UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA 

 

 

 

  Andreza Maria Fábio Aranha 

 

POTENCIAL ANGIOGÊNICO DE CÉLULAS PULPARES 

HUMANAS EM HIPÓXIA 

 

 

 

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Odontológicas – 

Área de Odontopediatria, da  Faculdade 

de Odontologia de Araraquara, 

Universidade Estadual Paulista, para 

obtenção do título de Doutor em 

Odontopediatria. 

 

 

   Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto de Souza Costa  

 
 
 
 
 

    ARARAQUARA 

2008 

 



 2 

 
 
 
 

ANDREZA MARIA FÁBIO ARANHA 

 
 

POTENCIAL ANGIOGÊNICO DE C�LULAS PULPARES 

HUMANAS EM HIPÓXIA 

 
 
 
 

COMISSÃO JULGADORA 
 
 

TESE   PARA  OBTENÇÃO  DO  GRAU  DE  DOUTOR 
 
 
 
 
 

Presidente e Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto de Souza Costa 

2º Examinador: Prof. Dr. Jacques Eduardo Nör 

3º Examinador: Prof. Dr Flávio Fernando Demarco 

4ºExaminador: Prof. Dr. Joni Cirelli 

5º Examinador: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro 

 

 
 
 
 
 
 

Araraquara,  22 de setembro de 2008.  
 

 



 3 

 

 

 

Andreza Maria Fábio Aranha 

 

NASCIMENTO 19.11.76 - Bauru - SP 

FILIAÇÃO  Antonio Carlos Bourgogne Aranha 

   Maria Salete Fábio Aranha

1995/1998  Curso de Graduação em Odontologia

 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita

Filho, UNESP - Araraquara, São Paulo, Brasil. 

2000/2002  Especialização em Odontopediatria. Hospital de 

Reabilitação de Anomalias Crâniofaciais, USP, SP, 

Brasil. 

2002/2004 Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área de

Odontopediatria, Nível Mestrado, na Universidade

Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP -

Araraquara, São Paulo, Brasil. 

2005/2008     Curso de Pós-Graduação em Ciências

Odontológica, Área de concentração em

Odontopediatria, Nível Doutorado, na Universidade

Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP -

Araraquara, São Paulo, Brasil. 

2007           Estágio de Doutorado no Exterior, na Universidade

de    Michigan, Faculdade de Odontologia, Laboratório

de Angiogênese,  Ann Arbor, Michigan, EUA 

 



 4 

 

MESMO ASSIM 

 

AS PESSOAS SÃO IRRACIONAIS, ILÓGICAS E EGOCÊNTRICAS. 

AME-AS MESMO ASSIM. 

SE TEM SUCESSO EM SUAS REALIZAÇÕES, GANHARÁ FALSOS AMIGOS E 

VERDADEIROS INIMIGOS. 

TENHA SUCESSO MESMO ASSIM. 

O BEM QUE FAZ SERÁ ESQUECIDO AMANHÃ. 

FAÇA O BEM MESMO ASSIM. 

A HONESTIDADE E A FRANQUEZA O TORNAM VULNERÁVEL. 

SEJA HONESTO MESMO ASSIM. 

AQUILO QUE LEVOU ANOS PARA CONSTRUIR PODE SER DESTRUÍDO DE UM 

DIA PARA O OUTRO. 

CONSTRUA MESMO ASSIM. 

OS POBRES TÊM VERDADEIRAMENTE NECESSIDADE DE AJUDA, MAS ALGUNS 

DELES PODEM ATACÁ-LO SE VOCÊ OS AJUDAR. 

AJUDE-OS MESMO ASSIM. 

SE DER AO MUNDO E AOS OUTROS O MELHOR DE SI MESMO, CORRE O RISCO 

DE SE MACHUCAR. 

DÊ O QUE VOCÊ TEM DE MELHOR MESMO ASSIM. 

VEJA QUE, NO FINAL DAS CONTAS, É ENTRE VOCÊ E DEUS. 

NUNCA FOI ENTRE VOCÊ E OUTRAS PESSOAS. 

 

 

       Madre Teresa de Calcutá 
 
 
 
 



 5 

DEDICO ESTE TRABALHO... 

 

 
 

À Deus, por estar ao meu lado durante todos os 

momentos, iluminando meus caminhos e me guiando. Obrigada, 

Senhor !!! 

 

 

À minha querida família e em especial a meus pais, 

Antônio Carlos e Maria Salete, meus irmãos, Gustavo e Maíra e 

meu cunhado, Douglas pelo amor e apoio incondicional durante toda 

esta jornada. Amo vocês!!!! 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 6 

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS 

 
  Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Souza Costa, meu querido 

orientador, por sua confiança, apoio e fundamental contribuição para 

a concretização de um grande sonho. Muito obrigada por me ajudar a 

torná-lo realidade. A um exemplo de profissional honesto, 

responsável e dedicado, minha eterna admiração e gratidão!!! 

 
 
  Ao Prof. Dr. Jacques Eduardo Nör, por sua atenção e 

disponibilidade durante meu estágio em Ann Arbor na Universidade 

de Michigan. O meu aprendizado durante sua orientação foi 

fundamental para meu amadurecimento profissional e para o futuro 

da minha carreira acadêmica. 

 

  Á Profa. Dra. Josimeri Hebling, por sua total 

disponibilidade durante toda minha jornada acadêmica, por quem 

tenho grande admiração e carinho e pelo auxílio na análise 

estatística deste estudo. 

 

 

 

 

 

 



 7 

AGRADECIMENTOS 
 
 

  À Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP, 

nas pessoas de seu ex-diretor, Profa. Dra. Rosimary Adriana Chiérici 

Marcantônio, diretor, Prof. Dr. Luis Cláudio Martins Segalla e o vice-

diretor, Profa. Dra. Andréia Affonso Barreto Montandon. 

 
   Aos Professores da Disciplina de Odontopediatria, 

Josimeri Hebling, Elisa Maria Aparecida Giro, Lourdes Aparecida 

dos Santos-Pinto, Fábio C. Braga de Abreu e Lima, Cyneu 

Aguiar Pansani, Ângela Cristina Cilense Zuanon, Rita de Cássia 

Loiola Cordeiro, pela dedicação e por minha formação acadêmica. 

 

Aos demais professores do Programa de Doutorado em 

Ciências Odontológicas, área de concentração de Odontopediatria e 

da Pós-Graduação, pela atenção e disponibilidade. 

 

À coordenação da Pós-graduação em Ciências 

Odontológicas da Faculdade de Odontologia de Araraquara – 

UNESP, representada pela coordenadora Profa. Dra. Josimeri 

Hebling e pelo vice-coordenador Prof. Dr. Osmir Batista de Oliveira 

Junior. 

 
Aos colegas do Curso de Pós-Graduação, Érika Botelho, 

Fábio Scanavino, Fernanda Lessa, Hermes Pretel, Jonas 

Rodrigues, Júnia Ferrari, Luciana Lima, Mariana Emi Sanabi, 



 8 

Murilo Guimarães e aos colegas de outras turmas, Ana Lúcia de 

Oliveira, Camila Fávero, Cármen Coldebella, Elcilaine Azevedo, 

Herica Ricci, Indri Nogueira, Juliana Gondim, Lícia Cavalcanti, 

Michele Diniz, Márcia Tanaka, Nancy Sacono e Simone di Salvo, 

pela convivência, alegria e companheirismo. 

 

Às minhas queridas amigas do coração e companheiras 

de todos os momentos, em especial, Fernanda Bello, Fernanda 

Lessa, Yeon Kim, Lícia Cavalcanti, Carol Pawloski, Ângela 

Amaral, Aline Viana, Midori Yamato, Sabrina Serra, Mylene 

Pasin, Myrele Pasin e Virgínia Peixoto que estiveram sempre ao 

meu lado durante todo este trabalho. Por todos os conselhos e 

sugestões, pela amizade, carinho e apoio. Amo vocês!!! 

 
Aos amigos do Laboratório de Patologia Experimental e 

Biomateriais, Adriano Mendonça, Ana Paula  Ribeiro, Andreza 

Almeida, Camila Fávero de Oliveira, Carmen Coldebella, Carolina 

Brito, Castelo Cidade, Cláudia Huck, Daniela Cristina Barbosa, 

Darlon Martins, Fernanda Lessa, Fernanda Vargas, Flávia 

Coimbra, Flávia Trindade, Indri Nogueira, João Kina, Juliana 

Gondim, Juliana Pirola,  Nancy, Indri, Karina Neves, Keren 

Jordão, Luciana Coimbra, Marcela Tagliani, Maria da Glória 

Celli, Nancy Sacono, Patrícia Frederico, por compartilharmos 

conhecimentos, pelas sugestões e pelas risadas e descontração 

durante as apresentações e experimentos. 

 



 9 

Aos meus amigos do Laboratório de Angiogênese da 

Faculdade de Odontologia da Universidade de Michigan, Kathleen 

Neiva, Eoin Mullane, Zaocheng Zhang, Zhihong Dong, Ilan Maltz, 

Tatiana Botero, Naoki, Bill Love, Elliot Hill, Kristy Warner, Ben 

Zeitlin, Sudha Krishnamurthy, Isabel Lauxen, Paloma Telles, 

Flávio Demarco, Sandra Tarquin, Luciano Casagrande, Vichu, 

Alexandra Jakery e Marta Myiazawa  e aos amigos de outros 

departamentos, Christopher Strayhorn, Ruth Eberhart, Renita 

Bellmore por terem me recebido com tanto carinho em Ann Arbor, 

pela atenção e disponibilidade durante a execução de meus 

experimentos.  

 

Aos meu companheiros e amigos eternos, Bruno 

Teixeira,  Luciano Casagrande, Ilan Maltz, Ana Gabriela Maris, 

Renata Soares, Natália Branco e  Keith Pertile que estiveram ao 

meu lado nos momentos de alegrias e dificuldades durante minha 

experiência no exterior. 

 

Aos funcionários do Departamento de Clínica Infantil e 

do Laboratório de Patologia Experimental e Biomateriais, em 

especial a Juliana Pirola. 

 

Aos funcionários da seção de Pós-Graduação, Rosângela, 

Alexandre, Flávia e em especial, Mara, pelo auxílio e dedicação. 

 



 10 

Aos funcionários da biblioteca, em especial à Sílvia, 

Adriano e Eliane pelo bom humor e atenção. 

 

À Coordenação de Aperfeiçoameno de Pessoal de 

Nível Superior, Capes, pela bolsa de estudo concedida durante o 

Programa e pelo apoio financeiro ao meu Estágio de Doutorado no 

exterior . 

 

  À todos aqueles que direta ou indiretamente 

contribuíram para a realização deste trabalho.  

 

 

 

    Muito Obrigada!!! 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 
 

 



 11 

MY SINCERE THANKS TO … 

 

My labmates at Dr. Nör’s lab, Kathleen Neiva, Eoin 

Mullane, Zaocheng Zhang, Zhihong Dong, Ilan Maltz, Tatiana 

Botero, Naoki, Bill Love, Elliot Hill, Kristy Warner, Ben Zeitlin, 

Sudha Krishnamurthy, Isabel Lauxen, Paloma Telles, Flávio 

Demarco, Sandra Tarquin, Luciano Casagrande, Vichu, Alexandra 

Jakery e Marta Myiazawa, friends from other departments, 

Christopher Strayhorn, Ruth Eberhart, Renita Bellmore for all 

the support you gave me during my stay at Ann Arbor.  Staying 

there was a huge and extremely important experience to me.  Most 

of the things were completely new:  in the personal side, arriving at 

a foreign country, finding a place to live, getting home furniture and 

equipments, learning how to get around at the city, facing the low 

temperature and exercising communication in a foreign language, …in 

the professional side, moving to a new and more specific area of 

knowledge, with the consequent theoretical and methodological 

universe to grasp, a modified research project, all this made the 

whole year a very challenging task.  Your share of knowledge and 

experience with patience, kindness and caring were the tools that 

made it possible for me to grow and develop as a person and as a 

scientist. Thank you from the deep of my heart! 

 

 

 



 12 

SPECIAL THANKS TO … 

 

Prof. Dr. Jacques Eduardo Nör, who permitted me to enjoy a 

wonderful experience when he accepted me at his laboratory, in 

attention to Dr. Carlos Alberto Souza Costa´s indication.  Dr. Nör 

established the conditions for me to be introduced to a very 

important area of knowledge and sophisticated program, to go 

through a complex learning process and to get new directions to my 

professional life.  I thank you, Dr. Nör, for your attention and 

availability during the time I had the honor to work with your 

research group.  The learning you made accessible was essential for 

my professional development and for the future of my academic 

career.   

 

Kathleen, an intelligent, competent and kind person, who besides 

giving me all the professional support I needed to develop as a 

scientist, became a real friend, a very important person in my life!  

Your friendship, as well as your professional competence gave me 

support to learn, to find a direction, to move through the 

progressive steps of the process and finally, to reach my goals.  

Thank you, amore! 

 

Zhang, a deep source of knowledge, experience and competence, 

shared with me with grace and caring!  In his humble and quiet way, 

he became a solid support and a good friend.  You know that you 



 13 

were the person I turned to every time I got stuck in some step of 

the process, and methodological procedure. And you ALWAYS were 

there for me!  Thank you, Zhang!  You were an essential part in my 

development process! 

