC e 5’-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG), GSTT1: (5’- TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC e 5’-TCACCGGATCATGGCCAGCA) e CYP1A1(5’- GAACTGCCACTTCAGCTGTCT e 5’-CAGCTGCATTTGGAAGTGCTC) e 2,0 µl (100 ng) de DNA genômico. Os ciclos de co-amplificação foram de: 95°C por 5 minutos, 30 ciclos de 94°C por 2 min., 59°C por 1 min. e 72°C por 1 min., seguidos de uma extensão final (4 min. a 72°C). Os primers para CYP1A1 amplificam um fragmento constante de 312 pb, o qual foi usado como controle interno da reação, excluindo a possibilidade de uma falsa interpretação dos resultados devido à ausência da reação de amplificação. O fragmento de 215 pb pode ser visto somente nos casos de indivíduos que possuem o gene GSTM1. O fragmento de 480 pb pode ser visto somente nos casos de indivíduos que possuem o gene GSTT1. A ausência de amplificação GSTM1 (215 pb) ou GSTT1 (480 pb), na presença de controle interno, indica os respectivos genótipos nulos para cada gene. 23 3.3.4. Detecção do genótipo CYP2E1-PstI A reação de amplificação em cadeia por PCR e o polimorfismo RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição) PstI do gene CYP2E1, foi realizada de acordo com Anwar et al. (1996) modificado, onde foram utilizados: 21,5µl de PCR mix (Invitrogen); 1,0 µl (100ng/µl) de cada primer (Invitrogen): CYP2E11 (5’ CCA GTC GAG TCT ACA TTG TCA 3’) e CYP2E12 (5’ TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG 3’) e 2,0 µl (100 ng) de DNA genômico. Os ciclos de amplificação foram de: 95°C por 1 minuto, 26 ciclos de 95°C por 1 min., 55°C por 1 min. e 72°C por 1 min., seguidos de uma extensão final (4 min. a 72°C). Após a reação de amplificação, 20µl do produto de PCR foram digeridos com 6U (0,3µl) da enzima PstI (Gibco - BRL), 2,2µl de H2O e 2,5µl de tampão React 2, a 37oC por 1 hora, e então analisado em gel de agarose (Gibco-BRL) 2,0% submetido a eletroforese a 60V. O par de primers CYP2E11 e CYP2E12 gera um produto de amplificação constante de 410pb, referente ao genótipo homozigoto normal (c1/c1), o qual não sofre ação da enzima PstI, originando uma banda não clivada. O genótipo homozigoto mutante (c2/c2) possui um sítio para a enzima de restrição PstI, que cliva o produto da amplificação, gerando uma banda de 290 e outra de 120pb, e o genótipo heterozigoto (c1/c2) apresenta as três bandas: 410, 290 e 120pb. 24 4. Avaliação e interpretação dos resultados Os dados da mutagenicidade urinária foram analisados utilizando o programa estatístico Salanal elaborado e gentilmente cedido pelo Dr. L. Myers do Research Triangle Institute, RTP, Carolina do Norte, USA. Esse programa permite avaliar o efeito dose-resposta através do cálculo da análise de variância (ANOVA – teste F) entre as médias do número de revertentes nas diferentes doses testadas e o controle negativo, seguido de uma regressão linear. A inclinação da reta da parte linear da curva dose-resposta é também fornecida por esse programa e por extrapolação fornece a potência mutagênica de cada amostra, que corresponde ao número de revertentes induzidos por mL equivalente de urina. A partir dos resultados obtidos, foi calculado o razão de mutagenicidade (RM) para cada dose analisada, que é a média do número de revertentes na placa teste (espontâneos mais induzidos) dividida pela média do número de revertentes por placa do controle negativo (espontâneos). A amostra foi considerada positiva quando a razão de mutagenicidade (RM) foi maior ou igual a 2 em pelo menos uma das doses testadas e quando houve uma relação dose resposta entre as concentrações testadas e o número de revertentes induzidos (VALENT et al., 1993; VARGAS et al., 1993; VARELLA et al., 2004b). Por sua vez, a amostra foi considerada 25 negativa para o teste de Ames, quando a mesma não induziu aumento significativo no número de revertentes e seus RM foram todos menores que 2. Os dados da mutagenicidade urinária dos grupos controle e exposto, foram comparados utilizando o programa estatístico BioEstat 2.0, através do teste de Mann-Whitney (significância a 5%). O mesmo teste estatístico, foi utilizado para determinar a dependência entre mutagenicidade urinária e os polimorfismos genéticos dos genes GSTM1,GSTT1 e CYP2E1, de todos os indivíduos amostrados. A dependência entre as variáveis, sexo, idade e etnia, e o genótipo foram avaliadas usando o teste do χ2 (qui-quadrado). 