UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE ODONTOLOGIA e CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA 
CÂMPUS DE ARAÇATUBA 

 

 

 

 

 

 

 

AVALIAÇÃO EX VIVO DA EXPRESSÃO DE TLR-2 E -4  

EM LEUCÓCITOS DE EQUINOS E SUA RELAÇÃO COM A 

TOLERÂNCIA À ENDOTOXINA 

 

 

 

 

 

 

     Luciana Cristina A. Carrenho 

            Médica Veterinária 

 

 

 

 

 

 

ARAÇATUBA - SP 

      2009 



 

 

 

 

1

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE ODONTOLOGIA e CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA 
CÂMPUS DE ARAÇATUBA 

 

 

 

 

 

 

AVALIAÇÃO EX VIVO DA EXPRESSÃO DE TLR-2 E TLR-4 

EM LEUCÓCITOS DE EQUINOS E SUA RELAÇÃO COM A 

TOLERÂNCIA À ENDOTOXINA 

 

     

   

    Luciana Cristina A. Carrenho 

Orientadora: Profª. Ass. Drª. Juliana R. Peiró 

 

 

 

 

Dissertação apresentada à 
Faculdade de Odontologia – 
Unesp, Campus de Araçatuba, 
como parte das exigências para 
obtenção do título de Mestre em 
Ciência Animal (Fisiopatologia 
Médica e Cirúrgica). 
 
 
 

 
ARAÇATUBA – SP 

2009 



 

 

 

 

2

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca da FOA / UNESP 

 
 Carrenho, Luciana Cristina de Andrade 
C314a Avaliação ex vivo da expressão de TLR-2 e TLR-4  
 em  leucócitos de equinos e sua relação com a  
 tolerância à endotoxina / Luciana Cristina de Andrade 
 Carrenho. – Araçatuba: [s.n.], 2009. 
  72 f. : il. + CD ROM 
 
  Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual  
 Paulista, Faculdade de Odontologia e Curso de 
 Medicina Veterinária, Araçatuba, 2009. 
  Orientadora: Profa. Dra. Juliana Regina Peiró 
  
  1. Endotoxemia. 2. Equinos. 3. Receptores Toll-like. 
 4.  Citocinas. I.T. 
 
    CDD 636.0892 
 

 
 
 
 
 
 
 



 

 

 

 

3

DADOS CURRICULARES DO AUTOR 
       

LUCIANA CRISTINA DE ANDRADE CARRENHO - nascida em 30 de 

abril de 1982, na cidade de Bauru, formada em Medicina Veterinária 

pela Universidade Estadual de Londrina – PR, residência na área de 

Clínica Médica, Cirúrgica e Anestesiologia de Grandes Animais pela 

Universidade Estadual Paulista UNESP – Araçatuba e aluna do 

programa de Pós Graduação em Ciência Animal da UNESP- Araçatuba. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

     “Não basta ensinar ao homem uma especialidade,  

porque se tornará assim uma máquina utilizável e não 

uma personalidade. É necessário que adquira um 

sentimento, um senso prático daquilo que vale a pena 

ser empreendido, daquilo que é belo, do que é 

moralmente correto.”  

 

                                                      Albert Einstein 

 



 

 

 

 

5

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Aos meus pais José Roberto e Elza 

Que sempre estimularam todos os meus sonhos e propiciaram a 

realização de mais este projeto, pois sem eles nada seria possível. A 

minha conquista está relacionada diretamente à doação e oferta que 

fizeram em meu favor. Vocês que estiveram junto comigo desde o 

momento em que escolhi ser veterinária e acompanham todos os 

meus passos com carinho protetor. Obrigada por todo apoio e amor. 

Considero-me vitoriosa e dedico meu êxito a vocês, meus grandes 

incentivadores. 

 

Amo vocês! 



 

 

 

 

6

AGRADECIMENTOS 

 

Agradeço, 

 

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo 

financiamento do presente projeto (processo no 2007/53513-4); 

 

Ao Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Faculdade de Odontologia 

– Curso de Medicina Veterinária – Campus de Araçatuba, na pessoa do seu 

Coordenador Prof. Adjunto Marcelo Vasconcelos Meireles, pela oportunidade de 

realização do aperfeiçoamento profissional; 

 

A Deus e a Nossa Senhora, por terem me guiado sempre pelo caminho certo, me 

fazendo entender melhor os meus objetivos e meus sonhos através desse projeto; 

 

A Profa. Ass. Dra. Juliana R. Peiró, minha orientadora, por me dar a chance de 

desenvolver o projeto e por todo seu empenho em todos os momentos do meu 

mestrado; 

 

À Profa. Adjunto Valéria Marçal Félix de Lima, por ceder seu laboratório às minhas 

pesquisas, contribuindo muito para meu projeto e sempre atenciosa e prestativa 

nos meus momentos de dúvida, a quem agradeço profundamente; 

 

À Profa. Ass. Dra. Gisele Fabrino Machado que me auxiliou na realização de uma 

importante etapa desse projeto, cedendo o seu laboratório e todo seu 

conhecimento; 

 

À Profa. Adjunto Cáris Maroni Nunes e o Prof. Adjunto José Fernando Garcia por 

disponibilizarem equipamentos e o Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular 

Animal da UNESP- Araçatuba; 

 



 

 

 

 

7

Ao Prof. Adjunto Marcelo Vasconcelos Meireles, por disponibilizar seu laboratório 

para realização de uma importante etapa do projeto; 

 

Ao Prof. Paulo César Ciarlini por ter realizado a análise dos hemogramas 

completos dos equinos do experimento no laboratório clínico; 

 

À Profa. Luciana Del Rio Pinoti Ciarlini por ter cedido a sala da radiologia 

veterinária, no hospital veterinário, para realização de uma etapa do Western 

blotting; 

  

À Profa. Silvia Helena Venturoli Perri, por ter auxiliado na análise estatística do 

experimento;  

 

Ao Prof. Adjunto João Santana da Silva e seu Doutorando Walter Miguel Turato, 

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, por 

cederem o equipamento para realização de uma importante técnica do projeto e 

orientação na interpretação dos resultados da citometria de fluxo;  

   

Ao meu amado, Rodrigo, que com todo seu amor e paciência esteve presente em 

todas as etapas de mais esse passo na minha vida, da qual ele fará parte para 

sempre; 

 

À minha irmã Patrícia e meu cunhado Marcelo, que mesmo longe, me deram o 

suporte necessário para finalizar mais essa etapa; 

 

Às minhas avós, Maria José Carrenho e Laura Andrade, que sempre torceram por 

mim em todos os momentos; 

 

Às minhas amigas “CAPIVARAS” muito especiais Adriana, Larissa, Flávia, Gisele, 

Bia, Daniela, cuja amizade e alegria levarei para o resto de minha vida, pois foram 

pessoas muito importantes; 



 

 

 

 

8

Aos amigos de pós-graduação Tatiana Barbosa, Karina Fattori e Anivaldo 

(Panorama) por dividirem todo o caminhar da pós-graduação, nas horas difíceis e 

divertidas também; 

 

Aos discentes Paula Reis Mattos e Guilherme Dias Melo por me ajudarem nas 

coletas e na realização das técnicas empregadas; 

 

Ao funcionário Nirmen Carlos Pinheiro e seu cavalo Fogo, pela constante 

disponibilidade em me auxiliar e ceder amostras; 

 

Ao funcionário Antonio Alves, por sempre me auxiliar com generosidade em todos 

os momentos que necessitei; 

 

Às amigas que fiz nos meus estágios, Wendy Turatti Diniz e Cristina Beneli, que 

me ensinaram as técnicas necessárias para meu experimento, nos laboratório de 

Endocrinologia Pediátrica, na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP; 

 

Ao senhor Adriano Carani e à Estância Santa Helena, assim como ao seus 

funcionários, por disponibilizarem os animais para a realização deste estudo, 

sempre que necessário; 

 

Aos pós-graduandos Alex Akira Nakamura e Deuvânia Carvalho da Silva, por 

ajudarem em técnicas do laboratório de PCR. 

 

Aos funcionários da biblioteca do Curso de Medicina Veterinária da UNESP – 

Araçatuba, em especial às bibliotecárias Isabel Pereira Matos e Fátima Maria 

Metello Bertolucci pelo auxílio na elaboração das referências bibliográficas 

 

A funcionária Michele Lamara Leite Bispo, por me ajudar sempre tão 

solicitamente. 

  



 

 

 

 

9

 

SUMÁRIO 

                              Página 

  

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS.............................................. 11 

   Referências............................................................................................... 24 

CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO EX VIVO DA EXPRESSÃO DE TLR-2 E 

TLR-4 EM LEUCÓCITOS DE EQUINOS E SUA RELAÇÃO COM A 

TOLERÂNCIA À ENDOTOXINA............................................................. 

 

 

38 

   Resumo..................................................................................................... 38 

   Introdução................................................................................................. 39 

   Material e Método................................................................................... 41 

   Resultado................................................................................................ 48 

   Discussão................................................................................................. 55 

   Conclusão................................................................................................. 61 

   Referências............................................................................................... 63 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

10

AVALIAÇÃO EX VIVO DA EXPRESSÃO DE TLR-2 E TLR-4 EM LEUCÓCITOS 

DE EQUINOS E SUA RELAÇÃO COM A TOLERÂNCIA À ENDOTOXINA 

 

 

 

RESUMO - A endotoxemia é um importante distúrbio sistêmico que se origina da 

resposta do hospedeiro a um componente das bactérias Gram-negativas, o 

lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina, que é liberado após bacteriólise ou rápida 

multiplicação. A ativação do sistema imune inato pelo LPS é um fator chave para 

o disparo da resposta inflamatória pelo hospedeiro e que acarreta a produção de 

mediadores inflamatórios, responsáveis pelos eventos patológicos da 

endotoxemia. A interação dos receptores Toll-like (TLRs) com antígenos 

específicos deflagram a resposta inflamatória, sendo que o receptor Toll-like-4 

(TLR-4) é ativado pela ação das endotoxinas, enquanto o receptor Toll-like-2 

(TLR-2) interage com uma variedade de componentes microbianos. Uma 

exposição prévia a baixas concentrações de LPS pode tornar os cavalos 

“tolerantes” a um desafio letal subsequente, acarretando uma diminuição na 

produção de citocinas inflamatórias por um período transitório. Pouco se sabe a 

respeito do mecanismo celular deste fenômeno em equinos, supondo-se o 

envolvimento dos receptores Toll-like semelhante ao encontrado em outras 

espécies. Com este estudo investigaram-se os mecanismos celulares da 

tolerância à endotoxina em um modelo ex vivo com sangue total. Foi demonstrado 

redução na síntese de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-6), aumento da 

expressão gênica da citocina anti-inflamatória IL-10, e ausência de expressão do 

TGF-β, após o desafio secundário com LPS. A maior expressão dos receptores 

TLR-2 e -4 após o segundo estímulo de LPS demonstrou que a tolerância à 

endotoxina não acarreta diminuição da expressão de ambos os receptores em 

equinos.  