 

Eoin, a steady fountain of friendship, support and caring.  Your 

kindness was essential for me during last year in Ann Arbor. Thank 

you for your support, Irish!!!! 

 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 14 

 

SUMÁRIO 

 

Resumo   ..................................................................................... 17 

Abstract  ..................................................................................... 20 

INTRODUÇÃO  ........................................................................ 22 

REVISÃO DA LITERATURA .................................................. 26 

PROPOSIÇÃO ........................................................................... 95 

MATERIAL E MÉTODO  ..................................................... 96 

RESULTADO .......................................................................... 108 

DISCUSSÃO  ............................................................................. 121 

 CONCLUSÃO  ......................................................................... 139 

 REFERÊNCIAS  ....................................................................... 139 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 15 

Lista de abreviações e símbolos 

 

DPSC Células-tronco de polpa de dentes permanentes humanos 

HDPF Fibroblastos de polpa dentária humana 

HDMEC Células endoteliais microvasculares da derme humana 

VEGF (VEGF A) Fator de crescimento endotelial vascular 

bFGF (FGF-2) Fator de crescimento fibroblastico basico 

PGF (P1GF) Fator de crescimento de placenta 

PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas 

IGF Fator de crescimento semelhante a insulina 

HGF Fator de crescimento de hepatocitos  

TGF Fator de crescimento de transformação  

EGF Fator de crescimento epidérmico  

VPF Fator de permeabilidade vasccular 

HIF-1 (HIF-1�/�) Fator de transcrição induzido pela hipoxia 1 

SDS Sulfato dodecil-sodico 

GAPDH Gliceraldeido 3- fosfato desidrogenase 

DAB Tetracloreto de diaminobenzidina 

YC1 Inibidor de HIF-1alpha 

CM Meio de acondicionamento 

NX Normóxia 

HX Hipóxia 

CM DPSC NX ou HX Meio de acondicionamento das DPSC em normóxia ou 

hipóxia 

CM HDPF NX ou HX Meio de acondicionamento dos HDPF em normóxia ou 



 16 

hipóxia 

EGM-2MV Meio de cultura para as HDMEC 

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium – meio de cultura para 

as células HDPF e DPSC 

FBS Soro fetal bovino 

PBS Solução Salina Fosfatada Tamponada 

TBS Solução Salina Tamponada Tris 

TBST Solução Salina Tamponada Tris + 0.1% de Tween 20 

ELISA Teste de imunoensaio (Enzyme linked immunosorbent assay) 

WST-1 Teste colorimetrico de viabilidade celular 

WB Western blot 

Sprouts/Sprouting Estruturas semelhantes a tubos capilares / Formação de 

estruturas semelhantes a tubos capilares 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 17 

Aranha AMF. Potencial angiogênico de células pulpares humanas em 

hipóxia [Tese de doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da 

UNESP; 2008. 

  

Resumo 

Luxações dentárias resultam em injúrias ao feixe vásculo-nervoso, o que 

pode causar redução significante no nível de oxigênio das polpas 

dentárias, ou mesmo morte deste tecido conjuntivo especializado. O 

conhecimento dos mecanismos envolvidos na resposta das células 

pulpares à hipóxia pode melhorar o prognóstico dos tratamentos das 

luxações dentárias. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento 

de células-tronco (DPSC) e de fibroblastos (HDPF) de polpas dentárias 

humanas em condições de hipóxia e a capacidade destas em estimular a 

proliferação e formação de tubos capilares por células endoteliais 

microvasculares dérmicas humanas (HDMEC). As análises do western 

blot e imunocitoquímica foram realizadas para avaliar o efeito da hipóxia 

na ativação do fator de transcrição induzido pela hipóxia 1 (HIF-1alfa). A 

expressão dos fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) e 

fibroblástico básico (bFGF) foi avaliada pelos testes de imunoensaio 

ELISA. O efeito do HIF-1alfa na expressão do VEGF foi avaliado pelo 

tratamento das células DPSC e HDPF com 40 �M YC-1, inibidor do 

HIF-1alfa. Para a avaliação da angiogênese in vitro, os testes de 



 18 

proliferação celular (WST-1) e de formação de tubos capilares em gel de 

colágeno foram realizados após tratamento das células HDMEC com os 

meios de acondicionamento das células DPSC ou HDPF, em condições 

de normóxia ou hipóxia.. A análise dos dados obtidos foi realizada por 

testes estatísticos não-paramétricos com nível de significância de 5%. 

Aumento da atividade do HIF-1alfa e da expressão de VEGF foram 

observados nas células DPSC e HDPF em condições de hipóxia. 

Entretanto, não foram observadas alterações nos níveis de expressão de 

bFGF. A expressão do HIF-1alfa foi inibida por 40μM de YC-1, em 

ambas as linhagens celulares, reduzindo significantemente a secreção de 

VEGF pelas DPSCs em hipóxia. As células HDPF em hipóxia 

aumentaram em 50% a formação de tubos capilares quando comparadas 

às mesmas células em normóxia e em 30% quando comparadas às DPSC 

em hipóxia. O aumento da taxa de proliferação das células HDMEC foi 

tempo-dependente. Após 72 horas, os fibroblastos em hipóxia 

estimularam a proliferação das HDMECs em 30% quando comparados 

com as DPSCs em hipóxia. Os resultados indicaram que o HIF-1alfa é 

regulado pela hipóxia nas DPSCs e HDPFs e está envolvido na regulação 

da expressão de VEGF pelas células DPSC. Notavelmente, a hipóxia é 

suficiente para aumentar o potencial angiogênico das células pulpares 

humanas. 



 19 

Palavras-chave: Neovascularização fisiológica; polpa dentária; anóxia; 

agentes moduladores da angiogênese 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 20 

Aranha AMF. The angiogenic potential of human dental pulp cells in 

hypoxia [Tese de doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da 

UNESP; 2008. 

 

Abstract 

Dental luxations can result in the severing of the dental pulp and the 

creation of a hypoxic environment that might lead to the death of the pulp 

tissue. Improved understanding of the mechanisms underlying the 

response of dental pulp cells to hypoxic conditions might lead to better 

treatment of dental luxations. The purpose of this work was to evaluate 

the behavior of Dental Pulp Stem Cells (DPSC) and Human Dental Pulp 

Fibroblasts (HDPF) under hypoxia and their ability to stimulate 

proliferation and sprouting of endothelial cells. Western blots and 

immunohistochemistry were used to evaluate the effect of hypoxia on the 

activation of the transcriptional factor HIF-1�. Vascular Endothelial 

Growth Factor (VEGF) and Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) 

expression was evaluated by ELISA. The effect of HIF-1� on VEGF 

expression was evaluated by treating DPSC or HDPF with 40 �M YC-1, 

an inhibitor of HIF-1�. To evaluate the angiogenic potential of dental 

pulp cells in vitro, human dermal microvascular endothelial cells 

(HDMEC) were treated with conditioned medium from DPSC or HDPF 

in normoxia or hypoxia. Sprouting and WST-1 assays were used to 



 21 

evaluate capillaries tubes-like formation and cell proliferation rate, 

respectively. The statistic analysis was performed by non-parametric 

tests. HIF-1� activity and VEGF expression were up-regulated in DPSC 

and HDPF under hypoxic conditions. However, no changes in the 

expression levels of bFGF were observed. YC-1 40μM was able to inhibit 

HIF-1alpha in both cell lines and it also reduced VEGF expression in 

DPSCs in hypoxia. HDPF under hypoxia increased HDMEC sprouting by 

50% when compared to HDPF in normoxia, and by 30% when compared 

to DPSC in hypoxia. Notably, HDPF under hypoxia stimulated HDMEC 

proliferation by 30% when compared to DPSC in hypoxia. It was 

concluded that HIF-1� and VEGF are regulated by hypoxia in DPSCs 

and in HDPFs. HIF-1� is involved in the regulation of VEGF expression 

in DPSCs under hypoxia. Notably, the hypoxia is sufficient to enhance 

the angiogenic potential of human dental pulp cells. 

 

Key-words: Angiogenesis; dental pulp; anoxia; angiogenesis modulating 

agents. 

 

 

 

 

 



 22 

 

INTRODUÇÃO 

 

Os traumas dentários ocorrem com freqüência em crianças e 

adolescentes em idade escolar e em fase de crescimento 3, 48. Os dentes 

anteriores superiores e, em especial, os incisivos centrais são os mais 

afetados 5 tendo como causas mais freqüentes as quedas, colisões, 

acidentes automobilísticos e atividades esportivas 16,  48,  49.  

Nos deslocamentos de dentes traumatizados, como nas luxações 

extrusivas parciais, luxações intrusivas e principalmente nas avulsões 

dentárias, redução severa do suprimento vascular sanguíneo pelo 

rompimento do feixe vásculo-nervoso e ruptura do ligamento periodontal, 

são observados 2, 4, 5, 6, 16, 48. Nos casos de avulsão dentária, o reimplante 

do elemento deslocado representa o tratamento de escolha, embora 

possam ocorrer complicações como dor, anquilose, necrose pulpar, 

obliteração dos canais radiculares, reabsorção radicular externa e perda 

óssea de   sustentação 4, 5.  Alguns fatores são determinantes para a 

revascularização, processo indicador de sucesso no tratamento de dentes 

reimplantados, como o estágio de formação radicular, o período de tempo 

entre o trauma e o tratamento, a presença de contaminação e o meio de 

armazenamento da estrutura dentária 5. A revascularização do tecido 



 23 

pulpar foi observada em 34% dos dentes reimplantados com ápice aberto 

4.   

 A regulação da angiogênese, processo de neovascularização a 

partir de vasos sanguíneos pré-existentes, pela hipóxia, é uma estratégia 

importante dos mecanismos de controle homeostático que ligam o 

suprimento vascular de oxigênio dos sistemas cárdio-pulmonar às 

necessidades locais metabólicas dos tecidos 29, 38, 67.  

 A regulação do fator de transcrição induzido pela hipóxia 1  (HIF-

1) representa o mecanismo molecular mais bem definido e responsável 

pela manutenção da homeostasia de oxigênio em metazoários 38. O HIF-

1, proteína heterodimérica composta por duas subunidades, uma 

subunidade sensível ao oxigênio (HIF-1alfa) e a outra constitutiva (HIF-

1beta), é expresso por diferentes tipos celulares 42, 89, 90. A expressão da 

subunidade da proteína HIF-1alfa aumenta imediatamente em condições 

de hipóxia e após reoxigenação, a proteína é degradada 1, 32, 72, 87, 88, 90.  

 O fator transcricional HIF-1alfa apresenta papel crítico no processo 

da angiogênese pela ativação da transcrição de genes que codificam 

fatores de crescimento pró-angiogênicos, incluindo o fator de crescimento 

vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), 

angiopoetina 1 (ANG1) e 2 (ANG2), fator de crescimento da placenta 

(PGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFB) 25, 32, 46, 50, 66, 

84, 92.  Estes fatores de crescimento são secretados por células hipóxicas, 



 24 

as quais estimulam a reorganização estrutural de células endoteliais, 

aquisição de fenótipo invasivo, proliferação e formação de tubos 

estruturas vasculares       (sprouts) 24, 76.  

 O VEGF é considerado o principal fator de crescimento pró-

angiogênico que regula processos fisiológicos e patológicos de    

angiogênese 22, 47, 58. A expressão de VEGF influencia a resposta 

angiogênica, sendo responsável pela estimulação da degradação da matriz 

extracelular ao redor das células endoteliais, promovendo a proliferação, 

migração e organização destas células em estruturas tubulares 9, 37, 56, 60.  

 Não menos importante, o fator de crescimento fibroblástico básico 

(bFGF) também está envolvido com a regulação da angiogênese in vitro e 

in vivo, induzindo proliferação e quimiotaxia de células endoteliais e 

produção de proteases 66, 70. 

 Como a regulação da expressão do HIF-1alfa depende do tipo    

celular 46 e existem poucas evidências da resposta das células pulpares à 

hipóxia e dos mecanismos moleculares envolvendo a resistência destas 

células às condições hipóxicas, estudos são necessários para explorar o 

comportamento das células pulpares em hipóxia na regulação da 

angiogênese in vitro.  

 A transição para a situação clínica dos eventos de sinalização 

envolvendo a regulação transcricional de fatores pró-angiogênicos pode 

futuramente representar forte impacto no tratamento das injúrias 



 25 

traumáticas dentárias, especialmente das avulsões dentárias. Dentro deste 

contexto, desenvolveu-se a presente pesquisa, cujo objetivo principal foi 

avaliar o efeito da hipóxia no potencial angiogênico de células pulpares 

humanas, examinando, pela primeira vez, respostas angiogênicas de 

células-tronco derivadas de tecidos pulpares. 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 26 

REVISÃO DE LITERATURA 

 

 Para facilitar a leitura deste capítulo, a literatura científica revisada 

foi subdivivida em tópicos de acordo com o assunto de interesse. 