26 5. Resultados 5.1. Caracterização das amostras estudadas Foram avaliados 60 indivíduos, divididos em dois grupos, controle (C) e exposto (E). Na Tabela 2 onde indivíduos estão pareados segundo o sexo e a idade (± 7anos), observa-se que a maioria é do sexo feminino (20 em cada grupo) , pertencente ao grupo étnico caucasiano (19 e 18, grupo controle e exposto, respectivamente) e com faixa etária entre 19 e 54 anos (28 ± 9 e 29,3 ± 7,7; grupo controle e exposto, respectivamente). No restante das tabelas, os indivíduos não estão pareados segundo o sexo e a idade. Tabela 2: Caracterização dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação ao sexo, grupo étnico e idade. Código Sexo F/M Etnia Idade (anos) Código Sexo F/M Etnia Idade (anos) 07C M C 42 36E M C 35 11C M C 39 30E M C 33 36C M C 33 45E M C 33 18C M C 27 50E M C 32 22C M C 26 10E M C 32 27 Continuação Código Sexo F/M Etnia Idade (anos) Código Sexo F/M Etnia Idade (anos) 33C M C 25 07E M C 27 23C M C 25 38E M N 27 35C M C 23 47E M C 22 21C M C 22 44E M C 20 19C M C 20 16E M O 20 02C F C 49 31E F C 54 32C F C 48 06E F C 49 04C F C 43 23E F C 38 27C F C 42 02E F C 35 13C F C 34 18E F C 33 09C F C 30 40E F C 32 08C F C 29 17E F C 31 16C F C 29 09E F C 30 24C F C 28 39E F C 30 34C F C 25 19E F C 29 39C F C 23 27E F C 28 14C F C 22 48E F N 27 29C F C 21 29E F C 26 20C F C 20 26E F C 23 25C F C 20 35E F C 23 26C F C 20 46E F C 23 17C F C 19 28E F C 23 37C F C 19 33E F C 22 30C F N 19 54E F C 22 38C F C 19 43E F O 21 C: grupo controle; E: grupo exposto, M:sexo masculino; F: sexo feminino; C: caucasianos; N: negros e O: orientais. 28 Tabela 3: Caracterização dos indivíduos, através da freqüência, segundo os hábitos alimentares, consumo de bebidas alcoólicas, uso de medicamentos e tempo de exposição. Consumo de vegetais Consumo de bebidas alcoólicas Uso de medicamentos Tempo de exposição GRUPO CONTROLE 2 (6,7%) não comem 7 (23,3%) não bebem 1 (3,3%) ansiolíticos 28 (93,3%) comem 14 (46,7%) bebem eventualmente 2 (6,7%) analgésicos 9 (30%) 1-4 copos/semana 3 (10%) outros 24 (80%) nenhuma medicação GRUPO EXPOSTO 2 (6,7%) não comem 9 (30%) não bebem 1 (3,3%) ansiolíticos 17 (56,6%) 1-5anos 28 (93,3%) comem 13 (43,3%) bebem eventualmente 3 (10%) antiinflamatórios 7 ( 23,3%) 6-10 anos 8 (26,7%) 1-4 copos/semana 7 (23,4%) analgésicos 6 (20%) mais de 10 anos 3 (10%) outros 16 (53,3%) nenhuma medicação F: sexo feminino; M: sexo masculino; (freqüência/30 indivíduos). A Tabela 3 apresenta, a caracterização dos indivíduos que participaram desse estudo, através da distribuição da freqüência, segundo o consumo de vegetais, consumo de bebidas alcoólicas, uso de medicamentos e tempo de exposição aos soleventes orgânicos. Dos indivíduos de cada grupo, 6,7% não comem vegetais, 3,3% usam ansiolíticos e 10% outros tipos de medicamentos. Entre os voluntários desse estudo, grupo controle e exposto, respectivamente, 80% e 53,4% não tomam nenhum tipo de bebida alcoólica, 46,7% e 43,3% eventualmente tomam bebidas com teor alcoólico, 30% e 26,7% apresentam um consumo de bebida alcoólica entre 1 a 4 copos por semana., 6,7% e 23,4% fazem uso de analgésicos, 80% e 53,3% não tomam nenhuma medicação. Apenas os voluntários (10%) do grupo exposto tomam antiinflamatórios. Todos os voluntários foram orientados para fazer a coleta de urina quando não tivessem usando medicamentos. O tempo de exposição a solventes orgânicos variou de 1 a 21anos. Dentre os 29 voluntários, o tempo de exposição variou entre 1 e 5 anos em 56,7% , 6 e 10 anos em 23,3% e, mais que 10 anos em 20% dos indivíduos avaliados. 5.2. Atividade mutagênica dos extratos orgânicos de urina A atividade mutagênica dos extratos orgânicos da urina do grupo controle (C) e do grupo exposto (E) a solventes orgânicos, adsorvidos pela resina XAD-2, foi avaliada através de ensaios com mutação gênica reversa em Salmonella typhimurium usando-se as linhagens TA100 e YG1024, tanto na presença quanto na ausência de metabolização. Anteriormente aos ensaios de mutagenicidade com as amostras de urina, foi feito um branco para a resina XAD-2, realizando-se o mesmo procedimento de adsorção, eluição e concentração adotados para a obtenção dos extratos orgânicos de urina, porém, a urina foi substituída por água milliQ. Em seguida, esse extrato (branco) foi avaliado no teste de Ames, onde não apresentou atividade mutagênica. Nas tabelas de 4 e 5 estão os resultados obtidos nos ensaios das amostras de urina dos grupos controle e exposto, respectivamente, com análise estatística descritiva indicando média (M), desvio padrão (SD) do número de revertentes his+/placa e razão de mutagenicidade (RM) nas diferentes doses testadas, com as linhagens TA100 e YG1024, tanto em presença (+S9) como ausência (-S9) de metabolização. Do