 

 

 Palavras chave: Endotoxemia, cavalos, receptor Toll-like, citocinas. 



 

 

 

 

11

EX VIVO EVALUATION OF TLR-2 AND TLR-4 EXPRESSION IN EQUINE 

LEUKOCYTES AND RELATIONSHIP WITH ENDOTOXIN TOLERANCE 

 

 

SUMMARY - Endotoxemia is an important systemic disease originated from host 

response to a component of Gram-negative bacteria, lipopolysaccharide (LPS) or 

endotoxin, which is released after bacteria death or quick replication. The innate 

immune recognition of LPS has a key role triggering host inflammatory answer and 

is due to inflammatory mediator’s synthesis, which are responsible for pathologic 

events of endotoxemia. Signs initiated by interaction of Toll-like receptors (TLRs) 

with specific products induce the inflammatory response. Toll-like receptor-4 (TLR-

4) is activated by endotoxin action while Toll-like receptor-2 (TLR-2) interacts with 

a range of microbial compounds. Some studies demonstrate that both can act like 

LPS receptors, although by independent pathways. It was demonstrated that a 

previous exposition to low concentrations of LPS can render horses “tolerant” to a 

lethal subsequent challenge with endotoxin, leading to a diminished release of 

inflammatory cytokines during a transient period. However, little is known about 

the cellular mechanisms involved in this phenomenon in horses, suspecting that 

there is involvement of cell surface receptors, similarly to other species. This study 

investigated cellular mechanisms of endotoxin tolerance in a whole blood ex vivo 

model, demonstrating a reduction on pro-inflammatory cytokines synthesis (TNF-

α, IL-1 and IL-6), increased gene expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 

and no alteration in TGF-β expression, after a secondary stimulus with LPS. The 

Toll-like receptors-2 and -4 increased expression after a second stimulus with LPS 

showed that endotoxin tolerance does not lead to a decreased expression of both 

receptors in horses. 

 

 

Keywords: Endotoxemia, horses, Toll-like receptor, cytokines. 

 

 



 

 

 

 

12

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 

 

 

A endotoxemia associa-se a doenças com altas taxas de mortalidade em 

equinos (MORRIS; MOORE, 1989). Nos adultos, estas doenças incluem várias 

enfermidades que afetam o trato gastrintestinal, principalmente as doenças que se 

caracterizam por inflamação e isquemia intestinal, relacionadas especialmente 

aos sinais de cólica. Trata-se de um distúrbio sistêmico que se origina da resposta 

do hospedeiro a um componente da membrana celular das bactérias Gram-

negativas (KUESIS; SPIER, 1998), sendo responsável por grandes perdas 

econômicas relacionadas aos custos com tratamento, possíveis complicações e 

morte (LOHMANN et al., 2003). 

Os efeitos clínicos induzidas pelas endotoxinas incluem depressão, 

taquicardia, pirexia, taquipnéia e laminite, e em casos mais severos podem 

resultar em um colapso cardiovascular, coagulação intravascular disseminada e 

falência múltipla dos órgãos (SMITH et al., 2005). Alguns equinos podem exibir 

sinais de dor abdominal, enquanto outros parecem ficar deprimidos (MOORE, 

2001). Os sinais clínicos de endotoxemia estão presentes apesar de baixas 

concentrações plasmáticas de endotoxina, pois os equinos são muito sensíveis 

aos efeitos adversos das endotoxinas das bactérias Gram-negativas (KIKU et al., 

2003). 

Há mais de 100 anos, descobriu-se que extratos de bactérias Gram-

negativas eram altamente tóxicos. Com base na suposição que essas toxinas 

eram liberadas do interior da bactéria após sua morte, o termo “endotoxina” foi 

proposto. No entanto, os resultados de estudos bioquímicos subsequentes 

determinaram que estas endotoxinas não eram provenientes  do interior da 

bactéria, mas tratavam-se de componentes lipopolissacarídeos (LPS) da 

membrana externa da bactéria entérica (MOORE, 2001).  

O lipopolissacarídeo é o componente bacteriano mais importante na 

fisiopatologia da endotoxemia (MOORE, 2001) e, embora permaneça intimamente 

associado à membrana externa na bactéria viva, ele é liberado quando ocorre 



 

 

 

 

13

replicação bacteriana rápida, lise ou morte do microorganismo (HENRY; MOORE, 

1993; MOORE, 1981; OLSON et al., 1995). Ele representa de 1 a 10 % do peso 

seco da bactéria Gram-negativa (BRADLEY, 1985; EMAU et al., 1987) e é 

constituído de três regiões, sendo uma externa polissacarídica (O-antigênica); 

uma central, composta por monossacarídeos; e uma região rica em ácidos 

graxos, conhecida como lipídeo A (MOORE, 1981), que é a parte biologicamente 

ativa do LPS (GALANOS et al., 1985).  

O lúmen intestinal do equino contém normalmente uma grande quantidade 

de endotoxinas (MOORE, 1981), porém distúrbios gastrintestinais reduzem a 

eficácia da barreira mucosa (HENRY; MOORE, 1993), facilitando a passagem 

destas para o sistema venoso mesentérico ou linfático, ou então para a cavidade 

peritoneal, e desta maneira alcançando a corrente circulatória (COLLATOS, 1995; 

MOORE, 1995). Em alguns casos, outros mecanismos protetores, como as 

células de Kupffer no fígado e anticorpos antiendotoxina circulantes protegem o 

organismo contra os efeitos deletérios das endotoxinas (BURROWS, 1981). 

Quando a permeabilidade do intestino inflamado ou isquêmico está aumentada, 

ou as células de Kupffer não conseguem detoxificar uma grande quantidade de 

endotoxina liberada, há a síntese de mediadores inflamatórios pelas células do 

hospedeiro as quais, por sua vez, são responsáveis pela mediação de eventos 

patológicos da endotoxemia (BARTON et al., 1996; MOORE, 1995; MORRIS; 

MOORE, 1989; MORRISON et al., 1994; ROBERTS, 1995; SEETHANATHAN et 

al., 1990).  

Embora muitos tipos celulares sejam capazes de sintetizar mediadores 

inflamatórios (BARTON et al., 1996), o monócito é célula pivô que medeia a 

resposta orgânica a endotoxemia (WRIGHT et al., 1990). Esta célula possui a 

capacidade de se ligar ao LPS e de ativar o sistema imune inato pela liberação de 

vários mediadores, como o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), a interleucina-1 

(IL-1) e a interleucina-6 (IL-6) (AKASHI et al., 2000; NOMURA et al., 2000).  

O TNF-α medeia diversos efeitos inflamatórios e metabólicos como a 

ativação, a aderência ao endotélio e a degranulação de neutrófilos, indução de 

febre, aumento da síntese de catecolaminas e atividade pró-coagulante. Resulta 



 

 

 

 

14

assim em microtrombose, extravasamento capilar e necrose hemorrágica em 

órgãos vitais como pulmão, coração, figado, rins e trato gastrintestinal (GYETKO 

et al., 1992).  Desta maneira, aumentos significativos na concentração do fator de 

necrose tumoral têm sido demonstrados no soro e líquido peritoneal de equinos 

com doenças gastrointestinais, e foram associados a um mau prognóstico 

(BARTON et al., 1996 ; MACKAY, 1992 ; MORRIS et al., 1991). 

As interleucinas são uma grande família de citocinas sintetizadas por 

fagócitos mononucleares, que funcionam como reguladores das respostas 

inflamatória e imunológica normais do hospedeiro (MOORE, 1999). A interleucina-

1 também tem sido implicada na patogênese da endotoxemia, causando 

hipotensão, além de agir sinergicamente com outras citocinas. Os picos de 

concentração do TNF-α e da IL-1 são três e 4,5 horas, a partir do início do 

processo, respectivamente (OLSON et al., 1995; SEETHANATHAN et al., 1990).  

Outra citocina importante na endotoxemia é a interleucina-6 (IL-6) (AKASHI 

et al., 2000; NOMURA et al., 2000), que juntamente com a IL-1 e o TNF-α tem um 

papel importante na produção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos 

(GAULDIE et al., 1990) e na indução da febre (LEMAY et al., 1990 ; OPP et al., 

1989). Uma associação positiva e uma correlação linear foram vistas entre as 

concentrações séricas de IL-6 e a resposta febril em equinos que receberam 

endotoxina por via intravenosa (MORRIS et al., 1992). A concentração dessa 

citocina está aumentada em relação a valores basais após 1 a 8 horas de 

estímulo com LPS (BUENO et al., 1999). 

Existem evidências de que além do estímulo para a síntese de mediadores 

pró-inflamatórios, as endotoxinas também originam a síntese e liberação de 

mediadores anti-inflamatórios (FLACH et al., 1997). A interleucina-10 (IL-10) é 

uma citocina anti-inflamatória sintetizada por monócitos, macrófagos e linfócitos, 

cuja produção parece ser regulada pelo fator de necrose tumoral e pela 

interleucina-1. O principal efeito anti-inflamatório da IL-10 parece envolver uma 

desativação dos fagócitos mononucleares e inibição da síntese de citocinas pró-

inflamatórias (FIORENTINO et al., 1991).  