 

A. TRAUMA DENTÁRIO RELACIONADO À HIPÓXIA E À 

ANGIOGÊNESE 

 

  Stanley et al. 78 (1978) descreveram o fenômeno do 

infartamento isquêmico da polpa dentária pós-trauma. Para esta finalidade, 

cento e cinqüenta dentes traumatizados (sub-luxados, luxados, avulsionados 

e reimplantados) tiveram seus tecidos pulpares extirpados e submetidos à 

análise histopatológica. Os autores demonstraram que alguns tipos de 

traumas dentários comprimiram os vasos sanguíneos no ápice radicular, 

tempo suficiente para romper o suprimento sanguíneo, induzindo a polpa a 

condição de anóxia. O grau de privação de sangue e oxigênio derivado dos 

episódios traumáticos determinou a rapidez com que os tecidos pulpares se 

converteram totalmente em uma massa homogênea vermelho-escarlate à 

pink, com alterações de suas características histológicas normais. Quando as 

artérias pulpares principais foram obstruídas, os vasos sanguíneos dos canais 

acessórios passaram a agir como arteríolas periféricas, permitindo a difusão 

de sangue. Em seguida, os capilares sofreram dilatação, congestão e 



 27 

posterior degeneração, permitindo a difusão de eritrócitos através da polpa 

dentária. Com o tempo, os eritrócitos se rompem e liberam grânulos de 

hemoglobina na coloração vermelho-escarlate. Os autores sugeriram que a 

coloração pink dos dentes traumatizados indicou morte agressiva do tecido 

pulpar com acúmulo de células vermelhas sanguíneas em seu interior. Na 

ausência de macrófagos para conversão destas células em hemossiderina, a 

hemoglobina se rompera em partículas vermelhas, determinando a coloração 

pink á vermelha do tecido. 

 

  Cipriano, Walton 14 (1986) examinaram a incidência e as 

características de infartamento isquêmico no tecido pulpar por meio de 

biópsias pulpares obtidas de 42 dentes traumatizados, assintomáticos, com 

ausência de história de patologia periapical, exposição pulpar ou 

sensibilidade pulpar negativa através da técnica da microscopia de luz. 

Apenas cinco polpas dentárias demonstraram infartamento isquêmico, que 

foram também avaliados com a microscopia eletrônica de transmissão. 

Quando comparados com polpas em condições normais, os tecidos pulpares 

considerados com infartamento mostraram-se marcantemente alterados. 

Algumas áreas indicaram inflamação, alteração nuclear, alteração de feixes 

nervosos e perda de colágeno. Os tecidos analisados em microscopia 

eletrônica mostraram evidências de necrose, padrão de degradação nuclear, 

avascularização relativa, degeneração de fibras nervosas e desorganização 



 28 

de colágeno. De acordo com os resultados, pôde ser concluído que o 

fenômeno do infartamento isquêmico em polpas traumatizadas ocorre 

ocasionalmente, mas apresenta uma variedade de alterações estruturais 

indicando degeneração tecidual.  

 

  Andreasen et al. 2 (1995) investigaram a chance de 

revascularização de 94 dentes reimplantados com formação incompleta da 

raiz no momento da injúria. A revascularização do tecido pulpar 

determinada pela  presença de sensibilidade pulpar positiva, ocorreu em 

34% dos casos. A sensililidade pulpar positiva e sinais radiográficos de 

obliteração do canal pulpar foram observados após 6 meses, enquanto que a 

necrose pulpar foi diagnosticada após 3 semanas dos reimplantes. O efeito 

de diversos fatores clínicos foi examinado, como gênero, idade, tipo de 

dente reimplantado, estágio de formação da raiz, tipo e período de tempo de 

armazenamento extra alveolar, contaminação clínica e procedimentos para 

limpeza da superfície radicular, além do tipo e período de tempo da 

contenção dentária e uso de antibióticos. O tamanho do forame apical e o 

comprimento radicular foram determinados radiograficamente no momento 

da injúria. Os dados obtidos revelaram que a revascularização pulpar foi 

mais freqüente em dentes com comprimentos radiculares mais curtos e em 

dentes armazenados em meio úmido (solução salina e/ou saliva) por mais de 

5 minutos. O reimplante dentário imediato (menos de 5 minutos) mostrou 



 29 

maior frequência de revascularização pulpar e embora não houve diferença 

estatística significante, as contenções dentárias semi-rígidas apresentaram 

tendência em aumentar a frequência de cura do tecido quando comparadas 

as contenções rígidas. 

 

  Claus et al. 15 (2004) observaram as alterações pulpares em 

dentes unirradiculares imaturos de cães, após remoção dos tecidos pulpar e 

transplantes dos dentes extraídos nos lugares de seus contra-laterais. 

Dezesseis dentes de ápices abertos foram utilizados e nos dia 0, 9, 16 e 23, 

quatro dentes foram extraídos e auto-transplantados. Os dentes foram 

extraídos e submetidos à análise histológica após 7, 14, 21 e 30 dias. Os 

resultados mostraram que após 7 dias, houve crescimento de um novo tecido 

no interior do canal radicular na região apical em 50% dos dentes. No 14o 

dia, todos os dentes apresentaram formação de um novo tecido conjuntivo 

rico em células em � das raízes. Vinte e um dias após o auto-transplante, 

75% das camadas pulpares estavam preenchidas, enquanto que aos 30 dias, 

reparo completo foi observado em 50% dos dentes e os vasos sanguíneos 

foram diferenciados em artérias e veias. Desta forma, pôde-se concluir que 

em dentes imaturos transplantados, após remoção dos tecidos pulpares 

originais, há formação de um novo tecido conjuntivo organizado e 

vascularizado. 

 



 30 

  Ritter et al. 69 (2004) investigaram o efeito tópico de 

antibióticos na revascularização pulpar em dentes reimplantados como 

controle de infecção bacteriana. Para tal finalidade, 34 dentes imaturos, com 

ápices abertos, foram selecionados de três cães. Radiografias iniciais e 

leitura do fluxo sanguíneo pelo Laser Doppler (LDF) foram utilizados para a 

análise. Os dentes foram extraídos e divididos aleatoriamente em quatro 

grupos: G1 - tratados com minociclina, G2 - tratados com doxiciclina e G3 - 

tratados com solução salina (controle negativo). Após tratamento, os dentes 

foram imediatamente reimplantados. Dentes não extraídos foram utilizados 

como controle (G4). Radiografias pós-operatórias e leituras de fluxo e 

viabilidade dos tecidos pulpares (LDF) foram realizadas após dois meses do 

reimplante. A revascularização pulpar ocorreu em 91%, 73% e 33% para os 

grupos G1, G2 e G3, respectivamente. Através dos resultados, os autores 

concluíram que a minociclina em forma de microesferas apresentou 

eficiente ação de liberação lenta do antibiótico de amplo-espectro, 

permitindo que a revascularização tenha ocorrido em níveis mais altos que a 

solução de doxiciclina em dentes imaturos reimplantados. 

 

  Chappuis, von Arx 12 (2005) avaliaram 34 pacientes com 45 

dentes permanentes avulsionados e reimplantados por meio de exames 

radiográficos, analisando alterações períodontais e pulpares por período de 

um ano. Todos os dentes avulsionados foram mantidos em meio de 



 31 

armazenamento especial, contendo aminoácidos, vitaminas e glicose 

(Dentosafe, GmbH, Iserlohn, Germany) pelo menos por 30 minutos e então 

imersos em tetraciclina 5% antes do reimplante. Os dentes foram 

manualmente reimplantados e estabilizados por 7-10 dias. Após este 

período, apenas os dente com ápice fechado e aqueles com ápice aberto ou 

que não foram estocados de forma adequada foram submetidos ao 

tratamento endodôntico. A tetraciclina foi administrada sistemicamente a 

todos os pacientes durante 10 dias. Foi observado que dos 95,6% dos dentes 

reimplanados e mantidos após 1 ano de acompanhamento, 82,2% foram 

submetidos ao tratamento endodôntico. Não houve revascularização pulpar, 

mas em 57,7% dos casos houve restabelecimento periodontal normal. Dos 

42,3% dos dentes que sofreram reabsorção externa, 28,9% apresentaram 

reabsorção por substituição. Em apenas 6,7% dos dentes ocorreu reabsorção 

relacionada a infecção ou reabsorção de superfície. 

   

  Strobl et al. 79 (2005) determinaram se o tipo de luxação 

dentária seria responsável por alterações da medida do fluxo sanguíneo em 

dentes permanentes após trauma, reposicionamento e contenção. Em 41 

pacientes, 69 incisivos centrais superiores foram analisados através de Laser 

Doppler para mensurar os valores do fluxo sanguíneo (unidade de perfusão-

PU). As unidades de perfusão foram obtidas no dia da remoção da 

contenção e após 3, 6 e 12 meses. As luxações intrusivas foram associadas 



 32 

com redução significante dos valores do fluxo sanguíneo, enquanto que as 

subluxações, luxações laterais e extrusivas, bem como as avulsões não 

mostraram diferenças entre as sessões. Os valores do fluxo sanguíneo nas 

avulsões dentárias foram sempre menores que os valores das subluxações e 

luxações laterais. Os autores sugeriram que o tipo de luxação dentária 

interfere na resposta pulpar em dentes traumatizados, sendo a intrusão 

seguida da avulsão, as injúrias com piores prognósticos. 

 

B. CÉLULAS-TRONCO PULPARES  

 

  Gronthos et al. 33 (2000) identificaram e isolaram uma 

população de células progenitoras odontogênicas de tecidos pulpares adultos 

de dentes permanentes humanos (DPSCs) e as compararam com células do 

estroma da medula óssea humana (BMSCs). Para tal finalidade, tecidos 

pulpares de terceiros molares foram separados das coroas e raízes e 

digeridos em solução de colagenase tipo I e dispase por uma hora a 370C e 

suspensões de célula-única foram obtidas para avaliar a formação de 

colônias pelas células isoladas. As análises da imunocitoquímica, da 

atividade da fosfatase alcalina, RT-PCR e hibridização in situ foram 

realizadas para caracterização das células. As células DPSCs ou BMSCs 

foram misturadas com pó de hidroxiapatita/fosfato tricálcio e transplantadas 

no dorso de camundongos imunosuprimidos por 45 dias, quando os 



 33 

transplantes foram removidos e preparados para análise histológica. Células 

DPSC isoladas apresentaram frequência de formação de colônias e de 

número de células proliferativas significantemente maior do que a cultura de 

células BMSC. Em geral, DPSCs e BMSCs apresentaram padrão de 

expressão semelhantes para uma variedade de marcadores associados com 

endotélio (CD146 e VCAM-1), musculatura lisa (�-SM actin), osso 

(fosfatase alcalina, colágeno tipo I, osteonectina, osteopontina e 

osteocalcina) e fibroblastos (colágeno tipo III e bFGF). Células DPSCs 

produziram nódulos densos, calcificados e esporádicos e não formaram 

adipócitos, enquanto que as BMSCs calcificaram através de camada de 

células aderentes com formação de agrupamentos de adipócitos. Quando 

DPSCs foram transplantadas em camundongos, houve formação de tecido 

semelhante à estrutura dentinária, lineada por células odontoblastóides que 

circundavam tecido semelhante à polpa dentária. Em contraste, BMSCs 

formaram osso lamelar contendo osteócitos e osteoblastos ao redor de tecido 

vascular fibroso com hematopoiese ativa e adipócitos. Os autores 

concluíram que o tecido pulpar pós-natal contém células clonogênicas 

altamente proliferativas e capazes de formar complexo semelhante ao 

dentino-pulpar. 

 

  Gronthos et al. 34 (2002) caracterizaram a capacidade de auto-

renovação e de diferenciação em multi-linhagens, bem como a eficiência 



 34 

clonogênica de células-tronco de polpas dentárias humanas (DPSCs). Foi 

demonstrado que DPSCs são capazes de formar dentina ectópica e tecido 

pulpar associado in vivo. Células semelhantes àquelas presentes no estroma 

de transplantes de DPSCs de três meses foram re-isoladas em culturas de 

transplantes primários de células DPSC e, re-transplantadas em 

camundongos imunodeprimidos para gerar tecido semelhante ao dentino-

pulpar, demonstrando sua capacidade de auto-renovação. As células DPSCs 

também foram capazes de se diferenciar em adipócitos e células semelhantes 

às células neurais. Dois terços de colônias de célula-única foram capazes de 

formar dentina ectópica abundante in vivo, sugerindo que as colônias 

derivadas de DPSCs diferem entre si em relação a taxa de odontogênese. 

Estes resultados demonstraram que DPSCs possuem características de 

células-tronco, incluindo capacidade de auto-renovação, alta taxa de 

proliferação e diferenciação em multi-linhagens. Desta forma, os autores 

sugeriram que as DPSCs podem ser utilizadas como modelo de estudo para 

diferenciação de células-tronco adultas in vitro e regeneração tecidual in 

vivo. 