total de amostras avaliadas, 10 apresentaram resultados significativos para RM e efeito dose-resposta, sendo, 3 amostras pertencentes ao grupo controle (04C, 17C e 36C) e o restante ao grupo exposto (02E, 09E, 39E, 40E , 44E, 45E e 54E). As amostras 04C e 17C (Tabela 4) foram mutagênicas na linhagem TA100 (- S9) com RM entre 1,3 e 2,5, e número de colônias his+ revertentes entre 141 e 390. Foi observada atividade mutagêncica positiva da amostra 36C (Tabela 4) apenas na linhagem 30 YG1024 (-S9), os valores de RM variaram de 1,6 a 2,0, com valores de 43 a 55 no número de colônias his+ revertentes. Foi observada atividade mutagênica das amostras 02E, 09E, 39E, 40E, 44E e 45E (Tabela 5) na linhagem YG1024, com metabolização. O valor de RM variou de 1,3 a 3,3 e o número de colônias his+ revertentes variou de 29 a 88. A amostra 54E (Tabela 5) foi mutagênica para a linhagem YG1024, apenas na ausência de metabolização, com RM entre 1,9 e 2,2 e número de colônias his+ revertentes entre 48 e 60. A Tabela 6, mostra as potências mutagênicas (número de revertentes his+/mL equivalente urina) das amostras do grupo controle e exposto, que apresentaram resposta mutagênica positiva, em pelo menos um dos ensaios (TA100 ou YG1024, com metabolização ou sem metabolização). Em ensaios com a linhagem TA100, em ausência de metabolização, duas amostras do grupo controle apresentaram potências de 2,3 e 19,2 revertentes/mL equivalente de urina. Para a linhagem YG1024 (-S9), apenas uma amostra do grupo controle (13,8 revertentes/mL equivalente de urina) e uma do grupo exposto (2,6 revertentes/mL equivalente de urina) apresentaram atividade mutagênica. Porém, em presença de S9, seis amostras de urina do grupo exposto foram positivas, com potências que variaram de 1,8 a 25,1 revertentes/mL equivalente de urina. A Tabela 7, mostra os maiores valores de RM obtidos para o grupo exposto e controle e, as Figuras 2 a 5 ilustram esses resultados. Verificou-se que os valores do RM das amostras de urina em ensaios com a linhagem YG1024 em presença do sistema de ativação metabólica (Figura 5), demonstram um número maior de amostras com RM ≥ 2,0 no grupo exposto, quando comparado ao número de amostras com a mesma característica no grupo controle. Em ausência de S9 (Figura 4), observa-se um perfil semelhante, em ambos os grupos 31 (exposto e controle); destacando-se duas amostras do grupo controle (36C e 38C). Por outro lado, na Figura 2, observa-se que para a linhagem TA100 (-S9), o grupo controle apresentou um número maior de extratos urinários com RM ≥ 2,0; comparado ao grupo exposto aos solventes. Em presença de metabolização (Figura 3), observa-se um perfil semelhante, em ambos os grupos (exposto e controle). Analisando estatisticamente (Tabela 7), esses dados mostram um aumento significativo (p = 0,008) nos valores de RM das amostras de urina do grupo exposto, comparado ao grupo controle, apenas para a linhagem YG1024 (+S9). A Tabela 8, mostra o índice de aumento relativo (maior número de revertentes his+ obtido de cada amostra de urina, menos o número de revertentes his+ espontâneas; dividido pelo número de revertentes his+ espontâneas), para cada amostra de urina do grupo controle e exposto em todos os ensaios de mutagenicidade. Esses resultados demonstram um aumento significativo (p = 0,002) na média dos índices de aumento relativo das amostra de urina do grupo exposto, comparado ao grupo controle, apenas para a linhagem YG1024 (+S9). Não apresentaram nenhuma atividade mutagênica as amostras, 07C,14C e 19C (Tabela 4), 06E, 18E e 50E (Tabela 5). Em 24 amostras do grupo controle e em 20 amostras do grupo exposto, observou-se apenas resultados significativos em um dos parâmetros avaliados (o efeito dose- resposta). A linhagem YG1024 (+S9) foi a que detectou mais amostras, com efeito dose resposta significativo, sendo 17 no grupo controle e 16 no grupo exposto. Apresentaram indícios de citotoxicidade, avaliada pela diminuição dos revertentes e pela análise do background law, normalmente para as maiores concentrações testadas, as amostras: 8C, 9C, 32C (Tabela 4), 09E, 33E e 36E (Tabela 5) para a linhagem TA100(-S9); 13C, 16C, 33C (Tabela 4), 6E, 9E, 18E, 19E, 29E e 38E (Tabela 5) para linhagem 32 TA100(+S9); 20C (Tabela 4), 6E e 48E (Tabela 5) para a linhagem YG1024 (-S9); 18E (Tabela 5) para a linhagem YG1024 (+S9). Os resultados obtidos demonstram que apenas para a linhagem YG1024 na presença de ativação metabólica houve aumento significativo nos valores de RM (p = 0.008) e no índice de aumento relativo (p = 0,002), encontrados no grupo exposto em relação ao grupo controle, sugerindo a presença de maior quantidade de mutágenos indiretos na urina dos indivíduos expostos ocupacionalmente aos solventes. 