 

 

 

 

15

Outro mediador com potencial anti-inflamatório que merece estudo em 

equinos inclui o fator de crescimento transformador-β (TGF-β), que parece 

apresentar um papel importante na regulação de respostas imunes, 

principalmente por sua função imunossupressora (MOORE, 2001). O papel do 

TGF-β na endotoxemia é controverso, pois ele é responsável por uma menor 

regulação dos reativos de fase aguda (MICHALOPOULOS; DEFRANCES, 1997) 

e inibe a resposta in vitro de macrófagos ao LPS (IMAI et al., 2000). Por outro 

lado, o TGF-β tem sido associado à inflamação sistêmica, apresentando níveis 

elevados tanto na sepse (MARIE et al., 1996) quanto no choque pós-traumático 

(VAREDI et al., 2001), além de induzir a expressão do TNF-α (CHANTRY et al., 

1989) e da IL-6 (TURNER et al., 1990). 

Sabe-se que o TGF-β promove diferentes respostas biológicas ligando-se a 

dois pares de receptores de membranas do tipo I e do tipo II e que 

consequentemente fosforilam proteínas Smads, cuja localização intracelular é 

requerida para regulação da transcrição de genes alvos. O TGF-β1 é secretado 

sob a forma de um complexo latente (LAP), o qual é incapaz de interagir com seu 

receptor, sendo portanto inativo. Ao ser clivado, esse complexo libera TGF-β1 

como uma proteína homodimérica ativa (HUSE et al., 2001; KIMURA et al., 2007; 

LI et al., 2006; MASSAGUE, 1998). 

Esta forma latente pode ser secretada como uma proteína ligadora de 

TGF-β latente (LTBP). O TGF-β não pode se ligar a seus receptores na forma 

latente, precisando ser liberado do interior da LAP ou LTBP. In vitro isto pode ser 

feito por extremos de pH ácido, calor ou várias proteases (ANNES et al., 2003). In 

vivo, o mecanismo para ativação não é tão claro, mas alguns modelos têm 

proposto a ativação proteolítica por transglutaminase, alterações conformacionais 

na LAP pela interação com a trombospondina, ou tração mecânica via integrinas 

nas células epiteliais (ANNES et al., 2004; CRAWFORD et al., 1998; MUNGER et 

al., 1999; NUNES et al., 1995). 

Pouco se sabe a respeito da regulação transcripcional da regulação do 

TGF-β, sendo que em muitos casos os níveis de mensagem do TGF-β não 



 

 

 

 

16

correspondem à quantidade de proteína secretada, sugerindo uma regulação pós-

transcripcional e/ou pós-transducional da expressão do TGF-β (KIM et al., 1992).   

A ativação de monócitos, macrófagos ou neutrófilos pelo LPS para 

produção dessas citocinas é mediada principalmente pelo CD14 (MOORE, 2001). 

O início da resposta inflamatória ocorre quando a proteína ligante de LPS 

transfere o monômero de endotoxina a um receptor superficial celular denominado 

antígeno de diferenciação de agrupamento 14 (CD14), que existe principalmente 

em fagócitos mononucleares. O CD14 é um receptor protéico de reconhecimento 

que identifica endotoxinas como um padrão indicativo de patógenos (STELTER, 

2000), e é ele que inicia a ativação de macrófagos para síntese de citocinas pró-

inflamatórias (DEUTENER et al., 1993).  

Embora o receptor CD14 tenha um papel importante na resposta às 

endotoxinas, falta a este a habilidade de sinalizar ao interior da célula a presença 

da endotoxina na corrente circulatória.  O receptor de superfície está ancorado, 

somente ao exterior da célula, o que não inclui a porção transmembrana 

(MOORE, 2001). Tem sido sugerido que a ligação da endotoxina ao receptor de 

superfície celular CD14 é seguido de uma interação subsequente do complexo 

CD-14-LPS a outros componentes de membrana, que servem na verdade para 

iniciar a sinalização interna. Portanto o CD14 funciona como a principal unidade 

de ligação para o LPS, mas não está diretamente envolvido na sinalização celular 

(LEE et al., 1993). 

Há pouco tempo foram identificados os receptores Toll-like (TLRs)  (BAKER 

et al., 1997; HASHIMOTO et al., 1988; MEDZHITOV et al., 1997), que são 

glicoproteínas de membrana integral tipo I, responsáveis por fazer a comunicação 

entre os aspectos externo e interno da célula (MOORE, 2001). Esta denominação 

“Toll” foi inicialmente dada ao receptor envolvido no desenvolvimento embrionário 

da mosca Drosophila melanogaster (BELVIN; ANDERSON, 1996; LEMAITRE et 

al., 1996), e já foram descritos onze membros da família dos receptores Toll-like 

em humanos (AKIRA; TAKEDA, 2004).  

Dois membros dessa família, os receptores Toll-like-2 e -4 têm sido 

identificados como possíveis receptores envolvidos na sinalização do LPS 



 

 

 

 

17

(KIRSCHNING et al., 1998; POLTORAK et al., 1998; YANG et al., 1998). Estes 

são responsáveis pelo início da cascata da resposta inflamatória (HODGSON, 

2006), então associados com a via de sinalização que resulta na ativação de 

genes que medeiam a resposta imune inata (MEANS et al., 2000) e na atividade 

de produtos de microorganismos invasores (TAKEUCHI; AKIRA, 2001).  

A regulação da expressão dos receptores Toll-like-2 e -4 pelo LPS é 

considerada um dos mecanismos controladores de respostas das células do 

sistema imune frente a bactérias (MARSIK et al., 2003), uma vez que o receptor 

Toll-like-2 (TLR-2)  reconhece uma variedade de componentes microbianos 

(TAKEDA et al., 2003), e o receptor Toll-like-4 (TLR-4) é ativado pela ação das 

endotoxinas (EBERT et al., 2006).  

Um estímulo exagerado ou contínuo ao receptor Toll-like-4 por qualquer 

ligante pode resultar em uma resposta inflamatória, progredindo para hipotensão, 

choque, falência de órgãos e até mesmo a morte (ROSSIGNOL; LYNN, 2005). 

Embora não se observe uma resposta espécie-específica mediada pelo TLR-2, 

este receptor não deixa de ter importância na transdução no sinal do LPS (LIEN et 

al., 1999). 

Estudos recentes em humanos e animais (BUTTENSCHOEN et al., 2008; 

ZHONG et al., 2008) tentam demonstrar que tanto o TLR-2 quanto o TLR-4 

podem agir como receptores para LPS, porém de formas independentes (MEANS 

et al., 2000). As síndromes cólica e da resposta inflamatória severa (SIRS) têm 

sido associadas com a alta expressão dos TLR-2 e TLR-4 (XIONG et al., 2006), 

devendo-se considerar que as atividades biológicas dos receptores Toll-like não 

podem ser extrapoladas dos relatos em humanos e camundongos para equinos 

(BRYANT et al., 2007).   

Com o conhecimento adquirido sobre a interação entre receptores e 

mediadores inflamatórios, desenvolveram-se estratégias para controlar a 

endotoxemia, que envolvem o bloqueio dos efeitos da endotoxina e a modulação 

da resposta pró-inflamatória (ULEVITCH et al., 2001). Experimentalmente, o uso 

preventivo de vários fármacos tem demonstrado um efeito benéfico, diminuindo a 

morbidade e a mortalidade de animais com doença gastrintestinal (PARVIAINEN 



 

 

 

 

18

et al., 2001). Observou-se também que houve efeitos terapêuticos benéficos 

quando ocorreu um efeito cumulativo da exposição ao LPS em equinos 

(MORRESEY, 2001). 

Beeson (1947) demonstrou que coelhos submetidos a injeções repetidas 

de vacina tifóide eventualmente se tornavam resistentes a febre, fenômeno 

referido como “tolerância ao LPS” (VAN EPPS, 2006). Há meio século já existia 

ampla evidência de que um regime de administração de algumas doses de LPS 

induz a tolerância à endotoxina e também aumenta as defesas do hospedeiro 

contra vários patógenos (BIOZZI et al., 1959; HOWARD et al., 1958; WHARTON; 

CREECH, 1949).  

A tolerância ao LPS é definida como uma redução na reatividade ao 

desafio de lipopolissacarídeo após um segundo encontro com a endotoxina 

(CAVAILLON et al., 2003). Constitui um estado transitório, que pode ser induzido 

por um único ou repetidos estímulos com doses subletais de endotoxina, sendo 

observado tanto em animais quanto em humanos (ACKERMANN et al., 2001). 

Esta tolerância pode ser verificada dentro de horas após uma exposição 

secundária ao LPS, envolvendo a participação de mediadores como TNF-α, IL-1, 

IL-6 e IL-10 (GRANOWITZ et al., 1993), inibindo significantemente a habilidade de 

vários tipos celulares em responder ao desafio subsequente com o 

lipopolissacarídeo (BARTON et al., 1996).  

O fator de necrose tumoral (TNF) é provavelmente o melhor marcador de 

tolerância à endotoxina por apresentar uma dramática redução após um desafio 

com LPS em animais “tolerantes”, em contraste ao seu pico definido e rápido em 

resposta a primeira injeção de LPS (MATHINSON et al., 1993). Segundo Allen et 

al. (1996) e Barton et al. (1996), equinos que já apresentaram uma doença 

gastrintestinal, têm menor  produção de  TNF-α quando expostos novamente às 

endotoxinas, diferentemente de animais sem histórico da afecção, sugerindo a 

ocorrência de tolerância à endotoxina (CAMPEBELL et al., 2007).  

Utilizando a indução de febre como ponto limite, dois tipos de tolerância 

têm sido reconhecidos (GRIESMAN; HORNICK, 1973). A tolerância tardia (>72 

horas), provavelmente relacionada ao desenvolvimento de anticorpo contra a 



 

 

 

 

19

região O, que é tipo-específica; e a tolerância precoce (<72 horas), que foi 

considerada não específica, na qual a endotoxina derivada de diferentes espécies 

bacterianas pode iniciar a atividade do sistema retículo-endotelial não-responsivo, 

observado após a administração de LPS heterólogo (CROSS, 2002).  