 

  Pierdomenico et al. 64 (2005) investigaram o fenótipo de 

células-tronco derivadas de polpa de dentes permanente humanos (DP-

MSCs) e o compararam com as células-tronco derivadas da medula óssea 

(BM-MSCs). A análise da citometria de fluxo mostrou que as DP-MSCs e 



 35 

BM-MSCs foram positivas para SH2, SH3, SH4, CD29 e CD166. A 

proliferação in vitro de ambas as linhagens celulares foi avaliada pela 

incorporação do corante 3H-timidina. A função de imunossupressão das 

células-tronco mesenquimais foi testada através da co-cultura das mesmas 

com ou sem linfócitos humanos por 3 dias. As células BM-MSC in vitro se 

diferenciaram em osteócitos, condrócitos e adipócitos, enquanto que as 

células DP-MSCs mostraram diferenciação adipogênica menos evidente e 

ausência de diferenciação condrogênica. Foi demonstrado que as DP-MSCs 

apresentam crescimento rápido in vitro entre os dias 3 e 8 de cultura, o qual 

diminui no 150 dia. Por outro lado, BM-MSCs proliferam de forma estável e 

contínua pelo mesmo período de tempo. A co-cultura da DP-MSCs ou das 

BM-MSCs resultou em inibição de 91% e 75% das células T, 

respectivamente. Os autores concluíram que o tecido pulpar é uma fonte 

eficiente de células-tronco mesenquimais com mecanismos e capacidade de 

diferenciação distintos das células isoladas da medula óssea. A capacidade 

de proliferação rápida e as caraterísticas imunorregulatórias das DP-MSCs 

indica o uso destas células para tratamento e prevenção de transplantes de 

órgãos alogênicos. 

 

  Yamada et al. 91 (2006) investigaram os padrões de expressão 

gênica e as classificações funcionais de duas populações de células pré-

cursoras: células-tronco de polpa dentária humana (hDPSC) e células-tronco 



 36 

mesenquimais humanas (hMSC) por meio da análise microarray de cDNA. 

A expressão dos genes da fosfatase alcalina (ALP), proteína da matriz 

dentinária 1 (DMP-1) e da sialoproteína dentinária (DSPP) foram analisadas 

pela Reação em Cadeia da Polimerase pela Transcriptase Reversa em 

Tempo Real (qRT-PCR). As análises do padrão de expressão gênica 

indicaram vários genes que codificam componentes da matriz extracelular 

(colágeno tipo IV, XIII, XVIII, sialoproteína óssea, metaloproteinase da 

matriz, trombospondina), moléculas de adesão celular (integrinas � 2, 4, 7, 

11, � 2), fatores de crescimento (IGF-1 e II, Interleucina 8 e 11, TNF-�, 

BMP-2 e 4) e reguladores transcripcionais (Msx1, Jun-B). Análises de 

formação de agrupamentos celulares (clusters) e análises funcionais da 

diferença no nível de expressão gênica das células-tronco examinadas, 

revelaram expressão de genes de sinalização, comunicação ou de 

metabolismo celular. De acordo com os resultados, os autores acreditam que 

ambas as linhagens de células-tronco podem ser utilizadas no futuro como 

recursos celulares multipotentes para a tecnologia genética e de engenharia 

de tecido 

 

C. HIPÓXIA 

Respostas celulares à hipóxia 

  Baumgardner et al. 8 (1996) examinaram se a substância 

tritiato misonidazole (3H-MISO) poderia diferenciar tecidos pulpares e 



 37 

periapicais em condições de normóxia e hipóxia. As substâncias, 3H-

MISO (tritiato misonidazole), MISO (misonidazole) não marcado, ou 

solução salina, foram injetadas intra-peritonialmente em ratos e então 

divididos nos grupos normóxia e hipóxia. Os animais em condições de 

hipóxia foram mantidos em câmaras hipobáricas a 0.5 atm por 24 horas. 

A retenção de 3H-MISO foi avaliada pela análise quantitativa de auto-

radiografias dos tecidos. Dentes com osso perirradicular foram 

removidos, fixados e submetidos ao processamento histológico. A taxa de 

retenção do 3H-MISO em células dos animais em normóxia mostrou 

pequena variação com exceção da alta retenção em ameloblastos maduros 

e odontoblastos imaturos em incisivos em erupção. Nos tecidos pulpares 

de ambos os grupos dentários (incisivos e molares), a manutenção dos 

animais na câmara hipobárica aumentou a retenção de 3H-MISO quando 

comparada com os animais em normóxia e do grupo controle. Intensa 

retenção de 3H-MISO de células hipóxicas foi observada no cemento, 

ligamento periodontal, osteócitos e ocasionalmente nos odontoblastos dos 

cornos pulpares de molares. Os resultados demonstraram que com 

técnicas padrão de auto-radiografia, o 3H-MISO pode marcar condições 

induzidas de hipóxia, com alteração do fluxo sanguíneo na polpa dentária 

e no periodonto circundante. 

 



 38 

  Hochachka et al. 39 (1996) propuseram uma teoria para a 

tolerância de alguns tipos celulares à hipóxia, na qual a resposta celular à 

redução dos níveis de oxigênio ocorreria em duas fases, defesa e resgate. 

Na primeira fase, uma série de processos moleculares de defesa como o 

declínio quase total da síntese protéica e a redução da permeabilidade da 

membrana citoplasmática economizariam grande parte da energia 

necessária para o metabolismo celular em condições normais, permitindo 

a sobrevivência das células durante um período prolongado de hipóxia ou 

anóxia diante dos níveis extremamente baixos do turnover de ATP. Se o 

período de falta de oxigênio fosse prolongado, o sistema de tolerância à 

hipóxia ativaria mecanismos de “resgate”, regulando a expressão de 

diversas proteínas. Nesta segunda fase, mecanismos de sinalização com 

ativação de fatores chaves de transcrição, como o fator induzido pela 

hipóxia 1 (HIF-1), seriam ativados e os mecanismos da demanda e 

suprimento de energia para o metabolismo celular seriam suprimidos 

durante o período hipóxico, transformando as taxas do turnover de ATP 

durante a normóxia, em um novo e estável estado hipometabólico. 

 

  A reparação tecidual envolve a deposição de matriz de 

colágeno, angiogênese e crescimento de novo tecido. As atividades 

celulares durante o reparo estão relacionadas com os níveis de oxigênio 

do tecido. Diante destes dados científicos, Tompach et al. 82 (1997) 



 39 

investigaram os efeitos do oxigênio hiperbárico (HBO) em células 

envolvidas na reparação. Culturas de células endoteliais de aorta bovina e 

fibroblastos de pele humana foram expostas ao HBO, variando-se a 

pressão parcial, saturação de oxigênio, duração e freqüência da 

exposição. A proliferação celular foi determinada pela incorporação de 

timidina marcada por 3H. Um aumento da pressão parcial de oxigênio no 

meio de cultura das células cultivadas foi observado quando expostas ao 

oxigênio hiperbárico, resultando em aumento da proliferação celular. A 

proliferação das células endoteliais aumentou após 15 minutos de 

exposição ao HBO, enquanto que 120 minutos de exposição foram 

necessários para a proliferação dos fibroblastos, que persistiu por 72 

horas. O aumento na pressão de 2,4 para 4 atmosferas não potencializou a 

resposta proliferativa de ambas as linhagens celulares, reduziu 

significantemente à incorporação da timidina. Os autores sugeriram que 

bons resultados podem ser obtidos nos processos de reparação tecidual, 

incluindo a angiogênese, através do aumento dos níveis de oxigênio 

tecidual, utilizando tratamentos celulares e teciduais com oxigênio 

hiperbárico. 

 

  Giaccia et al. 29 (2004) resumiram o atual conhecimento 

discutido no Encontro de Keystone sobre a biologia da hipóxia. Foi 

observado que as respostas induzidas pela hipóxia são fortemente 



 40 

reguladas no desenvolvimento embrionário normal e podem ser 

desreguladas em diferentes estados das doenças. A identificação das 

proteínas reguladas pelo oxigênio como os fatores transcricionais da 

família HIF (fator induzido pela hipóxia) representa um paradigma para a 

percepção do oxigênio a nível molecular. Todavia, considera-se que esta 

família seja um dos exemplos envolvidos na regulação da expressão 

proteica em resposta a hipóxia. Uma variedade de organelas 

intracelulares também pode estar relacionada com a percepção do 

oxigênio como, por exemplo, os canais iônicos, mitocôndrias e retículos 

endoplasmáticos. O uso de organismos-modelo, incluindo camundongos 

transgênicos e knockout tem sido fundamentais em associar eventos 

moleculares na percepção do oxigênio com respostas de 

desenvolvimento, contribuindo para melhor visualização dos aspectos 

inerentes à percepção do oxigênio mantidos durante evolução. 

Finalmente, os pesquisadores concluíram que o conhecimento de como as 

células percebem e respondem a hipóxia é fundamental para entender o 

papel da hipóxia em doenças, bem como para aprimorar os diagnósticos e 

tratamentos.  

 

  Swiderek et al. 81 (2008) examinaram as alterações celulares 

e moleculares de uma linhagem de células de mamíferos (NSO) 

produtoras de anticorpo quimérico de camundongos e humanos, em 



 41 

condições de hipóxia (< de 1% de O2). Vários parâmetros celulares, tais 

como a viabilidade (Análise do Triplan Blue), produtividade 

(concentração de expressão de anticorpos - teste ELISA e análise de 

microarray), metabolismo (concentração de lactato e glicose), apoptose 

(Kit) e ciclo celular (citometria de fluxo) foram estudados. Após 12 horas 

de incubação, houve supressão do crescimento celular e perda 

significante da viabilidade celular em detrimento ao baixo teor de 

oxigênio. Quando as células foram expostas a 48 horas de hipóxia, morte 

celular foi observada. O mecanismo de produção de anticorpos foi 

completamente interrompido nas células em hipóxia. A análise de 

microarray revelou que a sobrevivência inicial das células NSO em 

hipóxia durante as primeiras 12 horas de incubação foi mantida pela 

supressão de processos consumidores de energia, tal como a síntese de 

RNA e DNA, e  pela estimulação de mecanismos de aquisição de mais 

energia e de transporte de oxigênio, como o aumento da glicólise e do 

metabolismo de carboidratos, levando a caminhos alternativos para a 

produção de ATP e maior disponibilidade de oxigênio. Estes resultados 

sugeriram que mudanças nos mecanismos e genes foram responsáveis 

pela aceleração da morte celular em condições de hipóxia. 

 

 

 



 42 

HIF-1alfa 

  Semenza, Wang 72 (1992) identificaram um fator 

intensificador (enhancer) de 50 nucleotídeos (nt) de um gene humano da 

eritropoietina (EPO - sequência 3’GCCCTACGTGCTGTCTCACACA 

GCCTGTCTGACCTCTC 

GACCTACCGGCC) capaz de mediar a indução transcricional em resposta a 

hipóxia (1% de O2), em células de hepatoblastoma humano (Hep3B). Os 

estudos de mutagênese realizados revelaram duas regiões do fator 

intensificador induzidas pela hipóxia (50 nt), nucleotídeos 4 a 12 (site 1) 

e 19 a 23 (site 2), que foram essenciais para a indução da expressão 

gênica induzida pela hipóxia. O footprint da DNase I demonstrou a 

ligação com o fator nuclear constitutivo dos nucleotídeos 26 a 48 (site 3). 

A atividade de ligação ao DNA do fator intensificador, quando as células 

estavam em condições hipóxicas, foi inibida pela presença de 

ciclohexamidina, o que não aconteceu na região constitutiva do mesmo. 

Estes resultados indicaram que um fator nuclear, denominado de fator 

induzido pela hipóxia 1 (HIF-1), liga-se às sequências necessárias (site 1) 

para a ativação transcricional do gene EPO em resposta a hipóxia e, a 

ligação do HIF-1 depende da síntese proteica. Os autores concluíram de 

acordo com os resultados obtidos, que um fator intensificador induzido 

pela hipóxia de 50 nucleotídeos, tripartido funcionalmente (sites 1, 2 e 3), 



 43 

se liga a diversos fatores nucleares, sendo um deles induzido pela hipóxia 

via síntese proteica. 

 

  Wang, Semenza 87 (1993) caracterizaram o HIF-1 e a 

regulação de sua atividade de ligação ao DNA pela hipóxia. A indução do 

HIF-1 e do RNA da eritropoietina (EPO) foi inibida pelo inibidor da 

proteína kinase, 2-amonipurina e pela actinomicina D. A ligação do fator 

transcricional ao DNA foi eliminada pelo tratamento dos extratos 

nucleares com fosfatase. Os autores demonstraram que o mecanismo de 

indução do HIF-1 pela hipóxia foi paralelo ao mecanismo de indução 

transcricional do gene da eritropoietina. A atividade de ligação ao DNA 

do HIF-1 diminuiu rapidamente quando as células Hep3B foram expostas 

ao aumento da tensão de oxigênio.  A ligação in vitro do HIF-1 ao DNA 

alcançou condições de equilíbrio em menos de 5 minutos, como era 

esperado de um regulador transcripcional fisiológico. Entretanto, a meia-

vida do complexo DNA-proteína foi menor que 1 minuto. Por meio dos 

resultados, os autores sugeriram que o fator trascricional HIF-1 é um 

regulador fisiológico da expressão gênica que responde a alterações na 

tensão do oxigênio celular.  

