UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU TEORES FOLIARES DE SILÍCIO, TANINOS E LIGNINA, EM Maytenus ilicifolia Martius ex Reiss (ESPINHEIRA-SANTA), EM FUNÇÃO DE VARIÁVEIS AMBIENTAIS E GENÉTICAS. MARIA IZABEL RADOMSKI Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp – Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura). BOTUCATU – SP Agosto/2006 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU TEORES FOLIARES DE SILÍCIO, TANINOS E LIGNINA, EM Maytenus ilicifolia Martius ex Reiss (ESPINHEIRA-SANTA), EM FUNÇÃO DE VARIÁVEIS AMBIENTAIS E GENÉTICAS. MARIA IZABEL RADOMSKI Orientador: Prof. Dr. Leonardo Theodoro Bull Co-Orientador: Dr. Antonio Francisco Jurado Bellote Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp – Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura). BOTUCATU – SP Agosto/2006 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) Radomski, Maria Izabel, 1966- R131t Teores foliares de silício, taninos e lignina, em May- tenus ilicifolia Martius ex Reiss (Espinheira-Santa), em função de variáveis ambientais e genéticas / Maria Izabel Radomski.- Botucatu : [s.n.], 2006. x, 104 f., gráfs, tabs. Tese (Doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Facul- dade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2006 Orientador : Leonardo Theodoro Büll Co-orientador : Antonio F.J. Bellote Inclui bibliografia 1. Maytenus. 2. Plantas medicinais. 3. Fenóis. 4. Lignina. 5. Silício. I. Büll, Leonardo Theodoro. II. Bellote, Anto- nio Francisco Jurado. III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronômicas. IV. Título. III “... Tudo o que Deus criou Já nasce com seu valor. Não sou contra farmácia, Nem hospital, nem doutor. Mas, se existissem as reservas Das matas com suas ervas Não havia assim tanta dor. Vamos procurar conhecer As plantas medicinais, Seguindo um pouco do exemplo Que deram os nossos pais. Pra ver se sobram uns trocados, Pois, só com remédio comprado, A gente não agüenta mais!” Adelino Antunes Cordeiro IV AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, Prof. Dr. Leonardo T. Büll, pela confiança neste trabalho, e apoio em todos os momentos necessários. Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia-Horticultura, e ao CNPq, pela bolsa concedida, e à FAPESP, pelo auxílio pesquisa. Ao IBAMA-Floresta Nacional de Irati, à MANASA FLORESTAL, e à RURECO, pela disponibilização de suas áreas para realização das coletas de dados. Ao Dr. Antonio F.J. Bellote, da Embrapa Florestas, pela co-orientação. Aos “velhos” amigos, Marianne Scheffer e Gustavo Curcio, companheiros de longa data nas lidas com a espinheira-santa. Aos “novos” amigos, José Abramo Marchese, Rumy Goto, Lin Chau Ming, Maíra Vasconcellos, Rosa de Belém, Milena Pilla, Maria dos Anjos e Juliana Gadum, pela acolhida, e pelos inesquecíveis momentos de lazer, fundamentais para “segurar a barra” do doutorado. Aos funcionários da FCA-Botucatu, em particular à Elisabete M. de Almeida e Rosemeire P. de Almeida, do Setor de Horticultura, e às “meninas” da Seção de Pós- Graduação, Jaqueline de M. Gonçalves, Katia O. Duarte, Marlene R. de Freitas e Marilena do C. Santos, pelas ajudas “burocráticas”. À Embrapa Florestas, por dispor seus laboratórios e pessoal, em particular ao Arnaldo Soares, Wilson Maschio e Irineu Olinisky, pela “força” nas etapas de campo, à Maria Lúcia Simione, pelo apoio nas compras, à Cláudia M. Pereira, Paula Pucci, José Dias e Onécimo Veiga, do Laboratório de Solos, ao Dr. Washington Magalhães, ao Sidney Scheffer e Marcela Guiotoku, do Laboratório da Madeira, ao Dr. Edílson B. de Oliveira, pelo auxílio nas análises estatísticas, aos “meninos” da informática, Youssef Mazlum, Rodrigo de O. Cintra, Sérgio Guimarães e Gerson Oaida, por “quebrar meus galhos” com o computador, à Maria Sandra Ferreira, Guiomar Braguinia e Claudia Garbuio pelo apoio e amizade diários, e a todos os demais funcionários, que de uma ou de outra forma contribuíram com este trabalho. À minha mãe, Wanda, e à minha irmã, Sonia, por sempre estarem ao meu lado, e à minha Vó Buia que, onde quer que esteja, continua me inspirando a conviver com o mundo fabuloso das plantas medicinais. V SUMÁRIO LISTA DE TABELAS VII LISTA DE FIGURAS VIII RESUMO IX SUMMARY X 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4 2.1 Maytenus ilicifolia 4 2.2 Silício 10 2.3 Compostos fenólicos – taninos e lignina 15 2.4 Variação genética e a síntese de substâncias bioativas 21 3 MATERIAL E MÉTODOS 23 3.1 Caracterização das áreas de estudo de Maytenus ilicifolia e coleta de dados 23 3.1.1 Populações naturais 23 3.1.2 Banco de Germoplasma 26 3.1.3 Ensaio de aplicação de Si 27 3.2 Determinações 28 3.2.1 Solos 28 3.2.2 Material vegetal 29 3.2.2.1 Produção de biomassa aérea e massa específica foliar 29 3.2.2.2 Morfotipos 30 3.2.2.3 Composição fitoquímica 30 3.3 Análise estatística 31 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 4.1 Caracterização das populações naturais de Maytenus ilicifolia 33 4.1.1 Caracterização dos ambientes 33 4.1.2 Massa específica foliar e composição fitoquímica 39 4.2 Caracterização das progênies cultivadas no Banco de Germoplasma 45 4.2.1 Morfotipos 45 VI 4.2.2 Produção de biomassa aérea 46 4.2.3 Composição fitoquímica 47 4.3 Efeito da aplicação do Si 54 4.3.1 Características químicas do solo 54 4.3.2 Produção de biomassa aérea e composição fitoquímica 56 4.4 Considerações finais 62 5 CONCLUSÕES 64 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66 APÊNDICE 84 VII LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Identificação das matrizes coletadas de oito populações de Maytenus ilicifolia na região Sul do Brasil, e que compõem o banco de germoplasma (BGEM), localizado no município de Ponta Grossa, Paraná. 