33 Tabela 4: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do número de revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos de urina do grupo controle (C), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens TA100 e YG1024 tanto na presença (+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação metabólica. Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 02C 0 125 ± 12 116 ± 5 20 ± 1 22 ± 1 1,5 124 ± 2 (1,0) 124 ± 2 (1,0) 21 ± 1 (1,1) 22 ± 1 (1,0) 3,0 126 ± 1 (1,0) 126 ± 4 (1,1) 23 ± 1 (1,2) 24 ± 2 (1,1) 6,0 124 ± 2 (1,0) 131 ± 2 (1,1)* 25 ± 2 (1,3)* 27 ± 1 (1,2)* 12,0 128 ± 7 (1,0) 128 ± 2 (1,1)* 25 ± 1 (1,3)* 26 ± 1 (1,2)* 04C 0 108 ± 4 103 ± 6 19 ± 1 21 ± 4 1,5 141 ± 11 (1,3)* 116 ± 15 (1,1) 20 ± 5 (1,1) 23 ± 1 (1,1) 3,0 142 ± 6 (1,3) ** 111 ± 9 (1,1) 24 ± 6 (1,3) 25 ± 2 (1,2) 6,0 158 ± 4 (1,5)** 136 ± 6 (1,3)** 28 ± 4 (1,5)* 25 ± 4 (1,2) 12,0 240 ± 78 (2,2) ** 155 ± 8 (1,5)** 28 ± 2 (1,5)** 29 ± 1 (1,4) 07C 0 125 ± 12 128 ± 7 21 ± 3 18 ± 3 1,5 145 ± 16 (1,2) 151 ± 33 (1,2) 20 ± 1 (1,0) 16 ± 3 (0,9) 3,0 140 ± 3 (1,1) 132 ± 9 (1,0) 24 ± 2 (1,2) 22 ± 2 (1,2) 6,0 136 ± 25 (1,1) 135 ± 2 (1,1) 21 ± 2 (1,1) 18 ± 1 (1,0) 12,0 125 ± 32 (1,0) 140 ± 2 (1,1) 26 ± 2 (1,3) 20 ± 3 (1,1) 08C 0 144 ± 18 151 ± 16 29 ± 9 25 ± 2 1,5 151 ± 19 (1,0) 148 ± 8 (1,0) 33 ± 3 (1,1) 28 ± 1 (1,1) 3,0 141 ± 4 (1,0) 177 ± 20 (1,2) 36 ± 3 (1,2) 33 ± 1 (1,3)** 6,0 150 ± 9 (1,0) 145 ± 26 (1,0) 33 ± 2 (1,1) 26 ± 1 (1,0) 12,0 123 ± 6 (0,9) 138 ± 40 (0,9) 33 ± 1 (1,1) 36 ± 1 (1,4)** 09C 0 177 ± 5 139 ± 5 29 ± 9 21 ± 3 1,5 100 ± 6 (0,6) 145 ± 8 (1,0) 31 ± 4 (1,1) 29 ± 3 (1,4) 3,0 125 ± 10 (0,7) 157 ± 13 (1,1) 29 ± 5 (1,0) 29 ± 1 (1,4)* 6,0 120 ± 6 (0,7) 149 ± 3 (1,2) 27 ± 4 (0,9) 32 ± 3 (1,5)* 12,0 137 ± 7 (0,8) 150 ± 5 (1,2) 30 ± 6 (1,0) 38 ± 6 (1,8)* 11C 0 144 ± 18 139 ± 5 29 ± 9 21 ± 3 1,5 157 ± 26 (1,1) 154 ± 2 (1,1)* 27 ± 3 (0,9) 29 ± 1 (1,4)* 3,0 141 ± 13 (1,0) 160 ± 7 (1,2)* 26 ± 3 (0,9) 28 ± 4 (1,3) 6,0 130 ± 7 (0,9) 174 ± 24 (1,3) 27 ± 1 (0,9) 32 ± 3 (1,5)* 12,0 146 ± 14 (1,0) 149 ± 14 (1,1) 30 ± 2 (1,0) 28 ± 3 (1,3) 13C 0 168 ± 4 138 ± 12 29 ± 9 21 ± 3 1,5 178 ± 19 (1,1) 166 ± 25 (1,2) 23 ± 4 (0,8) 28 ± 3 (1,3) 3,0 185 ± 4 (1,1) 162 ± 21 (1,2) 27 ± 1 (0,9) 25 ± 3 (1,2) 6,0 186 ± 16 (1,1) 146 ± 16 (1,1) 26 ± 6 (0,9) 34 ± 5 (1,6)* 12,0 174 ± 6 (1,0) 30 ± 6 (0,2) 30 ± 1 (1,0) 18 ± 5 (0,9) Controle + 1271 ± 44 1472 ± 58 1822 ± 50 1021± 36 34 continuação Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 14C 0 159 ± 17 136 ± 7 25 ± 2 38 ± 6 1,5 175 ± 10 (1,1) 137 ± 7 (1,0) 23 ± 1 (0,9) 38 ± 8 (1,0) 3,0 131 ± 5 (0,8) 110 ± 14 (0,8) 21 ± 6 (0,8) 42 ± 4 (1,1) 6,0 180 ± 4 (1,1) 126 ± 4 (0,9) 25 ± 3 (1,0) 45 ± 4 (1,2) 12,0 151 ± 14 (0,9) 118 ± 2 (0,9) 23 ± 3 (0,9) 44 ± 5 (1,2) 16C 0 170 ± 9 138 ± 12 22 ± 1 32 ± 1 1,5 175 ± 1 (1,0) 158 ± 4 (1,1) 15 ± 3 (0,7) 27 ± 1 (0,8) 3,0 191 ± 11 (1,1) 117 ± 12 (0,8) 22 ± 5 (1,0) 44 ± 2 (1,4)* 6,0 177 ± 5 (1,0) 111 ± 2 (0,8) 22 ± 3 (1,0) 38 ± 0 (1,2) 12,0 194 ± 1 (1,1) 103 ± 7 (0,7) 23 ± 3 (1,0) 34 ± 1 (1,1) 17C 0 159 ± 17 136 ± 7 25 ± 2 38 ± 6 1,5 246 ± 14 (1,5)** 156 ± 6 (1,1) 17 ± 2 (0,7) 43 ± 13 (1,1) 3,0 236 ± 5 (1,5)* 153 ± 20 (1,1) 25 ± 2 (0,9) 37 ± 5 (1,0) 6,0 340 ± 15 (2,1)** 195 ± 7 (1,4)** 27 ± 7 (1,1) 44 ± 6 (1,2) 12,0 390 ± 6 (2,5)** 262 ± 4 (1,9)** 39 ± 8 (1,6)* 41 ± 2 (1,1) 18C 0 159 ± 17 136 ± 7 25 ± 2 38 ± 6 1,5 145 ± 18 (0,9) 141 ± 19 (1,0) 26 ± 4 (1,0) 42 ± 2 (1,1) 3,0 165 ± 12 (1,0) 124 ± 10 (0,9) 30 ± 2 (1,2) 49 ± 10 (1,3) 6,0 169 ± 5 (1,1) 135 ± 6 (1,0) 34, ± 4 (1,4) 53 ± 9 (1,4) 12,0 172 ± 27 (1,1) 115 ± 22 (0,8) 38 ± 1 (1,5)** 53 ± 4 (1,4) 19C 0 129 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 123 ± 6 (1,0) 162 ± 12 (1,0) 26 ± 4 (1,0) 20 ± 2 (0,8) 3,0 130 ± 3 (1,0) 166 ± 4 (1,0) 24 ± 4 (0,9) 21 ± 6 (0,8) 6,0 128 ± 4 (1,0) 159 ± 6 (1,0) 25 ± 2 (0,9) 22 ± 5 (0,8) 12,0 128 ± 1 (1,0) 166 ± 2 (1,0) 30 ± 1 (1,1) 25 ± 4 (1,0) 20C 0 129 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 116 ± 5 (0,9) 183 ± 11 (1,1) 24 ± 3 (0,9) 26 ± 5 (1,0) 3,0 132 ± 4 (1,0) 178 ± 15 (1,1) 24 ± 2 (0,9) 24 ± 2 (0,9) 6,0 150 ± 9 (1,2) 175 ± 3 (1,1) 22 ± 1 (0,8) 37 ± 6 (1,4) 12,0 123 ± 6 (1,0) 185 ± 3 (1,1)* 24 ± 3 (0,9) 33 ± 1 (1,3)** 21C 0 129 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 191 ± 12 (1,5)** 179 ± 7 (1,1) 26 ± 2 (1,0) 23 ± 1 (0,9) 3,0 188 ± 2 (1,5)** 186 ± 10 (1,1) 33 ± 2 (1,2) 28 ± 2 (1,1) 6,0 174 ± 7 (1,3)** 193 ± 2 (1,2)** 29 ± 2 (1,1) 30 ± 1 (1,2)* 12,0 