 



 44 

  Com o objetivo de determinar se o HIF-1 apresenta papel na 

ativação hipóxica da transcrição gênica, Wang, Semenza 88 (1993) 

analisaram diferentes linhagens celulares de mamíferos, nas quais o gene 

da eritropoietina (EPO) não foi expresso. A atividade do HIF-1 esteve 

presente nos extratos nucleares de células em hipóxia, mas não em 

normóxia, em todas as linhagens. Os autores demonstraram que a 

atividade de ligação ao DNA pelo HIF-1 foi induzida pela hipóxia em 

todas as linhagens celulares testadas, nas quais o gene EPO não era 

transcrito (fibroblastos de camundongo Ltk-, células CHO, fibroblastos 

Rat1, células 293 embrionárias de fígado humano, células de carcinoma 

da cervical humana HeLa e mioblastos de camundongo C2C12.). A 

composição do complexo de ligação ao DNA pelo HIF-1, a subunidade 

de ligação ao DNA isolada e o mecanismo de ativação do HIF-1 foram 

semelhantes ou idênticos nas células produtoras ou não do gene EPO. A 

transcrição de genes contendo o fator intensificador do gene EPO foi 

induzida pela hipóxia em células não produtoras do gene EPO, sendo que 

mutações que eliminaram a ligação do HIF-1, inibiram sua capacidade de 

indução. Estes resultados forneceram evidências de que em diferentes 

tipos celulares, a hipóxia induz a atividade de ligação do HIF-1 ao DNA 

com a mesma mobilidade e especificidade de seqüência que a atividade 

de ligação ao DNA do HIF-1, caracterizada previamente nas células 



 45 

Hep3B. Portanto, HIF-1 e sua seqüência de reconhecimento são 

elementos comuns de respostas celulares gerais de mamíferos à hipóxia. 

 

  Wang, Semenza 89 (1995) investigaram as propriedades 

bioquímicas do HIF-1 e seu papel no mecanismo de transdução dos sinais 

durante hipóxia. Para tal finalidade, os genes codificadores das 

subunidades do HIF-1 foram clonados e as células humanas de hepatoma 

(Hep3B) e de carcinoma cervical (HeLa) foram tratadas com cloreto de 

cobalto ou submetidas à hipóxia. HIF-1 foi purificado pelo teste de troca 

iônica DEAE e pela cromatografia de afinidade ao DNA. Análises do 

HIF-1 isolado revelaram a presença de quatro poli-peptídeos, sendo que 

os poli-peptídeos de 91-, 93- e 94-KDa apresentaram perfis semelhantes, 

sugerindo que eles representavam seqüências correlacionadas, enquanto 

que o polipeptídeo de 120-KDa apresentou perfil diferente. As análises 

cross-linking UV do HIF-1 purificado indicaram que ambas as 

subunidades do HIF-1 interagiram diretamente com o DNA. Os autores 

concluíram que durante o tratamento das células HeLa com cloreto de 

cobalto e das células Hep3B em hipóxia, o HIF-1 foi expresso e 

composto por duas diferentes subunidades: HIF-1 alpha de 120-KDa e 

HIF-1beta de 91-94-KDa. 

 



 46 

  Wang et al. 90 (1995) mostraram que ambas as subunidades 

do HIF-1 são proteínas básicas hélice-loop-hélice (bHLH), contendo 

domínio PAS (Per-ARNT-AHR-Sim), bHLH-PAS, consistindo de uma 

subunidade HIF-1alfa com 120kDa associada com uma subunidade HIF-

1beta  (ARNT- aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) com 91-

94 KDa. HIF-1alfa esteve mais relacionado com a proteína Sim, enquanto 

que o HIF-1 beta foi definido como uma série de produtos do gene ARNT 

que poderia heterodimerizar com o HIF-1alfa ou com a proteína AHR. As 

moléculas de RNA e os níveis de proteína do HIF-1alfa e do HIF-1beta 

(ARNT) foram induzidos em células expostas a 1% de O2, o que foi 

consistente com o papel do HIF-1 como mediador das respostas 

transcricionais a hipóxia. Os resultados forneceram evidências de que a 

atividade de ligação do HIF ao DNA celular é regulada pelos mecanismos 

transcricionais e pós-transcricionais. 

 

  Jiang et al. 42 (1996) identificaram fatores estruturais da 

subunidade HIF-1alfa essenciais para a heterodimerização, ligação ao 

DNA e transativação. As subunidades HIF-1alfa e HIF-1beta (ARNT) ao 

serem co-imunoprecipitadas de extratos nucleares das células humanas do 

fígado (Hep3B) em condições de hipóxia (1% de O2) ou normóxia (20% 

de O2), demonstraram heterodimerização na ausência de ligação ao DNA. 

A translação in vitro do HIF-1alfa e HIF-1beta gerou um complexo HIF-



 47 

1/DNA com mobilidade eletroforética e especificidade de seqüência 

semelhantes ao HIF-1 presente nos extratos nucleares das células 

hipóxicas. A deleção do domínio básico do HIF-1alfa eliminou a união ao 

DNA sem afetar a heterodimerização das proteínas (HIF-1alfa e HIF-

1beta). Em contraposição, com a deleção do terminal carboxil do HIF-

1alfa, houve redução significante da habilidade do HIF-1alfa 

recombinante (rh- HIF-1alfa) de ativar a transcrição. Nos testes de co-

transfecção, a expressão induzida de HIF-1alfa e HIF-1beta 

recombinantes, ativou a transcrição de genes contendo seqüência do fator 

intensificador EPO (gene da eritropoietina), com presença de sítios de 

ligação do HIF-1 intactos. A acentuada expressão de HIF-1alfa com 

deleções nos domínio básico e carboxil bloqueou a ativação gênica pelo 

HIF-1alfa endógeno em células hipóxicas. Através dos resultados, pode-

se sugerir que a transativação de células submetidas a 1% de O2 foi 

mediada primariamente pelo domínio carboxil da estrutura do HIF-1alfa, 

enquanto que outro domínio, como o de transativação do ARNT, 

apresenta papel importante para células em normóxia (20% de O2 ). 

 

  Jiang et al. 41 (1996) demonstraram que os níveis de 

atividade de ligação do HIF-1 ao DNA, das proteínas HIF-1� e HIF-1� 

são inversamente proporcionais à concentração do oxigênio celular, ou 

seja, aumentaram exponencialmente quando células de carcinoma 



 48 

cervical humano (HeLa S3) foram submetidas a concentrações 

decrescentes de O2 (20% a 0), com resposta média entre 1.5% e 2% de O2 

e resposta máxima a 0,5% de O2, na presença ou ausência de 1mM KCN 

(cianeto de potássio). O KCN foi utilizado para bloquear a fosforilação 

oxidativa, mantendo semelhantes as concentrações de O2 intracelular e 

extracelular, inibindo qualquer gradiente de O2 intracelular para analisar a 

expressão do HIF-1. Estes resultados mostraram evidências do 

envolvimento do HIF-1 na homeostasia de O2 e sugeriram que o sensor 

de O2 inicia a transdução do sinal de hipóxia, levando a expressão do 

HIF-1. 

 

  Forsythe et al. 25 (1996) demonstraram o envolvimento da 

proteína heterodimérica que ativa a transcrição do gene humano da 

eritropoietina (EPO), fator induzido pela hipóxia (HIF-1), em células 

hipóxicas, com a ativação da transcrição do fator de crescimento vascular 

endotelial (VEGF). Pela primeira vez, foi demonstrado, através do 

isolamento do cDNA codificador das duas subunidades do HIF-1, que o 

HIF-1 interage com a seqüência 5’- do VEGF para mediar a ativação 

transcricional em células hipóxicas. Este resultado foi determinado pela 

expressão induzida do HIF-1� e HIF-1� (rHIF-1), os quais aumentaram a 

expressão do VEGF em células expostas a 1% ou 20% de O2 de forma 

dose – dependente. O mRNA do VEGF não foi induzido pela hipóxia em 



 49 

células que não expressaram a subunidade HIF-1�, sugerindo a 

importância do HIF-1 na ativação da transcrição do VEGF em células 

hipóxicas. 

 

  Chun et al. 13 (2001) testaram a possibilidade do YC1 ([3-

(5’–Hydroxymethyl-2’–furyl)-1-benzyl indazole]) inibir as respostas 

induzidas pela hipóxia, como o óxido nítrico (NO). Células de hepatoma 

(Hep3B) em normóxia (20% O2) ou em hipóxia (1% O2) foram utilizadas 

para observar a indução do gene da eritropoietina (EPO) e do VEGF. Os 

efeitos do YC1 foram comparados com aqueles do óxido nítrico. Nas 

células submetidas à hipóxia, YC1 bloqueou a indução dos mRNAs de 

EPO e do VEGF, além de inibir a atividade de ligação do fator de 

transcrição HIF-1 ao DNA. O acúmulo, em nível protéico, do HIF-1alfa 

em condições de hipóxia foi suprimido, mas os níveis do mRNA não 

foram alterados, sugerindo que o YC1 atua bloqueando o HIF-1alfa na 

etapa pós-translacional. O YC1 também inibiu o acúmulo de HIF-1alfa 

induzido pelo cobalto e pela desferrioxamina (DFX), o qual não foi 

recuperado pelo tratamento das células com antioxidantes. Os resultados 

indicaram que os efeitos inibitórios do YC1 podem estar associados com 

o mecanismo  das células em perceber as alterações de oxigênio 

relacionado a metais e não pelo mecanismo de redução celular. 

 



 50 

  Kelly et al. 46 (2003) demonstraram que a exposição de 

culturas primárias de células cardíacas e vasculares à hipóxia ou ao 

adenovírus, codificando constitutivamente de forma ativa o HIF-1� 

(AdCA5), regulou coordenadamente a expressão de genes codificadores 

de diversos fatores de crescimento angiogênicos críticos, fatores de 

crescimento endotelial vascular (VEGF) semelhantes aos da placenta 

(PLGF) e derivados das plaquetas (PDGFB) e angiopoietinas 1 

(ANGPT1) e 2 (ANGPT2), de maneira específica para cada tipo celular. 

Dependendo do tipo celular, a expressão das angiopoetinas ANGPT1 e 

ANGPT2 foram ativadas ou reprimidas em resposta à hipóxia e ao 

AdCA5. Em todos os casos, houve concordância entre os resultados dos 

efeitos da hipóxia e do AdCA5. Para determinar se o aumento da 

atividade do HIF-1� seria suficiente para induzir angiogênese em tecidos 

não-isquêmicos in vivo, os autores analisaram o efeito da injeção sub-

retinária do AdCA5 na vascularização da retina de camundongos por 

meio da imunohistoquímica. Os resultados indicaram que o vetor 

adenoviral AdCA5 foi responsável por diferentes tipos de 

neovascularização intraocular na ausência de hipóxia/isquemia. 

Adicionalmente, concentrações elevadas de um único isoforme do VEGF 

não foi suficiente para formação e proliferação de novos vasos. Os 

autores ainda sugeriram um papel proeminente na neovascularização do 

PLGF induzido pelo AdCA5. A análise da expressão gênica revelou 



 51 

aumento na expressão do mRNA das ANGPT1 e ANGPT2, do PDGFB, 

do PLGF e do VEGF em AdCA5 injetado nos olhos dos camundongos. 

 

  Yamakawa et al. 92 (2003) investigaram os eventos 

moleculares envolvidos na regulação da resposta angiogênica pelo fator 

transcricional HIF-1alfa durante hipóxia. Para isto, células endoteliais 

primárias humanas (HPAEC) foram submetidas à hipóxia (1% O2), 

tratadas com desferroxamina (DFX) ou infectadas com Ad2/HIF-

1�/VP16, vetor adenoviral codificador de forma híbrida e estável 

constitutiva do HIF-1�. A apoptose, a proliferação, a permeabilidade e a 

formação de tubos capilares in vitro pelas células HPAEC foram 

avaliadas após os diferentes tratamentos. Também foram analisadas a 

expressão gênica do VEGF e de seus receptores (VEGFR1 e VEGFR2), 

angiopoietinas (Ang-1, Ang-2 e Ang-4), Tie -2, PLGF e PDGF. Nível 

baixo de expressão dos fatores angiogênicos foi observado nas células 

endoteliais em normóxia. Em contraposição, a hipóxia, DFX e a infecção 

com Ad2/HIF-1�/VP16 estimularam a expressão de mRNA e dos níveis 

de proteína do VEGF, VEGFR1, P1GF, PDGF e Ang-4. Hipóxia e DFX 

também aumentaram os níveis de Ang-2. O tratamento das HPAEC com 

a proteína recombinante Ang-4 foi capaz de proteger as células 

endoteliais contra a apoptose induzida pela ausência de soro fetal bovino 

no meio de cultura, além de aumentar a migração e a formação de 



 52 

capilares pelas células. O vetor adenoviral, assim como a hipóxia, 

também aumentaram a migração e a formação de capilares pelas HPAEC, 

a qual foi significantemente reduzida quando um inibidor dos receptores 

tirosina-kinase das angiopoietinas (Tie-2), foi utilizado. Através dos 

resultados, pode-se sugerir que o HIF-1� media a resposta angiogênica à 

hipóxia pela regulação de múltiplos fatores angiogênicos, especialmente 

do VEGF e do sistema da angiopoetinas. Há evidências de que a ativação 

do sistema angiopoetina/Tie-2 contribui no papel do HIF-1� em 

condições hipóxicas. 