27 Tabela 2 - Posição geomórfica, classe de solos e ambiente lumínico das populações naturais de Maytenus ilicifolia. 34 Tabela 3 - Valores médios de pH, P, K+, Ca+2, Mg+2, Al+3, H+ + Al+3, C, CTC, V% e m%, por classe de solo, e nas profundidades de 0-5, 5-10, 10-15 e 15- 20 cm, sob as populações naturais de Maytenus ilicifolia. 37 Tabela 4 – Massa seca foliar, área foliar e massa específica foliar de quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia (média de dez repetições). 41 Tabela 5 – Teores foliares de lignina, fenóis totais, fenóis não-tanantes, e taninos, em quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia (média de dez repetições). 41 Tabela 6 – Teores foliares dos elementos minerais, N, P, K, Ca, Mg, Si, Fe, Mn, Cu, Zn, e Al, em quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia (média de 10 repetições). 42 Tabela 7 - Morfotipos identificados entre as progênies de Maytenus ilicifolia do Banco de Germoplasma de Ponta Grossa, PR. 45 Tabela 8 - Valores de pH, C, CTC, V% e m%, e dos teores disponíveis de Si, P, K, Ca, Mg, Al, H + Al, Fe, Mn, Cu e Zn, do Latossolo Vermelho Tb Distrófico câmbico A moderado onde localiza-se o Banco de Germoplasma. Ponta Grossa, PR. 48 Tabela 9 – Teores foliares médios de lignina, fenóis totais, fenóis não-tanantes e taninos, média geral, desvio padrão e coeficiente de variação, em 25 progênies de Maytenus ilicifolia do Banco de Germoplasma localizado em Ponta Grossa, PR. 50 Tabela 10 – Teores foliares médios de elementos minerais, média geral, desvio padrão e coeficiente de variação, em 25 progênies de Maytenus ilicifolia do Banco de Germoplasma localizado em Ponta Grossa, PR 51 Tabela 11 – Características químicas do solo, antes da aplicação e um ano após os tratamentos de aplicação de Si, em população cultivada de Maytenus ilicifolia. 55 Tabela 12 – Teores foliares de elementos minerais em Maytenus ilicifolia um ano após a aplicação das diferentes doses de Si solo (média de seis repetições). 58 Tabela 13 – Teores foliares de lignina, fenóis totais, fenóis não-tanantes, e taninos, em Maytenus ilicifolia, um ano após a aplicação das diferentes doses de Si no solo (média de seis repetições). 59 VIII LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Vias de síntese dos compostos fenólicos (TAIZ e ZEIGER, 2004). 18 Figura 2 – Análise de agrupamento baseada na similaridade das características foliares avaliadas nas quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia. 43 Figura 3 – Massa seca de folhas, ramos e total, aos 75 meses de idade, das 44 progênies de Maytenus ilicifolia do Banco de Germoplasma localizado em Ponta Grossa, PR. 47 Figura 4 - Análise de agrupamento baseada na similaridade fitoquímica entre as 25 progênies do Banco de Germoplasma de Maytenus ilicifolia. 53 Figura 5 – Relação entre os teores disponíveis de P e Si no solo um ano após a aplicação das diferentes doses de Si (R2 = 0,48, significativo a 1%). 56 Figura 6 – Variação da massa seca de folhas de Maytenus ilicifolia em função das diferentes doses de Si aplicadas no solo (barras com a mesma letra não diferem significativamente entre si, pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade). 57 Figura 7 – Variação do teor de fenóis totais em folhas de Maytenus ilicifolia em função das diferentes doses de Si aplicadas no solo (R2 = 0,60, significativo a 1%). 60 Figura 8 – Variação do teor de tanantes em folhas de Maytenus ilicifolia em função das doses diferentes doses de Si aplicadas no solo (R2 =0,61, significativo a 1%). 60 IX RESUMO A espécie medicinal Maytenus ilicifolia, localiza-se naturalmente sob diferentes condições edafo-climáticas. Este fato implica em prováveis mecanismos de adaptação das populações naturais, cujas características químicas podem, ou não, estar fixadas geneticamente. A identificação da variabilidade fenotípica da espécie permite viabilizar práticas de manejo visando a produção de fitoterápicos com qualidade organoléptica, nutricional e terapêutica. Para identificar a influência do ambiente na composição fitoquímica de M. ilicifolia foram efetuados três estudos, o primeiro em quatro populações naturais distribuídas no Estado do Paraná, o segundo em um banco de germoplasma, e o terceiro em uma unidade de cultivo experimental onde foi conduzido um ensaio de fertilização baseado