180 ± 8 (1,4)** 189 ± 7 (1,2)* 28 ± 3 (1,0) 29 ± 3 (1,1) 22C 0 128 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 135 ± 6 (1,1) 189 ± 6 (1,2)* 21 ± 1 (0,8) 25 ± 2 (1,0) 3,0 184 ± 10 (1,4)** 177 ± 16 (1,1) 26 ± 2 (1,0) 19 ± 1 (0,7) 6,0 188 ± 6 (1,5)** 173 ± 7 (1,1) 24 ± 4 (0,9) 25 ± 2 (1,0) 12,0 183 ± 4 (1,4)** 195 ± 3 (1,2)** 36 ± 5 (1,3) 24 ± 1 (1,0) Controle + 1184 ± 111 1920 ± 68 1608 ± 99 1720 ± 244 35 continuação Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 23C 0 129 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 191 ± 2 (1,5)** 181 ± 10 (1,1) 24 ± 2 (0,9) 29 ± 2 (1,1) 3,0 180 ± 13 (1,4)* 158 ± 7 (1,0) 22 ± 3 (0,8) 25 ± 4 (1,0) 6,0 165 ± 6 (1,3)* 168 ± 5 (1,0) 25 ± 3 (0,9) 25 ± 2 (1,0) 12,0 177 ± 2 (1,4)** 170 ± 2 (1,0) 24 ± 3 (0,9) 31 ± 2 (1,2) 24C 0 128 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 169 ± 16 (1,3)* 178 ± 14 (1,1) 25 ± 3 (0,9) 25 ± 2 (1,0) 3,0 167 ± 14 (1,3) * 174 ± 12 (1,1) 26 ± 2 (1,0) 22 ± 2 (0,8) 6,0 160 ± 11 (1,3)* 196 ± 5 (1,2)** 24 ± 4 (0,9) 26 ± 4 (1,0) 12,0 144 ± 23 (1,1) 196 ± 5 (1,2)** 36 ± 5 (1,3) 25 ± 2 (1,0) 25C 0 170 ± 9 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 1 1,5 157 ± 1 (0,9) 171 ± 16 (1,1) 26 ± 5 (1,0) 24 ± 4 (0,9) 3,0 163 ± 12 (1,0) 174 ± 12 (1,1) 28 ± 2 (1,0) 25 ± 2 (1,0) 6,0 173 ± 9 (1,0) 193 ± 5 (1,2)** 20 ± 2 (0,7) 31 ± 3(1,2) 12,0 180 ± 1 (1,1) 196 ± 6 (1,2)** 25 ± 3 (0,9) 28 ± 6 (1,1) 26C 0 145 ± 14 144 ± 11 22 ± 4 22 ± 3 1,5 157 ± 11 (1,1) 141 ± 21 (1,0) 27 ± 3 (1,2) 27 ± 2 (1,2) 3,0 142 ± 11 (1,0) 207 ± 22 (1,4)* 23 ± 3 (1,0) 28 ± 4 (1,3) 6,0 129 ± 2 (0,9) 199 ± 17 (1,4)* 22 ± 2 (1,0) 35 ± 2 (1,6)** 12,0 146 ± 6 (1,0) 252 ± 12 (1,8)** 30 ± 1 (1,4) 37 ± 2 (1,7)** 27C 0 170 ± 9 144 ± 11 22 ± 4 22 ± 3 1,5 177 ± 1 (1,0) 185 ± 7 (1,3)* 23 ± 1 (1,0) 28 ± 5 (1,3) 3,0 182 ± 6 (1,1) 168 ± 5 (1,2) 31 ± 3 (1,4) 29 ± 2 (1,3) 6,0 162 ± 4 (1,0) 200 ± 27 (1,4) 29 ± 1 (1,3) 35 ± 0 (1,6)** 12,0 174 ± 4 (1,0) 200 ± 3 (1,4)** 27 ± 1 (1,2) 35 ± 2 (1,6)** 29C 0 136 ± 4 144 ± 11 23 ± 5 21 ± 1 1,5 132 ± 3 (1,0) 142 ± 12 (1,0) 25 ± 1 (1,1) 20 ± 1 (1,0) 3,0 133 ± 12 (1,0) 143 ± 7 (1,0) 27 ± 3 (1,2) 24 ± 2 (1,1) 6,0 134 ± 15 (1,0) 146 ± 18 (1,0) 30 ± 2 (1,3) 27 ± 2 (1,3)* 12,0 133 ± 9 (1,0) 154 ± 17 (1,1) 32 ± 2 (1,4) 29 ± 3 (1,4)* 30C 0 125 ± 2 116 ± 5 28 ± 3 21 ± 1 1,5 147 ± 10 (1,2)* 115 ± 2 (1,0) 25 ± 2 (0,9) 26 ± 4 (1,2) 3,0 155 ± 8 (1,2)* 120 ± 14 (1,0) 29 ± 1 (1,0) 31 ± 3 (1,5)** 6,0 168 ± 8 (1,3)** 120 ± 18 (1,0) 34 ± 3 (1,2) 38 ± 3 (1,8)** 12,0 175 ± 5 (1,4)** 128 ± 5 (1,1) 37 ± 2 (1,3)* 33 ± 3 (1,6)* 32C 0 125 ± 2 116 ± 5 28 ± 3 21 ± 1 1,5 112 ± 17 (0,9) 112 ± 3 (1,0) 24 ± 2 (0,9) 24 ± 3 (1,1) 3,0 99 ± 5 (0,8) 137 ± 10 (1,2) 32 ± 4 (1,1) 25 ± 2 (1,2) 6,0 117 ± 22 (0,9) 115 ± 6 (1,0) 26 ± 3 (0,9) 27 ± 1 (1,3)** 12,0 73 ± 55 (0,6) 118 ± 7 (1,0) 31 ± 2 (1,1) 29 ± 2 (1,4)** Controle + 1184 ± 111 1920 ± 68 1608 ± 99 1720 ± 244 36 continuação Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 33C 0 125 ± 2 116 ± 5 28 ± 3 21 ± 1 1,5 142 ± 6 (1,1)* 112 ± 13 (1,0) 30 ± 3 (1,1) 30 ± 2 (1,4)** 3,0 142 ± 13 (1,1) 120 ± 11 (1,0) 34 ± 2 (1,2) 32 ± 4 (1,5)* 6,0 150 ± 7 (1,2)* 126 ± 17 (1,1) 34 ± 2 (1,2) 34 ± 5 (1,6)* 12,0 136 ± 1 (1,1) 80 ± 18 (0,7) 31 ± 2 (1,1) 35 ± 2 (1,7)** 34C 0 125 ± 2 116 ± 6 28 ± 3 21 ± 1 1,5 106 ± 4 (0,8) 118 ± 8 (1,0) 28 ± 2 (1,0) 27 ± 4 (1,3) 3,0 94 ± 8 (0,8) 121 ± 11 (1,0) 34 ± 4 (1,2) 27 ± 1 (1,3)* 6,0 140 ± 8 (1,1) 115 ± 7 (1,0) 38 ±4 (1,4)* 30 ± 2 (1,4)** 12,0 144 ± 13 (1,2) 118 ± 12 (1,0) 38 ± 2 (1,4)* 30 ± 1 (1,4)** 35C 0 125 ± 12 128 ± 7 21 ± 3 31 ± 4 1,5 143 ± 10 (1,1) 211 ± 76 (1,6) 25 ± 6 (1,2) 32 ± 4 (1,0) 3,0 126 ± 9 (1,0) 149 ± 8 (1,2) 19 ± 2 (0,9) 31 ± 3 (1,0) 6,0 158 ± 6 (1,3)* 189 ± 17 (1,5)* 21 ± 2 (1,0) 33 ± 3 (1,1) 12,0 150 ± 13 (1,2) 160 ± 19 (1,3) 21 ± 1 (1,0) 38 ± 9 (1,2) 36C 0 125 ± 12 128 ± 7 27 ± 2 31 ± 4 1,5 121 ± 8 (1,0) 131 ± 3 (1,0) 48 ± 7 (1,8)* 27 ± 1 (0,9) 3,0 129 ± 5 (1,0) 145 ± 20 (1,1) 52 ± 7 (1,9)* 35 ± 9 (1,1) 6,0 115 ± 16 (0,9) 148 ± 19 (1,2) 55 ± 7 (2,0)** 39 ± 1 (1,3) 12,0 114 ± 13 (0,9) 138 ± 2 (1,1) 43 ± 5 (1,6)* 43 ± 7 (1,4) 37C 0 144 ± 11 136 ± 4 19 ± 1 21 ± 2 1,5 155 ± 20 (1,1) 122 ± 14 (0,9) 21 ± 1 (1,1) 23 ± 1 (1,1) 3,0 151 ± 22 (1,0) 142 ± 6 (1,0) 21 ± 1 (1,1) 24 ± 2 (1,1) 6,0 177 ± 23 (1,2) 146 ± 14 (1,1) 22 ± 1 (1,2) 28 ± 1 (1,3)* 12,0 137 ± 14 (1,0) 136 ± 42 (1,0) 22 ± 2 (1,2) 21 ± 1 (1,0) 38C 0 125 ± 12 136 ± 4 27 ± 2 31 ± 4 1,5 116 ± 7 (0,9) 132 ± 4 (1,0) 52 ± 6 (1,9)* 29 ± 4 (0,9) 3,0 115 ± 4 (0,9) 133 ± 8 (1,0) 46 ± 5 (1,7)* 29 ± 4 (0,9) 6,0 128 ± 3 (1,0) 146 ± 17 (1,1) 42 ± 8 (1,6) 32 ± 2 (1,0) 12,0 133 ± 10 (1,1) 130 ± 9 (1,0) 42 ± 12 (1,6) 27 ± 3 (0,9) 39C 0 144 ± 11 136 ± 4 19 ± 1 21 ± 2 1,5 146 ± 4 (1,0) 136 ± 4 (1,0) 22 ± 1 (1,2) 25 ± 3 (1,2) 3,0 149 ± 4 (1,0) 135 ± 2 (1,0) 23 ± 3 (1,2) 25 ± 4 (1,2) 6,0 151 ± 2 (1,0) 141 ± 13 (1,0) 21 ± 2 (1,1) 29 ± 1 (1,4)* 12,0 155 ± 4 (1,1) 133 ± 12 (1,0) 21 ± 1 (1,1) 27 ± 2 (1,3) Controle + 1010 ± 12 2033 ± 81 1240 ± 107 1034 ± 60 0 : controle negativo = 50µL DMSO Controle positivo : –S9 → 10,0 µg/placa de 4-nitro-o-fenilenediamina para a YG1024 e 1,25µg/placa de azida sódica para a TA100 ; +S9 → 0,63µg/placa de 2-antramina * significância a 5%; ** significância a 1% (ANOVA). 