 

  O HIF-1alfa ativa a transcrição de genes codificadores de 

fatores de crescimento pró-angiogênicos, os quais são secretados por 

células hipóxicas e estimulam o processo de angiogênese por células 

endoteliais. Para determinar se o HIF-1� mediaria também resposta 

celular autônoma à hipóxia, Manalo et al. 50 (2005) compararam o perfil 

de expressão gênica em células endoteliais cultivadas em normóxia ou 

hipóxia e, em células em normóxia infectadas com adenovírus 

codificando forma constitutivamente ativa do HIF-1� (AdCA5) ou da 

beta-galactosidase (AdLacZ-grupo controle). A análise da expressão 

gênica induzida pela hipóxia e pelo AdCA5 revelou diversas categorias 

de produtos gênicos como óxido-redutases, colágenos, enzimas 

modificadoras, citocinas, fatores de crescimento, receptores, proteínas 



 53 

sinalizadoras e fatores de transcrição. A expressão dos diferentes genes 

foi aumentada ou reduzida. Grande parte da categoria dos genes com 

expressão reduzida pela hipóxia ou AdCA5 codificou proteínas 

envolvidas com o crescimento e proliferação celular. Por outro lado, os 

genes com expressão aumentada codificaram fatores de crescimento, 

citocinas, receptores e outras proteínas sinalizadoras. Os fatores de 

transcrição do maior grupo de genes regulados pelo HIF-1�, indicaram 

que este fator de transcrição controla uma rede de respostas 

transcricionais à hipóxia em células endoteliais. A infecção das células 

endoteliais com o AdCA5 foi suficiente para induzir aumento da invasão 

da membrana basal e formação de estruturas tubulares semelhantes às 

respostas induzidas pela hipóxia, sugerindo que o HIF-1alfa regula 

ativação autônoma de células endoteliais. 

 

  Greijer et al. 32 (2005) avaliaram genes induzidos pela hipóxia e 

dentre estes, os genes mediados pelo HIF-1 por meio de análises de 

expressão do microarray cDNA. Os genes regulados pela hipóxia foram 

identificados comparando-se fibroblastos wild-type de camundongos em 

normóxia e hipóxia (1% de O2) e diferenças entre duas linhagens de 

fibroblastos (wild-type e HIF-1� -/-) foram analisadas para estudar a 

importância do HIF-1 na regulação gênica em condições hipóxicas. Em 

geral, a hipóxia causou redução da expressão gênica em ambas as linhagens. 



 54 

O fator transcricional HIF-1alfa foi responsável pela regulação de 89% dos 

genes que tiveram sua expressão aumentada e apenas 17% dos genes com 

expressão reduzida. Todas as enzimas glicolíticas sofreram forte aumento na 

expressão durante hipóxia de forma dependente do HIF-1. Adicionalmente, 

vários genes novos regulados pelo HIF-1 foram identificados, incluindo os 

genes envolvidos no metabolismo celular (adenilato kinase 4, 

galactokinase), na apoptose (galectina 3 e gelsolina) e na invasão celular 

(RhoA). Os genes de expressão reduzida pela hipóxia foram aqueles 

envolvidos com a manutenção do citoesqueleto (Rho Kinase), o 

processamento do mRNA (ribonucleoproteína nuclear heterogênea H1 e 

fator de splicing) e com o reparo do DNA (REV 3). De acordo com os dados 

científicos obtidos, os autores sugeriram que o HIF-1 parece ter importância 

no aumento da expressão gênica necessária para suportar o stress causado 

pela hipóxia e subsequentemente, para a sobrevivência celular. 

 

  Dai et al. 17 (2007) examinaram a secreção e a regulação do 

fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) pelo fator de transcrição 

HIF-1alfa em infartamento miocárdico por células-tronco da medula óssea 

(BMSCs). As BMSC foram obtidas de camundongos transgênicos sobre-

expressando proteína verde fluorescente (GFP) e co-cultivadas com 

cardiomiócitos em condições de hipóxia (1% de O2) ou anóxia. As análises 

da liberação de  desidrogenase lática (LDH), do teste de viabilidade celular 



 55 

do MTT (metiltetrazolium), da fragmentação do DNA e da marcaçãoda de 

apoptose por anexiva V foram utilizadas para identificação de danificação 

celular. Os níveis de expressão do HIF-1alfa e do VEGF pelo teste ELISA 

também foram examinados. A expressão de HIF-1alfa e do VEGF nas 

BMSCs foi analisada por meio do PCR quantitativo e imunihistoquímica 

para localização celular. Após 24 horas de hipóxia, houve aumento da 

liberação de LDH e redução da viabilidade celular, o que foi prevenida pela 

co-cultura dos cardiomiócitos com as BMSCs. A secreção do VEGF pelas 

células-tronco foi significantemente aumentada juntamente com a expressão 

do HIF-1alfa após hipóxia e anóxia de forma tempo-dependente. Embora 

não tenha ocorrido aumento dos níveis de mRNA do HIF-1alfa, sua 

concentração proteica foi marcantemente aumentada, juntamente com a 

translocação nuclear. Ao utilizarem inibidor de HIF-1alfa, a proteção dos 

cardiomiócitos pelas BMSCs e a expressão do VEGF foram inibidas. Por 

estes resultados, os autores demonstrarm que as células-tronco de medula 

óssea foram capazes de proteger os cardiomiócitos pelo aumento da 

expressão do VEGF regulada pelo HIF-1alfa. 

 

 Com o objetivo de identificar as moléculas e os mecanismos 

envolvidos com a troca do fenótipo angiogênico durante a progressão 

tumoral,  Fang et al. 21 (2008) desenvolveram um modelo de condrosarcoma 

in vivo. O papel do VEGF e do bFGF e do fator transcricional HIF-1alfa foi 



 56 

examinado nas fases de crescimento avascular e vascular do tumor. Os 

autores observaram aumento significante dos níveis de expressão proteica 

do VEGF em nódulos avasculares do tumor quando comparado aos nódulos 

vasculares. Quando os nódulos avasculares se vascularizaram, houve 

redução da expressão do VEGF. Contrariamente, a concentração de bFGF 

não foi aumentada nos nódulos avasculares, mas foi duas vezes maior nos 

nódulos vasculares. Como a expressão do VEGF foi regulada 

transcripcionalmente pelo HIF-1alfa, análises da imunohistoquímica dos 

nódulos do condrosarcoma revelaram que a translocação nuclear do HIF-

1alfa foi detectada exclusivamente em nódulos do tumor avascular. Estes 

resultados indicaram que o aumento da expressão do VEGF foi mediada 

pelo fator de transcrição HIF-1alfa, o que não ocorreu para o bFGF na troca 

do fenótipo angiogênico durante o desenvolvimento tumoral. 

 

Células pulpares reguladas pela hipóxia 

Amemiya et al. 1 (2003) investigaram a resposta de células 

pulpares durante a hipóxia e a reoxigenação. Tecidos pulpares obtidos de 

trinta e dois pré-molares de cães foram cultivados em meio de cultura �-

MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibiótico. No 

grupo controle, as células foram incubadas em atmosfera umidificada em 

condições normais de oxigênio (20% O2, 5% CO2, 75% N2 a 37oC), 

durante 1-4 dias. Para o grupo da hipóxia, as células pulpares foram 



 57 

mantidas pelo mesmo período em incubadora umidificada com 2% O2 a 

37oC. No grupo da reoxigenação, as células foram primeiramente 

mantidas sobre condições de hipóxia durante 24 horas e em seguida, 

foram transferidas para condições de normóxia por mais 1-3 dias. A 

viabilidade celular (Tryplan Blue), a taxa de metabolismo celular (Teste 

do MTT), a proliferação celular e a atividade da fosfatase alcalina foram 

avaliadas. A expressão de HSP-70 (proteína de choque térmico) e do 

VEGF foi examinada através da análise do Western blot. Para a avaliação 

da expressão do HIF-1� pelas células pulpares foi utilizado a análise do 

RT-PCR. A taxa de crescimento celular e a atividade da fosfatase alcalina 

no grupo das células submetidas a hipóxia foram significantemente mais 

altas do que as do grupo controle. Entretanto, após reoxigenação, a 

proliferação celular e a atividade da fosfatase alcalina reduziram ao nível 

das células do grupo controle, enquanto que houve um aumento da 

expressão das HSP-70. A expressão do mRNA do HIF-1� pelas células 

pulpares foi observada e a expressão do VEGF regulada pelo HIF-1� 

aumentou sob as condições de hipóxia. Os resultados indicaram que as 

células pulpares apresentam resposta dinâmica sob condições de hipóxia 

e de reoxigenação. 

 

 

 



 58 

D. FATORES PRO-ANGIOGÊNICOS  

  Tran-Huang et al. 84 (2008) quantificaram a secreção de fatores 

de crescimento angiogênicos por células pulpares mecanicamente 

danificadas. As células pulpares obtidas de terceiros molares humanos 

foram submetidas ao trauma mecânico realizado com espátula, rompendo a 

monocamada celular. O meio de acondicionamento obtido após contato por 

5 horas, 1, 2 ou 3 dias com as células danificadas ou intactas, foi utilizado 

para quantificação dos fatores de crescimento pelos testes ELISA. As 

células pulpares quando traumatizadas aumentaram significantemente o 

nível de expressão do PDGF-AB, do VEGF e do bFGF, em 150,59%, 20,6% 

e 23,35%, respectivamente. A concentração destes fatores angiogênicos 

aumentou apenas nas primeiras 5 horas após injúria e então, retornou aos 

valores iniciais após 24 horas. Os resultados indicaram que as células 

pulpares secretam fatores de crescimento que apresentam papel fundamental 

na angiogênese. O fator PDGF-AB parece ser o principal responsável pela 

reparação do complexo dentino-pulpar por ter sido mais  secretado por 

células mecanicamente danificadas.  

 

VEGF  

  Senger et al. 73 (1986) examinaram a secreção do fator de 

permeabilidade vascular (VPF), proteína isolada em células tumorais de 

roedores com peso molecular entre 34-42 KDa, por sete linhagens de células 



 59 

tumorais humanas. O teste de permeabilidade de Miles foi utilizado para 

mensurar, quantitativamente, o aumento da permeabilidade vascular em 

cobaias em resposta a injeção intra-dérmica das células tumorais em cultura 

ou, das células associadas a imunoglobulina de coelhos (controle), ou das 

células associadas a IgG de coelhos após injeção intra-dérmica de VPF 

(antígeno). A secreção de VPF foi observada em cinco das sete linhagens de 

células de sarcoma e carcinomas avaliadas. O anticorpo IgG obtido pela 

presença do antígeno VPF neutralizou a permeabilidade vascular em 90% 

nos animais que foram tratados com as linhagens celulares secretoras do 

VPF. Estes resultados suportaram a hipótese de que o fator de 

permeabilidade vascular é responsável por grande parte do aumento da 

permeabilidade vascular e do acúmulo de fluído, que são associados com 

doenças neoplásicas. Desta forma, os autores sugeriram que a expressão 

desta proteína por células tumorais e o conseqüente aumento da 

permeabilidade vascular possa ser fundamental para o crescimento tumoral. 

 

  Ferrara, Henzel 23 (1989) identificaram fator de crescimento de 

células endoteliais vasculares no meio de acondicionamento de células 

foliculares pituitárias de bovinos, o qual foi purificado e homogeneizado. O 

fator de crescimento era uma proteína catiônica, estável ao calor, 

relativamente estável em meio ácido e com peso molecular de 

aproximadamente 45 KDa em condições não redutoras e cerca de 23 KDa 



 60 

em condições redutoras. A proteína purificada apresentou efeito mitogênico 

máximo na concentração de  1-1,2 ng/mL em células endoteliais de capilares 

derivadas do córtex adrenal. A caracterização da bioatividade do fator de 

crescimento revelou que a proteína também apresentou atividade mitogênica 

em células endoteliais vasculares isoladas de outros locais, células epiteliais 

do cristalino ocular, células endoteliais da córnea, fibroblastos BHK-21 ou 

keratinócitos, indicando que a especificidade das células-alvo deste fator de 

crescimento foi diferente de qualquer outro fator de crescimento 

previamente caracterizado. Adicionalmente, a análise da micro-sequência 

molecular relevou uma seqüência única N-amino-terminal da proteína. Com 

base na aparente seletividade das células-alvo, os autores propuseram para a 

proteína caracterizada o nome de fator de crescimento endotelial vascular 

(VEGF). 

 

  Tisher et al. 81 (1991) examinaram e caracterizaram diferentes 

isoformes do VEGF. A secreção de VEGF por células da musculatura lisa 

vascular em cultura foi observada por meio de análises protéicas e do 

Northern blot. Análises de bibliotecas de cDNA destas células pela técnica 

de reação em cadeia da polimerase (PCR) e da clonagem de cDNA 

revelaram três formas diferentes da região codificadora do VEGF, contendo 

189, 165 e 121 aminoácidos no comprimento da cadeia protéica. A 

comparação da seqüência de nucleotídeos do cDNA com seqüências 



 61 

derivadas de clone genômico do VEGF humano indicou que o gene VEGF é 

dividido em oito éxons (unidade codificadora do DNA) e que as diversas 

formas da região codificadora do VEGF são provenientes deste gene 

submetido a splicing alternativos (ausência de um ou mais éxons). Os 

resultados indicaram que os diferentes isoformes do VEGF podem 

determinar diferentes propriedades e funções. 