na aplicação de diferentes doses de um resíduo de siderurgia rico em Si. Foram avaliados os teores foliares de N, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, Si, Al, lignina, fenóis totais, fenóis não tanantes e taninos. Nas populações naturais também foi determinada a massa específica foliar. No banco de germoplasma, em função da elevada diversidade morfológica, foi efetuada a classificação dos indivíduos em morfotipos, tendo sido identificados nove morfotipos foliares, os quais apresentaram relação com alguns dos ambientes de origem das populações. Os estudos efetuados indicam que é possível efetuar o controle de compostos fenólicos presentes em M. ilicifolia, seja através do manejo de luz, interferindo tanto na síntese de lignina quanto dos taninos, seja por meio da aplicação de Si e Ca, regulando principalmente a síntese de fenóis totais e taninos. X FOLIAR SILICON, TANNINS AND LIGNIN IN Maytenus ilicifolia MARTIUS EX REISS (ESPINHEIRA-SANTA), IN CONSEQUENCE OF ENVIRONMENTAL AND GENETICAL VARIABILITY. Botucatu, 2006. 104p. Tese (Doutorado em Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Author: MARIA IZABEL RADOMSKI Adviser: LEONARDO THEODORO BÜLL SUMMARY Maytenus ilicifolia is a medicinal species that occurs naturally under different soils and light conditions. This fact involves adaptation mechanisms of the natural populations whose chemical characteristics can be or not genetically fixed. The identification of the genetic variability can viabilize the management practices to the production of phytotherapics with organoleptical, nutritional and therapeuthic quality. Three studies were developed to determine the influence of the environment in the phytochemical content of M. Ilicifolia and the samples were collected from four natural communities, a germoplasm bank, and an experimental area in wich there was fertilized with different doses a rich Si residue. There was determinate the specific leaf mass in leaves from the natural populations, also there was determinate the total content of N,P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, Si, Al, lignin, total phenols and tannins in all samples. In the germoplasm bank the individual plants were classified in nine morphotypes, too. The studies indicate that is possible to controle the M. ilicifolia lignin and tannin composition by light management, as well as the total phenols and tannin by Si and Ca fertilization. _______________________________________ Keywords: Phenols, Silicon, Lignin, Medicinal plants. 1 1 INTRODUÇÃO A “Estratégia Global da Biodiversidade” prevê a utilização sustentável dos recursos naturais, propondo políticas de apoio à gestão e conservação dos mesmos. Com relação às plantas medicinais, o documento cita as sérias ameaças de extinção ou perda da variedade genética no ambiente silvestre, enfocando a importância das mesmas na manutenção das práticas tradicionais de medicina das comunidades locais. Também propõe o seu cultivo, não apenas para aliviar a pressão sobre as espécies silvestres e garantir o seu suprimento, mas como fonte de renda adicional para agricultores (WRI/UICN/PNUMA, 1992). No Brasil, a Central de Medicamentos - CEME desenvolveu na década de 1980 o Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais, cujos objetivos foram, entre outros, reforçar a cultura fitoterapêutica nacional e criar uma alternativa medicamentosa efetivamente testada e de baixíssimo custo para a população. Das 61 plantas pesquisadas, 8 apresentaram resultados positivos e dentre estas, Maytenus ilicifolia, conhecida popularmente como espinheira-santa, e que teve sua eficácia terapêutica comprovada (CARLINI, 1988). A espinheira-santa é uma espécie arbórea, nativa da região Sul do Brasil. Grande parte dos estudos relacionados à espécie está voltada às áreas de farmacologia e farmacoquímica, pouco se relacionando com aspectos ecológicos e de manejo. Este fato é de grande relevância, já que se trata de uma espécie cuja produção de fitoterápicos depende, em parte, do extrativismo de populações nativas, com elevada diversidade ambiental e genética, 2 além de áreas de cultivo cujo manejo tem sido desenvolvido principalmente a partir de observações de campo de agricultores, fatores estes que podem exercer grande influência sobre a composição química da espinheira-santa e, conseqüentemente, sobre seus efeitos terapêuticos. RADOMSKI & WISNIEWSKI (2004) e RADOMSKI et al. (2004) verificaram que fatores edáficos e a luminosidade exercem forte influência sobre os teores foliares de polifenóis totais, de taninos, e de elementos minerais em M. ilicifolia. Vários autores têm abordado o papel do Si nas plantas, principalmente a sua relação com a síntese de compostos polifenólicos, como a lignina (INANAGA e OKASAKA, 1995; INANAGA et al., 1995; MARSCHNER, 1995). No caso de espécies medicinais, estudos têm procurado relacionar o efeito terapêutico das mesmas com a ocorrência de silício no esqueleto de substâncias bioativas como proteínas, polissacarídeos, polifenóis e fosfolipídios (KOLESNIKOV e GINS, 2001). Este fato deve ser levado em conta, considerando que parte da ação terapêutica da espinheira-santa deve-se à presença de tanino, cuja concentração pode estar associada à disponibilidade de silício para a planta. O fato da espinheira-santa ocorrer naturalmente sob a influência de diferentes condições edafo-climáticas implica em prováveis mecanismos de adaptação das suas populações, cujas características químicas podem, ou não, estar fixadas geneticamente. Ao identificar a variabilidade fenotípica da espécie viabiliza-se o desenvolvimento de práticas que permitem tanto o manejo de populações naturais quanto cultivadas, visando a produção de fitoterápicos com qualidade organoléptica, nutricional e terapêutica. Para identificar a influência destes fatores na composição química da espécie estudou-se quatro populações naturais, um banco de germoplasma contendo progênies de oito distintas populações do Sul do Brasil, e uma população cultivada submetida à fertilização com doses crescentes de Si aplicado no solo. Os objetivos deste trabalho foram: 1o. Avaliar o conteúdo foliar de N, P, K, Ca, Mg, Al, Fe, Mn, Cu, Zn e Si, de lignina, fenóis totais e taninos, de quatro populações naturais de M. ilicifolia, localizadas em diferentes regiões fisiográficas do Estado do Paraná; 3 2o. Caracterizar o conteúdo foliar de N, P, K, Ca, Mg, Al, Fe, Mn, Cu, Zn e Si, de lignina, fenóis totais e taninos, em progênies integrantes de um banco de germoplasma de M. ilicifolia; 3o. Avaliar o efeito da aplicação de diferentes doses de Si sobre os teores foliares de N, P, K, Ca, Mg, Al, Fe, Mn, Cu, Zn e Si, de lignina, de fenóis totais e taninos, em uma população cultivada de M.ilicifolia. 4 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Maytenus ilicifolia A espécie M. ilicifolia pertence à ordem Celastrales, e família Celastraceae, a qual engloba 50 gêneros compreendendo 800 espécies distribuídas nos trópicos e apenas alguns gêneros nas regiões temperadas. Esta espécie predomina nos estados da região Sul do Brasil, e nos países vizinhos, Paraguai, Uruguai e Leste da Argentina. (CRONQUIST, 19811, citado por CARVALHO-OKANO, 1992). No Brasil, M. ilicifolia apresenta uma distribuição predominantemente subtropical, ocorrendo em regiões onde o tipo climático predominante é o Cfb, com temperatura média do mês mais quente de 22oC, temperatura média do mês mais frio superior a 10oC, e precipitação média anual de 1500 mm (CARVALHO-OKANO, 1992; LEITE, 1994). No Paraná, M. ilicifolia pode ocorrer em clima do tipo Cfa como um elemento raro na vegetação, em áreas de contato das Florestas Estacional Semidecidual e Ombrófila Densa com a Floresta Ombrófila Mista. Estudos tem identificado populações da espécie distribuídas sobre diferentes litologias e classes de solo;além disso observa-se que a 1 Cronquist, A . An integrated system of classification of flowering plants. New York, Columbia University Press, 1981. 5 espécie é tolerante a diferentes regimes de saturação hídrica do solo, entretanto, tem-se constatado que quanto mais próximo o lençol da superfície, mais rara a sua ocorrência (RADOMSKI, 1998; MAZZA et al., 2003; RADOMSKI et al. 2004a). A maior parte da bibliografia referente a levantamentos fitossociológicos e sucessão secundária, em remanescentes da Floresta Ombrófila Mista, no Paraná e em Santa Catarina, indicam a presença de M. ilicifolia em estágios mais avançados da vegetação, ocupando normalmente o sub-bosque das formações (GALVÃO et al., 1989; ZILLER, 1996; SILVA et al., 1998; NEGRELLE e LEUCHTENBERGER, 2001). Deve-se considerar, entretanto, que na maior parte dos levantamentos fitossociológicos, a freqüência de indivíduos adultos desta espécie é bastante baixa. Este fato está relacionado, basicamente, à metodologia adotada nestes estudos, em geral limitando as observações ao compartimento arbóreo superior, com medição de indivíduos com diâmetro a altura do peito (DAP) maior que 5 cm. Já em áreas com restrição edáfica para o desenvolvimento de uma vegetação de maior porte (especialmente sobre afloramentos de rocha associados a Neossolos Litólicos), a freqüência de indivíduos de M. ilicifolia é bastante elevada. Nestes ambientes, a espécie normalmente predomina na vegetação, desenvolvendo-se e reproduzindo-se, a pleno sol (SOUZA, 2000; STEENBOCK, 2003). Em ambientes com solos hidromórficos, também é possível identificar uma freqüência maior de M. ilicifolia, incluindo a regeneração natural, conforme constatado por BARDDAL (2002) e MAZZA et al. (2003). Em relação às exigências e estratégias da espécie, baseadas apenas na condicionante lumínica, BARDDAL (2002) classifica M. ilicifolia como potencial facultativa umbrófita, em função do predomínio de indivíduos jovens no compartimento inferior da floresta aluvial. Cabe citar que mudas da espécie introduzidas em área de capoeirão (fase avançada da sucessão), apresentaram desenvolvimento praticamente nulo, três anos após o plantio (RACHWAL et al., 2002). Levantamentos pedológicos em comunidades