UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL MICROPROPAGAÇÃO E USO DE MARCADORES MOLECULARES NA DETERMINAÇÃO DO SEXO DO MAMOEIRO Humberto Actis Zaidan Engenheiro Agrônomo Jaboticabal - São Paulo - Brasil 2002 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL MICROPROPAGAÇÃO E USO DE MARCADORES MOLECULARES NA DETERMINAÇÃO DO SEXO DO MAMOEIRO Humberto Actis Zaidan Orientadora: Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias do Câmpus de Jaboticabal - UNESP, para obtenção do Título de Doutor em Agronomia - Área de Concentração em Genética e Melhoramento de Plantas. Jaboticabal - SP Julho - 2002 Zaidan, Humberto Actis Z21m Micropropagação e uso de marcadores moleculares na determinação do sexo do mamoeiro / Humberto Actis Zaidan. – – Jaboticabal, 2002 xii, 154 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2002 Orientadora: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Banca examinadora: Carlos Ruggiero, Maria Helena de Souza Goldman, Luiz de Souza Corrêa, Walter José Siqueira Bibliografia 1. Micropropagação-mamoeiro. 2. Marcadores moleculares-sexo. 3. Carica papaya L.-sexo. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 575:634.651 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação. E-mail: hzaidan@hotmail.com DADOS CURRICULARES DO AUTOR HUMBERTO ACTIS ZAIDAN - nascido em 15 de julho de 1969, no município de Ilhéus, Estado da Bahia, é Engenheiro Agrônomo formado pela Escola de Agronomia da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Câmpus de Cruz das Almas, em abril de 1993. Em fevereiro de 1998, obteve título de Mestre em Ciências, Área de Concentração em Fisiologia e Bioquímica de Plantas pela Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" (ESALQ), da Universidade de São Paulo (USP), Câmpus de Piracicaba. iv O amor é paciente, é benigno. O amor não inveja, não se vangloria, não se ensoberbece. Não se porta inconvenientemente, não busca os seus próprios interesses, não se irrita, não suspeita mal. O amor não se alegra com a injustiça, mas se regozija com a verdade. Tudo sofre, tudo crê, tudo espera, tudo suporta. O amor nunca falha. Mas havendo profecias, cessarão; havendo línguas, desaparecerão; havendo ciência, passará. Agora permanecem estes três: a fé, a esperança, e o amor, mas o maior destes é o amor. (1 Coríntios 13:4-8,13) v A Deus, Aos meus pais Alvaro Zaidan e Lícia Ma Actis Zaidan, Aos meus irmãos Virgínia e Ricardo, E à minha amiga Maria Helena Gerbasi, Por terem me dado forças para seguir em frente. DEDICO vi AGRADECIMENTOS A Deus, pelo privilégio da vida. Aos meus pais e irmãos, por terem acreditado nos meus potenciais. À Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, pela orientação, e pela confiança em mim depositada. À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), por ter concedido a bolsa de doutorado, possibilitando o desenvolvimento desta Tese (Processo 98/14735-0). Aos Profs. Drs. Carlos Ferreira Damião Filho, Janete Apparecida Desidério Sena, Jesus Aparecido Ferro, e João Carlos de Oliveira, pelas importantes sugestões no Exame de Qualificação, as quais contribuíram para o aperfeiçoamento deste trabalho. Aos professores da FCAV - UNESP, e da USP de Ribeirão Preto, com quem tive aulas, tendo aprimorado meu aprendizado. A todos do Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, onde pude crescer pessoal e profissionalmente. Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. vii SUMÁRIO Página RESUMO............................................................................................................ ix ABSTRACT........................................................................................................ xi 1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................... 4 2.1. Genética e melhoramento do mamoeiro.............................................. 4 2.2. Cultivo in vitro........................................................................................ 22 2.3. Aclimatação em casa de vegetação das plantas cultivadas in vitro. 28 2.4. Plantio no campo das plantas aclimatadas em casa de vegetação 32 2.5. Determinação sexual............................................................................. 33 2.6. Marcadores moleculares....................................................................... 39 2.6.1. RAPD............................................................................................... 41 2.6.2. SCAR............................................................................................... 48 2.6.3. fAFLP............................................................................................... 49 3. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 54 3.1. Cultivo no campo.................................................................................. 54 3.2. Cultivo in vitro........................................................................................ 58 3.2.1 Análise estatística dos experimentos de enraizamento.............. 68 3.3. Aclimatação em casa de vegetação das plantas cultivadas in vitro. 69 3.4. Plantio no campo das plantas aclimatadas em casa de vegetação 70 3.5. Marcadores moleculares....................................................................... 71 3.5.1. Extração de DNA............................................................................ 71 3.5.2. RAPD............................................................................................... 74 3.5.3. SCAR............................................................................................... 75 3.5.4. fAFLP............................................................................................... 78 viii 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................... 86 4.1. Cultivo no campo.................................................................................. 86 4.2. Cultivo in vitro........................................................................................ 94 4.3. Aclimatação em casa de vegetação das plantas cultivadas in vitro. 117 4.4. Plantio no campo das plantas aclimatadas em casa de vegetação 119 4.5. Marcadores moleculares....................................................................... 123 4.5.1. RAPD............................................................................................... 123 4.5.2. SCAR............................................................................................... 125 4.5.3. fAFLP............................................................................................... 129 5. CONCLUSÕES.............................................................................................. 136 6. REFERÊNCIAS.............................................................................................. 137 ix MICROPROPAGAÇÃO E USO DE MARCADORES MOLECULARES NA DETERMINAÇÃO DO SEXO DO MAMOEIRO RESUMO - O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma planta normalmente propagada por sementes. Um dos seus principais cultivares é o Sunrise Solo, que em plantios comerciais, apresenta plantas hermafroditas e femininas em proporção 2:1, sendo que o sexo dessas plantas só pode ser identificado de 3 a 4 meses após o plantio, quando surgem os primeiros botões florais. Por outro lado, o cv. Cariflora, que é dióico, apresenta plantas masculinas e femininas, em proporção 1:1, e tem a vantagem de ser tolerante ao vírus do mosaico do mamoeiro. Um dos objetivos deste trabalho, foi desenvolver um protocolo de micropropagação, a partir de plantas matrizes do cv. Sunrise Solo que apresentassem características desejáveis como sexo hermafrodita bem definido. A imersão dos explantes em solução contendo rifampicina (300 mg.L-1), foi imprescindível para a obtenção de ápices caulinares provenientes do campo livres de contaminação por bactérias endógenas. Carvão ativado (1 g.L-1) inibiu totalmente o enraizamento in vitro do mamoeiro e proporcionou um maior desenvolvimento da parte aérea, em comparação com os meios sem carvão. O maior número de plântulas com rizogênese foi obtido com o uso de 0,8 mg.L-1 de AIB (Ácido 3-Indolbutírico), em meio MS (Murashige e Skoog) modificado, contendo a metade da concentração dos macronutrientes. Os mamoeiros clonados, crescendo em condições de campo, apresentaram características morfológicas e sexo das flores compatíveis com as plantas matrizes que as originaram, e apresentaram menor altura de inserção de flores no caule, quando comparados às plantas matrizes. Foram encontrados marcadores moleculares RAPD (DNA polimórfico amplificado ao acaso), SCAR (Região amplificada de sequência caracterizada) e fAFLP (Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados, com marcação fluorescente) capazes de identificar precocemente o sexo das mudas propagadas por sementes. O marcador RAPD UBC210438 mostrou-se eficiente na determinação precoce do sexo das plantas clonadas e da progênie S1 do cv. Sunrise Solo, e também mostrou-se eficiente na diferenciação x dos sexos masculino e feminino das plantas do cv. Cariflora. O primer SCAR foi eficiente em diferenciar precocemente o sexo entre plantas hermafroditas e femininas do cv. Sunrise Solo. O primer fAFLP AAG-CAT (Joe) foi eficiente em diferenciar os sexos das plantas nos cultivares Sunrise Solo e Cariflora, através de uma banda de 155,3 pb presente apenas nas plantas hermafroditas e masculinas, e ausente nas plantas femininas de ambos os cultivares. Este primer fAFLP também conseguiu diferenciar os cultivares Sunrise Solo e Cariflora, independentemente do sexo das plantas, apresentando uma banda de 256,9 pb exclusiva ao cv. Sunrise Solo, e uma banda de 345,39 pb exclusiva ao cv. Cariflora. Palavras-Chave: Carica papaya L., cultura de tecidos, fAFLP, identificação sexual, RAPD, SCAR xi MICROPROPAGATION AND MOLECULAR MARKERS FOR SEX DETERMINATION IN PAPAYA ABSTRACT - Papaya (Carica papaya L.) is usually propagated from seeds. One of the principal papaya cultivars is Sunrise Solo, which when planted commercially presents hermaphrodite and feminine plants at a ratio of 2:1, although these plants can only be sexed three or four months after planting, when the first floral buds emerge. The cultivar Cariflora is dioecious, presenting equal numbers of male and female plants, and is tolerant to the papaya ringspot virus (PRV). One of the objectives of the work presented in this thesis was to develop a micropropagation protocol for cv Sunrise Solo plants presenting desirable characteristics such as well-defined hermaphrodism. To produce shoot apices free from endogenous bacterial contamination the explants collected in the field were immersed in a solution containing 300 mg.L-1 rifampicin. Activated carbon added to the culture medium at 1 g.L-1 totally inhibited in vitro rooting and allowed greater development of the aerial parts of the plantlets than that which occurred on culture medium without activated carbon. The greatest number of plants with rhizogenesis was obtained in modified MS (Murashige and Skoog) medium containing half- strength of macronutrients supplemented with 0.8 mg.L-1 IBA (Indole-3-butyric acid). When grown in the field, the cloned papaya presented morphological and sexual characteristics typical of the plants from which they had been obtained. Random amplified polymorphic DNA (RAPD), Sequence Characterized Amplified Region (SCAR), and fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism (fAFLP) markers were found which were capable of the early sexing of seedlings. The UBC210438 RAPD marker was efficient at precociously sexing both cloned plants and the S1 progeny of cv. Sunrise Solo, as well as differentiating between male and female plants of cv Cariflora. The SCAR primer was able to distinguishing between hermaphrodite and female plants of cv Sunrise Solo at an early stage in the development of seedlings and cloned plants. The fAFLP primer AAG-CAT (Joe) was efficient at detecting the sex of plants of cv Sunrise Solo