Este mecanismo de tolerância à endotoxina pode proteger o hospedeiro 

contra o desenvolvimento de uma síndrome choque, causada pela produção 

excessiva das citocinas (MEDVEDEV et al., 2001). Tal fenômeno tem sido 

também chamado de desativação, dessenssibilização, anergia, refratariedade ou 

reprogramação, e em muitos aspectos assemelha-se a uma 

imunodepressão/imunossupressão/imunoparalisia que tem sido descrita em 

pacientes com sepse ou na síndrome de resposta inflamatória sistêmica não-

infecciosa (GRANOWITZ  et al., 1993).  

Bennett Junior (1964) notou que o fenômeno da tolerância à endotoxina é 

experimentalmente tão extraordinário que se torna difícil acreditar que não tenha 

significado clínico. É importante relembrar que a tolerância à endotoxina tem sido 

associada com aumento da resistência e proteção contra lesões teciduais e até 

mesmo mortalidade (ACKERMAN et al., 2001; COLLETTI et al., 1994; EISING et 

al., 1996; HE et al., 1992 ; HEEMANN et al., 2000). Esse aumento de resistência 

em situações estressantes demonstra que a tolerância à endotoxina é muito mais 

do que uma simples diminuição na resposta inflamatória ao LPS (CAVAILLON; 

ADIB-CONQUY, 2006).  

Apesar do exato mecanismo da tolerância à endotoxina ainda não estar 

totalmente elucidado, a ocorrência de menor expressão de receptores de 

endotoxina nas células alvo têm sido proposta (BARTON et al., 1996; 

CAMPEBELL et al., 2007). Dessa maneira, Labeta et al. (1993) analisaram a 

expressão do receptor de superfície CD14 na tolerância ao LPS em células 

fagocitárias humanas, e ao invés de observarem uma diminuição da expressão 

deste receptor, relataram um aumento da expressão do CD14 nas células 

tratadas com o LPS.  Estudo similar em células humanas demonstrou que tanto a 

expressão do RNAm do CD14 quanto a sua expressão de superfície estavam 

aumentadas após  a indução da tolerância ao LPS (ZIEGLER- HEITBROCK et al., 



 

 

 

 

20

1994). No entanto, outros investigadores não encontraram alterações na 

expressão do CD14 após a indução da tolerância ao LPS (MATHINSON et al., 

1993; MCCALL et al., 1993), e desta maneira concluiu-se que a supressão da 

expressão do receptor CD14 não ocorre no mecanismo de tolerância ao LPS 

(FAN; COOK, 2004). Consequentemente, estudos surgiram para investigar o 

envolvimento de outras moléculas nesse fenômeno.  

 A sinalização do LPS mediada pelo TLR-4 requer a expressão 

concomitante da proteína acessória de diferenciação mielóide-2 (MD-2) que está 

fisicamente associada ao TLR-4. Este complexo controla o principal sistema 

sinalizador de resposta, que detecta a presença de microrganismos Gram-

negativos (AKASHI et al., 2000; KAWASHI et al., 2000; SHIMAZU et al.,1999).  

Em macrófagos peritoneais de camundongos, a expressão do RNAm da 

MD-2 não demonstra alterações após o pré-tratamento com LPS (SATO et al., 

2000). Porém, em monócitos de humanos, a expressão do RNAm da MD-2 

encontrava-se aumentada (MEDVEDEV et al., 2002), enquanto Yeo et al. (2003) 

demonstraram uma diminuição da expressão de superfície do complexo TLR-4 

MD-2 após o estímulo com LPS, revelando que o envolvimento dessa proteína na 

tolerância ao LPS ocorre de modo variável. 

Outros pesquisadores investigaram o possível envolvimento somente dos 

receptores Toll-like no fenômeno de tolerância à endotoxina. Estudos realizados 

em monócitos humanos e órgãos de hamsters (MEDVEDEV et al., 2001) ou em 

células mononucleares de humanos (ADIB-CONQUY; CAVAILLON, 2002),  

demonstram que a expressão do RNAm do TLR-4 nestas células  diminuiu após a 

segunda dose de LPS, enquanto a expressão de superfície do TLR-4 não foi 

alterada. Desta maneira, sugeriu-se que os mecanismos de tolerância ao LPS não 

poderiam simplesmente ser explicados como uma maior ou menor regulação dos 

receptores de superfície (FAN; COOK, 2004).  

A tolerância à endotoxina é demonstrável tanto in vivo quanto in vitro, tanto 

em organismos vivos como em células isoladas. A diminuição na produção de 

citocinas também foi reproduzida em modelos ex vivo de tolerância em humanos 



 

 

 

 

21

com sepse (GRANOWITZ et al., 1993), assim como em células mononucleares 

“tolerantes” de equinos (DURANDO et al., 2005). 

 A supressão de várias citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-6) pode 

ocorrer durante a tolerância à endotoxina (WYSOCKA et al., 2001), sendo que a 

capacidade dos monócitos em produzir TNF-α está diminuída durante o fenômeno 

in vitro em ratos (FLOHE  et al., 1991), coelhos (WAKABAYASHI et al., 1994) e 

humanos (ZIEGLER-HEITBROCK et al., 1992). No entanto, a produção de IL-1 

pode estar aumentada nos macrófagos peritoneais de camundongos (SEATTER 

et al., 1994), diminuída em células humanas (ZIEGLER-HEITBROCK et al., 1992) 

ou inalterada como encontrado in vitro em murinos (TAKASUKA et al., 1991). 

Assim como os níveis de IL-6 encontram-se aumentados em macrófagos 

peritoneais de camundongos (HIROHASHI et al., 1996) e monócitos de humanos 

(MENGOZZI et al., 1993) ou reduzidos nas células humanas (ZIEGLER-

HEITBROCK et al., 1992), caracterizando um padrão contraditório na expressão 

de tais citocinas no fenômeno de tolerância à endotoxina.   

Como as citocinas IL-10 e TGF-β têm efeito anti-inflamatório (HORWARD 

et al., 1993), sugeriu-se um aumento nas suas produções durante o fenômeno de 

tolerância à endotoxina (RANDOW et al., 1995). O uso de anticorpos anti-TGF-β e 

anti-IL-10 demonstrou previnir a tolerância (RANDOW et al., 1995). Porém, 

enquanto alguns autores demonstraram um aumento na expressão de IL-10 em 

modelos in vivo (FRANKENBERGER et al., 1995; VARMA et al., 2001), outros 

demonstraram uma diminuição na liberação dessa citocina em um modelo ex vivo 

de tolerância (VAN DER POLL et al., 1996) e em cultura de células em humanos 

(KARP et al., 1998).  

Assim, os modelos experimentais a serem escolhidos para mimetizar o 

fenômeno de tolerância à endotoxina devem ser cuidadosamente avaliados. O 

modelo in vitro apresenta desvantagens, pois os monócitos em cultura não 

respondem ao LPS da mesma maneira como no sangue total, e o procedimento 

de isolamento em condições de cultura pode ativar as células, podendo interferir 

com a ativação específica pelo LPS (DE LA CALLE et al., 2002).  



 

 

 

 

22

Já os modelos in vivo também apresentam desvantagens, uma vez que a 

infusão de doses baixas de endotoxina (0,03-0,10 µg/kg) em equinos é suficiente 

para induzir hipertensão pulmonar moderada e diminuir significantemente o fluxo 

sanguíneo para o tecido intestinal (BAXTER, 1995; CLARK; MOORE, 1989; 

CLARK et al., 1991; MOORE; MORRIS, 1992).   

Dependendo da dose de LPS, os sinais clínicos da endotoxemia 

experimental podem variar de febre sem mal-estar evidente à falha múltipla de 

órgãos. Em um equino exposto a um “bolus” intravenoso com uma dose subletal 

de endotoxina (1µg/kg), há um período de taquipnéia discreta. Ao redor de uma 

hora, depressão, inquietação e inapetência manifestam-se gradualmente, 

verificando-se um aumento progressivo da temperatura corpórea ao final de 2 

horas (MACKAY et al., 1991; MACKAY et al., 1992). Os modelos in vivo também 

levam à ativação de ligantes endógenos dos receptores Toll-like, outras células 

ecomponentes da cascata de coagulação (FAURE et al., 2001; SMILEY et al., 

2001). 

Como demonstrado por diversos autores (HADLEY et al., 2005; HADLEY et 

al., 2007; WANG et al., 2000; WANG et al., 2001; YAGUB et al., 2003) o modelo 

ex vivo com sangue total apresenta vantagens como a estabilidade em relação à 

contagem e viabilidade de leucócitos ao longo do período de 24 horas. Desta 

maneira, este modelo permite quantificar a expressão do receptor Toll-like-4 em 

humanos, demonstrando a interação entre as populações celulares e mediadores 

da resposta imune inata (HADLEY et al., 2007). A quantificação de citocinas 

inflamatórias foi obtida por outros estudos (HADLEY et al., 2005; WANG et al., 

2000), com relato de produção similar ao encontrado em cultura de monócitos 

(WANG et al., 2000). Este modelo é tempo e custo-eficiente, assim como de fácil 

uso, reduzindo a necessidade de experimentos animais (YAGUB et al., 2003).  

Na imunologia experimental vários receptores de superfície das células 

podem ser determinados através da citometria com o uso de anticorpos 

monoclonais específicos conjugados a um determinado fluorocromo (DAVIS et al., 

2002). Os citômetros de fluxo têm como princípio básico aspirar células ou 

partículas de uma suspensão e forçá-las a passar por uma câmara especial que 



 

 

 

 

23

faz com que as células fiquem envolvidas e centralizadas num fluxo contínuo de 

líquido e saiam desta câmara uma atrás da outra de modo que uma única célula 

seja interceptada pelo laser. Primeiro, uma parte da luz é espalhada (scatter) de 

acordo com as características morfológicas e estruturais da célula. Segundo, as 

células previamente marcadas com fluorocromos, uma vez excitadas pelo laser, 

emitem luz de acordo com suas características fluorescentes e são utilizadas para 

se examinar aspectos bioquímicos, biofísicos e moleculares das células 

(CHAPMAN, 2000).  