vegetais onde se registrou a ocorrência de M. ilicifolia demonstram que a espécie ocorre tanto em solos álicos, 6 com baixa saturação em bases trocáveis, quanto em solos eutróficos (NEGRELLE e LEUCHTENBERGER, 2001; BARDDAL, 2002; RADOMSKI et al., 2004). Outro fato bastante relevante constatado a campo, é que, no Paraná, a ocorrência de populações de M. ilicifolia nas planícies aluviais está estreitamente condicionada ao regime hídrico dos solos. Isto vale para os Gleissolos Melânicos e Háplicos e para os Neossolos Flúvicos (gleicos e típicos). No caso destes solos, o regime de saturação hídrica pode ser subdividido em: a) pleno (lençol freático na superfície, caso dos solos mal e muito mal drenados) e b) parcial (lençol freático oscilante, caso dos solos imperfeitamente drenados). A freqüência de M. ilicifolia está condicionada ao período de saturação hídrica em cada um destes dois regimes: permanente e temporário. Sobre solos com regime de saturação hídrica pleno e permanente a espécie não ocorre (RADOMSKI et al., 2004b). A princípio, a tolerância de M. ilicifolia a determinados regimes hídricos parece estar relacionada à distribuição de seu sistema radicular. Ao se observar plantas em ambientes naturais, percebe-se uma concentração de raízes até 20 cm de profundidade no solo, onde as reações de redução no solo são menos intensas e menor a probabilidade de toxidez por elementos como o Mn, por exemplo, comum em ambientes hidromórficos, com processos de gleização (RADOMSKI et al., 2004b). Em relação aos estudos relacionados às propriedades terapêuticas da espinheira-santa estes se concentram nas áreas de farmacoquímica e farmacologia (LIMA et al,1971; AHMED et al.,1981; MANDICH et al., 1984; SANTOS et al., 1987; SIMÕES et al., 1988; CARLINI, 1988; VARGAS et al., 1989; ITOKAWA et al., 1991; ITOKAWA et al., 1993; GONZALEZ, 1998; MONTANARI et al., 1998; GONZALEZ et al., 2001; NIERO et al., 2001; SOUZA, 2001; MELO et al., 2001; SOARES et al., 2004; MOSSI, 2003). CARLINI (1988) constatou o efeito de extratos aquosos da espinheira- santa no combate às úlceras gástricas, citando que esta ação pode, em parte, ser atribuída à presença de taninos nestas plantas. O autor baseou-se nos trabalhos de YOSHIZAWA et al. 7 (1987)2 e USHIDA et al. (1987)3, os quais relacionam a ação antitumoral e anti-radicais livres de oxigênio dos compostos tânicos. BERNARDI e WASICKY (1959) foram os primeiros autores a relatar a presença de substâncias tânicas em diferentes tipos de folhas de M. ilicifolia. O teor de taninos em folhas coletadas de diversos ambientes revelou grande variação, fato associado às características morfológicas e às condições de insolação. Segundo os autores, folhas de sol apresentaram menor comprimento e maior concentração de substâncias tânicas. Além destas observações, citam a ocorrência de cristais de oxalato de cálcio nos tecidos foliares de Maytenus ilicifolia. SILVA et al. (1991), também encontraram diferentes concentrações de polifenóis totais e taninos em materiais de espinheira-santa coletados de diversos ambientes no município de Araucária, Paraná. RADOMSKI (1998), obteve uma média de teor de taninos (6,7 %) superior aos teores obtidos por BERNARDI e WASICKY (1959), os quais variaram de 1,92 a 3,85 %, e por SILVA et al. (1991) cuja faixa obtida foi de 3,3 a 4,9 %. Provavelmente estas diferenças se devem a diferentes condições ambientais das populações estudadas nos respectivos estudos. Nos estudos efetuados por RADOMSKI (1998), em uma população natural de M. ilicifolia distribuída sobre quatro distintos ambientes em uma mesma toposseqüência, foi verificada a influência do solo e da luminosidade sobre a composição fitoquímica da espécie - os teores foliares de N, K, B e Si variaram entre os ambientes, principalmente em função da intensidade luminosa, tendo sido observadas correlações negativas entre estes elementos e a disponibilidade de luz. Para P, Mn e Cu as diferenças observadas entre os ambientes indicam uma possível interação entre solo e luminosidade na absorção destes elementos. Os teores de Ca, Mg, Fe, Al e Zn não apresentaram diferenças entre os ambientes. No caso dos taninos os teores foram superiores nas plantas crescendo a 2 Yoshizawa,S.; Horiuchi,T.; Fijjiki,H. Antitumor promoting activity of (-) - epigalocatechin gallate, the main constituent of “Tannin” in green tea. Phytotherapy Research 1:44-47, 1987. 3 Ushida,S.; Edamatsu, R.; Hiramtsu,M.; Mori,ª; Nonaka,G.; Nishioka,I.; Niwa,M.; Ozaki,M. Condensed tannins scavenge active oxygen free radicals. Medical Science Research 15:831-832, 1987. 