and Cariflora, based on a 155.3 bp band which was present only in hermaphrodite and xii male plants but absent from female plants of both cultivars. This primer was also efficient at differentiating between cultivars Sunrise Solo and Cariflora independently of the sex of the plants, a 256.9 bp band being exclusively present in cv Sunrise Solo and a 345.39 bp band in cv Cariflora. Keywords: Carica papaya L., tissue culture, fAFLP, sex identification, RAPD, SCAR 1 1. INTRODUÇÃO O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma planta cujo fruto tem grande importância econômica, alimentícia e social, sendo cultivado principalmente nos países tropicais, e possui ótima aceitação no mercado internacional. De acordo com a FAO (2001) a sua produção mundial no ano de 1999 foi ao redor de 5,3 milhões de toneladas, sendo o Brasil atualmente o maior produtor do mundo, chegando a produzir no mesmo ano cerca de 1,7 milhões de toneladas, o que representa cerca de 31% da produção mundial, vindo a seguir a Nigéria (14%), México (10%), Indonésia (9%) e Índia (8%). No ano de 1998, o Brasil foi o terceiro maior exportador mundial de mamão, ficando atrás apenas do México e Malásia; no mesmo ano, os maiores importadores mundiais de mamão foram os Estados Unidos, Cingapura e Hong Kong. O mercado interno absorve mais de 99% da produção brasileira, e no ano de 1999 os principais países importadores do mamão brasileiro foram os Estados Unidos, Reino Unido, Países Baixos, Alemanha, Portugal, França e Canadá. No ano de 2001, o Brasil exportou cerca de 22.000 ton de mamão, o equivalente a US$ 18,503 milhões. Os mamoeiros do grupo Solo em plantios comerciais são ginodióicos, ou seja, apresentam plantas hermafroditas e femininas em proporção 2:1. Nas plantas femininas, a fecundação é efetuada pelo pólen de flores hermafroditas, ocorrendo a formação de frutos normalmente arredondados ou ligeiramente ovalados, com grande cavidade interna em relação à espessura da polpa, com menor valor comercial. Já as plantas hermafroditas, são capazes de se autofecundar, produzindo frutos geralmente alongados, com formato piriforme e cavidade interna menor do que os produzidos por plantas femininas, apresentando maior valor comercial por terem maior espessura de polpa (MARIN e GOMES, 1985). 2 Nos plantios comerciais, o mamoeiro é normalmente propagado por sementes. Os produtores selecionam plantas hermafroditas com características desejáveis, e geralmente usam as sementes obtidas de frutos onde ocorreu a autofecundação. Essas sementes em geral produzem progênies uniformes, porém, devido à segregação originam plantas hermafroditas e femininas em proporção 2:1. A falta de conhecimento com relação ao sexo das mudas, obriga os produtores a plantarem três mudas por cova, para após 3 a 4 meses do plantio, quando então é possível identificar o sexo das plantas através dos botões florais, ser realizado o desbaste das plantas femininas, deixando-se apenas as hermafroditas, que produzem os frutos de maior valor comercial. Mesmo após o desbaste, ainda restam cerca de 3 a 7% de plantas femininas no plantio, pois algumas vezes as três mudas plantadas por cova pertencem ao sexo feminino. Esse processo aumenta os custos de produção e consequentemente torna o produto final mais caro para o consumidor, e o prejuízo ao produtor será tanto maior quanto maior for a área cultivada e o tempo em que esses mamoeiros permanecerem competindo com os demais em água, luz e nutrientes, demandando tratos culturais (MARIN e GOMES, 1985). De acordo com os dados publicados no AGRIANUAL (2001), o custo de produção, somente com pagamento de mão de obra para a realização da sexagem do mamoeiro do grupo Solo no Brasil no ano de 2000, foi de cerca de US$ 17.73 por hectare, demonstrando a importância do conhecimento prévio do sexo das mudas, ainda na fase de viveiro, antes que sejam plantadas no campo. Ocorrem também gastos significativos com a compra das sementes, visto que 1 kg de sementes do mamão grupo Formosa custa cerca de US$ 3,000 e 1 kg de sementes do mamão grupo Solo custa cerca de US$ 300. LEMOS et al. (2002) usando a técnica de RAPD, e trabalhando com "seedlings" de mamoeiros pertencentes a três cultivares comerciais do grupo Solo, ainda na fase de viveiro, identificaram um marcador molecular (UBC210438) presente apenas nas mudas hermafroditas e ausente nas femininas, sendo portanto capazes de determinar precocemente e com 100% de acerto, o sexo das mudas antes que as mesmas fossem plantadas no campo. Uma outra opção para 3 solucionar esse problema, seria o plantio de mudas produzidas através de cultivo in vitro, clonadas a partir de plantas matrizes hermafroditas adultas e altamente produtivas. Este trabalho teve por objetivos a produção de mudas de mamão clonadas a partir de plantas matrizes hermafroditas selecionadas, através da multiplicação in vitro do cv. Sunrise Solo, bem como encontrar marcadores RAPD, SCAR e fAFLP ligados ao sexo das plantas dos cultivares Sunrise Solo e Cariflora. 4 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Genética e melhoramento do mamoeiro Na genética da herança do sexo em mamoeiro destacam-se os trabalhos de HOFMEYR (1938, 1941, 1967), STOREY (1938 a b, 1941, 1953, 1967, 1976) , HOROVITZ et al. (1953) e HOROVITZ (1954). STOREY (1941) agrupou as flores do mamoeiro em 6 tipos bem diferenciados segundo os principais tipos de flores e de frutos derivados em cada caso, da seguinte maneira: (Tipo I) -flor pistilada ou feminina típica, com ovário grande funcional, cinco estigmas sésseis, e ausência total de estames, não é afetada por nenhum tipo de mudança climática, ou seja, é estável; (Tipo II) - flor hermafrodita pentandra, com ovário e 5 estames funcionais, produz um fruto arredondado profundamente 5-lobulado; (Tipo III) - flor hermafrodita intermedia, com ovário funcional e 2 a 10 estames, produz frutos malformados, com carpeloidia, também conhecidos como “cara de gato”; (Tipo IV) - flor hermafrodita elongata, perfeita normal, com ovário e 10 estames funcionais, produz fruto de maior valor comercial, com forma alongada e subcilíndrico (piriforme), em contraste com a forma mais arredonda do tipo I feminino; (Tipo IV+) - flor hermafrodita “estéril de verão”, não desenvolve o ovário nos meses mais quentes do ano, as plantas que produzem estas flores são denominadas “andróicas lábeis”; (Tipo V) - flor estaminada ou masculina típica, com 10 estames funcionais e pistilo rudimentar, sem estigma, consequentemente não pode produzir frutos. Se os mamoeiros machos, podem produzir somente flores estaminadas durante todo o ano, podem ser contudo férteis em determinadas épocas do ano, quando produzem de algumas a muitas flores hermafroditas, geralmente hermafrodita elongata ou tipo IV, que se desenvolvem em frutos, dando assim os chamados 5 mamões-de-cabo, mamões-de-corda ou mamões-macho. Os tipos de flores de I a V constituem graus de uma dupla escala de masculinidade crescente e de feminilidade decrescente. STOREY (1941), distinguiu, para fins práticos, quatro tipos distintos de mamoeiros, com base em seus tipos florais, a saber: (Grupo A) - planta pistilada, feminina ou ginóica, é a única forma invariável, e produz flores do tipo I; (Grupo B) - planta hermafrodita ou perfeita bissexual, composto por plantas continuamente férteis, pode produzir flores dos tipos II, III, IV ou V, mas principalmente do tipo IV no verão, tipo II no inverno, tipo III durante os períodos de transição e raras vezes do tipo V, sendo as do tipo IV+ sempre raras ou ausentes; (Grupo C) - planta hermafrodita estéril de verão, produz flores do tipo IV no inverno e flores do tipo IV+ no verão, ocorrendo também flores do tipo III, porém são menos numerosas que na forma B hermafrodita; (Grupo D) - planta estaminada, masculina ou andróica, produz geralmente flores masculinas típicas tipo V, mas ocasionalmente por mudanças de estação pode produzir flores do tipo IV hermafrodita elongata. De acordo com HOROVITZ et al. (1953), segundo os tipos de flores que C. papaya seja capaz de produzir, encontram-se as seguintes formas sexuais: Ginóica - forma sexual A de Storey, constituída de mamoeiros que têm flores exclusivamente femininas; Andróica - forma sexual D de Storey, constituída de mamoeiros que têm flores exclusivamente masculinas; Andromonóica - formas sexuais B e C de Storey e inversões ocasionais à forma D, constituída de mamoeiros que têm em suas inflorescências uma mistura de flores masculinas e hermafroditas. STOREY (1958) sumarizou e simplificou a classificação dos tipos de flores em oito categorias aceitas pelos melhoristas de mamão. Para fins práticos, os oito tipos de flores são classificadas em três grupos primários: macho (M), hermafrodita (H) e fêmea (F). As diversas variações nos tipos de sexo são encontradas em plantas hermafroditas e machos, enquanto as plantas femininas são constantes. Os tipos de flores do mamoeiro encontram-se resumidamente descritos a seguir. 6 Tipos de flores do mamoeiro, M (masculina), F (feminina), H (Hermafrodita). Tipos Planta Flor Descrição Estaminada M M Típica flor unisexual masculina em longos pedúnculos, tem 10 estames distribuídos em duas séries de 5. Tipo V de Storey Estaminada teratologica M M Encontrada em plantas masculinas com reversão sexual, tendo algum grau de iniciação e desenvolvimento de carpelos vestigiais. Tipo IV+ de Storey, sugerindo que poderia ser uma forma transacional entre o tipo IV (elongada) e tipo V (estaminada). Elongada reduzida H M Flor elongada normal modificada, difere das flores estaminadas, tendo um tubo de corola espesso e rígido, aborto de pistilos, reduzido tamanho de ovário e reduzido número de carpelos. Ocorrem mais frequentemente durante os períodos quentes, e podem surgir em um período de 1-2 semanas até 6 meses, dependendo do cultivar e da temperatura Elongada (tipo normal) H H Elongada refere-se à forma do pistilo terminando em estigmas com lóbulos finos; desenvolve fruto cilíndrico ou piriforme, com cinco carpelos laterais fundidos. Pétalas fundidas em dois terços do seu comprimento. Tipo IV de Storey Elongada carpelóide H F Transformação de series internas de estames em estruturas semelhantes a carpelos. Há vários tipos, com diferentes números de estames, tornando-se carpelóides ou com vários graus de carpeloidia, tendo desde insignificantes até desenvolvidos lóculos com estigma funcional. Frutos com vários graus de deformações. Tipo III de Storey Pentandria H F Tipo hermafrodita normal, flor unisexual pistilada modificada, através da transformação parcial dos estames em carpelos, com perda dos carpelos originais. Tubo de corola curto, apenas cinco estames de verticílios externos em longos filamentos globosos e pistilo sulcado. Tem de cinco a dez carpelos. Tipo II de Storey Pentandria carpelóide H F Os estames dos verticílios externos tornam-se carpelóides. Formas carpelóides em vários estágios, especialmente sob condições de frio. Todos os cinco estames são inteiramente carpelóides e fundidos lateralmente, com aborto dos carpelos originais, flores semelhantes às flores pistiladas (pseudo-pistiladas). Pistilada F F Flores unisexuais femininas maiores que as flores hermafroditas, sem estames. Forma estável, não é afetada pelo ambiente. Tipo I de Storey 7 A diferenciação dos estames inicia 50-56 dias antes da ântese e é completada cerca de 35 dias antes da ântese. A diferenciação dos ovários inicia 42-50 dias antes da antese e é completada dentro de 28 dias antes da ântese. O início do surgimento do primórdio floral até a antese ocorre em um prazo de 46 dias no Havaí e 80 dias na Índia, com essa grande discrepância sendo devido à temperatura (NAKASONE e PAULL, 1998). NAKASONE e LAMOUREUX (1982) estudando formas transicionais de flores hermafroditas do mamoeiro, relataram a existência de um tipo de fruto hermafrodita que ainda não havia sido descrito por STOREY, e esse fruto seria elongado e cilíndrico, semelhante a um pepino, mas apresentando