 

  Peters et al. 63 (1993) investigaram a expressão do fms-receptor 

tirosina kinase (flt-VEGFR1), receptor para o fator de crescimento endotelial 

vascular (VEGF), em órgãos de camundongos adultos, em embriões e em 

feridas de pele de camundongos. A análise de hibridização in situ 

demonstrou a expressão do VEGF no endotélio de tecidos de camundongos 

adultos, sugerindo que o receptor flt possa mediar às respostas endoteliais ao 

VEGF in vivo. A expressão do receptor flt em estruturas embrionárias de 

onde as células endoteliais são diferenciadas e no endotélio de vasos 

embrionários em desenvolvimento indicaram que o VEGF apresenta efeitos 

na diferenciação endotelial e no crescimento vascular embrionário. 

Adicionalmente, a expressão do receptor flt no endotélio de tecidos adultos 

sugeriu papel do VEGF na regulação da permeabilidade vascular e no reparo 

e manutenção vascular. 

 



 62 

   Gerber et al. 28 (1998) examinaram o papel do VEGF em 

prevenir a apoptose em células primárias endoteliais da veia umbilical 

humana (HUVEC). As células HUVEC foram tratadas ou não com VEGF e 

submetidas ou não a ausência de soro fetal bovino (FBS). A análise do RT-

PCR em tempo real (qRT-PCR) foi utilizada para determinar a expressão de 

genes envolvidos em atividades anti-apoptóticas como Bcl-2, A1, Bcl-XL 

ou genes indutores da apoptose como o Bax, pela células HUVEC. O VEGF 

foi capaz de prevenir apoptose induzida pela ausência de FBS nas 

concentrações de 10 a 100 ng/mL. A adição de VEGF (100 ng/mL) na 

cultura das células HUVEC sem FBS levou a indução de 5,2 vezes e de 2,4 

vezes da expressão de Bcl-2 após 36 horas de incubação e de A1 após 7 

horas de incubação, respectivamente. Os autores encontraram correlação 

direta entre os níveis de mRNA e de proteína dos genes Bcl-2 e A1 nas 

células HUVEC em resposta a estimulação do VEGF. Estes resultados 

indicaram que o VEGF exerce sua atividade de estimulação dos genes anti-

apoptóticos, Bcl-2 e A1 primariamente a nível transcricional. 

Adicionalmente, a sobre-expressão de Bcl-2 através de experimentos de 

transfecção das células endoteliais foi suficiente para prevenir a morte 

celular por apoptose na ausência de VEGF, indicando a importância do gene 

Bcl-2 em mediar a atividade de sobrevivência das células endoteliais pelo 

VEGF. 

 



 63 

 FGF 

  Schweigerer et al. 70 (1987) examinaram a expressão do gene 

do fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), mRNA e proteína, em 

células endoteliais de capilares do cérebro ou do córtex adrenal de bovinos. 

Os resultados demonstraram que o fator bFGF foi expresso pelas células 

endoteliais e secretado para o meio extracelular e o gene foi capaz de 

estimular a proliferação das células endoteliais capilares. Os autores 

concluíram que o bFGF poderia agir como fator de crescimento auto-

estimulador para células endoteliais capilares e possivelmente a formação de 

novos capilares seria induzida pelas próprias células endoteliais dos 

capilares pré-existentes. 

 

  Moscatelli et al. 53 (1988) isolaram um fator angiogênico da 

placenta humana e células de hepatoma humano. Este fator foi capaz de 

estimular a produção de protease em cultura de células endoteliais capilares 

e quando purificado também estimulou a síntese de DNA, a migração das 

células e induziu a angiogênese in vivo. Dados da seqüência de aminoácidos 

revelaram que o fator analisado correspondia ao fator de crescimento 

fibroblástico básico (bFGF). Os bFGFs que foram isolados de diferentes 

tecidos e seqüenciados, mostraram variabilidade no N-terminal. Os autores 

sugeriram que estas diferenças estruturais poderiam ocorrer em função de 

processos naturais ou geradas pela liberação de proteases durante o processo 



 64 

de isolamento do fator angiogênico. Um isoforme do bFGF , Mr 25.000 

(25KDa), foi isolado e apresentou as mesmas atividades biológicas e a 

mesma afinidade pelo receptor do bFGF que a forma típica, Mr 18.000 

(18KDa). A conversão do bFGF de 25KDa em bFGF de 18KDa ocorreu 

pelo tratamento com baixas concentrações de tripsina, sugerindo que esta 

forma poderia ser precursora do bFGF Mr 18.000.  

 

  Gualandris et al. 35 (1996) investigaram as conseqüências 

biológicas da ativação de células endoteliais pelo fator de crescimento 

fibroblástico básico (bFGF) endógeno em linhagem de células endoteliais da 

aorta de camundongos que foram transfectadas com vetor de expressão 

retroviral infectado com cDNA de bFGF (pZipbFGF). Os resultados 

mostraram que os transfectantes expressando alta concentração de bFGF in 

vitro apresentaram comportamento invasivo e formação de tubos capilares 

(sprouts) sobre géis de fibrina tri-dimensionais e formaram rede complexa 

de estruturas semelhantes a cordas em conexão com células infiltradas 

quando cultivados sobre matriz de matrigel. O comportamento 

morfogenético e invasivo das células transfectadas foi prevenido pelo uso de 

anticorpo anti-bFGF, revelando padrão autócrino do processo. As 

conseqüências biológicas desta ativação autócrina foram examinadas in 

vivo. As células endoteliais sobre-expressando o fator bFGF estimularam a 

formação de lesões altamente vascularizadas semelhantes ao sarcoma de 



 65 

Kaposi quando injetadas em camundongos e induziram angiogênese em 

córneas avascularizadas de coelhos. Quando injetadas no saco alantóide de 

embrião de galinhas, as células transfectadas causaram aumento na 

densidade vascular e formação de hemangiomas nas membranas cório-

alantóideas. De acordo com os resultados, os autores concluíram que as 

células endoteliais codificadoras de bFGF ao ativarem um programa 

autócrino in vitro, afetam a proliferação celular, o comportamento invasivo e 

o potencial morfogênico, além de adquirir fenótipo angiogênico e recrutar o 

endotélio quiescente, originando lesões auto-proliferativas in vivo. 

 

  Shi et al. 74 (2007) examinaram o efeito do fator de crescimento 

fibroblástico básico (bFGF) na indução hipóxica da expressão do fator de 

crescimento endotelial vascular (VEGF) por células de câncer de mama 

humano e investigaram os possíveis mecanismos envolvidos. A hipóxia (1% 

O2) induziu a expressão de HIF-1alfa (fator de transcrição induzido pela 

hipóxia), a transatividade de HIF-1 e a secreção de VEGF, enquanto que o 

fator bFGF (10ng/mL) potencializou estas induções hipóxicas. O 

mecanismo do PI3K/Akt foi requerido para estes processos como 

demonstrado pela aplicação de um inibidor de PI3Kinase. Por outro lado, 

embora o fator bFGF tenha ativado o mecanismo MEK1/ERK em condições 

de hipóxia, apenas a transativação de HIF-1 foi regulada por este 

mecanismo, sendo que a expressão do HIF-1alfa e a secreção do fator VEGF 



 66 

não foram afetadas. Os autores concluíram que o fator angiogênico bFGF 

cooperou com a indução da secreção do VEGF em condições hipóxicas, 

principalmente pelo mecanismo PI3K e parcialmente pela atividade do   

HIF-1 

 

E. ANGIOGÊNESE 

  Nicosia et al. 55 (1994) avaliaram a resposta angiogênica in 

vitro de diversos fatores de crescimento, utilizando o modelo de anéis de 

aortas de ratos com 2 a 3 meses de idade. Estes anéis foram embebidos em 

géis de colágeno com ausência de soro fetal bovino, na presença ou ausência 

dos fatores de crescimento (concentrações de 0,1 a 50 ng/mL), fator de 

crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivados das 

plaquetas natural (PDGF) e recombinantes (PDGF-AA, PDGF-BB), fator de 

crescimento semelhante a insulina-1 (IGF-1), fator de crescimento de 

transformação-� (TGF-�), fator de crescimento de transformação-�1 (TGF-

�1), fator de crescimento epidérmico (EGF), interleucina-1� (IL-1�) ou 

fator de crescimento de hepatocitos (HGF). A resposta angiogênica da aorta 

de ratos foi estimulada pelo VEGF, PDGF, PDGF-AA, PDGF-BB e IGF-1, 

sendo os efeitos indutores máximos obtidos pelo VEGF e PDGF-BB. 

Contrariamente, TGF-�1 e IL-1� apresentaram atividade inibitória. Os 

fatores de crescimento TGF-�, EGF e HGF não apresentaram efeitos 

significantes. O crescimento vascular das culturas estimuladas pelo VEGF 



 67 

foi primariamente composto por microvasos, enquanto que nas culturas 

estimuladas pelo PDGF- e IGF-1, houve aumento do número de células 

semelhantes aos fibroblastos. A incapacidade dos fatores TGF-�, EGF, HGF 

TGF-�1 e IL-1� de estimularem angiogênese em aorta de ratos parece ter 

ocorrido pelo fato destes fatores requererem atividade mediada por células 

acessórias que não estão presentes no modelo de aorta de ratos ou pela 

heterogeneidade de vasos sanguíneos na capacidade de respostas a 

diferentes fatores de crescimento.  

 

  Para estudar a diferenciação de células endoteliais em 

estruturas vasculares, Kanda et al. 44 (1996) isolaram uma linhagem de 

células endoteliais capilares de cérebro de camundongos transgênicos. Estas 

células mostraram caracteres específicos das células endoteliais, como a 

expressão do fator de von Willebrand (Fator VIII), a presença de sites de 

ligação para lectina BS-1 e receptores para Ac-LDL. Os efeitos de vários 

fatores de crescimento nas respostas celulares foram avaliados. Alguns 

fatores falharam na indução de respostas biológicas como o fator de 

crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento endotelial vascular 

(VEGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA). Por 

outro lado, os fatores PDGF-BB, fator de crescimento epidérmico (EGF) e 

os fatores de crescimento fibroblásticos ácidos (aFGF) e básicos (bFGF) 

estimularam a proliferação celular. A diferenciação das células endoteliais 



 68 

em estruturas semelhantes a tubos capilares, em géis de colágeno 

tridimensionais, ocorreu apenas na presença dos fatores aFGF e bFGF. Os 

fatores de crescimento também foram analisados quanto à indução do 

ativador de plasminogênio (PA-atividade de proteases) e migração celular. 

Receptores funcionais para os diferentes fatores de crescimento foram 

testados nas células endoteliais, as quais expressaram apenas os receptores 

EGFR, PDGFR-�, FGFR-1 e c-met/HGFR. Para identificar os receptores 

capazes de transduzir as respostas biológicas induzidas pelo bFGF, um 

receptor quimérico, composto pelo domínio extracelular e transmembrana 

do receptor do PDGF-� e o domínio intracelular do FGFR-1, foi construído 

e transfectado nas células endoteliais. As células transfectadas responderam 

ao tratamento com PDGF-AA, indução da atividade de proteases, migração, 

proliferação e formação de estruturas vasculares em colágeno. Estes 

resultados indicaram que o FGFR-1 respondeu ao mecanismo de transdução 

de sinal, levando a diferenciação das células endoteliais.  

 

  Durante uma revisão da literatura, Risau 68 (1997) discutiu 

os mecanismos do processo da angiogênese. O plexo vascular inicial é 

derivado da mesoderme pela diferenciação de angioblastos, células 

endoteliais que ainda não se diferenciaram formando um lúmen, células 

pelas quais geram vasos sanguíneos primitivos. Fatores indutores da 

mesoderme da família dos fatores de crescimento fibroblásticos (FGF) 



 69 

são fundamentais para a formação dos angioblastos e das células 

hematopoiéticas. O VEGF parece ser necessário para manter a 

diferenciação dos angioblastos por meio de mecanismo parócrino. Após o 

embrião ter formado este plexo vascular primário, processo conhecido 

como vasculogênese, vasos sanguíneos são gerados por dois processos 

diferentes de angiogênese, formação de tubos capilares de longa extensão 

(sprouting) e pelo processo de divisão de vasos pré-existentes por pilares 

trans-capilares ou matriz extracelular (no-sprouting). Assim, os vasos 

sanguíneos passam a ser progressivamente remodelados em um sistema 

circulatório adulto funcional. Em ambos os processos de vascularização, 

vasculogênese e angiogênese, mais estudos são necessários para elucidar 

os diferentes mecanismos moleculares envolvidos, além do papel de 

fatores de crescimento angiogênicos. 