8 pleno sol. RADOMSKI et al. (2004a), observaram que em ambientes de sombra os teores de Si e de polifenóis totais foram iguais a 1075 mg.kg-1 e 7,0%, respectivamente, enquanto que no ambiente a pleno sol os teores foram de 692 mg.kg-1 e 10,3%. Segundo os autores, esta relação inversa entre a presença de Si e dos compostos polifenólicos poderia ser atribuída ao papel do Si na defesa da planta, no caso de ambientes de sombra, onde a síntese dos polifenóis é reduzida pela menor disponibilidade de luz. RADOMSKI e WISNIEWSKI (2004) observaram uma tendência de maior solubilidade do Si nas plantas de M. ilicifolia crescendo a pleno sol (74% contra 53% na sombra); os autores relacionaram estas diferenças às formas de ligação menos estáveis do elemento aos complexos fenólicos, e, conseqüentemente, a diferentes acúmulos nas paredes de células lignificadas, conforme comentado por MARSCHNER (1995). Estudos referentes à diversidade genética da espécie têm sido conduzidos, abordando a variabilidade inter e intrapopulações, protocolos de mapeamento genético e formação de bancos de germoplasma (BITTENCOURT, 2000; CALHEIROS, 2000; SCHEFFER, 2001; PERECIN e KAGEYAMA, 2002; STEENBOCK, 2003). BITTENCOURT (2000), estudando a variabilidade genética em populações naturais do Estado do Paraná, cita que a estrutura genética da espinheira-santa está intimamente relacionada ao microambiente (no caso, solos) no qual estas se desenvolveram. Por outro lado, SCHEFFER (2001), em seu estudo com diferentes progênies conclui que, a maior parte da variação genética concentra-se dentro das populações, a identidade genética entre as populações diminui à medida que aumenta a distância geográfica entre as mesmas e que, aparentemente, não ocorre interação genótipo x ambiente em espinheira-santa. Considerando que, na sua área de ocorrência natural, a espécie vegetal em diferentes condições ambientais, cabe analisar até que ponto estas foram incorporadas geneticamente, influenciando a síntese de substâncias bioativas de interesse terapêutico. STEENBOCK (2003) observou que há fortes evidências de que as maiores taxas de fecundação cruzada em certas populações de M.ilicifolia, podem ser influenciadas pela diferenciação floral. Nos estudos do autor, a população que possuía 9 indivíduos portando os dois tipos florais (tipo A= funcionalmente feminina, e tipo B=funcionalmente masculina) teve maior endogamia e menor taxa de alogamia que a população na qual os indivíduos portavam flores do tipo A ou do tipo B. A presença de apenas um tipo floral tende a reduzir a autofecundação, mas em indivíduos com os dois tipos florais a autofecundação ocorre de forma expressiva. Em relação a outras fontes de variação na composição fitoquímica do gênero Maytenus, cabe citar um experimento com M. aquifolia, onde em árvores originadas de sementes de mesma procedência, foi encontrada diferença significativa no teor de fenóis totais dos indivíduos (PEREIRA et al., 1994). Neste caso, não se pode desprezar a hipótese de haver, também, variação devido a fatores genéticos em relação ao teor de taninos nas folhas, pois não é raro que espécies medicinais apresentem raças químicas. O cultivo da espinheira-santa, ainda em pequena escala, é praticado por produtores que vêm testando, empiricamente, espaçamentos e formas de manejo, sempre a pleno sol. A tendência é de ampliação das áreas de cultivo, uma vez que a Agência Nacional de Vigilância Sanitária exige que o fabricante de fitoterápicos, para registro de seus produtos, comprove estar adquirindo matéria-prima de fornecedores em conformidade com a legislação ambiental (BRASIL, 1985; BRASIL, 1995; BRASIL; 2000). Apesar do crescente interesse pelo plantio da espécie, estudos avaliando o efeito do uso de corretivos e/ou fertilizantes sobre a composição fitoquímica de M. Ilicifolia são bastante escassos. Em relação aos estudos agronômicos, existem trabalhos sobre formas de propagação, seja por sementes (EIRA et al., 1993; ROSA et al., 1996; ROSA, 1999; SCHEFFER et al., 1999), ou por propagação vegetativa (SILVA, 1999; PEREIRA, 1993a). Alguns cultivos experimentais foram realizados buscando relacionar os efeitos da adubação (MAGALHÃES, 1994; PEREIRA, 1993b) e da poda (RACHWAL, comunicação pessoal4), sobre o desenvolvimento e a composição fitoquímica da espinheira-santa. Cabe ressaltar que, no Paraná, M. ilicifolia é uma das espécies nativas de ocorrência rara (SEMA/GTZ, 1995). A coleta indiscriminada de grandes quantidades de folhas, sem qualquer critério técnico, além de depredar o patrimônio genético vegetal, pode 4 RACHWAL, M.G. Embrapa Florestas. Colombo-PR. 10 levar esta espécie à extinção.Neste sentido, a “Primeira Reunião Técnica sobre Recursos Genéticos de Plantas Medicinais e Aromáticas” (VIEIRA et al., 2002) indicou, para a região da Mata Atlântica, a espinheira-santa como uma das principais espécies para ações prioritárias de pesquisa. 