uma curvatura resultante de um restrito desenvolvimento de 1 ou 2 carpelos. A genética da carpeloidia dos estames e da esterilidade feminina é extremamente complexa e STOREY (1953) postulou dois conjuntos independentes de fatores que podem modificar a expressão do sexo em plantas masculinas e hermafroditas sob certas condições ambientais. Um conjunto de fatores induzem mudanças sazonais de fêmeas férteis para estéreis, e que voltam a ser férteis. O outro conjunto causa estames carpelóides, usualmente com fusão do pistilo. Ambos fatores são limitados a plantas masculinas e hermafroditas, sendo as femininas fenotipicamente estáveis, ou seja, não são afetadas por nenhum tipo de mudança climática. HOROVITZ (1954) expõe sua própia hipótese sobre a herança do sexo do mamoeiro, indicando que as hipóteses anteriores não explicam a existência das formas sexuais masculinas que periodicamente produzem frutos, como a forma C de Storey, e menciona que a esterilidade e a fertilidade feminina nestas duas formas sexuais são duas faces do mesmo fenômeno. Portanto, postula a existência de quatro alelos, (FH) de tendência hermafrodita, (f’) e f que dão tendência feminina e (F) que é o único de tendência masculina. O alelo (f) pertence ao cromossomo m, que na forma homozigota mm, determina planta feminina. O alelo (F) pertence ao cromossomo (M1) que, na forma heterozigota (M1m), determina a planta masculina. Um terceiro alelo (FH), de tendência hermafrodita, ocupa um locus composto, por duplicação dos loci (f) mais (F) e 8 caracteriza o cromossomo (M2) que na forma heterozigota (M2m) determina as plantas hermafroditas. HOROVITZ (1954) postulou também a existência de substâncias florígenas específicas para machos e fêmeas, que são geralmente controladas por um único gene com dois alelos. O alelo dominante promove estrutura masculina, e o alelo recessivo promove estrutura feminina nas flores. Eles fazem isso através da produção de enzimas que catalizam compostos promotores de masculinidade e feminilidade respectivamente. O grau de sexualidade de uma flor depende da proporção de substâncias responsáveis pela masculinidade e feminilidade presentes no primórdio inicial. Dentro de um determinado genótipo, a temperatura é o fator decisivo na produção de um particular tipo de flor em uma determinada época. LANGE (1961) observou que temperaturas mínimas, ou uma grande diferença entre as temperaturas diurnas e noturnas, produziam mais flores femininas do que o normal no mamoeiro. Em Carica papaya persistem as formas dióicas primitivas, e a hermafrodita (monóica) que em cultivo é conservada por seleção constante feita pelo homem. Em populações espontâneas de C. papaya, que voltam ao estado silvestre, a forma hermafrodita é eliminada em poucas gerações pela masculina, dando lugar a populações estritamente dióicas (HOROVITZ et al., 1953). STOREY (1953) cita que uma população dióica (macho e fêmea) pode ser convertida em ginodióica (fêmea e hermafrodita), pela completa eliminação do macho. Isso pode ser acompanhado por uma primeira polinização da flor feminina com pólen de plantas hermafroditas. A seguir faz-se o retrocruzamento, até que o cultivar obtenha as características desejadas. De acordo com HOROVITZ et al. (1953), quanto ao sexo, o mamoeiro é classificado basicamente em três tipos de populações: dióicas, ginóico- andromonóicas (ginodióicas) e andromonóico-trióicas. As dióicas são originárias do cruzamento de plantas do sexo masculino com plantas do sexo feminino. As sementes coletadas dos frutos desses mamoeiros deverão produzir plantas dos dois sexos em igual proporção, caso o pólen da flor masculina fecunde a feminina. Nesse tipo estão os mamoeiros conhecidos como “comum”, “de derrubada”, 9 “mamão de quintal” e “mamão de passarinho”. As ginóico-andromonóicas ou ginodióicas são originários do cruzamento entre plantas hermafroditas, que são capazes de se autofecundar porque apresentam os órgãos masculino e feminino na mesma flor, ou seja, não necessitam do pólen de outras plantas ou flores para produzir frutos e sementes. As sementes desses mamoeiros segregam para o sexo, produzindo duas plantas hermafroditas para cada planta feminina. Nesse tipo são encontrados os cultivares do grupo Solo ou Mamão Havaí, Tainung ou Mamão Formosa, Tailândia, etc., normalmente de maior valor comercial e de importância relevante para o mercado interno e externo. As populações andromonóico-trióicas são constituídas por indivíduos ginóicos (femininos), andróicos (masculinos) e andromonóicos (hermafroditas). HOFMEYR (1967) propôs a hipótese do balanço gênico, para a determinação sexual em C. papaya, relatando que os símbolos (M1) e (M2), representam regiões inertes ou inativadas, de comprimentos ligeiramente diferentes, nos cromossomos sexuais, que são inertes ou apresentam a ausência de genes importantes. Isso explicaria a letalidade zigótica nos genótipos homozigotos (M1M1, M2M2 e M1M2). A região homóloga (m) é normal. Os genótipos viáveis são M1m (macho), M2m (hermafrodita), mm (fêmea). Baseado na maior frequência de ocorrência de reversão sexual em plantas hermafroditas e machos, do que em fêmeas, propõe que uma maior concentração de genes afetando a feminilidade estão nos cromossomos sexuais, enquanto a maior concentração dos genes afetando a masculinidade estão nos cromossomos autossômicos, concluindo que a interação entre esses fatores determina o sexo da planta. Então, o genótipo mm é feminino e sua homozigosidade confere estabilidade fenotípica. Como M1 é a maior das regiões inertes, é expressada fenotipicamente como masculina, por causa da maior influência dos fatores autossômicos. A região M2 é menor e menos influenciada pelos genes autossômicos, logo o genótipo M2m é expresso fenotipicamente como hermafrodita. A heterozigosidade de M1m e M2m torna-os suscetíveis a alterações na expressão fenotípica devido a influências externas, principalmente temperatura. 10 De acordo com STOREY (1976) com exceção de três espécies de Carica, todos os membros de Caricaceae são dióicos. As três exceções são Carica monoica, Carica pubescens e Carica papaya. Elas têm formas sexualmente ambivalentes que passam por reversões sexuais em resposta a mudanças climáticas e/ou fotoperiódicas durante o ano. Carica monoica é estritamente monóica, mas em certas épocas do ano pode não ter flores pistiladas (femininas). Existem plantas de C. pubescens em três formas sexuais básicas: pistiladas (femininas), estaminadas (masculinas) e andromonóicas (hermafroditas). As plantas pistiladas e estaminadas não respondem às mudanças climáticas sazonais. As plantas andromonóicas são sexualmente ambivalentes, produzindo flores estaminadas, andromonóicas perfeitas e pistiladas em várias proporções em diferentes épocas do ano. As plantas de C. papaya existem nas mesmas três formas sexuais básicas de C. pubescens. A planta pistilada é estável. Plantas estaminadas e andromonóicas podem ser: (1) fenotipicamente estáveis, ou (2) fenotipicamente ambivalentes, passando por reversões sexuais sazonais, durante a qual elas produzem várias proporções de flores estaminadas, andromonóicas perfeitas e pistiladas. Devido a estresses de causas ambientais, a planta masculina pode produzir frutos, popularmente conhecidos como "mamão de corda", que não tem valor comercial. STOREY (1958) classificou plantas de C. papaya em 31 fenótipos herdáveis com base no comprimento e ramificação de pedúnculo, e respostas sexuais sazonais. Quinze dessas são variações dentre as plantas estaminadas, e outras quinze são variações dentre as plantas andromonóicas. O fenótipo restante é a planta pistilada, que é estável. STOREY (1938b) e HOFMEYR (1938) obtiveram iguais proporções das formas sexuais nos segregantes de cruzamentos efetuados artificialmente e concluíram baseados nessas segregações, que o sexo em C. papaya está determinado por um gene simples com três alelos multiplos. Trabalhando independentemente, estabeleceram hipóteses semelhantes sobre a determinação do sexo em C. papaya. Segundo estas, através de estudos genéticos e exame de sementes a partir de frutos masculinos e hermafroditas, os fatores Mendelianos 11 (m), (M1) e (M2) são alelomórficos, tendo sido esses símbolos atribuídos por HOFMEYR (1938). O gameta relacionado ao hermafroditismo é representado por (M2), o de masculinidade por M1 e o de feminilidade por (m), podendo ocorrer as seguintes combinações: plantas masculinas, estaminadas ou andróicas (M1m) correspondentes ao grupo D de Storey, plantas hermafroditas ou andromonóicas (M2m) correspondentes aos grupos B e C de Storey, e plantas femininas, pistiladas ou ginóicas (mm) correspondentes ao grupo A de STOREY. Segundo STOREY (1939) a condição de homozigose envolvendo ambos os alelos dominantes é letal, ou seja, as combinações (M1M1), (M1M2) e (M2M2) não ocorrem porque são letais no zigoto. As plantas masculinas e hermafroditas são heterozigotas, e seus frutos apresentam 25% de sementes inviáveis. As plantas femininas são homozigotas para o alelo recessivo. Portanto, plantas masculinas somente produzem pólen de constituição m e M1, e as plantas hermafroditas produzem duas classes de pólen, m e M2 e duas classes de óvulos, m e M2. De acordo com STOREY (1938b) e HOFMEYR (1938),quando realiza-se cruzamentos com o mamoeiro, obtém-se as proporções esperadas de plantas masculinas, femininas e hermafroditas que aparecem descritas a seguir. Um cruzamento entre fêmea e macho (mm x M1m) produz fêmeas e machos com uma proporção de 1:1. O autocruzamento de uma hermafrodita ou cruzando duas hermafroditas (M2m) produz femininas e hermafroditas com uma proporção 1:2. O cruzamento entre fêmea e hermafrodita (mm x M2m) produz fêmeas e hermafroditas com uma proporção 1:1. Uma hermafrodita (M2m) cruzada com um macho (M1m) produz 1mm:1 M2m:1 M1m. Ocasionalmente, quando uma planta masculina produz flores hermafroditas, essas podem vir a ser autopolinizadas, resultando em uma fêmea (mm) e dois machos (M1m). 12 Combinações de polinização e proporções resultantes de segregação em progênies de Carica papaya (STOREY ,1938b; HOFMEYR, 1938). Cruzamentos Proporção da Segregação de Plantas Esperadas Feminina mm Masculina M1m Hermafrodita M2m Nao Viável M1M2 M1M1 M2M2 1. Masculina x Feminina M1m x mm 1 1 0 0 2. Hermafrodita x Feminina M2m x mm 1 0 1 0 3. Masculina x Masculina M1m x M1m (autopolinização) 1 2 0 1 M1M1 4. Masculina x Masculina M1m x M1m 1 2 0 1 M1M1 5. Hermafrodita x Hermafrodita M2m x M2m (autopolinização) 1 0 2 1 M2M2 6. Hermafrodita x Hermafrodita M2m x M2m 1 0 2 1 M2M2 7. Masculina x Hermafrodita M1m x M2m 1 1 1 1 M1M2 HOFMEYR (1941) formulou uma hipótese quantitativa para Carica papaya, de certo modo análoga à do balanço gênico de BRIDGES (1932), na qual supõe que o conjunto dos autossomos possui tendência masculina, e todos os cromossomos sexuais, ou seja, a maior concentração dos genes para a feminilidade está nos cromossomos sexuais, e a maior concentração de genes para a masculinidade está nos autossomos. Então, o genótipo (mm) é pistilado e sua homogozidade confere estabilidade fenotípica. Já que a região inerte de (M1) é maior, se expressa fenotipicamente como estaminada, por causa da maior influência dos fatores autossômicos. A região inerte de (M2) é menor e está menos influenciada pelos genes autossômicos, desta forma o genótipo (M2m) é expressado fenotipicamente como andromonóica. A heterozigosidade de (M1m) e 13 (M2m) causa suscetibilidade a alteração na expressão fenotípica, devido a influências externas. De acordo com STOREY (1953) esses dados indicam um complexo de genes intimamente ligados em diferentes segmentos, localizados em regiões idênticas nos cromossomos sexuais, que codificam para características secundárias, como comprimento de pedúnculo e número de flores por nó. Os segmentos determinantes do sexo comportam-se hereditariamente como se fossem fatores unitários. Pedúnculos (p) longos são exclusivos dos machos (Mp) e os pedúnculos curtos são