37 Tabela 5: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do número de revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos de urina do grupo exposto (E), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens TA100 e YG1024 tanto na presença (+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação metabólica. Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 02E 0 170 ± 9 138 ± 12 29 ± 9 23 ± 2 1,5 168 ± 4 (1,0) 138 ± 25 (1,0) 24 ± 1 (0,8) 35 ± 5 (1,5)* 3,0 186± 4 (1,1) 158 ± 8 (1,1) 23 ± 1 (0,8) 52 ± 4 (2,3) ** 6,0 182 ± 5 (1,1) 130 ± 5 (0,9) 25 ± 4 (0,9) 48 ± 3 (2,1)** 12,0 185 ± 24 (1,1) 163 ± 20 (1,2) 29 ± 1 (1,0) 33 ± 1 (1,4)** 06E 0 125 ± 12 128 ± 7 21 ± 3 18 ± 3 1,5 143 ± 8 (1,1) 144 ± 16 (1,1) 23 ± 3 (1,1) 17 ± 2 (0,9) 3,0 117 ± 6 (0,9) 149 ± 24 (1,2) 24 ± 1 (1,1) 21 ± 6 (1,2) 6,0 133 ± 13 (1,1) 181 ± 23 (1,4) 25 ± 1 (1,2) 25 ± 6 (1,4) 12,0 129 ± 5 (1,0) 79 ± 9 (0,6) 17 ± 2 (0,8) 17 ± 1 (0,9) 07E 0 168 ± 4 138 ± 12 29 ± 9 23 ± 2 1,5 173 ± 9 (1,0) 135 ± 13 (1,0) 29 ± 4 (1,0) 28 ± 3 (1,2) 3,0 194 ± 7 (1,2)* 138 ± 17 (1,0) 26± 5 (0,9) 36 ± 3 (1,6)** 6,0 190 ± 8 (1,1)* 151 ± 5 (1,1) 26 ± 4 (0,9) 32 ± 4 (1,4)* 12,0 191 ± 20 (1,1) 137 ± 8 (1,0) 31 ± 4 (1,1) 33 ± 6 (1,4) 09E 0 177 ± 5 138 ± 12 29 ± 9 23 ± 2 1,5 135 ± 13 (0,8) 144 ± 10 (1,0) 26 ± 2 (0,9) 46 ± 5 (2,0)** 3,0 124 ± 10 (0,7) 117 ± 18 (0,8) 28 ± 5 (1,0) 38 ± 4 (1,7)** 6,0 120 ± 13 (0,7) 147 ± 16 (1,1) 29 ± 4 (1,0) 51 ± 4 (2,2)** 12,0 130 ± 8 (0,7) 100 ± 9 (0,7) 31 ± 5 (1,1) 39 ± 3 (1,7)** 10E 0 168 ± 4 138 ± 12 29 ± 9 23 ± 2 1,5 134 ± 13 (0,8) 133 ± 17 (1,0) 26 ± 2 (0,9) 37 ± 4 (1,6)** 3,0 171 ± 33 (1,0) 149 ± 16 (1,1) 25± 3 (0,9) 40 ± 5 (1,7)** 6,0 142 ± 23 (0,8) 145 ± 11 (1,1) 28 ± 3 (1,0) 31 ± 1 (1,3)** 12,0 166 ± 12 (1,0) 141 ± 10 (1,0) 27 ± 4 (0,9) 43 ± 3 (1,9)** 16E 0 144 ± 18 139 ± 5 21 ± 4 23 ± 2 1,5 173 ± 7 (1,2) 154 ± 17 (1,1) 21 ± 1 (1,0) 39 ± 4 (1,7)** 3,0 150 ± 10 (1,0) 133 ± 16 (1,0) 24 ± 4 (1,1) 38 ± 6 (1,7)* 6,0 148 ± 6 (1,0) 139 ± 7 (1,0) 23 ± 2 (1,1) 37 ± 4 (1,6)* 12,0 165 ± 9 (1,1) 155 ± 6 (1,1) 26 ± 3 (1,2) 35 ± 4 (1,5)* 17E 0 129 ± 8 162 ± 6 27 ± 2 26 ± 2 1,5 150 ± 43 (1,2) 157 ± 45 (1,0) 25 ± 4 (0,9) 27 ± 2 (1,0) 3,0 185 ± 10 (1,4)** 192 ± 11 (1,2)* 25 ± 5 (0,9) 30 ± 2 (1,2) 6,0 191 ± 7 (1,5)** 176 ± 10 (1,1) 20 ± 2 (0,7) 28 ± 3 (1,1) 12,0 194 ± 3 (1,5)** 210 ± 10 (1,3)** 25 ± 3 (0,9) 29 ± 1 (1,1) Controle + 1944 ± 43 1950 ± 64 1521 ± 106 1911 ± 62 38 continuação Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 18E 0 159 ± 17 136 ± 7 25 ± 2 38 ± 6 1,5 158 ± 20 (1,0) 139 ± 12 (1,0) 20 ± 1 (0,8) 39 ± 3 (1,0) 3,0 154 ± 7 (1,0) 126 ± 5 (0,9) 21 ± 3 (0,8) 34 ± 10 (0,9) 6,0 203 ± 12 (1,3) 106 ± 18 (0,8) 27 ± 2 (1,1) 30 ± 6 (0,8) 12,0 187 ± 2 (1,2) 115 ± 8 (0,8) 30 ± 5 (1,2) 17 ± 5 (0,4) 19E 0 168 ± 4 138 ± 11 29 ± 9 23 ± 2 1,5 181 ± 24 (1,1) 155 ± 8 (1,1) 29 ± 6 (1,0) 28 ± 7 (1,2) 3,0 173 ± 19 (1,0) 132 ± 16 (1,0) 31 ± 5 (1,1) 31 ± 6 (1,3) 6,0 156 ± 17 (0,9) 121 ± 10 (0,9) 30 ± 5 (1,0) 37 ± 3 (1,6)** 12,0 177 ± 6 (1,1) 95 ± 16 (0,7) 31 ± 2 (1,1) 34 ± 2 (1,5)** 23E 0 145 ± 14 146 ± 11 22 ± 4 22 ± 3 1,5 216 ± 30 (1,5)* 137 ± 15 (0,9) 22 ± 2 (1,0) 25 ± 3 (1,1) 3,0 264 ± 13 (1,8)** 153 ± 22 (1,0) 23 ± 1 (1,0) 29 ± 1 (1,3)* 6,0 260 ± 25 (1,8)** 179 ± 23 (1,2) 27 ± 2 (1,2) 31 ± 2 (1,4)* 12,0 185 ± 27 (1,3) 137 ± 12 (0,9) 35 ± 4 (1,6)* 24 ± 3 (1,1) 26E 0 144 ± 18 139 ± 5 21 ± 4 23 ± 2 1,5 134 ± 8 (0,9) 149 ± 3 (1,1) 22 ± 3 (1,0) 37 ± 4 (1,6)** 3,0 130 ± 8 (0,9) 146 ± 31 (1,1) 22 ± 2 (1,0) 35 ± 4 (1,5)* 6,0 143 ± 21 (1,0) 134 ± 23 (1,0) 23 ± 2 (1,1) 41 ± 8 (1,8)* 12,0 150 ± 5 (1,0) 149 ± 19 (1,1) 29 ± 1 (1,4) 37 ± 5 (1,6)** 27E 0 168 ± 4 144 ± 11 19 ± 3 22 ± 1 1,5 171 ± 137 (1,0) 155 ± 9 (1,1) 25 ± 5 (1,3) 32 ±2 (1,5)* 3,0 174 ± 11 (1,0) 169 ± 22 (1,2) 26 ± 8 (1,4) 36 ± 5 (1,6) 6,0 172 ± 15 (1,0) 228 ± 17 (1,6)** 28 ± 4 (1,5) 34 ± 6 (1,5) 12,0 184 ± 9 (1,1) 151 ± 20 (1,0) 19 ± 2 (1,0) 37 ± 1 (1,7)** 28E 0 144 ± 18 139 ± 5 25 ± 4 21 ± 3 1,5 142 ± 5 (1,0) 151 ± 5 (1,1) 30 ± 5 (1,2) 32 ± 4 (1,5)* 3,0 152 ± 1 (1,1) 142 ± 5 (1,0) 