2.2 Silício O Si é um não-metal que ocorre na natureza nos estados de oxidação - 4, +2, e +4. Este elemento é o segundo mais abundante da crosta terrestre cuja composição, na sua maior parte, é de silicatos com metais agregados em estruturas aluminossilicatadas. Na natureza, o Si ocorre freqüentemente na forma de óxidos (quartzo, quartzo-ametista, ágata, jaspe e opala), e silicatos (hornblendas, asbestos, feldspatos, micas e argilo-minerais) (MINEROPAR, 2005). O quartzo, SiO2, é o mineral mais resistente nos solos, e é conhecido por ocorrer também na forma criptocristalina, a opala, à qual alguns pesquisadores atribuem uma origem biológica, ou seja, depósitos de silicatos em tecidos vegetais (KLEIN e GEIS, 1978; ÁLVAREZ et al., 2005; BORRELLI et al, 2005; VALLEJO et al., 2005). Em regiões temperadas, os teores de Si, na forma de aluminossilicatos, costumam ser maiores que os dos sexquióxidos de Al e Fe; nas regiões tropicais úmidas, solos bastante intemperizados, altamente lixiviados, ácidos e com baixos teores de argila, podem ter limitações quanto ao silício disponível para as plantas (KORNDÖRFER e DATNOFF, 1995; MARSCHNER, 1995). O Si solúvel ocorre na forma de ácido monosilícico – Si(OH)4, na faixa de pH de 4 a 9, sendo que sua concentração na solução do solo é controlada principalmente pelo pH dependente das reações de adsorção dos sesquióxidos (MENGEL e KIRBY, 1987; MARSCHNER, 1995). O Si pode ser adsorvido às superfícies dos óxidos de Fe, possivelmente nos mesmos sítios do P; o fato de competirem pelos mesmos sítios de adsorção pode fazer com que o Si(OH)4, quando adicionado ao solo, favoreça a liberação do P para as plantas, ou diminua o excesso de absorção, no caso de uma elevada adubação fosfatada. Deste modo, de 11 maneira indireta, o Si pode favorecer o desenvolvimento de plantas via regulagem da absorção de P (OBIHARA e RUSSEL, 1972; KABATA-PENDIAS e PENDIAS, 1992). Neste sentido, trabalhos têm sido desenvolvidos, buscando comprovar os efeitos da aplicação de Si sobre o aumento na disponibilidade de P no solo, e conseqüentemente, seu efeito sobre o desenvolvimento de culturas anuais como o milho (MA et al, 2001), e o arroz (CARVALHO-PUPATTO, 2004), e espécies perenes como o eucalipto (CARVALHO et al, 2000). Por outro lado, MENGEL e KIRBY (1987) citam que óxidos de Al são mais efetivos que óxidos de Fe na adsorção de Si. Com base neste fato, diversos autores citam o papel do Si na formação de complexos estáveis com o Al, reduzindo os efeitos nocivos deste elemento através da deposição de aluminosilicatos, no solo, ou no interior de organismos (DUAN e GREGORY, 1998; PERRY e KEELING-TUCKER, 1998; NEUMANN e NIEDEN, 2001; BRITEZ et al., 2002). O silício é absorvido na forma de Si(OH)4 , entretanto os mecanismos para sua absorção e translocação dentro da planta não são plenamente conhecidos e parecem variar entre as espécies vegetais. Devido a esta variação, e ao conteúdo de Si e da relação Si/Ca, na matéria seca, autores classificam as espécies vegetais em acumuladoras, intermediárias e não acumuladoras (MARSCHNER, 1995; EPSTEIN, 1994). Dentre as acumuladoras destacam-se espécies agrícolas como o arroz, a cana-de-açúcar (KORNDÖRFER et al, 2002), espécies forrageiras da família Poaceae (Phalaris spp., Brachiaria spp.) (HARRISON, 1995; KORNDÖRFER et al., 2002), e não forrageiras como o bambu (Phyllostachys bambusoides, P. Pubescens e Sasa veitchii) (MOTOMURA et al., 2002), e também vegetais da família Equisetaceae (EPSTEIN, 1994; MARSCHNER, 1995), além de organismos do reino Protista, como diatomáceas e esponjas, cujo conteúdo de sílica pode variar de 1a 90% (HOLZHÜTER et al, 2005). No interior da planta, 99% do Si acumulado encontram-se na forma de ácido silícico polimerizado, o restante, 1%, encontra-se na forma coloidal ou iônica (KORNDÖRFER et al., 2002). Ao ser absorvido pelas plantas, o Si é facilmente translocado 12 no xilema, e tem tendência natural a se polimerizar, associando-se a compostos orgânicos como proteínas, polissacarídeos e lignina (EPSTEIN, 1994; KOLESNIKOV e GINS, 2001). O Si também é encontrado nas plantas na forma de sílica amorfa hidratada (SiO2.nH2O), também chamada de opala ou fitolito. Nesta forma o Si torna-se imóvel e não pode ser redistribuído dentro da planta. A sílica hidratada pode estar depositada no lúmen e na parede celular, nos espaços intercelulares ou nas camadas externas, em raízes, folhas, e brácteas das inflorescências de cereais (EPSTEIN, 1994). Para a maior parte das plantas o Si não é considerado um elemento essencial, entretanto alguns grupos, como as diatomáceas e as equisetáceas, dependem deste elemento para seu estabelecimento e crescimento (HOFFMANN e HILLSON, 1979; EPSTEIN, 1994). Vários efeitos benéficos são relacionados à presença de Si nas plantas, dentre eles, uma maior resistência da parede celular e resistência ao acamamento (KORNDÖRFER et al, 2002), a proteção contra ataque de fungos e insetos sugadores e mastigadores (DATNOFF et al, 1991; KORNDÖRFER e DATNOFF, 1995; EPSTEIN, 1994; HAMMMERSCHMIDT, 2005), a tolerância ao stress hídrico (MARSCHNER, 1995) e a tolerânica a toxidez por Al, Cu, Fe, Mn e Zn (HODSON e SANGSTER,1999; NEUMANN e NIEDEN, 2001; ROGALLA e RÖMHELD, 2002; IWASAKI et al., 2002; BRITEZ et al., 2002). A biossíntese de compostos fenólicos, como a lignina, também parece ser regulada pela maior ou menor disponibilidade de Si. A alta afinidade do ácido silícico por o-difenóis, como o ácido cafeico e ésteres correspondentes, resulta em complexos de silício de alta estabilidade e baixa solubilidade, os quais teriam uma função estrutural na forma de depósitos nas paredes de células lignificadas, balanceando a biossíntese de lignina. Isto seria uma vantagem para a planta, já que a biossíntese dos complexos de silício demanda muito menos energia do que a síntese de lignina (RAVEN, 19835, citado por MARSCHNER, 1995). INANAGA e OKASAKA (1995) e INANAGA et al.