comuns a fêmeas (mp) e hermafroditas (mp). O gene letal ao zigoto (l) é comum a machos e hermafroditas, e é o fator que força a heterozigosidade nessas formas sexuais, não ocorrendo “crossing over” entre o gene (l) e outros genes da região de determinação sexual. O gene (C) é um fator hipotético para supressão de “crossing over” na região de diferenciação sexual. O gene supressor do androceu (sa) suprime completamente o desenvolvimento do androceu quando homozigoto, como na fêmea, ele aparentemente não é completamente recessivo para o seu alelo normal, mas pode exercer alguma influência na supressão do androceu em machos e hermafroditas sob certas condições ambientais, possivelmente através da interação com fatores modificadores do sexo. Outro gene é o supressor do gineceu (sg), que quando homozigoto, exerce completa supressão do desenvolvimento do gineceu, como nos machos fêmea-estéreis; muitos hermafroditas e machos parecem ser heterozigotos para esse gene, e sua expressão sexual tende a ser forçada na direção da masculinidade nos meses mais quentes do ano. Os hipotéticos genótipos sexuais são mostrados a seguir: Macho Hermafrodita Fêmea M1 = Mp I C + sg m + + + sa + M2 = + I C + sg m + + + sa + m = + + + sa + m + + + sa + De acordo com a hipótese revisada de STOREY (1976) o símbolo (SA) representa a soma dos fatores envolvidos na transmutação do androceu ancestral no presente gineceu; (sa) representa o desenvolvimento normal do androceu; (SG) representa o fator ou fatores responsáveis pela supressão do gineceu em flor 14 estaminada; (sg) permite que os fatores (SA) funcionem ontogeneticamente no desenvolvimento do restabelecimento do gineceu. O símbolo (l) representa o fator recessivo ligado ao sexo letal ao zigótico que força a heterozigosidade em plantas estaminadas e andromonóicas; e (C) representa o fator que previne o “crossing- over” entre os fatores de determinação sexual e o fator letal, considerando que não existem plantas pistiladas portadoras do do fator (l). Como em outras hipóteses, a heterozigosidade permite a ambissexualidade. A determinação sexual dos genótipos são expressadas como a seguir: Estaminada e Andromonóica Pistilada M1 e M2 = (sa) l C (SG) m m (SA) + + (sg) m = (SA) + + (sg) m (SA) + + (sg) De acordo com STOREY (1976) o comprimento e ramificação das inflorescências são caracteres sexuais secundários. Os alelos que transmitem a expressão desses caracteres estão nos cromossomos sexuais, mas a ligação com os fatores de determinação sexual não é absoluta. Com efeito, todas as formas estaminadas e andromonóicas são idênticas, entretanto, a classificação das plantas como uma ou outra forma depende da natureza da inflorescência. De acordo com HOROVITZ e JIMENEZ (1967), o hermafroditismo em Carica se constitui em um desenvolvimento recente, produto de uma evolução secundária, que tem sido observado em apenas três espécies de Carica, a saber C. papaya, C. monoica e C. pubescens. Em cada uma das três espécies o aparato hermafrodita está regido por um sistema genético diferente, porém em todos os casos tem se derivado da condição dióica. Em Carica papaya, o mecanismo determinante do hermafroditismo se estabeleceu a partir do cromossomo Y, diferenciando-se no novo cromossomo Y2, sem nenhuma alteração no cromossomo X, sendo as plantas femininas (XX), masculinas (XY1) e hermafroditas (XY2). As combinações Y1Y1, Y1Y2, Y2Y2 são letais, o que prova que a região letal do cromossomo Y1 da forma dióica, foi preservada no novo cromossomo Y2 da forma hermafrodita. Em C. monoica o cromossomo Z originado a partir do X, resulta na forma bisexual homogamética ZZ. Em C. pubescens o sistema bisexual monóico resulta da interação complementar de um cromossomo 15 Y específico (Ypm), com um citoplasma específico [pm], sendo indiferente o cromosso X que intervenha, mesmo que pertença a uma espécie distinta. A planta bisexual monóica de C. pubescens é um indivíduo de genótipo XY, modificado em sua expressão pelo citoplasma [pm = pubescens monóica]. Seu genótipo completo é [pm].XYpm. Estas plantas monóicas, quando são autofecundadas segregam em sua descendência 2 plantas bisexuais monóicas [pm].XYpm para 1 planta feminina [pm].XX. Esse genótipo bisexual monóico tem uma expressão variável quanto à proporção de flores masculinas e femininas. Uma mesma planta pode passar por períodos de alta feminilidade e períodos de alta masculinidade. A genética da carpeloidia dos estames e da esterilidade feminina é extremamente complexa e STOREY (1953) postulou dois conjuntos independentes de fatores que podem modificar a expressão do sexo em plantas masculinas e hermafroditas sob certas condições ambientais. Um conjunto de fatores induzem mudaças sazonais de fêmeas férteis para estéreis, e que voltam a ser férteis. O outro conjunto causa estames carpelóides, usualmente com fusão do pistilo. Ambos fatores são limitados a machos e hermafroditas, mas as fêmeas podem ser influenciadas por esses fatores. Um mapa genético inicial do mamoeiro indica um único locus para o sexo. Estudos posteriores de ARKLE (1973) forneceram alguma evidência genética para sustentar essa teoria. Um conjunto de fatores modificantes faz com que os estames se tornem semelhantes a carpelos e se fundam com o pistilo, em baixas temperaturas. O outro conjunto de fatores causa abortamento do ovário, produzindo essencialmente flores masculinas à temperaturas elevadas. Parece, entretanto, que os dois conjuntos de fatores modificantes são, por sua vez, compostos de vários genes. O mesmo autor apresenta um modelo tri-híbrido que representa o número mínimo de fatores possíveis de se combinarem com os complexos dados de campo. O modelo apresenta um número par de genes envolvendo 3 loci, 2 para carpeloidia (c/c, c/c) e 1 para esterilidade (s/s). Esses fatores agem independentemente. Seus alelos normais (+) são parcialmente ou completamente dominantes. A combinação (s/+) é normal. Em (c/+), o + é parcialmente dominante sobre (c), havendo assim algum grau de carpeloidia. O 16 fator (s), em homozigose ou não (s/-), é epistático sobre o alelo c quando os fatores de carpeloidia são heterozigotos. O fenótipo seria normal, mas instável, dependendo das condições ambientais. Se algum dos fatores (c) é homozigoto (c/c), a força combinada dos dois alelos em um locus pode reverter a epistase e a carpeloidia se manifestará. O mesmo autor fornece 27 combinações genotípicas dos loci (c) e (s), junto com suas expressões fenotípicas. De acordo com CHAN (1985), a alta herdabilidade para carpeloidia de estames não se presta para a seleção fenotípica, devido a interação entre genótipo, idade da planta e o ambiente De acordo com NAKASONE e PAULL (1998) um fato que não tem sido satisfatoriamente explicado é a produção de uma linhagem hermafrodita altamente uniforme com o mínimo de carpeloidia e esterilidade através de contínua seleção e melhoramento. Quando sementes de uma linhagem uniforme são plantadas em outro ambiente com maior ou menor ou uma grande faixa de temperaturas, carpeloidia e/ou esterilidade podem ser fortemente expressadas de novo. Esses fatores modificantes são além disso influenciados por outros genes associados com adaptações a mudanças fisiológicas específicas, induzidas por mudanças na temperatura, o que ainda não esta claro. Parece que existem muitos e independentes conjuntos de fatores, com interações entre eles e que são fortemente influenciados pelas condições ambientais. Estudos de genes mutantes em C. papaya não têm obtido muito sucesso, na tentativa de encontrar caracteres vegetativos ligados ao sexo, que pudessem diferenciar o sexo na fase de muda. Cor amarela de flor (Y) é dominante à branca (y), cor roxa de caule e pecíolo (P) é dominante à verde (p) e sementes de cor cinza (B) são dominantes em relação às pretas (b), sendo todos esses caracteres ligados ao sexo (HOFMEYR, 1938). Cor roxa de caule e pecíolo está fracamente ligada ao sexo, com aproximadamente 41% do valor da recombinação, valor muito próximo de 50%, e por isso não oferece nenhuma vantagem na seleção dos tipos sexuais. O valor da recombinação é cerca de 32% entre o sexo e a cor da sarcotesta da semente, e o plantio de sementes de sarcotesta cor cinza, resultaria, 17 portanto, em um aumento no número de plantas femininas, porém essa cor de semente não tem sido observada no grupo Solo. Entre os genes não ligados ao sexo estão incluídos polpa amarela dominante sobre polpa vermelha e cor de casca de fruto amarela recessiva à verde normal. Um forte fator ligado ao sexo é a flor de cor púrpura tingida, descoberta em uma raça do cv. Kapoho Solo, pois essa cor é encontrada somente em plantas hermafroditas, enquanto as flores de plantas femininas são brancas, novamente essa característica não apresenta nenhum valor prático no selecionamento prévio de hermafroditas na fase precoce de plântula (NAKASONE, 1980). Os genes mutantes do mamoeiro encontram-se resumidamente descritos a seguir. Genes mutantes do mamoeiro (HOFMEYR, 1938; NAKASONE, 1980). Símbolo Descrição a Planta albina recessiva à planta verdes d Nanismo recessivo à alta; excessiva ramificação na fase juvenil dp Planta pequena recessiva à planta grande; tronco e pecíolos curtos e finos, folhas, flores e frutos pequenos cp Folhas deformadas recessivas às folhas normais; sintomas semelhantes ao PRSV (papaya ringspot vírus) rg Folha rugosa recessiva à folha lisa; enrugamento da folha; pecíolos curtos, obliquamente verticais w Folha ondulada recessiva à folha normal r Polpa vermelha recessiva à amarela Y Flor de cor amarela dominante à branca P Caule e pecíolo roxos dominantes aos verdes; intensidade da cor pode ser afetada por genes modificantes B Semente cor cinza dominante em relação à preta De acordo STOREY (1976) alguns dos problemas da cultura do mamoeiro que necessitam ser solucionados para aumentar a probabilidade de incremento da produção de fruto e latex são desenvolvimento de cultivares resistentes a vírus; 18 eliminação de formas andromonóicas ambisexuais que tendem a ser fêmea estéreis em certas épocas do ano ou mostram uma tendência para a carpeloidia de estame; desenvolvimento de formas andromonóicas homozigotas pela possível eliminação do fator letal ao zigoto ou pela cultura in vitro de embriões; indução de um caractere vegetativo ligado ao sexo para eliminação das formas indesejáveis precocemente na fase de “seedling”; plantas de porte pequeno; seleção para inflorescências de comprimento moderado (cerca de 7,5-10,0 cm) tendo frutos individuais, para evitar amontoamento com resultante deformação dos frutos; seleção para uma cavidade ovariana circular em seção transversa e com uma placenta facilmente separável; melhoramento de cultivares dióicos para locais em que os tipos andromonóicos são excessivamente sexualmente ambivalentes; melhoramento para expandir regiões de produção pela hibridização com espécies que sejam mais tolerantes ao frio (p. ex. C. pubescens); e melhoramento para aumentar a produção de latex. Segundo NAKASONE e PAULL (1998), alguns objetivos do melhoramento no mamoeiro são comuns a todas as regiões, com objetivos específicos em diferentes localidades devido a diferenças climáticas, preferências do consumidor, tipos de sexo desejado e mercados de exportação. Esses objetivos têm mudado pouco nos últimos 80 anos. Características desejáveis para as plantas são: vigor, frutificação precoce e com localização baixa no caule, expressão mínima de carpeloidia e esterilidade feminina, resistência a doenças e pragas, e alta produtividade. Universalmente as características desejáveis de frutos são casca lisa, livre de manchas, fruto firme com polpa espessa, cavidade interna arredondada, ausência de protuberâncias internas e longa vida de prateleira. O tamanho desejado de fruto, forma e cor de polpa variam com as diferentes regiões produtoras do mundo. A preferência por frutos pequenos (450-650 g) cv. Solo é crescente em países tropicais, quando a exportação é considerada. Requerimentos para cultivares destinados ao processamento são as mesmas, no entanto frutos grandes podem ser mais desejáveis, tamanho e padrão uniformes. A altura total das plantas não é um bom critério para avaliar o vigor das mesmas, sendo o diâmetro de caule uma medida mais verdadeira. 