 

  Benjamin et al. 9 (1998) examinaram a remodelação do 

plexo endotelial inicial em uma rede vascular madura e funcional, 

observando a remodelação da vasculatura da retina pós-natal de ratos. Os 

autores mostraram a importância do recrutamento de pericitos, células de 

arteríolas positivas para a proteína actina de músculo liso-� e, do 

recobrimento do plexo primário de células endoteliais pré-organizadas. O 

período anterior a migração dos pericitos definido como estágio de 

transição da imaturidade vascular, mostrou-se essencial para a 



 70 

plasticidade da rede vascular, determinando o desenvolvimento da 

vasculatura de acordo com a necessidade nutricional da retina. A 

remodelação da vasculatura demonstrou representar uma resposta de 

feedback a alterações do nível de oxigênio disponível no tecido, 

indicando que o processo vascular representaria um ajuste ao suprimento 

de oxigênio. Desta forma, os resultados indicaram que os pericitos 

influenciaram a maturação e a remodelação dos vasos da retina, não 

apresentando papel na formação inicial dos vasos sanguíneos. Para 

fundamentar que a associação da rede vascular com os pericitos 

estabilizaria a vasculatura, estas associações foram rompidas pela injeção 

de PDGF-BB que separou os receptores do PDGF-� dos vasos recém-

recobertos pelos pericitos, resultando em regressão excessiva da rede 

vascular e remodelação anormal. Em contraposição, a injeção intraocular 

de VEGF acelerou a cobertura do plexo endothelial recém-formado pelos 

pericitos, revelando nova função deste fator de crescimento, além da 

proliferação e migração de células endoteliais e, manutenção da 

viabilidade de vasos sanguíneos imaturos. 

 

  Para definir os mecanismos pelos quais o VEGF promove a 

angiogênese e a significância do aumento da sobrevivência das células 

endoteliais neste processo, Nör et al. 58 (1999) examinaram os efeitos do 

VEGF na expressão de diversos membros da família Bcl-2 durante o 



 71 

desenvolvimento de respostas angiogênicas in vitro e in vivo. Quando o 

VEGF foi adicionado à cultura de células endoteliais microvasculares 

dérmica humanas (HDMECs), implantadas em géis de colágeno tipo I, 

houve redução de 75% na proporção de células apoptóticas, dados 

observados pelas análises de fluxo e de fragmentação do DNA e, pelo 

teste de coloração de TUNEL. O aumento da sobrevivência das HDMECs 

foi associado ao aumento da expressão do Bcl-2 de forma dose-

dependente e com a redução da expressão da enzima, cisteína protease 

caspase-3. Culturas de HDMECs transduzidas com Bcl-2 e com ausência 

de fatores de crescimento mostraram proteção contra a apoptose e 

aumentaram duas vezes o número de sprouts. Células HDMEC sobre-

expressando Bcl-2 foram incorporadas às matrizes de ácido poli-L-lático 

(PLLA) e em seguida, implantadas em camundongos imunodeprimidos. 

Um aumento de cinco vezes no número de microvasos e a redução de 

quatro vezes do número de células apoptóticas foram observados nos dias 

7 e 14 após os implantes. Estes resultados indicaram que a atividade 

mitogênica do VEGF deve ser atribuída em parte pela habilidade de 

aumentar a sobrevivência de células endoteliais pela indução da 

expressão de Bcl-2. 

 

  Nör et al. 59 (2001) caracterizaram o desenvolvimento de um 

modelo novo para angiogênese humana fisiológica e patológica em 



 72 

camundongos imunodeficientes (SCID). Matrizes altamente porosas de 

ácido poli-L-lático (PLLA) utilizadas como arcabouços para células 

endoteliais microvasculares dérminas humanas (HDMEC) foram 

implantadas bilateralmente no tecido subcutâneo do dorso de 

camundongos SCID. As células HDMEC se diferenciaram em 

microvasos humanos funcionais, que sofreram anastomoses com a 

vaculatura dos animais. Para confirmar a origem humana dos microvasos, 

as células HDMECs foram transduzidas com epítopos Flag ou com 

fosfatase alcalina. No dia seguinte ao transplante, as células endoteliais 

apareceram dispersas nas esponjas, enquanto que por volta do quinto dia, 

tornaram se organizadas em estruturas tubulares vazias e se diferenciaram 

em microvasos funcionais após 7 a 10 dias.  Os microvasos humanos nos 

camundongos SCID expressaram marcadores fisiológicos da 

angiogênese, CD31, CD34, molécula de adesão celular vascular 1 

(VCAM-1) e molécula de adesão inter-celular 1 (ICAM1). As células 

HDMEC foram revestidas por células de camundongos expressando 

moléculas de �-actina de músculo liso perivascular após 21 dias do 

transplante. O modelo de angiogênese humana utilizando camundongos 

imunodeprimidos foi proposto para o estudo do desenvolvimento de 

vasculatura fisiológica e de respostas de neovascularização patológica 

como em angiogênese tumoral e para o desenvolvimento e investigação 



 73 

de estratégias delineadas para potencializar a neovascularização na 

engenharia de tecidos e órgãos humanos.  

 

  Haspel et al. 37 (2002) examinaram o papel da atividade de 

receptores tirosina-kinase associados ao VEGF (VEGF RTK) na 

angiogênese in vitro. Células endoteliais microvasculares cardíacas 

derivadas de camundongos foram embebidas em matriz de colágeno tipo I e 

avaliadas quanto a agregação e organização em núcleos esferóides e 

formação de estruturas tubulares (sprouting), utilizando o inibidor tirosina-

kinase, SU5416, que demonstrou previamente inibir a atividade do sistema 

VEGF RTK e a angiogênese in vivo. A formação de esferóides e sprouts foi 

observada pelas células endoteliais entretanto, o SU5416 inibiu cerca de 

50% da síntese de DNA basal e de DNA estimulado pelo VEGF nas culturas 

de células em monocamadas. O inibidor não interferiu na agregação, nem na 

organização esferóide das células, mas eliminou completamente a formação 

espontânea de tubos capilares e a formação estimulada pelo VEGF. Estes 

resultados indicaram que a organização e a diferenciação das sélulas 

endoteliais são independentes da sinalização pelos receptores tirosina-kinase 

associados ao VEGF. Contrariamente, a atividade do sistema VEGF RTK 

mostrou ser essencial para a formação de estruturas capilares pelas células 

endoteliais cardíacas de camundongos. 

 



 74 

  Yamamoto et al. 93 (2003) analisaram os efeitos do stress de 

deformação na atividade mitogênica de células progenitoras endoteliais 

derivadas da medula óssea (EPCs). Quando as EPCs foram submetidas ao 

stress gerado pelo fluxo sanguíneo ou pelo fluxo de fluído tissular 

(aparato de rotação que induz movimento do meio de cultura em círculos 

concêntricos) exibiram alterações morfológicas, as células se alongaram e 

se orientaram em direção ao fluxo. A densidade das EPCs expostas ao 

stress foi maior e as análises da citometria de fluxo mostraram que grande 

parte das células estavam na fase G2-M do ciclo celular, quando 

comparadas com as células cultivadas em condições normais, indicando a 

estimulação da proliferação celular. O stress aumentou intensamente a 

expressão pelas células EPCs de dois receptores do fator de crescimento 

endotelial vascular, KDR (VEGFR2-kinase insert domain-containing 

receptor) e Flt-1 (VEGFR1-fms-like tyrosine kinase-1) e moléculas de 

adesão intercelular, VE-cadherin (caderina vascular endotelial), em 

ambos os níveis, proteína e mRNA. Análises para formação de tubos 

foram realizadas, cultivando as EPCs submetidas ao stress de deformação 

sobre gel de colágeno tipo I. As EPCs pós-stress formaram estruturas 

semelhantes a tubos capilares e desenvolveram extensa rede tubular mais 

rápida do que as células em condições normais. Os autores sugeriram de 

acordo com os resultados que as células progenitoras endoteliais 



 75 

derivadas da medula óssea são sensíveis ao stress de deformação, o qual e 

capaz de modular as atividades vasculogênicas das mesmas. 

 

  Oishi et al. 61 (2004) investigaram o potencial de 

desenvolvimento de células-tronco neurais (NSCs) como células 

progenitoras vasculares. As células NSCs foram isoladas do córtex de 

camundongos no período embrionário e cultivadas em meio de cultura 

livre de soro fetal bovino (FBS), na presença de fator de crescimento 

fibroblástico básico (bFGF), para formação de neuroesferas. Estas foram 

dissociadas mecanicamente em suspensões de células-únicas que se 

diferenciaram em células neurais após cultivo em meio sem bFGF. As 

células dferenciadas foram inoculadas em géis de colágeno com 10% de 

FBS e bFGF e então, incubadas por 10 dias. Houve formação de 

estruturas tubulares semelhantes a vasos sanguíneos compostas por 

células imuno-reativas aos marcadores fenotípicos endoteliais, PECAM-1 

e VE-caderina, processo de angiogênese idêntico ao desenvolvimento 

vascular cerebral in vivo. A análise do RT-PCR mostrou que as células 

NSCs foram capazes de expressar marcadores endoteliais como o 

PECAM-1, VE-caderina e Flk-1 (VEGFR2), além de desenvolverem 

morfologia das células endoteliais, comprovando a diferenciação celular. 

A formação de estruturas tubulares também foi observada quando as 

células endoteliais diferenciadas foram implantadas em gel de colágeno e 



 76 

incubadas por 5 dias. Estes resultados sugeriram que as NSCs podem se 

diferenciar in vitro em dois tipos de células vasculares, células endoteliais 

e murais, as quais são capazes de formar tubos vasculares. 

 

  McCloskey et al. 52 (2005) testaram a capacidade de uma 

população proliferativa de células endoteliais purificadas e isoladas de 

células-tronco embrionárias de camundongos, em formar estruturas 

vasculares tri-dimensionais in vitro. As células endoteliais derivadas das 

células-tronco foram embebidas em gel de colágeno tipo I (106 células/mL 

de gel). Os géis foram observados diariamente por meio de microscópio de 

contraste de fase para avaliar o tempo para a organização das células 

endoteliais. Os primeiros vasos foram observados entre os dias 3 e 5 após a 

construção do gel e após este período, foi observado aumento do número e 

da complexidade das estruturas, atingindo um número máximo, antes de 

começarem a regredir. Por volta da segunda semana, todos as estruturas 

vasculares tinham regredido a células unitárias. Imagens da histologia e do 

teste de fluorescência das estruturas vasculares mostraram que as estruturas 

tubulares eram multi-celulares e foram capazes de desenvolver lúmens intra 

e inter-celulares. Os autores mostraram que as células entoteliais derivadas 

das células embrionárias, purificadas e expandidas in vitro, apresentaram 

habilidade de suportar a vasculogênese em gel de colágeno, indicando que 

estas células poderiam ser úteis em aplicações médicas de regeneração. 



 77 

  Goldstein et al. 30 (2005) examinaram o efeito de culturas 

primárias de fibroblastos dérmicos humanos no processo de angiogênese em 

células de melanoma. Os autores testaram a capacidade de 12 linhagens de 

melanoma para induzir a invasão e migração de células endoteliais 

microvasculares dérmicas humanas (HMVECs) em gel de colágeno tipo I e 

de formar rede capilar. Geis de colágeno tri-dimensionais sobre 

monocamadas de células HMVEC foram embebidos com células de 

melanoma, fibroblastos ou uma combinação de ambas as linhagens. Após 5 

dias, os géis foram removidos, fixados e submetidos a análise de 

imunofluorescência para o Fator von Willebrand. A influência de fatores 

solúveis na invasão/migração de células HMVEC no colágeno foi avaliada 

através do tratamento do colágeno sobre as monocamadas de HMVECs com 

os meios de acondicionamento derivados de culturas de células de 

melanoma, de fibroblastos ou da combinação das duas linhagens celulares. 

A expressão de vinte fatores de crescimento angiogênicos diferentes 

também foi analisada. A associação das células de melanoma com os 

fibroblastos aumentou significantemente as respostas angiogênicas das 

células HMVEC. Os meios de acondicionamento das células de melanoma 

ou das células de melanoma associadas a fibroblastos reduziram a 

invasão/migração das HMVECs no colágeno quando comparados ao meio 

de acondicionamento apenas dos fibroblastos. Nas culturas onde as células 

de melanoma foram associadas aos fibroblastos, interleucina 8 (IL8), 



 78 

proteína quimiotáxica de monócitos-1 (MCP-1) e o inibidor tecidual de 

metaloproteínase-2 (TIMP-2) foram identificados nos meios de cultura em 

concentrações significantemente superiores quando comparadas com as 

culturas de tipos celulares separados. Os autores demonstraram pela 

primeira vez que a angiogênese em melanomas em colágeno foi mais 

fortemente influenciada por fibroblastos derivados de pele normal do que 

pelos diferentes tipos de melanoma.   

 

  Koch et al. 47 (2006) investigaram a possibilidade de aumentar 

as propriedades angiogênicas de matrizes de colágeno pela incorporação 

covalente do VEGF. O VEGF foi incorporado ao colágeno através do cross-

linker SS-PEG-SS, formando um conjugado. A atividade biológica do 

conjugado foi investigada pela exposição de células endoteliais umbilicais 

(HUVECs) ao VEGF misturado ou ao VEGF conjugado ao cross-linker. O 

conjugado apresentou efeito limitado na atividade mitogênica do VEGF. A 

reação cross-linking foi aplicad