A citometria de fluxo é muito importante para avaliar a expressão dos 

receptores Toll-like na superfície celular de leucócitos humanos em modelos in 

vitro (MARSIK et al., 2003) e ex vivo (HADLEY et al., 2007; WITTEBOLE et al., 

2005). Demonstrou-se, por meio desta técnica, que o LPS também modula a 

expressão dos receptores Toll-like-2 e -4 em modelos ex vivo e in vivo na 

endotoxemia equina (PEIRÓ et al., 2008).  

Métodos confiáveis e específicos como a reação em cadeia da polimerase 

(PCR) têm sido empregados para mensurar a expressão de citocinas (FICKO; 

CERNELE, 2005; HEID et al., 1996; WANG; BROWN, 1999).  A PCR em tempo 

real (qRT-PCR) apresenta vantagens como rapidez, especificidade, sensibilidade 

e quantificação. A amplificação é dividida em 3 fases: a linha basal na qual não há 

produtos de PCR suficientes para detectar fluorescência, a fase log em que a 

quantidade de produtos de PCR dobra a cada ciclo e a fase platô onde não há 

mais aumento no número de produtos (GACHON et al., 2004). Existem dois 

métodos de quantificação na PCR em tempo real: a detecção não-específica e a 

específica. O Syber Green é o exemplo mais utilizado de detecção não-específica, 

no qual fluoróforos fluorescentes se ligam à fita-dupla de DNA, emitindo 

fluorescência, enquanto o TaqMan utiliza uma sonda altamente específica para a 

sequência alvo, liberando fluorescência apenas na presença do produto de PCR 

de interesse (SCHAAD; FREDERICK, 2002). 

Desta maneira, acredita-se que o sistema imune possa ser um alvo 

terapêutico interessante (BROAD et al., 2006), e que a tolerância à endotoxina 



 

 

 

 

24

possa ser um mecanismo decorrente da evolução, pela supressão da liberação de 

citocinas durante a sepse.  

Interessantemente, pouco se sabe a respeito do fenômeno de tolerância à 

endotoxina em equinos (DURANDO et al., 2005), sua natureza e o significado 

fisiológico permanecem ainda desconhecidos até hoje, semelhante a quando 

inicialmente descritos (CROSS, 2002). Apesar do conhecimento já adquirido em 

humanos e em outros animais, é necessário um melhor entendimento dos 

mecanismos da resposta celular a um segundo estímulo com LPS nos equinos. 

Assim, os objetivos desse estudo incluem tentar identificar o papel dos 

receptores Toll-like-2 e -4 durante o fenômeno da tolerância ao LPS em um 

modelo ex vivo de sangue total em equinos, e investigar os possíveis efeitos 

supressores do estímulo secundário de LPS neste modelo, através da 

quantificação da produção de citocinas como TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e TGF- β.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

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259, 2008. 

ZIEGLER-HEITBROCK, H.; BLUMENSTEIN, M.; KAFFERLEIN, E. et al. In vitro 

desensitization to lipopolysaccharide suppresses tumor necrosis factor, 

interleukin-1 and interleukin-6 gene expression in a similar fashion. Immunol., v. 

75, n. 2, p. 264-268, 1992. 

ZIEGLER-HEITBROCK, H.W.; WEDEL, A.; SCHRAUT, W. et al. Tolerance to 

lipopolysaccharide involves mobilization of nuclear factor kappa B with 

predominance of p50 homodimers. J. Biol Chem., v. 269, n. 95, p. 17001-17004, 

1994.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

39

CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO EX VIVO DA EXPRESSÃO DE TLR-2 E TLR-4 EM 

LEUCÓCITOS DE EQUINOS E SUA RELAÇÃO COM A TOLERÂNCIA À 

ENDOTOXINA 

 

RESUMO 

 

O fenômeno de tolerância à endotoxina tem se mostrado presente em várias 

espécies, sendo necessária uma melhor compreensão deste processo em 

equinos. O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis efeitos supressores do 

estímulo secundário de LPS num modelo ex vivo, através da quantificação da 

produção de citocinas inflamatórias como o TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e TGF-β, 

assim como identificar o papel dos receptores Toll-like-2 e -4 neste processo. 

Foram utilizados seis equinos, da raça Quarto-de-Milha, de ambos os sexos, 

média de oito anos de idade, sem histórico de doença gastrintestinal ou de 

cirurgia abdominal. As amostras de sangue total foram incubadas durante 24 

horas a 37º C com 5% de CO2, na presença (1, 10 ou 100 ng/mL) ou ausência de 

LPS (0 ng/mL). Após 4 horas, as amostras foram reestimuladas com LPS em 

diferentes concentrações. Alíquotas de 100 µL de sangue foram coletadas nos 

momentos 0, 2, 4, 8 e 24 horas após o estímulo primário de LPS. A expressão dos 

genes das citocinas TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e TGF-β foi quantificada por PCR em 

tempo real e a expressão dos receptores Toll-like-2 e -4 foi verificada através de 

citometria de fluxo. Observou-se uma diminuição das citocinas pró-inflamatórias 

(TNF-α, IL-1, IL-6) e aumento da citocina anti-inflamatória IL-10 após o estímulo 

secundário de LPS, nas concentrações 1, 10 e 100 ng/mL de LPS. Não houve 

expressão gênica do TGF-β. No entanto, houve um aumento da expressão dos 

receptores Toll-like-2 e -4 de maneira significativa nos momentos 8 e 24 horas 

após o segundo estímulo de LPS, nas três concentrações de LPS (1, 10 e 100 

ng/mL). Os resultados observados sugerem que a tolerância à endotoxina não 

esteja relacionada com a diminuição da expressão do TLR-2 e TLR-4 em equinos. 

 

Palavras-chave: citometria de fluxo, endotoxemia, lipopolissacarídeo, qRT-PCR. 



 

 

 

 

40

INTRODUÇÃO 

 

 

A endotoxemia é um distúrbio sistêmico que se origina da resposta do 

hospedeiro a um componente da membrana celular das bactérias Gram-

negativas, o lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina (KUESIS; SPIER, 1998). O 

lúmen intestinal do equino contém normalmente uma grande quantidade de 

endotoxinas, porém distúrbios gastrintestinais reduzem a eficácia da barreira 

mucosa, facilitando a passagem destas para a corrente circulatória (COLLATOS, 

1995; HENRY; MOORE, 1993; MOORE, 1981). Trata-se de uma das principais 

causas de morbidade e mortalidade nos equinos (MORRIS, 1991). 

A endotoxina é liberada quando ocorre replicação bacteriana rápida, lise ou 

morte do microorganismo (OLSON et al., 1995), induzindo assim a síntese de 

muitos mediadores inflamatórios pelas células do hospedeiro os quais, por sua 

vez, são responsáveis por eventos patológicos da endotoxemia (BARTON et al., 

1996; MOORE, 1995; MORRIS; MORRE 1989; MORRISON et al., 1994; 

ROBERTS, 1995; SEETHANATHAN et al., 1990).  

As alterações clínicas mais comuns em equinos endotoxêmicos incluem 

alterações na coloração das membranas mucosas, aparecimento de linha tóxica 

ao redor dos dentes, aumento do tempo de preenchimento capilar, elevação das 

frequências cardíaca e respiratória, diminuição dos borborigmos intestinais, febre, 

hemoconcentração e trombocitopenia (MOORE, 2001).  

Esses sinais são desencadeados principalmente pela presença de 

mediadores inflamatórios como as citocinas, que são proteínas reguladoras 

secretadas por macrófagos e exercem papel-chave na regulação da imunidade 

(TIZARD, 1998). Esses mensageiros são responsáveis por induzir múltiplas 

atividades nas células hospedeiras locais ou distantes, modulando processos 

inflamatórios e imunológicos do hospedeiro. Os subtipos que demonstraram ser 

mais operantes na endotoxemia incluem o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e 

as interleucinas (IL)-1 e -6 (HENRY; MOORE, 1993), assim como a IL-10 e o 



 

 

 

 

41

TGF-β, que têm potencial anti-inflamatório (FIORENTINO et al., 1991; HORWARD 

et al., 1993; VOGEL; HOGAN, 1990).  

A atividade da endotoxina é um processo mediado principalmente pelo 

receptor CD14, que devido à ausência de um domínio intracelular necessita ligar-

se a outros receptores (DELUDE et al., 1995; INGALLS et al., 1999; ULEVITCH; 

TOBIAS, 1994). Desta forma, a descoberta dos receptores Toll-like (TLR) (BAKER 

et al., 1997; HASHIMOTO et al., 1988; MEDZITHOV et al., 1997) teve grande 

importância, uma vez que são proteínas responsáveis por realizar a comunicação 

entre os aspectos externo e interno da célula (WITTEBOLE et al., 2005). Estas 

proteínas transmembranas têm um papel essencial no reconhecimento de 

patógenos, sendo que a sinalização via Toll-like é um fator importante na defesa 

do hospedeiro (UNDERHIL; OZINSKY, 2002).  

Dois membros da família dos receptores Toll-like, o TLR-2 e -4 são 

responsáveis pela sinalização celular estimulada via LPS (CHOW et al., 1999; 

KIRSCHNING et al., 1998; QURESHI et al., 1999; YANG et al., 1998), e a 

expressão destes é considerada um dos mecanismos controladores das 

respostas das células do sistema imune frente a bactérias (MARSIK et al., 2003). 

Sabe-se que o receptor Toll-like-2 tem atividade em uma variedade de 

componentes microbianos (TAKEDA et al., 2003), e o receptor Toll-like-4 é 

ativado pela ação das endotoxinas, controlando o principal sistema sinalizador de 

resposta à bactérias Gram-negativas (EBERT et al., 2006; ROSSIGNOL; LYNN, 

2005). Tais receptores são expressos nos leucócitos e outras células (DE LA 

CALLE et al., 2002), e outros pesquisadores tentam demonstrar que ambos os 

receptores podem reconhecer o LPS de forma sinérgica (BUTTENSCHOEN et al., 

2008; ZHONG et al., 2008). 