19 O papaya ringspot virus (PRSV) ou vírus do mosaico do mamoeiro é transmitido por afídeos e frequentemente limita a produção comercial na maioria das áreas onde o mamoeiro é plantado. Linhagens tolerantes têm sido selecionadas, e o cv. Cariflora, desenvolvido no sul da Flórida, é dióico, apresenta alta tolerância ao PRSV, e produz frutos de boa qualidade, com formato arrendodado, tamanho pequeno, tendo polpa doce de cor amarelada e aroma agradável (CONOVER et al., 1986). Usando esse material, muitas seleções altamente tolerantes do grupo Solo hermafrodita têm sido feitas no Havaí (ZEE, 1985). Uma tolerância mais rápida é obtida com o uso das técnicas de biologia molecular e a transformação de papaya com a capa proteica de uma linhagem fraca do vírus, que confere resistência. Foram obtidas no Havaí duas linhagens do grupo Solo resistentes ao vírus, uma com polpa amarela cv. Rainbow, e outra com polpa vermelha cv. Sunup (NAKASONE e PAULL, 1998). O mamoeiro hermafrodita é naturalmente autopolinizado, e não tem mostrado depressão devido a essa contínua autopolinização. Também, híbridos F1 entre cultivares do grupo Solo não têm mostrado vigor híbrido, provavelmente devido à estreita relação genética, havendo muitos genes em comum (HAMILTON, 1954). Essa proximidade no germoplasma foi confirmada para dez cultivares do Havaí e três cultivares não Havaianos, pela análise do DNA, tendo apresentado 80% de similaridade. Heterose foi observada na F1 de cruzamentos entre o grupo Solo e muitos diferentes acessos de papaya e entre cruzamentos interespecíficos envolvendo Carica cauliflora Jacy x C. monoica e C. goudotiana Trian et Planchon x C. monoica (MEKAKO e NAKASONE, 1975). Nas áreas onde são plantadas cultivares hermafroditas, a carpeloidia e a esterilidade feminina podem ser grandes problemas, afetando a produção. O mamoeiro hermafrodita é muito sensível a modificações mínimas no ambiente e, portanto o cv. Solo havaiano não se estabeleceu satisfatoriamente em todos os locais, embora suas sementes se tenham distribuído através dos trópicos (NAKASONE, 1980). AWADA (1953) verificou que condições de alta umidade favoreciam a produção de frutos carpelóides. Durante os meses de seca, as plantas adquirem 20 esterilidade feminina. Altos teores de nitrogênio tendem a mudar o sexo das flores hermafroditas normais para feminino, produzindo assim frutos deformados. Excesso de N e umidade também favorece a carpeloidia, enquanto plantas estressadas, com deficiência de N e estresse hídrico, tendem a ter esterilidade feminina (AWADA e IKEDA, 1957). Baixas temperaturas causam mudança para flores carpelóides (AWADA, 1958). A incidência de carpeloidia também declina com o aumento da idade da planta e pode estar relacionada ao comprimento do internó (CHAN, 1984). De todos os fatores que afetam as mudanças de sexo, a temperatura é, talvez, o mais importante fator isolado. De acordo com SIQUEIRA e BOTREL (1986), durante o inverno, observa-se que as plantas hermafroditas produzem flores femininas estéreis, sendo que a fertilidade destas flores aumenta quando as temperaturas são elevadas e a umidade é baixa. ALLAN et al. (1987) estudaram os efeitos de seis diferentes condições ambientais sobre plantas clonadas de C. papaya fêmeas e machos, e concluiram que temperaturas noturnas ao redor de 12°C, em conjunção com comprimentos de dia intermediários (11h), são responsáveis pela reversão sexual na produção de flores estaminadas para hermafroditas tipo alongatas. Segundo MANICA (1996), quando sementes de mamão após a sua germinação, foram expostas durante 20 dias a 16 horas diárias de luz antes do plantio das mudas no campo, elas mostraram tendência a aumentar o número de plantas do sexo feminino. De acordo com NAKASONE e PAULL (1998) a temperatura ótima para o crescimento de papaya esta entre 21 e 33 °C, sendo extremamente sensível ao frio e, se a temperatura cair abaixo de 12-14 °C por muitas horas à noite, o crescimento e a produção são severamente afetadas. Cultivares dióicas são mais adaptadas a baixas temperaturas (<20°C), pois plantas femininas não apresentam mudanças de sexo, o que mostra a maior sensibilidade dos cultivares bisexuais (hermafroditas) à carpeloidia. Cultivares hermafroditas (tipo Solo), crescendo com temperaturas mínimas menores que 17°C, podem ter 100% de flores carpelóides. Em temperaturas altas (>35°C), existe uma tendência nos cultivares bisexuais para formar flores masculinas funcionais pouco desenvolvidas e partes femininas 21 não funcionais. Essa tendência varia com os cultivares e dentro dos cultivares. A taxa fotossintética líquida também declina rapidamente acima de 30°C. NAKASONE (1980) questionou se as mudanças de temperatura poderiam influenciar genes associados com adaptação para mudanças fisiológicas hormonais específicas no mamoeiro. Esse questionamento pode ser relacionado com a pesquisa feita por HASDISEVE et al. (1989), que trabalhando com plantas femininas, masculinas e hermafroditas de C. papaya cv. Fang, através de cromatografia líquida, observaram diferenças na concentração endógena de auxina até os 60 dias após a semeadura, o mesmo não ocorrendo com a concentração endógena de giberelina. Ambas as substâncias aumentaram nas plantas masculinas com o tempo. Nas femininas e hermafroditas, o nível de auxina endógena sofreu incremento até 100 dias após a semeadura, quando houve um decréscimo, em contraste com o conteúdo de giberelina, que sofreu incremento progressivamente com a idade da planta. GHOSH e SEN (1975) aplicaram reguladores de crescimento em plântulas de C. papaya e observaram que houve uma maior proporção de plantas fêmeas em relação a machos quando foram aplicados NAA (ácido naftalenoacético) e CCC (2-cloroetil trimetilamônio), por outro lado MH (hidrazida maléica), GA3 (ácido giberélico) e propionato de testosterona aumentaram a proporção de plantas masculinas. Estes mesmos autores também aplicaram seis diferentes doses de N (5 a 60 g por planta) em plântulas de mamoeiro com 2,5 meses de idade, e observaram que na dose correspondente a 30 g de N havia significativamente mais plantas femininas (85%) do que nos demais tratamentos como 5 g de N (37,5%), incluindo o controle (50%) onde não havia sido aplicado o N, concluindo que a aplicação de fertilizantes nitrogenados em plântulas jovens de mamão modifica a sua proporção sexual. 22 2.2. Cultivo in vitro Um dos principais fatores limitantes na micropropagação do mamoeiro cultivado em condições de campo, é a dificuldade de obtenção de explantes livres de contaminações causadas por microrganismos endofíticos. LITZ et al. (1981), trabalhando com a micropropagação do mamoeiro, observaram que a contaminação bacteriana foi um problema severo, impossível de ser totalmente eliminado, e após realizarem o seu isolamento, concluíram que a bactéria contaminante mais comumente encontrada era a Pseudomonas sp. REUVENI et al. (1990), trabalhando com a micropropagação de três clones de mamoeiro dióico de polinização aberta, crescidos em casa de vegetação e em condições de campo, concluíram que a imersão dos ápices caulinares em solução contendo o antibiótico rifampicina (300 mg.L-1), durante 24 horas, sob agitação constante a 100 rpm, seguida da imersão em hipoclorito de sódio (0,6%) contendo Tween 20 (0,1%) por 10 min, foi o tratamento mais eficiente na redução da contaminação dos ápices obtidos a partir das plantas crescidas em casa de vegetação, chegando a obter cerca de 90% de sucesso, mas também concluíram que este protocolo não foi eficiente na desinfestação dos ápices obtidos a partir de plantas crescidas em condições de campo. Por outro lado, VIANNA et al. (1997) trabalhando com o cv. Formosa crescido em condições de campo, e usando o mesmo protocolo proposto por REUVENI et al. (1990), obtiveram um sucesso de 70% na desinfestação dos ápices caulinares, indicando que o uso deste protocolo poderia ser eficiente também para plantas crescidas no campo. Ambos autores concluíram que a rifampicina (50 mg.L-1) adicionada ao meio de cultura também foi eficiente no controle da contaminação bacteriana. O antibiótico rifampicina, pertence ao grupo das rifamidas, é indicado no controle de bactérias gram-positivas e gram-negativas, sendo considerado eficiente no controle ou eliminação da contaminação endofítica em cultura de tecidos de várias especies de plantas (POLLOCK et al., 1983; YOUNG et al., 1984; HALDEMAN et al., 1987; PHILLIPS et al., 1981). 23 Outra etapa limitante na micropropagação do mamoeiro é o enraizamento in vitro dos brotos. A fase de enraizamento de brotos no processo de micropropagação foi conceituada por MURASHIGE (1974) como estádio III, sucedendo-se aos estádios I e II, que estão relacionados à introdução e multiplicação, respectivamente, dos explantes in vitro. A qualidade das partes aéreas provenientes da fase de multiplicação determina, em geral, o sucesso do enraizamento. Partes aéreas pequenas não enraizam bem e necessitam de uma fase intermediária de alongamento (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). O enraizamento é uma etapa que pode ser realizada in vitro ou in vivo. No primeiro sistema, as raízes são regeneradas em condições assépticas e a planta é transplantada para substrato. No segundo sistema, as partes aéreas são manipuladas como microestacas e todo o processo de enraizamento se dá em substrato. A opção por um dos sistemas depende da qualidade das partes aéreas obtidas na multiplicação, da espécie, do genótipo e da disponibilidade de infra- estrutura adequada em casa de vegetação. Outra alternativa é induzir o enraizamento in vitro e transplantar as partes aéreas para o substrato antes de as raízes aparecerem. Com o aperfeiçoamento de sistemas de manutenção de umidade em casas de vegetação, evolui-se hoje para o enraizamento in vivo (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). A rizogênese ocorre de uma a três semanas e pode ser dividida em indução, iniciação e alongamento de raízes. Enquanto as duas primeiras fases (às vezes consideradas como uma só respondem ou dependem de auxina, o crescimento das raízes é inibido pela presença de auxina. A dificuldade num sistema de micropropagação está em determinar uma condição in vitro na qual todas essas fases possam ocorrer normalmente e, de preferência, sem demandar manipulação adicional de uma fase para outra (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). CARRER (1988), trabalhando com o cv. Improved Sunrise Solo 72/12, obteve melhor formação in vitro de raízes normais quando usou 0,2 mg.L-1 de AIB (Ácido 3-Indolbutírico), em meio MS completo (MURASHIGE e SKOOG, 1962), 24 solidificado com 8 g.L-1 agar, e acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, não informando qual foi a porcentagem de plantas enraizadas. SCHMILDT (1994) trabalhando com o mamoeiro do grupo Formosa, também concluiu que a melhor concentração de AIB para o enraizamento in vitro, corresponde a 0,2 mg.L-1 por um período de 30 dias, em meio MS completo, solidificado com 5 g.L-1 de agar, acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, tendo obtido 45% de plantas enraizadas in vitro e 44,4% de sobrevivência após a aclimatação. Por outro lado, obteve 60% de plantas enraizadas in vitro e 41,67% de sobrevivência após a aclimatação, quando usou dois meios sequenciais, onde primeiro as plantas permaneceram 5 dias em meio MS completo contendo 0,2 mg.L-1 AIB e depois foram transferidas para outro meio MS completo sem AIB. Obteve 50% de plantas enraizadas e 100% de sobrevivência após aclimatação em casa de vegetação, quando as plantas permaneceram por 5 dias em meio MS completo contendo 0,2 mg.L-1 AIB e a seguir foram transferidas para tubetes contendo vermiculita diretamente para a casa de vegetação. Observou que quando as plântulas eram seccionadas logo abaixo de um nó, a resposta rizogênica era mais elevada. Segundo DREW (1987), embora o AIB seja essencial para a iniciação radicular de plântulas de mamoeiro in vitro, a exposição prolongada das mesmas ao AIB pode retardar ou mesmo inibir o enraizamento, ocorrendo a formação de calo na base dos explantes. Por isso muitas vezes é recomendado o uso de meios sequenciais ou de alguma substância como a riboflavina, que quando adicionada ao meio de cultura, foto oxida o AIB em presença de luz, não sendo portanto necessário o uso de meios sequenciais para que ocorra o enraizamento no mamoeiro (DREW et al., 1993). A redução dos macronutrientes, geralmente permite o aumento do enraizamento, provavelmente pela redução do nitrogênio total (GEORGE e SHERRINGTON, 1984). DREW (1987) observou que houve antecipação na formação de raízes pela supressão do nitrogênio amoniacal do meio M de DeFOSSARD et al. (1974). 