28 ± 6 (1,1) 30 ± 3 (1,4)* 6,0 153 ± 26 (1,1) 150 ± 11 (1,1) 18 ± 3 (0,7) 31 ± 4 (1,5)* 12,0 149 ± 7 (1,0) 157 ± 9 (1,1) 25 ± 2 (1,0) 32 ± 3 (1,5)* 29E 0 159 ± 17 136 ± 7 25 ± 2 38 ± 6 1,5 159 ± 15 (1,0) 140 ± 7 (1,0) 29 ± 4 (1,2) 40 ± 4 (1,1) 3,0 154 ± 27 (1,0) 172 ± 12 (1,3)* 30 ± 8 (1,2) 45 ± 9 (1,2) 6,0 155 ± 7 (1,0) 80 ± 17 (0,6) 29 ± 5 (1,2) 49 ± 11 (1,3) 12,0 178 ± 7 (1,1) 99 ± 6 (0,7) 27 ± 3 (1,1) 33 ± 9 (0,9) 30E 0 144 ± 11 136 ± 4 19 ± 1 21 ± 2 1,5 146 ± 9 (1,0) 141 ± 9 (1,0) 24 ± 1 (1,3)* 29 ± 2 (1,4)* 3,0 146 ± 3 (1,0) 150 ± 17 (1,1) 24 ± 2 (1,3)* 32 ± 2 (1,5)** 6,0 150 ± 2 (1,0) 146 ± 9 (1,1) 25 ± 5 (1,3) 29 ± 2 (1,4)* 12,0 132 ± 17 (0,9) 141 ± 28 (1,0) 29 ± 1 (1,5)** 30 ±4 (1,4) Controle + 1944 ± 43 1950 ± 64 1521 ± 106 1911 ± 62 39 continuação Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 31E 0 134 ± 17 110 ± 8 21 ± 3 18 ± 3 1,5 131 ± 1 (1,0) 154 ± 12 (1,4)* 18 ± 2 (0,9) 26 ± 4 (1,4) 3,0 136 ± 4 (1,0) 129 ± 4 (1,2) 22 ± 3 (1,0) 25 ± 2 (1,4)* 6,0 139 ± 1 (1,0) 159 ± 2 (1,4)** 28 ± 1 (1,3)* 25 ± 4 (1,4) 12,0 131 ± 3 (1,0) 171 ± 5 (1,6)** 29 ± 1 (1,4)* 26 ± 3 (1,4)* 33E 0 144 ± 18 139 ± 5 21 ± 4 21 ± 3 1,5 147 ± 9 (1,0) 125 ± 21 (0,9) 24 ± 2 (1,1) 30 ± 3 (1,4) 3,0 153 ± 17 (1,1) 142 ± 17 (1,0) 26 ± 1 (1,2) 25 ± 3 (1,2) 6,0 134 ± 9 (0,9) 150 ± 10 (1,1) 26 ± 6 (1,2) 22 ± 3 (1,0) 12,0 103 ± 12 (0,7) 129 ± 2 (0,9) 29 ± 8 (1,4) 32 ± 2 (1,5)* 35E 0 125 ± 20 107 ± 2 25 ± 4 21 ± 3 1,5 150 ± 6 (1,2) 115 ± 6 (1,1) 20 ± 5 (0,8) 25 ± 4 (1,2) 3,0 135 ± 21 (1,1) 121 ± 4 (1,1) 27 ± 5 (1,1) 24 ± 3 (1,1) 6,0 142 ± 9 (1,1) 131 ± 2 (1,2)** 29 ± 4 (1,2) 30 ± 1 (1,4)* 12,0 142 ± 5 (1,1) 139 ± 1 (1,3)** 32 ± 3 (1,3) 30 ± 4 (1,4) 36E 0 170 ± 9 145 ± 14 22 ± 4 22 ± 3 1,5 183 ± 5 (1,1) 207 ± 8 (1,4)** 25 ± 3 (1,1) 27 ± 3 (1,2) 3,0 192 ± 3 (1,1) 211 ± 17 (1,5)* 26 ± 2 (1,2) 25 ± 1 (1,1) 6,0 181 ± 2 (1,1) 272 ± 26 (1,9)** 23 ± 3 (1,0) 35 ± 2 (1,6)** 12,0 156 ± 2 (0,9) 255 ± 26 (1,8)** 24 ± 3 (1,1) 38 ± 2 (1,7)** 38E 0 125 ± 20 107 ± 2 25 ± 4 22 ± 1 1,5 127 ± 20 (1,0) 97 ± 3 (0,9) 25 ± 5 (1,0) 29 ± 1 (1,3)* 3,0 126 ± 4 (1,0) 116 ± 3 (1,1)* 32 ± 1 (1,3) 25 ± 4 (1,1)* 6,0 146 ± 5 (1,2) 69 ± 3 (0,6) 29 ± 3 (1,2) 30 ± 1 (1,4) 12,0 191 ± 8 (1,5)* 66 ± 3 (0,6) 41 ± 4 (1,6)* 29 ± 1 (1,3) 39E 0 117 ± 1 151 ± 16 32 ± 1 27 ± 1 1,5 97 ± 7 (0,8) 159 ± 18 (1,1) 26 ± 1 (0,8) 55 ± 2 (2,0)** 3,0 117 ± 11 (1,0) 135 ± 8 (0,9) 32 ± 2 (1,0) 70 ± 2 (2,6)** 6,0 176 ± 1 (1,5)** 160 ± 27 (1,1) 45 ± 1 (1,4)** 88 ± 3 (3,3)** 12,0 175 ± 8 (1,5)* 154 ± 16 (1,0) 37 ± 2 (1,2) 73 ± 3 (2,7)** 40E 0 170 ± 9 103 ± 6 19 ± 2 27 ± 1 1,5 193 ± 3 (1,1) 126 ± 4 (1,2)* 22 ± 2 (1,2) 49 ± 2 (1,8)** 3,0 198 ± 6 (1,2) 132 ± 4 (1,3)** 26 ± 3 (1,4)* 57 ± 2 (2,1)** 6,0 204 ± 16 (1,2) 143 ± 21 (1,4) 25 ±3 (1,3) 55 ± 4 (2,0)** 12,0 193 ± 14 (1,1) 120 ± 9 (1,2) 34 ± 4 (1,8)** 71 ± 3 (2,6)** 43E 0 134 ± 17 110 ± 8 21 ± 3 18 ± 3 1,5 158 ± 4 (1,2) 132 ± 2 (1,2)* 19 ± 2 (0,9) 20 ± 6 (1,1) 3,0 131 ± 7 (1,0) 133 ± 3 (1,2)* 19 ± 2 (0,9) 21 ± 4 (1,2) 6,0 135 ± 19 (1,0) 127 ± 2 (1,2) 18 ± 1 (0,9) 23 ± 3 (1,3) 12,0 146 ± 12 (1,1) 148 ± 15 (1,3)* 21 ± 2 (1,0) 21 ± 2 (1,2) Controle + 1767 ± 106 1918 ± 51 1917 ± 16 1720 ± 299 40 continuação Código da amostra mL equivalente de urina/placa N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM) TA100 YG1024 -S9 +S9 -S9 +S9 44E 0 145 ± 14 144 ± 11 26 ± 4 22 ± 3 1,5 140 ± 18 (1,0) 233 ± 14 (1,6)** 26 ± 2 (1,0) 24 ± 2 (1,1) 3,0 137 ± 13 (0,9) 198 ± 11 (1,4)* 23 ± 2 (0,9) 29 ± 1 (1,3)* 6,0 166 ± 11 (1,1) 190 ± 8 (1,3)* 21 ± 2 (0,8) 36 ± 1 (1,6)** 12,0 184 ± 7 (1,3) 207 ± 13 (1,4)* 26 ± 3 (1,0) 43 ± 1 (2,0)** 45E 0 145 ± 14 144 ± 11 22 ± 4 22 ± 3 1,5 167 ± 25 (1,2) 183 ± 32 (1,3) 23 ± 1 (1,0) 29 ± 2 (1,3)* 3,0 147 ± 6 (1,0) 135 ± 30 (0,9) 23 ± 2 (1,0) 34 ± 3 (1,5)* 6,0 183 ± 16 (1,3) 184 ± 10 (1,3)* 25 ± 3 (1,1) 33 ± 2 (1,5)* 12,0 180 ± 14 (1,2)* 158 ± 21 (1,1) 34 ± 2 (1,5)* 46 ± 6 (2,1)* 46E 0 125 ± 12 128 ± 7 21 ± 3 18 ± 3 1,5 136 ± 15 (1,1) 125 ± 4 (1,0) 21 ± 2 (1,0) 24 ± 1 (1,3)* 3,0 162 ± 17 (1,3) 154 ± 12 (1,2) 21 ± 3 (1,0) 29 ± 1 (1,6)** 6,0 211 ± 25 (1,7)* 155 ± 12 (1,2) 20 ± 1 (1,0) 28 ± 4 (1,6)* 12,0 234 ± 15 (1,9)** 173 ± 5 (1,4)** 18 ± 2 (0,9) 28 ± 4 (1,6)* 47E 0 134 ±17 110 ± 8 21 ± 3 18 ± 3 1,5 154 ± 5 (1,1) 144 ± 4 (1,3)** 21 ± 3 (1,0) 24 ± 3 (1,3) 3,0 161 ± 10 (1,2) 128 ± 3 (1,2) 23 ± 3 (1,1) 26 ± 3 (1,4)* 6,0 188 ± 11 (1,4)* 136 ± 8 (1,2)* 25 ± 4 (1,2) 21 ± 5 (1,2) 12,0 177 ± 4 (1,3)* 151 ± 2 (1,4)** 18 ± 3 (0,9) 26 ± 4 (1,4) 48E 0 125 ± 12 128 ± 7 21 ± 3 18 ± 3 1,5 135 ± 18 (1,1) 137 ± 17 (1,1) 24 ± 1 (1,1) 26 ± 3 (1,4)* 3,0 137 ± 3 (1,1) 135 ± 9 (1,1) 24 ± 3 (1,1) 23 ± 3 (1,3) 6,0 124 ± 3 (1,0) 134 ± 