Alguns estudos demonstraram que a expressão desses receptores está 

envolvida no fenômeno conhecido como tolerância à endotoxina (ADIB-CONQUY; 

CAVAILLON, 2002; ZHONG et al., 2008), caracterizado em organismos que 

tiveram uma segunda exposição ao LPS após algumas horas do estímulo 

primário, com uma consequente diminuição na resposta inflamatória e até mesmo 

das manifestações clínicas. Esta tolerância pode ser observada dentro de horas 



 

 

 

 

42

após uma exposição secundária ao LPS envolvendo a participação de 

mediadores como TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e o TGF-β (GRANOWITZ et al., 1993).  

Na espécie equina, o primeiro relato de tolerância in vivo demonstrou uma 

diminuição da temperatura retal e na produção do TNF-α (ALLEN et al., 1996); 

outro estudo mais recente revelou uma supressão na produção das citocinas 

inflamatórias (TNF-α, IL-1, IL-4, IL-6 e IL-10) em um modelo ex vivo de tolerância 

à endotoxina (DURANDO et al., 2005). O envolvimento dos receptores Toll-like 

poderia ser uma possível explicação para o mecanismo celular de tal fenômeno 

(FAN; COOK, 2004).   

Portanto, os objetivos desse estudo incluem verificar a modulação da 

expressão das citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-6) e anti-inflamatórias (IL-

10 e TGF-β) durante a tolerância à endotoxina, utilizando um modelo ex vivo com 

sangue total em equinos; assim como avaliar alterações na expressão dos 

receptores protéicos Toll-like-2 e -4 em leucócitos do sangue periférico, 

desvendando assim o mecanismo celular desse fenômeno. 

 

 

 

MATERIAL E MÉTODO 

 

 

 Animais – Foram utilizados 6 equinos (5 machos e 1 fêmea), com idade média 

de 8 anos, peso médio de 450 kg,  pertencentes à raça Quarto-de-Milha. Os 

animais foram avaliados clinicamente, vermifugadosa e somente equinos com 

valores normais de hemograma e sem histórico anterior de doença gastrintestinal 

ou de cirurgia abdominal foram incluídos neste estudo. O protocolo experimental 

foi aprovado pela Comissão de Ética e Bem-Estar da Unesp-Araçatuba 

(2008/007550). 

 

                                                 
a Eqvalan® Pasta, Merial, Campinas, SP, Brasil 



 

 

 

 

43

 

Western blotting – A técnica foi realizada segundo Monick et al. (2003), a fim de 

validar o uso de anticorpo humano para realizar citometria de fluxo neste estudo. 

As amostras (10 mL) de sangue humano e equino foram colhidas em tubos com 

heparina sódicab. Realizou-se a lise das hemácias com um tampão contendo 5M 

NaCl e 1M Tris-HCl (pH 7,4), seguido da adição de um tablete de inibidor da 

proteasec, a cada 10 mL de tampão de lise. As proteínas foram separadas por 

eletroforese (SDS-PAGE a 10%), por 3 horas, a 80 mA. Em seguida, realizou-se a 

transferência para uma membrana de nitrocelulosed por 2 horas. O bloqueio de 

ligações inespecíficas foi feito com PBST (0,01 M e pH 7,2), acrescido de 5% de 

leite desnatadoe, incubado por 3 horas, à temperatura ambiente. Após três 

lavagens com PBST (0,01 M e pH 7,2), a membrana foi incubada com anticorpo 

primário monoclonal anti-Toll-like-2f (1 : 500) ou -4g (1 : 500) humano em PBST, 

“overnight”, a 4º C. A membrana foi lavada três vezes e incubada por 1 hora com 

um anticorpo secundário conjugado à peroxidaseh (1 : 5000). Após as últimas três 

lavagens, as bandas imunorreativas foram reveladas utilizando o reagente ECL 

Plusi, seguindo as instruções do fabricante. 

 

 

Modelo ex vivo – As amostras de sangue dos equinos foram colhidas por 

venopunção jugular em tubos contendo EDTAj e incubadas durante 24 horas na 

presença ou ausência de LPS. As amostras do grupo controle (14,5 mL) foram 

estimuladas com 500 µL de tampão PBS (0,01 M e pH 7,2), enquanto que as 

                                                 
b Tubos com heparina sódica, BD, Vacutainer® 10 mL, Franklin Lakes, EUA. 
c Protease Inhibitor Cocktail tablets, Roche Applied Science Inc., Indianapolis, IN, EUA. 
d Nitrocellulose membrane, Bio-rad Laboratories, Richmon, CA, EUA. 
e Leite em pó Molico®, Nestlé Brasil Ltda. Fábrica de laticínios, Araçatuba, SP, Brasil. 
f  Affinity purified anti-human toll-like receptor-2 (CD282, TLR2), eBioscience, San Diego, CA, EUA 
g Affinity purified anti-human toll-like receptor-4 (CD284, TLR4), eBioscience, San Diego, CA, EUA 
h  Anticorpo anti-mouse IgG1 com peroxidase, eBioscience, San Diego, CA, EUA 
i  ECL Plus, Amersham GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, EUA.   
j  Tubos com EDTA K3, BD Vacutainer® 4,5 mL, Plymouth, Devon, Reino Unido. 



 

 

 

 

44

amostras de sangue total do grupo experimental foram estimuladas com 500 µL 

de uma solução contendo 1, 10 ou 100 ng/mL de LPS derivado de E. coli 

(O55:B5)k. As amostras permaneceram em uma rotisseriel a 37o C, com 5% de 

CO2 por 24 horas. Após 4 horas do início da incubação, as amostras foram 

reestimuladas com LPS (1, 10 ou 100 ng/mL) de E. coli k  ou tampão de PBS (0,01 

M e pH 7,2) (Figura 1).  

 

 

FIGURA 1 - Delineamento experimental. LPS1 indica o primeiro estímulo com lipopolissacarídeo 
nas diferentes concentrações (1,10 ou 100 ng/mL ou tampão PBS (0 ng/mL); LPS2, o 
estímulo secundário com lipopolissacarídeo (1, 10 ou 100 ng/mL) ou tampão PBS (0 
ng/mL). Os momentos da colheita (0, 2, 4, 8 e 24 horas) das amostras de sangue 
para a citometria e qRT-PCR estão também indicados na figura. 

 

 

Expressão dos receptores Toll-like -2 e -4   – A expressão destes receptores foi 

quantificada por citometria de fluxom. Amostras de sangue total dos equinos (100 

µL) foram transferidas para tubos de poliestirenon e incubadas durante 30 minutos 

em temperatura ambiente, com 30 µL dos seguintes anticorpos: o anticorpo anti-

                                                 
k E. coli (O55:B5), Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA. 

l  Labquake rotisserie, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA. 
m Guava EasyCyte™ Mini, GE Healthcare, Hayward, CA, EUA. 
n Tubos Falcon poliestieno (15 mL), Becton and Dickinson, Plymouth, Devon, Reino Unido. 



 

 

 

 

45

receptor Toll-like-2 humano [TLR-2; isiothiocionato de fluoresceína (FITC)]o, o 

anticorpo anti-receptor Toll-like-4 humano [TLR-4; ficoeritrina (PE)]p, e os isotipos 

controlesq. Para lisar as hemácias foram adicionados 3 mL de tampão de NH4Clr. 

Os tubos foram invertidos, gentilmente, várias vezes, e permaneceram em 

temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida as amostras foram submetidas 

à centrifugação em 1000 rpm durante 8 minutos a 25º C. O sobrenadante foi 

descartado e as células lavadas com 3 mL  de  tampão PBS (0,01 M e pH 7,2), 

seguido de agitação mecânicas. Após centrifugação a 1.000 rpm durante 8 

minutos a 25º C, foi realizado descarte do sobrenadante. O pelete foi agitado em 

seu líquido de lavagem residual e ressuspendido em 300 µL de paraformaldeído a 

2%.  As amostras foram armazenadas a 4o C, protegidas da luz, até o momento 

da análise. A aquisição foi realizada em citômetrom, utilizando 10.000 eventos por 

amostra. Para separação das populações de leucócitos foi realizada a análise por 

tamanho e granulosidade e os dados foram avaliados pelo software FACSDiva 

v.6.1.1t, onde foram criados portões para definir as populações de neutrófilos 

(R1), linfócitos (R2) e monócitos (R3) (Figura 2), considerando-se a porcentagem 

de células duplamente marcadas. Os valores foram corrigidos para ligações 

inespecíficas subtraindo-se os valores das amostras com isotipos controles. 

 

 

 

 

 

 
                                                 
oFluorescein isothiocyanate (FITC) anti-human Toll-like receptor 2 (CD282, TLR2, TLR-2), 

eBioscience, San Diego, CA, EUA.  
p Phicoerytrin (PE) anti-human Toll-like receptor 4 (TLR4, TLR-4), eBioscience, San Diego, CA, 

EUA.  
q IgG2a Isotype Control, eBioscience, San Diego, CA, EUA. 
r 1X RBC Lysis buffer, eBioscience, San Diego, CA, EUA. 
s Vortex Phoenix, AP-56, Luferco, Araraquara, SP, Brasil. 
t FACSDiva™ software, versão 6.1.1, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA. 



 

 

 

 

46

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 2 - Identificação das populações de leucócitos: neutrófilos (R1), linfócitos (R2) e 

monócitos (R3) durante a citometria de fluxo, utilizando granulosidade (side scatter) 
versus tamanho (forward scatter) das células.                     

 

 

Isolamento de leucócitos para obtenção de RNA – De cada amostra incubada 

com e sem LPS,  500 µL de sangue total foram transferidos  para tubos de 

microcentrífuga  (2 mL) para o isolamento total do RNA com “kit” comercialu de 

acordo com as instruções do fabricante, nos momentos indicados. Em seguida, 

foram adicionados 1,3 mL de RNAlaterv para estabilizar o RNA. Estas amostras 

foram armazenadas a -20º C até o momento da extração do RNA.   

 Foram então separadas as fases aquosa e orgânica. A fase aquosa foi 

utilizada para a purificação final do RNA. Realizou-se o tratamento com DNAse 

para se remover o DNA genômico no RNA eluído.  