25 VIANNA (1996) trabalhando in vitro com mamoeiro pertencente ao grupo Formosa, obteve 100% de plantas enraizadas, quando usou dois meios sequenciais sendo o primeiro ½ MS (metade da concentração dos sais e vitaminas do MS) acrescido de 1,0 mg.L-1 AIB por 5 dias, e o segundo ½ MS sem AIB por 30 dias, ambos solidificados com 5 g.L-1 de agar e acrescidos de 30 g.L-1 de sacarose. Observou que, com o incremento dos níveis de AIB (0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,0 e 4,0 mg.L-1), houve aumento na porcentagem de enraizamento, até a concentração de 1,0 mg.L-1, notando que em concentrações superiores, os brotos passaram a apresentar grande quantidade de raízes grossas anormais, com geotropismo negativo e formadas a partir de calo. Observou também que nos brotos que permaneceram por 30 dias em meio contendo AIB, ocorreu a formação de calo na base dos explantes, com raízes crescendo a partir desses, portanto, aparentemente sem conexão. DREW (1988) trabalhando com o enraizamento in vitro do mamoeiro, usou o meio DeFOSSARD et al. (1974) acrescido de 2,0 mg.L-1 AIB, 20 g.L-1 de sacarose, solidificado com 8 g.L-1 de agar, com fotoperíodo de 12 h, e temperatura ao redor de 27oC, obtendo 95% de plântulas enraizadas em um prazo de 21 dias. Observou que após o início da indução do enraizamento, o desenvolvimento ótimo da parte aéra e raízes das plantas ocorreu no meio de DREW e SMITH (1986), sem reguladores de crescimento, mas acrescido de 1 g.L-1 de carvão ativado. Observou que o uso de brotos com crescimento ativo e a remoção de 2 mm da base do caule foi importante para uma ótima iniciação do enraizamento, e também que a exclusão da luz na parte inferior do tubo de ensaio, pela aplicação de tinta preta na superfície externa inferior, melhorou a iniciação do enraizamento dos brotos. DREW (1988) observou que após o início do enraizamento in vitro do mamoeiro em meio contendo 2 mg.L-1 AIB, sem carvão ativado, ocorreu um ótimo desenvolvimento da parte aérea e raízes em meio sem AIB, acrescido de 1 g.L-1 de carvão ativado. MONDAL et al. (1990), trabalhando com a micropropagação do mamoeiro var. Honey Dew, concluíram que o uso do meio MS acrescido de 2,0 mg.L-1 AIB, solidificado com 8 g.L-1 de agar, e acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, resultou em 26 55% de brotos enraizados, e que a concentração de 3,0 mg.L-1 AIB tornou as raízes mais escuras, ocorrendo a formação de calo, suprimindo o crescimento da parte aérea. REUVENI et al. (1990) trabalhando com mamoeiros dióicos de polinização aberta, obtiveram cerca de 90% de enraizamento usando 1 mg.L-1 AIB, com o meio MS modificado, contendo a metade da concentração dos macronutrientes, e a concentração total dos micronutrientes e vitaminas, em um curto período entre 10 e 18 dias. As plantas foram mantidas à 28°C e iluminadas exclusivamente com lâmpadas Grolux, 1000 lux (Sylvania), com fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuro. Observaram que o melhor enraizamento foi obtido com brotos alongados (5-10 mm) com 3 a 5 folhas, e também que brotos com folhas velhas quase sempre não enraizavam. Consideraram como enraizamento ótimo, a presença de pelo menos 4 raízes por planta, com comprimento de 1 cm. Notaram que brotos com raízes muito curtas ou com um menor número de raízes não se desenvolviam bem e por fim deterioravam. WINNAAR (1988) trabalhando com o cv. Sunrise Solo, obteve 35%, 39% e 57% de plantas enraizadas in vitro com o uso de 1, 2 e 4 mg.L-1 de AIB, respectivamente, usando o meio MT (MURASHIGE e TUCKER, 1969), acrescido de 30 g.L-1 de sacarose, e solidificado com 8 g.L-1 de agar. Transferiu as plantas enraizadas para o solo, mas nenhuma sobreviveu devido ao murchamento. De acordo com CALDAS et al. (1998) o carvão ativado é utilizado em meios nutritivos na concentração de 1 g.L-1 para estimular o enraizamento, e uma possível explicação para a sua ação é a adsorção de substâncias tóxicas presentes no meio. Segundo GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998) o carvão ativado fisicamente estimula a condição de escuro no qual as raízes normalmente se desenvolvem melhor, e quimicamente tem efeito diluidor, retendo parte de todos os elementos que compõem o meio, fixando citocininas (6- Benzilaminopurina - BAP) e auxinas (AIB) residuais trazidas nos tecidos das plantas e absorvendo compostos tóxicos inibidores do enraizamento. A fixação das auxinas pelo carvão tem, em geral, uma ação benéfica no alongamento das raízes, que crescem rapidamente, ramificando-se bastante e mantendo uma cor 27 mais clara do que quando expostas à luz. Com a inclusão de carvão ativado no meio de indução há uma menor disponibilidade de auxina livre, sendo que um aumento na concentração da auxina muitas vezes se faz necessário. TEO e CHAN (1994) obtiveram 68% de sucesso no enraizamento in vitro do mamoeiro, mergulhando a base dos brotos em solução contendo 2,5 mg.mL-1 de AIB, e a seguir inoculando-os em meio sem regulador de crescimento, e sem sais minerais ou vitaminas, contendo apenas água destilada, solidificado com 10 g.L-1 de ágar. Concluíram que não é necessário usar nenhum mineral no meio de enraizamento, e que a quantidade de ágar usada no meio também é muito importante no enraizamento, pois quando usaram 7 g.L-1 de ágar ocorreu uma maior formação de calo na base dos explantes, devido à uma maior disponibilidade de água no meio. De acordo com Assis e Teixeira (1998), uma das propriedades atribuídas ao carvão ativado, como sendo benéfica no processo de enraizamento, diz respeito à redução da intensidade de luz na região de formação de raízes. Concentrações muito altas de carvão ativado podem até mesmo impedir o enraizamento. Em E. gunnii X E. dalrymplena, 0,1 g.L-1 de carvão ativado aumentou o enraizamento e 0,25 g.L-1 inibiu o enraizamento (BOULAY, 1985). No crescimento e desenvolvimento de plantas, a luz influi na regulação da morfogênese e atua como fonte de energia para a realização de fotossíntese (HARTMANN e KESTER, 1983). No enraizamento, embora a fotossíntese realizada por explantes in vitro seja relativamente baixa, produtos fotoassimilados são importantes para a iniciação e crescimento radicular. Na rizogênese, as variáveis importantes são a intensidade luminosa, o fotoperíodo e a qualidade de luz (ECONOMOU e READ, 1987). A intensidade ótima de energia luminosa, requerida durante o enraizamento, varia de acordo com o estádio do explante, bem como com a espécie em questão. De maneira geral, pouca luz é necessária durante os estádios iniciais, já que pode inibir o enraizamento, pelo menos na fase indutiva do processo (VIEITEZ e BALLESTER, 1988). Entretanto, após este período, a luz é importante, principalmente, para o crescimento de partes aéreas e alongamento 28 de raízes, além de dotar a planta de maior resistência ao transplantio. ANDERSEN (1986) mostrou que a alta luminosidade propicia maior produção, transporte e acúmulo de auxinas e carboidratos. Entretanto, há também maior produção de ABA e substâncias fenólicas inibidoras do enraizamento. Não se sabe ainda por que o enraizamento é aumentado com a redução da intensidade luminosa. A luz branca resulta da combinação de radiações de diversas cores: violeta, anil, azul, verde, amarelo, laranja e vermelho. Mas nem todas essas radiações têm o mesmo efeito sobre a clorofila, portanto, nem todas agem igualmente estimulando a fotossíntese. A absorção da luz pela clorofila se faz com intensidade máxima nas faixas de comprimento de onda ao redor de 450 nm, que corresponde a cor azul, e ao redor de 700 nm, que corresponde a cor vermelha. A absorção da cor verde é quase nula, a clorofila reflete-a quase que integralmente. O espectro de absorção de luz feito pelas clorofilas a e b, é muito semelhante ao espectro de emissão de luz da lâmpada fluorescente Grolux, que tem picos de emissão de luz nos espectros azul e vermelho, e difere mais do espectro de emissão de luz da lâmpada fluorescente branca, cujos picos estão mais próximos do azul, verde e amarelo. Por isso, a Grolux simula melhor os comprimentos de onda necessários para a fotossíntese das plantas, cujo espectro é semelhante ao da luz solar, favorecendo o processo da fotossíntese, e o melhor desenvolvimento de plantas iluminadas artificialmente (www.sylvania.com.br). 2.3. Aclimatação em casa de vegetação das plantas cultivadas in vitro De acordo com GRATTAPAGLIA e MACHADO (1998), a etapa de transplantio envolve a transferência da planta da condição in vitro para casa de vegetação, onde é submetida a uma fase de aclimatação e endurecimento. Esta passagem é crítica e representa, em alguns casos, um fator limitante do processo de micropropagação. Isto se deve basicamente aos seguintes fatores: (1) a planta passa de uma situação de reduzido fluxo transpiratório, devido à baixa intensidade de luz e à elevada umidade relativa, para um ambiente que demanda um incremento na taxa de transpiração, ficando muito susceptível ao estresse hídrico; 29 (2) a planta passa de uma existência heterotrófica, na qual depende de um suprimento externo de energia (sacarose no meio), para um estado autotrófico, no qual precisa realizar fotossíntese para sobreviver; (3) a planta passa de uma condição de alta disponibilidade de nutrientes no meio para outra onde precisa rapidamente incrementar a absorção de sais; e (4) a planta passa de um ambiente asséptico para outro onde está sujeita ao ataque de microrganismos saprofíticos e, eventualmente, patogênicos. O tipo de sistema radicular obtido no enraizamento in vitro também determina o sucesso de transplantio. Raízes ainda curtas são mais desejáveis, pois facilitam a lavagem e retirada do meio de cultura aderido, bem como a introdução da planta no substrato. Além disso, raízes curtas ou ainda na forma de primórdios radiculares estão numa fase de crescimento ativo, o qual acelera o pegamento da planta e evita o enovelamento. Durante a toalete das mudas, as raízes longas ou muito ramificadas devem ser podadas. Entretanto, podando as extremidades das raízes, retira-se justamente o meristema, prejudicando o seu crescimento. Com uma parte aérea transpirando numa taxa muito acima da capacidade de absorção do sistema radicular, a planta pode murchar e morrer (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Fato semelhante ocorre ao transplantar plantas com uma parte aérea muito grande, resultado de uma permanência excessiva em meio de cultura aguardando o transplantio. Devido a uma razão alta entre parte aérea/raiz, essas mudas tendem a apresentar problemas de sobrevivência. Para máxima eficiência da operação de transplantio, é imperativo que esta seja perfeitamente sincronizada com a fase de enraizamento, de modo que, aos primeiros sinais de emergência de raízes in vitro, as plantas sejam imediatamente transplantadas (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). No transplantio, o estresse hídrico das plantas é geralmente o maior