4 (1,0) 22 ± 1 (1,0) 24 ± 4 (1,3) 12,0 124 ± 10 (1,0) 113 ± 10 (0,9) 17 ± 2 (0,8) 28 ± 3 (1,6)* 50E 0 134 ± 17 165 ± 10 21 ± 3 18 ± 3 1,5 156 ± 6 (1,2) 160 ± 3 (1,0) 24 ± 2 (1,1) 23 ± 2 (1,3) 3,0 138 ± 14 (1,0) 163 ± 3 (1,0) 23 ± 3 (1,1) 19 ± 3 (1,1) 6,0 148 ± 4 (1,1) 177 ± 5 (1,1) 26 ± 3 (1,2) 26 ± 5 (1,4) 12,0 135 ± 10 (1,0) 162 ± 11 (1,0) 27 ± 1 (1,3) 24 ± 3 (1,3) 54E 0 134 ± 17 110 ± 8 27 ± 2 31 ± 4 1,5 144 ± 10 (1,1) 117 ± 9 (1,1) 50 ± 8 (1,9)* 38 ± 5 (1,2) 3,0 122 ± 18 (0,9) 119 ± 9 (1,1) 48 ± 4 (1,8)** 34 ± 5 (1,1) 6,0 143 ± 18 (1,1) 142 ± 2 (1,3)** 51 ± 4 (1,9)** 38 ± 6 (1,2) 12,0 142 ± 9 (1,1) 123 ± 8 (1,1) 60 ± 6 (2,2)** 33 ± 3 (1,1) Controle + 1767 ± 106 1918 ± 51 1917 ± 16 1720 ± 299 0 : controle negativo = 50µL DMSO Controle positivo : –S9 → 10,0 µg/placa de 4-nitro-o-fenilenediamina para a YG1024 e 1,25µg/placa de azida sódica para a TA100 ; +S9 → 0,63µg/placa de 2-antramina * significância a 5%; ** significância a 1% (ANOVA). 41 Tabela 6 : Atividade mutagênica expressa em potência (número de colônias revertentes his+/ mL equivalente urina), das amostras do grupo controle e exposto, com resposta mutagênica positiva em pelo menos um dos ensaios (TA100 ou YG1024, com (+S9) ou sem (-S9) ativação metabólica). Grupo controle Grupo exposto TA100 YG1024 TA100 YG1024 Cód. -S9 +S9 -S9 +S9 Cód. –S9 +S9 -S9 +S9 04C 2,3 0 0 0 02E 0 0 0 9,2 17C 19,2 0 0 0 09E 0 0 0 12,9 36C 0 0 13,8 0 39E 0 0 0 25,1 40E 0 0 0 10,4 44E 0 0 0 1,8 45E 0 0 0 4,2 54E 0 0 2,6 0 Cód.:código da amostra. 42 Tabela 7: Atividade mutagência expressa pelo maior valor da razão de mutagenicidade (RM), nas amostras de urina do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100 e YG1024 com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica. Grupo controle TA100 YG1024 Cód. -S9 +S9 -S9 +S9 Grupo exposto TA100 YG1024 Cód. -S9 +S9 -S9 +S9 02C 1,0 1,1 1,3 1,2 02E 1,1 1,2 1,0 2,3 04C 2,2 1,5 1,5 1,4 06E 1,1 1,4 1,2 1,4 07C 1,2 1,2 1,2 1,1 07E 1,2 1,1 1,1 1,6 08C 1,0 1,2 1,2 1,4 09E 0,8 1,1 1,1 2,2 09C 0,8 1,2 1,1 1,8 10E 1,0 1,1 1,0 1,9 11C 1,1 1,3 1,0 1,5 16E 1,2 1,1 1,2 1,7 13C 1,1 1,2 1,0 1,6 17E 1,5 1,3 0,9 1,2 14C 1,1 1,0 1,0 1,2 18E 1,3 1,0 1,2 1,0 16C 1,1 1,1 1,0 1,4 19E 1,1 1,1 1,1 1,6 17C 2,5 1,9 1,6 1,2 23E 1,8 1,2 1,6 1,4 18C 1,1 1,0 1,5 1,4 26E 1,0 1,1 1,4 1,8 19C 1,0 1,0 1,1 1,0 27E 1,1 1,6 1,5 1,7 20C 1,2 1,1 0,9 1,4 28E 1,1 1,1 1,2 1,5 21C 1,5 1,2 1,2 1,2 29E 1,1 1,3 1,2 1,3 22C 1,5 1,2 1,3 1,0 30E 1,0 1,1 1,5 1,5 23C 1,5 1,1 0,9 1,2 31E 1,0 1,6 1,4 1,4 24C 1,3 1,2 1,3 1,0 33E 1,1 1,1 1,4 1,5 25C 1,1 1,2 1,0 1,2 35E 1,2 1,3 1,3 1,4 26C 1,1 1,8 1,4 1,7 36E 1,1 1,9 1,2 1,7 27C 1,1 1,4 1,4 1,6 38E 1,5 1,1 1,6 1,4 29C 1,0 1,1 1,4 1,4 39E 1,5 1,1 1,4 3,3 30C 1,4 1,1 1,3 1,8 40E 1,2 1,4 1,8 2,6 32C 0,9 1,2 1,1 1,4 43E 1,2 1,3 1,0 1,3 33C 1,2 1,1 1,2 1,7 44E 1,3 1,6 1,0 2,0 34C 1,2 1,0 1,4 1,4 45E 1,3 1,3 1,5 2,1 35C 1,3 1,6 1,2 1,2 46E 1,9 1,4 1,0 1,6 36C 1,0 1,2 2,0 1,4 47E 1,4 1,4 1,2 1,4 37C 1,2 1,1 1,2 1,3 48E 1,1 1,1 1,1 1,6 38C 1,1 1,1 1,9 1,0 50E 1,2 1,1 1,3 1,4 39C 1,1 1,0 1,2 1,4 54E 1,1 1,3 2,2 1,2 M 1,2 1,2 1,3 1,4 M 1,2 1,3 1,3 1,7* Cód.:código da amostra; M: média de RM; valores em negrito representam RM ≥ 2,0. * p < 0,05 – Teste de Mann Whitney. 43 Tabela 8: Atividade mutagência expressa pelo índice de aumento relativo no número de revertentes his+, das amostras de urina do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100 e YG1024 com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica. Grupo controle TA100 YG1024 Cód. -S9 +S9 -S9 +S9 Grupo exposto TA100 YG1024 Cód. -S9 +S9 -S9 +S9 02C 0,02 0,13 0,25 0,22 02E 0,09 0,18 0 1,3 04C 1,2 0,5 0,47 0,38 06E 0,14 0,41 0,19 1,22 07C 0,16 0,18 0,24 0,22 07E 0,15 0,09 0,07 0,57 08C 0,05 0,17 0,24 0,44 09E 0 0,07 0,07 1,22 09C 0 0,08 0,07 0,81 10E 0,02 0,08 0 0,87 11C 0,09 0,25 0,03 0,52 16E 0,2 0,12 0,24 0,7 13C 0,11 0,2 0,03 0,62 17E 0,5 0,3 0 0,15 14C 0,13 0,07 0 0,18 18E 0,28 0,02 0,2 0,03 16C 0,14 0,14 0,05 0,38 19E 0,14 0,12 0,07 0,61 17C 1,5 0,92 0,56 0,16 23E 0,45 0,23 0,59 0,41 18C 0,08 0,04 0,52 0,39 26E 0,04 0,07 0,38 0,78 19C 0,01 0,02 0,11 0 27E 0,1 0,58 0,47 0,68 20C 0,16 0,14 0 0,42 28E 0,06 0,13 0,2 0,52 21C 0,48 0,19 0,22 0,15 29E 0,12 0,26 0,2 0,29 22C 0,47 0,2 0,33 0 30E 0,04 0,1 0,53 0,52 23C 0,48 0,12 0 0,19 31E 0,04 0,55 0,38 0,44 24C 0,32 0,21 0,33 0 33E 0,06 0,08 0,38 0,52 25C 0,06 0,21 0,04 0,19 35E 0,2 0,3 0,28 0,43 26C 0,08 0,75 0,36 0,68 36E 0,13 0,88 0,18 0,73 27C 0,07 0,39 0,4 0,59 38E 0,17 0,08 0,64 0,36 29C 0 0,07 0,39 0,59 39E 0,34 0,07 0,41 2,26 30C 0,4 0,22 0,32 0,26 40E 0,2 0,39 0,8 1,63 32C 0 0,018 0,14 0,38 43E