 

 

Transcrição reversa e Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em 

tempo real (qPCR) – O cDNA sintetizado a partir do RNA recuperado dos 

leucócitos foi submetido à análise pela RT-PCR para se verificar a expressão dos 

seguintes genes: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e TGF-β utilizando-se primers e probes 

específicos. Estes primers e probes foram desenhados através de software 

                                                 
u RiboPure®-Blood, número de catálogo AM 1928, Ambion, Austin, TX, EUA 
v RNAlater, número de catálogo AM7021, Ambion, Austin, TX, EUA 



 

 

 

 

47

comercialw e sintetizados por empresas comerciais. As sequências de 

nucleotídeos que foram usadas para o desenho dos primers e probes foram 

obtidas através do GenBank com base na espécie equina, e estão representados 

na Tabela 1.  

 As reações de PCR continham 20 nM de cada primer, 10 nM de cada 

probe, PCR Mastermix comercialx e 2,5 µL de cDNA da amostra em um volume 

final de 25 µL. Curvas-padrão relativas foram construídas usando-se onze 

diluições seriadas do RNA total. Estas diluições sofreram transcrição reversa 

como descrito anteriormente para o cDNA. O cDNA preparado a partir do RNA 

não diluído recebeu o valor relativo de 1024. A primeira diluição 1:1 recebeu o 

valor relativo de 512, a segunda diluição 1:1 recebeu o valor relativo 256, etc, até 

à diluição final (11ª) a qual foi designado o valor relativo de 1. 

  As amostras foram colocadas, em duplicata, em placas de 96 poços e 

amplificadas em termocicladory. As condições de amplificação foram 2 minutos a 

50º C, 10 minutos a 95º C, 40 ciclos de 15 segundos a 95º C e 60 segundos a 60º 

C. A quantificação relativa do alvo foi feita usando-se o sinal para βGus, um gene 

“housekeeping”, em cada amostra. Os dados foram analisados pelo método 

∆∆CT: o valor de cada amostra foi normalizado dividindo-o pelo valor para βGus 

correspondente (valor da amostra/valor βGus). A quantificação da transcrição é 

reportada como n-log (fold change) em relação ao cDNA calibrador (transcrição 

das amostras não tratadas). 

 

 

 

 

 

 
                                                 
w
 Primer Express, Applied-Biosystem, Foster City, CA, EUA 
x
  Taqman® Universal PCR Mastermix, Applied Biosystems, Foster City, CA,  EUA 
y
  iQ 5, Bio-rad, Hercules, CA, EUA 



 

 

 

 

48

 
Tabela 1 – Sequências de primers e probes utilizadas na qRT-PCR 

 
Gene Senso (5´ - 3´) Anti-senso (5´ - 3´) Probe (5´ - 3´)* 

βgus gacatccgagggaagggct agccaacgaagcaggttga gtccttcaccagcagtggccagtct 

TNF-α gcccagacactcgatcatcttc catttgcacgcccactca cccatgttgtagcaaacccccaagc 

IL-1β gcagccatggcagcagta attgccgctgcagtaagtca ccgacaccagtgacatg 

 
IL-6 

 
agcacattaagtacatcctcggc 

 
ccagattggaagcatccgtc 

 
atctctgccctgaaaaatgagatgtgtaacaattt 

IL-10 gcacgtgaactccctggg aaatcgatgacagcgccg agcctcactcggagggtcttcagctttt 

TGF-β ccgagctctggacaccaacta tgccgtacgcagcagttct tgttccagctccacagag 

* Probes são marcadas com molécula repórter 6-FAM (6-carboxilfluoresceína) na posição 5´ e 
quencher BHQ-1 (black-hole quencher) na posição 3´. 

 
 

 

Análise estatística - Os dados obtidos na citometria de fluxo foram submetidos 

ao estudo das distribuições das variáveis quanto à normalidade (teste 

Kolmorogov-Smirnov). Foi utilizado o teste de Friedman para comparar os grupos, 

seguido do teste de Dunn para comparações múltiplas das médias, considerando-

se significativos valores com p < 0,05. As análises estatísticas foram efetuadas 

empregando-se um programa computacionalz. 

 

 

 

 

 

 

 
                                                 
z GraphPad Instat 3, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA. 



 

 

 

 

49

RESULTADO 

 

 

Reação cruzada – Através do Western blotting foi possível avaliar a habilidade 

das células leucocitárias de equinos em reagir com o anticorpo humano para os 

receptores Toll-like-2 e -4, assim como a expressão constitutiva de tais receptores 

(Figura 3). 

 

 
FIGURA 3 - O Western blotting demonstrou a reação cruzada dos anticorpos monoclonais 

específicos anti-TLR-2 e anti-TLR-4 humanos com as diferentes células de equino. 
As bandas comparativas das proteínas TLR-2 e TLR-4 de humano e equino foram 
reveladas pelo reagente ECL plusi. 

 

 

       

Expressão dos receptores Toll-like – Os valores referentes à expressão 

percentual dos receptores Toll-like-2 e -4 nos linfócitos, monócitos e neutrófilos 

para o animal 3 (melhor representativo) estão representados nas Figuras 4, 5 e 6, 

respectivamente.  

 

 



 

 

 

 

50

 

 

 

 

FIGURA 4 - Valores individuais da porcentagem de expressão de receptores Toll-like-2 e -4 em 

linfócitos, mensurados por citometria de fluxo. 

 
 



 

 

 

 

51

 

 

 

 

 

FIGURA 5 - Valores individuais da porcentagem de expressão de receptores Toll-like-2 e -4 em 

monócitos, mensurados por citometria de fluxo. 

 

 



 

 

 

 

52

 

 

 

 

 

FIGURA 6 - Valores individuais da porcentagem de expressão de receptores Toll-like-2 e -4 em 

neutrófilos, mensurados por citometria de fluxo. 

 



 

 

 

 

53

Os valores percentuais da expressão dos receptores Toll-like-2 e -4, nos 

diferentes grupos, estão representados na Tabela 2. 

Não foram observadas diferenças significativas (p > 0,05) na expressão 

dos receptores Toll-like-2 e -4 no Grupo controle (0 ng/mL de LPS), ao longo do 

tempo, nas diferentes populações celulares. Os neutrófilos, monócitos e linfócitos 

apresentaram um aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) da expressão 

dos receptores TLRs nos momentos 8 e 24 horas, em relação ao momento basal, 

nas três concentrações de LPS avaliadas  (1, 10 e 100 ng/mL).   

Quando foram comparadas as diferentes concentrações de LPS (1, 10 e 

100 ng/mL), houve uma resposta padronizada nas populações celulares, com um 

aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) da expressão dos receptores 

Toll-like, nas concentrações 10 e 100 ng/mL de LPS às 2, 4, 8 e 24 horas em 

relação ao Grupo controle (0 ng/mL de LPS). 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 

 

 

 

54

Tabela 2 - Valores da expressão dos receptores Toll-like-2 e -4, em três populações celulares 
(linfócitos, monócitos, neutrófilos) do sangue total, em relação às diferentes 
concentrações de LPS (0, 1, 10, 100 ng/mL). Os valores representam a mediana 
(mínimo e máximo) 

 
Populações      

celulares 
Momentos 

(horas) 
 

Concentrações (ng/mL) 
0                            1                         10                 100 

 
 
 
 
 
 

Linfócitos 

0 
 
 
2 
 
 
4 
 
 
8 
 
 

24 

0.2  
(0.1-0.4) 

 
0.3 B 

(0.1-0.4) 
 

0.2 B 
(0.2-0.4) 

 
0.3 B  

(0.2-0.6) 
 
0.3 B 

(0.2-0.6) 

0.2 b 
  (0.2-0.5) 
 

0.9 b, B 
(0.1-1.3) 

 
1.2 b, B 

(0.7-2.0) 
 

2.5 a, B 
(1.8-3.3) 

 
1.7 a, B 

(1.2-3.3) 

0.17 b 
(0.1-0.6) 

 
1.0 b, A 

(0.4-1.9) 
 

1.7 b, A 
(1.2-3.4) 

 
3.9 a, A 

(2.0-4.4) 
 

2.2 a, A 
(1.6-4.7) 

 

0.3 b 
(0.1-0.6) 

 
1.6 b, A 

(0.8-2.7) 
 

2.0 b, A 
(1.2-3.0) 

 
4.6 a, A 

(1.5-5.2) 
 

4.6 a, A 
         (2.5-7.6) 

 
 
 
 
 
 

Monócitos 

0 
 
 
2 
 
 

        4 
 
 
8 
 
 

24 

0.3  0.3 0.3 b 0.3 b 
(0.1-0.7) (0.1-0.6) (0.2-0.5) (0.2-0.6) 

    
0.2 B 1.5 b, B 1.8 b, A 3.3 b, A 

(0.1-0.3) (0.1-2.6) (0.2-2.9) (1.2-4.8) 
    

0.2 B 1.9 b, B 3.3 b, A 3.3 b, A 
(0.1-0.4) (1.0-3.1) (2.6-5.1) (1.6-5.7) 

    
0.3 B 3.3 a, B 5.1 a, A 4.6 a, A 

(0.2-0.9) (2.0-5.2) (2.5-8.3) (3.3-8.8) 
    

0.4 B 3.0 a, B 4.2 a, A  5.8 a, A 
(0.2-0.6) (1.4-5.5) (1.3-11.1) (1.6-33.1) 

 
 
 
 
 
 

Neutrófilos 

0 
 

 
2 

 
 

        4 
 

 
        8 
 
 

24 

0.4  0.3 b 0.5 b 0.3 b 
(0.2-0.5) (0.2-0.5) (0.1-0.6) (0.1-0.6) 

    
0.4 B 1.1 b, B 2.3 b, A 2.7 b, A 

(0.1-0.6) (0.5-1.1) (1.4-3.3) (2.2-4.2) 
    

0.5 B 1.8 b, B 2.3 b, A 3.4 b, A 
(0.4-1.2) (1.5-2.6) (2.1-4.5) (2.3-5.2) 

    
0.7 B 3.9 a, B 4.0 a, A 5.2 a, A 

(0.1-0.7) (2.2-4.6) (2.6-4.8) (3.6-10.2) 
    

0.6 B 2.8 a, B 4.8 a, A 4.9 a, A 
(0.3-0.7) (2.0-4.8) (3.5-5.1) (4.6-7.9) 

Medianas seguidas de letras distintas diferem significativamente entre si (p < 0,05) na coluna e na 
linha. Ausência de letras minúsculas (linha) ou maiúsculas (coluna) indica que não há diferença 
significativa (p > 0,05) entre os dados avaliados. 