problema. Mesmo uma planta aparentemente perfeita in vitro apresenta uma série de deficiências anatômicas que dificulta o controle da transpiração, permitindo uma rápida perda de água. Os estômatos não são funcionais e respondem muito lentamente ao estresse hídrico; a camada de cera protetora sobre as folhas é 30 mínima ou inexistente; a conexão entre o sistema vascular do caule e das raízes adventícias ainda é precário para permitir um fluxo transpiratório adequado (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). A manutenção de uma umidade relativa alta desde a retirada das plantas do meio de cultura até se verificar a retomada do crescimento da planta é um fator- chave para sua sobrevivência inicial. A planta passa a realizar fotossíntese em níveis suficientes para estimular o desenvolvimento de novas raízes funcionais, um passo importante, pois as raízes formadas in vitro são pouco ramificadas e não conseguem absorver água e sais minerais prontamente do substrato de transplantio. Com a normalização do processo de absorção de sais e água, reinicia o crescimento da parte aérea, preparando a planta para o transplantio final em campo (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). Sistemas de nebulização intermitente são utilizados para manter alta umidade relativa. Os melhores controles automáticos são aqueles que respondem diretamente às condições de umidade do ambiente de transplantio, aumentando ou diminuindo os períodos de nebulização e os intervalos entre eles de acordo com a necessidade (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). O substrato de transplantio deve ter uma boa capacidade de retenção de umidade e não compactar excessivamente, comprometendo a drenagem e a aeração do sistema radicular. Quimicamente ele deve ser de preferência inerte, para permitir a manipulação dos conteúdos de nutrientes de acordo com a necessidade da espécie. Os substratos comumente utilizados incluem vermiculita, perlita, areia, turfa, casca curtida de eucalipto ou Pinus, palha de arroz carbonizada e pó de carvão. Dependendo do período necessário para completar o crescimento, adubações são feitas com soluções nutritivas em cobertura, via irrigação ou por aplicações foliares (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). DREW (1988) trabalhando com mamoeiros dióicos de polinização aberta, obteve 99% de sucesso no estabelecimento de brotos enraizados usando o substrato de turfa/perlita/poliestireno em flocos (1:1:1), com 40% de luz natural, e cerca de 90% de umidade relativa. 31 REUVENI et al. (1990), transferiram plântulas de mamão, que haviam sido enraizadas in vitro, para substrato contendo turfa e poliestireno em flocos (1:1), permanecendo por 2-3 semanas em câmara úmida, tendo obtido cerca de 85% de sobrevivência de centenas de plantas durante a aclimatação. As plantas foram transferidas para casa de vegetação, e a seguir plantadas no campo. Na busca da otimização do processo de micropropagação, a eliminação da etapa de enraizamento in vitro é desejável do ponto de vista econômico, além de melhorar a qualidade do sistema radicular formado na planta. Enraizamento ex vitro é sinônimo de microestaquia. Os tufos de plantas em meio de multiplicação são retirados do frasco e, após lavar o meio aderido, as várias partes aéreas são manipuladas como diminutas estacas. Do ponto de vista econômico, isso representa uma considerável redução de custos de mão-de-obra e infra-estrutura, pois uma repicagem é eliminada e há economia de espaço na sala de crescimento, energia elétrica e meio de cultura. Em termos de qualidade, a regeneração de raízes diretamente no substrato tende a produzir um sistema radicular mais completo e funcional, com maior número de raízes secundárias, sem a formação intermediária de calo, que dificulta a conexão do sistema vascular entre caule e raiz. Além disso, evita-se a manipulação de plantas de raiz nua, ou a poda de raízes, práticas que muitas vezes resultam em má qualidade de transplantio e até na morte das plantas (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). A obtenção de enraizamento ex vitro é fácil com espécies herbáceas ou mesmo lenhosas que apresentam grande capacidade de enraizamento na estaquia. Uma vez que a planta passa de um estado de alta disponibilidade nutricional para uma condição autotrófica, ela deve ser capaz de emitir raízes rapidamente, para absorver os nutrientes necessários. A nebulização intermitente agrava a situação, lixiviando nutrientes da planta. Em espécies que demoram para emitir raízes, as partes aéreas apresentam uma clorose intensa e morrem, não suportando esse processo. Para acelerar a emissão de raízes, as bases das microestacas podem ser tratadas com soluções de auxinas em talco ou água ou, ainda, pré-tratadas em soluções de sacarose (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998). 32 SCHMILDT et al. (1997), trabalhando com o mamoeiro cv. Formosa, obtiveram cerca de 50% de mudas enraizadas, com o cultivo de ramos ex vitro diretamente em casa de vegetação, após indução de enraizamento in vitro por 5 dias em meio MS acrescido de 0,2 mg.L-1 AIB, tendo obtido 100% de sobrevivência após a aclimatação. Produziram cerca de 45% de mudas enraizadas, com o cultivo de ramos in vitro usando o meio MS de indução de enraizamento acrescido de 0,2 mg.L-1 AIB, com 44% de sobrevivência após a aclimatação. Conseguiram 60% de mudas enraizadas quando os ramos permaneceram 5 dias no meio MS acrescido de 0,2 mg.L-1 AIB, e a seguir foram transferidos para o meio MS sem AIB, obtendo cerca de 41% de sobrevivência após a aclimatação. SCHMILDT (1994), teve o cuidado de abrir as tampas dos tubos de ensaio, contendo os ramos de mamão enraizados in vitro, três dias antes do transplante para a casa de vegetação, e usaram como substrato a vermiculita. 2.4. Plantio no campo das plantas aclimatadas em casa de vegetação Com relação ao desenvolvimento no campo de mamaoeiros micropropagados, na página da internet do Depto. de Horticultura da Universidade do Havaí em Manoa (http://www2.ctahr.hawaii.edu/tpss/bookshelf/papaya/papaya.htm), existe uma obsevação de que foram notadas algumas mudanças no sexo dos mamoeiros micropropagados pela Hawaii Sugar Planter's Association. DREW (1988) trabalhando com mamoeiros dióicos de polinização aberta, observou que quando micropropagados e plantados em condições de campo, mostravam excessiva vegetação, menores espaços internós, reduzido estádio juvenil, e produção de frutos próximo ao solo. As plantas jovens apresentavam crescimento vigoroso, e conjunto de flores e frutos 30 a 40 cm acima do nível do solo. Por outro lado, mamoeiros dióicos de polinização aberta, plantados no campo a partir de sementes, tinham 1,5 a 2,0 m de fase juvenil antes de iniciar o florescimento. REUVENI et al. (1990), levaram a campo centenas de mudas de mamão enraizados in vitro e aclimatados em casa de vegetação, tendo observado que as 33 plantas floresceram em altura menor do que as produzidas por semente, e não detectaram a presença de variação somaclonal. 2.5. Determinação sexual HEILBORN (1921) foi o primeiro a relatar o número de cromossomos gaméticos do gênero Carica como sendo n=9 e na forma somática 2n=18. Esse número tem sido subsequentemente confirmado por diversos pesquisadores, mostrando que a meiose é usualmente normal em todas as espécies nos três tipos de sexo (STOREY, 1941; ZERPA, 1959; SUBRAMANYAM e IYER, 1982; MAGDALITA et al., 1997). SUBRAMANYAM e IYER (1982) observaram o comportamento citológico de quatro espécies Carica, dois híbridos interespecíficos (C. monoica x C. cauliflora, e C. cauliflora x C. papaya), e de alguns importantes cultivares de C. papaya, e concluíram que todas as espécies Carica, com exceção de C. quercifolia apresentavam meiose normal. Estudos citológicos em C. monoica x C. cauliflora mostraram várias anormalidades como a presença de univalentes, trivalentes e quadrivalentes em diacinese e atrasos durante a anáfase. Entretanto, a meiose em C. cauliflora x C. papaya foi normal, indicando que embora sejam morfologicamente divergentes, a diferenciação citológica entre essas duas espécies é apenas em nível estrutural, possivelmente gênico, e que elas têm estreita relação, apesar da natureza unidirecional dos cruzamentos. Todos os cultivares de C. papaya, exceto o cv. Pink Flesh Sweet, apresentaram meiose normal. Neste cultivar a meiose indicou a existência de rearranjamentos estruturais como translocações recíprocas de pares homólogos. Estudos citológicos no mamoeiro não têm tido sucesso em mostrar a presença de um par heteromórfico de cromossomos sexuais, o que foi observado em algumas outras espécies vegetais, que têm distintas formas sexuais. Entretanto, KUMAR et al. (1945) relataram que um par de cromossomos separa- se precocemente na Anáfase I da meiose em machos e hermafroditas de mamoeiro, não tendo sido observado em fêmeas. Eles notaram também que não 34 foi possível detectar diferenças morfológicas entre os cromossomos, concluindo que a variação na expresão sexual do mamoeiro não pode ser associada com alguma diferença morfológica visível entre autosomos e o par que se separa precocemente, que poderiam ser os cromossomos sexuais. Subsequentemente, STOREY (1953) examinou várias células mães de pólen de plantas masculinas e hermafroditas, observando que a separação anafásica precoce ocorria com alta frequência, embora ela não tenha sido observada em todas as células em Anáfase. A separação anafásica precoce pode realmente ser uma característica que sirva para distinguir os cromossomos sexuais separadamente dos autosomos. MAGDALITA et al. (1997) trabalharam com 120 híbridos interespecíficos de C. papaya e C. cauliflora, concluindo que apresentavam um número de cromossomos somáticos 2n=16-18, e as análises citológicas revelaram que 7-48% das células em muitos dos híbridos interespecíficos eram aneuplóides, sugerindo que havia ocorrido eliminação de cromossomo. Observaram também que a frequência de células aneuplóides estava negativamente associada (r=0,88) com o número de bandas RAPD obtidas a partir do parental masculino C. cauliflora, amplificadas nos híbridos interespecíficos, o que sugere que a eliminação de cromossomo explica algumas das perdas de bandas RAPD. Além disso, a baixa fertilidade do pólen de 5 híbridos interespecíficos que floresceram e o não florescimento de muitos híbridos, indica que isso pode ser devido a um desbalanceamento cromossômico causado por barreiras de incompatibilidade entre as duas espécies estudadas. De acordo com PARKER et al. (1990), os organismos diplóides têm duas cópias de cada região genética (locus), em pares de cromossomos homólogos. Essas duas cópias são chamadas alelos, apesar de representarem tanto as regiões codificadoras como as não codificadoras do genoma. As regiões codificadoras (exons) são frequentemente intercaladas com as mais variáveis regiões não codificadoras (introns ou regiões intergênicas). A descoberta de cromossomos sexuais em plantas superiores data de 1923 quando vários pesquisadores independentemente relataram a ocorrência de bivalentes heteromórficos em Melandrium album, Rumex acetosa e Humulus spp. 35 (BLACKBURN, 1923; WESTERGAARD, 1958). A existência de cromossomos sexuais heteromórficos é questionável ou insuficientemente estabelecido em algumas espécies (Urtica dioica, Salix spp., Ilex serrata), já em outras espécies tem sido bem estabelecido, a partir de evidências citológicas e genéticas como Cannabis sativa (fêmea XX e macho XY), Humulus lupulus (fêmea XX e macho XY), Asparagus officinalis (fêmea XX e machos XY ou YY), Rumex acetosa (fêmea XX e macho XY1Y2) , enquanto em algumas outras espécies os cromossomos sexuais heteromórficos não foram encontrados (Carica papaya, Vitis vinifera, Sedum rosea). A forma heterogamética é a masculina em todos os casos bem estabelecidos (WESTERGAARD, 1958; WILLIAMS, 1964). A ocorrência de cromossomos sexuais heteromórficos não necessariamente indica que todos os genes que decidem o sexo estão localizados neles. A análise de mecanismos de determinação sexual tem mostrado claramente a existência de no mínimo dois mecanismos de disparo. No primeiro tipo, como ocorre em Rumex acetosella e Melandrium album, o sexo dos indivíduos é decidido inteiramente pela presença ou ausência do cromossomo Y. No outro tipo, exemplificado por Rumex acetosa, o fator determinante do sexo é a proporção entre cromossomos X e autosomos, sendo o cromossomo Y inativo. A existência de um mecanismo XO em plantas não é conhecido com certeza (WESTERGAARD, 1958). DARLINGTON (1958) relatou que um controle eficiente do dioicismo depende da ausência de de “crossing over” entre os blocos de genes de determinação sexual, e isso ocorre em algumas plantas, para o desenvolvimento dos cromossomos sexuais heteromórficos com os genes de determinação sexual restritos aos segmentos diferenciais. O segmento diferencial do cromossomo Y é totalmente excluído pelo “crossing over” e porque a perda resulta em eficiência adaptativa o trabalho do cromossomo Y é frequentemente feito pelos autosomos. Segundo LIONAKIS (1985), uma espécie é chamada bisexual se as flores masculinas e femininas ocorrem na mesma planta. As plantas bisexuais podem ser hermafroditas quando os dois sexos são encontrados na mesma flor, ou monóicas quando os sexos estão restritos a flores separadas na mesma planta. 