 

 

 

 

55

Expressão gênica das citocinas – os valores do pool de cDNA demonstraram 

uma expressão basal para todas as citocinas (TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-10) no 

momento 0 hora, em todas as concentrações de LPS (0, 1, 10 e 100 ng/mL). 

Houve pequeno aumento da expressão gênica de IL-1 e IL-6 nos momentos 2, 4, 

8 e 24 horas no Grupo controle (0 ng/mL de LPS). A adição primária de LPS 

induziu um aumento rápido e potente na expressão gênica das citocinas pró-

inflamatórias TNF-α, IL-1 e IL-6, nos momentos 2 e 4 horas em relação ao 

momento basal (0 hora), nas diferentes concentrações de LPS (1, 10 e 100 

ng/mL). Porém houve diminuição drástica na expressão gênica do TNF-α (44-

73%), do IL-1 (51-61%) e do IL-6 (56-90%) no momento 8 horas, em relação ao 

momento 4 horas, que persistiu até o momento 24 horas após o estímulo primário 

com LPS, nas três concentrações de endotoxina. A IL-10 demonstrou um padrão 

diferente na sua expressão gênica. Enquanto não houve aumento da expressão 

de IL-10 na concentração controle (0 ng/mL) durante 24 horas, sua expressão 

apresentou-se pouco aumentada após o estímulo primário de LPS (momentos 2 e 

4 horas), com aumento considerável (75-83%) da expressão após o estímulo 

secundário de LPS no momento 8 horas e diminuição dos valores às 24 horas 

(98-99%) (Tabela 3). Não houve alteração na expressão gênica do TGF-β após o 

estímulo com diferentes concentrações de LPS neste estudo. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



 

 

 

 

56

Tabela 3 - Valores relativos da expressão gênica relativa de citocinas para as diferentes 
concentrações de LPS (0, 1, 10, 100 ng/mL) em um modelo ex vivo de tolerância ao 
LPS em equinos. Os valores foram normalizados em relação ao gene housekeeping 
βGus (gene/βGus) e comparados com o momento 0 (expressão relativa 
relativaTn/expressão relativaT0) 

Concentração de LPS Citocinas                                      Momentos (horas) 

(ng/mL)  2 4 8 24 

 TNF-α 0,46 0,73 0,67 0,16 

0 IL-1 1,68 20,13 4,05 6,00 

 IL-6 0,90 2,82 4,06 2,19 

 IL-10 0,78 0,55 0,36 0,67 

      

 TNF-α 238,72 197,21 54,84 3,26 

1 IL-1 147,87 122,96 46,83 9,37 

 IL-6 357,09 72,56 31,38 22,19 

 IL-10 12,19 32,60 126,40 2,16 

      

 TNF-α 271,49 199,69 63,36 1,30 

10 IL-1 345,09 136,24 66,08 7,67 

 IL-6 4066,38 970,68 92,78 35,06 

 IL-10 67,72 77,32 472,90 1,93 

      

 TNF-α 273,56 341,77 188,25 3,03 

100 IL-1 224,83 254,25 101,19 14,57 

 IL-6 2393,91 965,02 110,25 57,33 

 IL-10 43,02 120,12 746,33 2,49 
* Estímulo secundário de LPS no momento 4 horas. 
 

 

 

DISCUSSÃO 

 

 

O fenômeno de tolerância à endotoxina em equinos foi demonstrado neste 

estudo, através da diminuição da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias 

(TNF-α, IL-1 e IL-6), aumento na expressão da citocina anti-inflamatória IL-10, 

após o estímulo secundário de LPS (momentos 8 e 24 horas), e nenhuma 

alteração na expressão gênica do TGF-β durante todo o estudo. Ao se avaliar a 

expressão dos receptores Toll-like-2 e -4 em diferentes concentrações de LPS (1, 



 

 

 

 

57

10 e 100 ng/mL), observou-se aumento de ambos os receptores após o segundo 

estímulo de endotoxina, sugerindo que o mecanismo molecular da tolerância não 

acarreta diminuição na expressão destes receptores nessa espécie. 

A escolha do modelo experimental foi fundamental para confirmar a 

resposta de tolerância. Sabendo-se que, a utilização de células em cultura não 

responde ao LPS da mesma maneira como no sangue total, uma vez que cada 

população celular pode ser afetada de maneira diferente pelo mesmo insulto 

(CAVAILLON; ADIB-CONQUY, 2006; MATHINSON et al., 1992), e que os 

modelos in vivo apresentam desvantagens como a ativação de outras células e 

ligantes endógenos dos receptores Toll-like (FAURE et al., 2001; SMILEY et al., 

2001) optou-se pela utilização de um modelo ex vivo para o estudo da tolerância 

em equinos.  

Esse novo modelo foi desenvolvido para a avaliação da modulação de 

citocinas no sangue total, sendo caracterizado por boa estabilidade (contagem e 

viabilidade) de leucócitos ao longo de todo o período experimental (WANG et al., 

2000). Este modelo permitiu estudar o fenômeno da tolerância à endotoxina em 

equinos, assim como avaliar a expressão dos receptores Toll-like-2 e -4 nas 

diferentes concentrações de LPS e populações celulares, semelhante ao 

demonstrado em diversos estudos (HADLEY et al., 2005; HADLEY et al., 2007; 

JORGENSEN et al., 2001; YAGUB et al., 2003; WANG et al., 2001). 

A presença das proteínas dos Toll-like-2 e -4 vem sendo detectada através 

do Western blotting em células humanas, mostrando que o TLR-4 é alvo da 

indução de tolerância à endotoxina (FAURE et al., 2001; ZHONG et al., 2008). 

Uma vez que os receptores Toll-like-4 e -2 de equinos apresentam uma 

homologia grande com os mesmos receptores para humanos, (NCBI) 90% e 85%, 

respectivamente, anticorpos humanos contra estes receptores foram usados para 

marcá-los em leucócitos de equinos na citometria de fluxo, à semelhança de 

estudos para identificar tais receptores em leucócitos de cães (BURGENER; 

JUNGI, 2008). 

Estudos prévios investigaram a tolerância em relação aos efeitos dose-

dependentes do segundo estímulo de LPS. Koons et al. (2008) relataram que um 



 

 

 

 

58

estímulo secundário de LPS (4 horas após o estímulo primário), acarretava efeitos 

redutores em relação a produção de TNF-α utilizando a dose de 100 ng/mL, sem 

nenhuma diferença para a dose de 1 ng/mL de LPS. Outro estudo relatou que a 

dose de 100 ng/mL de LPS foi a única que reduziu drasticamente a produção de 

citocinas inflamatórias (IL-6 e IL-12) em macrófagos peritoneais de camundongos, 

enquanto as concentrações de 1 e 10 ng/mL não apresentaram diferenças 

significativas em relação a concentração controle (NOMURA et al., 2000). Porém, 

um estudo demonstrou que a segunda dose de 10 ng/mL de LPS acarretou a 

diminuição na expressão do TLR-4 (CUSCHIERI et al., 2006) em monócitos de 

humanos, enquanto Medvedev et al. (2002) não observaram alteração na 

expressão do TLR-2. No presente estudo, embora as três doses de LPS tenham 

induzido a tolerância à endotoxina, acredita-se que as doses a serem usadas para 

promover uma melhor expressão dos receptores Toll-like em monócitos, linfócitos 

e neutrófilos de equinos sejam de 10 e 100 ng/mL de LPS, pela maior ativação 

dos receptores Toll-like-2 e -4 encontradas nessas doses. 

O estabelecimento da tolerância à endotoxina em equinos nesse modelo ex 

vivo foi verificado através da diminuição na expressão gênica das citocinas 

inflamatórias, similar ao encontrado por outro modelo ex vivo em equinos cujo 

estímulo secundário de LPS promoveu a diminuição na transcrição dos genes das 

citocinas TNF-α, IL-1e IL-6 em monócitos tolerantes (DURANDO et al., 2005). 

Outras espécies como coelhos, camundongos, ratos e humanos já demonstraram 

o mesmo padrão de diminuição das citocinas inflamatórias frente a um estímulo 

ex vivo de LPS (ERROI et al., 1993; FLOHE et al., 1991; KIANI et al.,1997; 

WAKABAYASHI et al., 1994), enquanto modelos in vitro evidenciaram 

discordância de resultados (MENGOZZI et al., 1993; SEATTER et al., 1994; 

TAKASUKA et al., 1991; ZIEGLER-HEITBROCK et al., 1992), atribuída muitas 

vezes à variedade de diferentes doses de LPS, tipos ou linhagens celulares 

(RAYHANE et al., 1999).  

Como relatado por Wang et al. (2000), o modelo ex vivo com sangue total 

apresenta o consumo de oxigênio durante as 24 horas de incubação, sendo 

inicialmente um consumo maior e decrescendo vagarosamente ao longo do 



 

 

 

 

59

tempo. Assim, no presente estudo, o aumento da expressão das citocinas pró-

inflamatórias IL-1 e IL-6 na concentração controle (0 ng/mL) de LPS condiz com 

relatos prévios (GHEZZI et al., 1991) que concluíram que a hipóxia aumenta a 

produção de IL-1 e TNF-α.  

Semelhantemente, Knowlers et al. (1997) relataram que a capacidade 

fagocítica de células polimorfonucleares estava aumentada na presença de IL-1 e 

TNF-α durante a hipóxia em comparação à normoxia. Tais resultados sugerem 

que a privação de oxigênio aumenta a estimulação de LPS, assim como os efeitos 

de mediadores como citocinas pró-inflamatórias. No presente estudo, a hipóxia 

pode ter sido reconhecida pelas células como uma alteração semelhante ao que 

ocorre no org