36 Por outro lado, as espécies são dióicas ou unisexuais quando as flores masculinas (estaminadas) e femininas (carpeladas ou pistiladas) ocorrem separadamente em plantas individuais. O passo do dioicismo para a bisexualidade é frequentemente curto e em muitos casos o dioicismo não está esclarecido. Em muitas espécies dióicas são encontradas na natureza tipos bisexuais, muitas vezes com alta frequência. Uma espécie dióica em que algumas plantas bisexuais (hermafroditas ou monóicas) ocorrem regularmente na natureza, é denominada subdióica. A separação dos sexos em plantas diferentes é encontrada em muitas plantas cultivadas importantes, incluindo Carica papaya, Cannabis sativa, Vitis vinifera, Asparagus officinalis, Humulus lupulus e Actinidia chinensis. Segundo LIONAKIS (1985), a fisiologia da determinação sexual ainda não está claramente entendida, entretanto, é geralmente aceito que todas as plantas têm potencial para desenvolver órgãos sexuais de ambos os sexos, existindo um conjunto de mecanismos determinadores para uma ou outra das duas possíveis cadeias de eventos, uma levando ao desenvolvimento de órgãos sexuais femininos e a outra de masculinos. É provável que não exista um caso bem estabelecido onde a determinação sexual em espécies de plantas estritamente dióicas seja uma função da interação entre genes nucleares e o citoplasma. Entretanto, nas espécies ginodióicas, que apresentam plantas femininas e hermafroditas, um mecanismo de macho esterilidade tem sido observado em muitas espécies, o qual depende da interação citoplasmática/gênica (LEWIS, 1941). Segundo PARKER (1990) a maioria das plantas que florescem são hermafroditas, entretanto, o número das dióicas não é insignificante, com aproximadamente 1500 espécies em 1300 gêneros e 60 famílias mostrando separação dos sexos. De acordo com IRISH e NELSON (1989) a determinação sexual em espécies de plantas dióicas pode ser genética ou ambiental. A determinação sexual genética pode estar controlada por um único locus em um autosomo, multiplos loci em autosomos, ou genes em cromossomos heteromórficos. 37 Recentes estudos sugerem que todas as espécies de plantas possuem os genes necessários para desenvolver flores perfeitas (genes homeoticos - “MADS box genes”; COEN e MEYEROWITZ, 1991) e aqueles genes de determinação sexual, agindo juntamente ou independentemente dos genes homeoticos, interrompem o desenvolvimento do estame ou carpelo em várias fases, levando à diversidade de tipos florais e de sexos observados dentre as plantas que florescem (DELLAPORTA e CALDERON-URREA, 1993; HARDENACK et al., 1994). A base genética da determinação sexual em plantas dióicas pode ser extremamente diversa. Algumas espécies dióicas têm cromossomos sexuais heteromórficos (p. ex., Silene latifolia Poiret), enquanto em outras espécies o sexo é determinado por um ou vários loci nucleares autossômicos, possivelmente influenciados por genes citoplasmáticos (DURAND e DURAND,1991). Similarmente, a regulação hormonal não parece seguir um padrão bem estabelecido. Em Mercurialis, as citocininas causam a conversão de macho para fêmea (LOUIS, 1989), enquanto em Asparagus officinalis, um efeito oposto tem sido observado (BRACALE et al., 1991). Além disso, YIN e QUINN (1995) recentemente propuseram um modelo hormonal para determinação sexual que inclui o controle genético de receptores hormonais, bem como das concentrações dos hormônios endógenos. O controle genético do sexo em populações ginodióicas, compostas por plantas fêmeas e hermafroditas, tem também sido estudado em detalhe, e é bastante diferente daquele das populações dióicas, compostas por plantas machos e fêmeas. Três mecanismos têm sido identificados: macho esterilidade citoplasmática (CMS - “Cytoplasmic Male Sterility”), interações citonucleares, e simples herança nuclear. O controle citonuclear é provavelmente a forma mais comum de determinação sexual em populações de plantas ginodióicas (FRANK, 1989). Às vezes existem vários e diferentes genes citoplasma macho estéreis, juntamente com vários genes macho restauradores nucleares (VAN DAMME e VAN DELTEN, 1982; VAN DAMME, 1983). 38 Os mecanismos de determinação sexual em plantas que florescem são extremamente diversos, variando desde de uma simples determinação cromossomal até determinação citoplasmática e polifatorial. Em populações de plantas dióicas, por exemplo, a determinação sexual pode ser devido a presença de cromossomos sexuais heterocromáticos ou não heterocromáticos (WESTERGAARD, 1958), devido a proporção de cromossomos sexuais (PARKER e CLARK, 1991), ou devido a muitos loci autossômicos distintos (LOUIS, 1989). Entretanto, a presença de um único locus ou cromossomo de determinação sexual, parece ser a forma predominante de determinação sexual em plantas dióicas (WESTERGAARD, 1958; RICHARDS, 1986). O conhecimento dos mecanismos de determinação sexual pode ser extremamente útil em programas de melhoramento genético. Em espécies dióicas é frequentemente benéfica a seleção de um determinado sexo, por exemplo, em Asparagus, os clones masculinos são preferidos em relação aos clones femininos, e em Carica papaya as plantas hermafroditas são preferidas em relação às femininas e masculinas, em plantios comerciais. Então a melhor caracterização da determinação sexual através da identificação de marcas ligadas ou o isolamento de sequências de DNA expressados, traria um grande avanço nos programas de melhoramento de plantas (ALSTROM-RAPAPORT, 1998). De acordo com HESLOP-HARRISON (1972), Turnois em 1912 relatou que o fotoperiodismo estava ligado à expressão sexual em duas plantas dióicas, Cannabis sativa e Humulus japonicus, observando que os dias curtos não apenas aceleravam o florescimento de Humulus japonicus mas também afetavam o sexo das plantas, e apareceram expressões sexuais anômalas em plantas geneticamente masculinas, muitas mostrando inversão sexual ou intersexualidade estrutural. Este experimento com lúpulo é de interesse histórico por ser o primeiro experimento fotoperiódico. Em plantas masculinas de Cannabis sativa crescidas sob dias curtos, Tournois observou uma incidência de intersexualidade excedendo 85%. A conversão de plantas geneticamente masculinas de Vitis vinifera dióicas para hermafroditas funcionais pela aplicação de citocininas foi relatada por NEGI e 39 OLMO (1966, 1971) e MOORE (1970). HESLOP-HARRISON (1956) tratou sisal com ANA (ácido naftalenoacético) e induziu flores femininas em plantas geneticamente masculinas, sugerindo que as auxinas controlam o sexo de acordo com uma curva ótima, sendo esse ótimo menor para o desenvolvimento de plantas masculinas do que para as femininas. BAKER (1947) observou que a infecção de espécies de Malandrium geneticamente femininas, pelo fungo Ustilago violacea, causa completa inversão sexual nas partes mais infectadas, com supressão do desenvolvimento do ovário e desenvolvimento de estames. GOLDSCHMIDT (1955) sugeriu que essa infecção estaria modificando o metabolismo auxínico no primórdio floral em diferenciação. OSTAPEMKO (1960) observou que os conteúdos de polifenoloxidase e peroxidase nas folhas de Cannabis sativa, Asparagus officinalis, Actinidia kolomkta, Hippophae thannoides e Ribes alpinum diferiam muito, mas eram sempre maiores em plantas masculinas do que nas femininas. SANTOS (2001) trabalhando com Carica papaya L. cv. Sunrise Solo, obteve diferentes perfis protéicos em gel bidimensional entre amostras de plantas hermafroditas e femininas. 2.6. Marcadores moleculares De acordo com FERREIRA e GRATTAPAGLIA (1995), marcadores moleculares de DNA também têm sido usados com o objetivo de avaliar relações genéticas entre cultivares, espécies e seus híbridos intra e interespecíficos, além da construção de mapas genéticos. Outro importante objetivo é a identificação de marcadores moleculares ligados a genes de resistência a doenças e pragas, e também genes ligados a determinação sexual e produtividade, facilitando assim a introgressão desses genes em espécies e cultivares de interesse comercial, através de programas de melhoramento vegetal. Essas marcas moleculares podem estar associadas a loci de características qualitativas ou quantitativas (QTLs - “Qualitative or Quantitaive Trait Loci”). 40 De acordo com KARP et al. (1996), dentre os marcadores moleculares de DNA mais usados atualmente pode-se destacar, polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP - “Restriction Fragment Length Polymorphisms”), DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD - “Random Amplified Polymorphic DNA”), polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP - “Amplified Fragment Length Polymorphism”), minisatélites também conhecidos como número variável de sequências repetidas umas após as outras (VNTR - “Variable Number of Tandem Repeats”), microsatélites também conhecidos como sequências simples repetidas (SSR - “Simple Sequence Repeats”) ou sequências curtas repetidas umas após as outras (STR - “Short Tandem Repeats”), região amplificada de sequência caracterizada (SCAR - “Sequence Characterized Amplified Region”), e “differential display” de mRNA reversamente transcrito PCR (DDRT-PCR - “Differential Display Reverse Transcription mRNA PCR”). Várias dessas técnicas moleculares são acompanhadas de uma outra técnica conhecida como reação em cadeia da polimerase (PCR - “Polymerase Chain Reaction”). A técnica do PCR baseia-se na amplificação de um segmento específico de DNA, na qual uma sequência de oligonucleotídios iniciadores (“primers”) se hibridizam à sequência de DNA a ser amplificada. Repetidas desnaturações térmicas da fita de DNA permitem o pareamento dos primers à sequência complementar do DNA molde e conseguinte extensão desses pela DNA polimerase. Os produtos da amplificação podem também se hibridizar com os primers a cada ciclo de desnaturação e pareamento, duplicando exponencialmente o fragmento alvo (SAIKI et al, 1985). Os primers são oligonucleotídios de até 20 ou 25 pb que servem de iniciação para a síntese de DNA pela enzima Taq polimerase. O PCR permite a amplificação do DNA em forma de fita dupla ou simples, e com a transcrição reversa do RNA em cDNA, o RNA pode ser também utilizado (ERLICH et al., 1991). 41 2.6.1. RAPD WILLIAMS et al. (1990), desenvolveram uma técnica baseada no PCR, denominada RAPD, onde uma sequência aleatória de um único oligonucleotídio composto geralmente por 10 nucleotídeos é usada como primer, não sendo necessário o conhecimento prévio da sequência de DNA a ser analisada. O polimorfismo é identificado pela ausência ou p