(1995), relataram o papel do Si e do Ca na formação de ligações entre carboidratos e lignina, a partir da sua 5 RAVEN, J.A. The transport and function of silicon in plants. Biol. Ver. Cambridge Philos. Soc. 58(2):179- 207, 1983. 13 associação com ácidos fenólicos e anéis aromáticos, nas paredes celulares de plantas de arroz, o que confere maior resistência aos tecidos vegetais. Ainda neste sentido, cabe citar outro importante papel do Si na substituição de fenólicos em funções como proteção contra raios UV e defesa contra herbivoria, a partir de depósitos na parede celular formados a um menor custo energético para a planta (GOTO et al., 2003). Grande parte dos trabalhos tem enfocado o efeito da aplicação do Si na produtividade do arroz (DEREN et al., 1994; KORNDÖRFER e DATNOFF, 1995; KORNDÖRFER et al., 1999a; KORNDÖRFER et al., 1999b; CARVALHO-PUPATTO et al., 2003). Estudos com espécies de outras famílias também têm demonstrado o aumento da produtividade de culturas como a soja, o pepino e a videira, em função do aumento da disponibilidade deste elemento para as plantas. (ADATIA e BESFORD, 1986; CHÉRIF e BÉLANGER, 1992; MENZIES et al., 1992; VOOGT, 1992). Os efeitos da adubação com Si em espécies arbóreas também têm sido relatados. EMADIAN e NEWTON (1989) observaram maior desenvolvimento de mudas de Pinus taeda que receberam aplicação de Si e adubação em relação às plantas que receberam apenas adubação convencional. BRADBURY e AHMAD (1990) verificaram que a aplicação de Si, em solos salinos, aumenta a produção de biomassa de Prosopis juliflorai; os autores sugeriram que este efeito pode estar relacionado ao papel do Si na elasticidade das paredes primárioas das células. Estudos com eucalipto demonstraram os benefícios da aplicação do Si sobre esta cultura. CARVALHO et al. (2000 e 2003), observaram ganhos em fósforo e incrementos na produção de matéria seca da parte aérea, em plantas de Eucalyptus grandis cultivadas em Cambissolo, o qual recebeu aplicação de Si, após adubação fosfatada. Os autores chamaram a atenção sobre o papel do Si como elemento útil aos vegetais, notadamente às gramíneas, e, pelo fato da sua função nas dicotiledôneas ainda não ter sido relatada, consideram que outros fatores, além do Si, também devem estar envolvidos na produção de matéria seca do eucalipto. 14 A pesquisa também tem avançado no sentido de identificar os múltiplos benefícios da utilização de resíduos industriais ricos em Si, como as escórias de alto forno de indústrias siderúrgicas. Estudos sobre os efeitos da aplicação destes resíduos têm sido conduzidos particularmente em espécies acumuladoras de Si, como o arroz e a cana-de-açúcar, avaliando-se os benefícios da fertilização com base neste elemento sobre a produtividade destas culturas (CARVALHO, 2000; PRADO, 2000; CARVALHO-PUPATTO et al., 2004). Além do interesse agronômico, o Si tem assumido importância como elemento nutracêutico, com várias ações sobre o organismo de humanos e animais (TESKE e TRENTTINI, 1997; LESNIEWICZ et al., 2006; KOLESNIKOV e GINS, 2001). Assim como nas plantas, no organismo animal o silício está presente nos mecanismos de defesa e desintoxicação; contribui com a função dos tecidos conectivos, promove força e elasticidade às paredes dos vasos, promove a biossíntese de colágeno e a formação e calcificação dos tecidos ósseos. Além disso, o silício está envolvido no metabolismo do fosfato e dos lipídios (KOLESNIKOV e GINS, 2001). KOLESNIKOV e GINS (2001), estudando formas de Si em várias espécies medicinais, observaram que 50% do conteúdo total do elemento nas plantas correspondiam à fração orgânica (Si ligado a proteínas, lignina e polissacarídeos). RADOMSKI e WISNIEWSKI (2004) obtiveram uma concentração média de 0,09% de Si total em folhas da espécie medicinal Maytenus ilicifolia (espinheira- santa), sendo que 50% deste encontrava-se na forma hidrossolúvel. 15 2.3 Compostos fenólicos – taninos e lignina Por uma questão de conveniência, os compostos químicos das plantas são freqüentemente classificados como metabólitos primários ou secundários (BALANDRIN et al., 1985; SALISBURY e ROSS, 1992). Os açúcares e outros carboidratos são considerados os produtos finais da fotossíntese e a fonte de carbono e energia para a síntese de gorduras, ácidos graxos, aminoácidos e ácidos orgânicos. Nas plantas superiores, todos estes compostos estão freqüentemente concentrados nas sementes e orgãos vegetativos de armazenagem, sendo denominados metabólitos primários, pois deles depende o metabolismo básico da célula e, conseqüentemente, o desenvolvimento fisiológico do vegetal (BALANDRIN et al., 1985; WARING e SCHLESINGER, 1985) Os metabólitos secundários, ou compostos secundários, são biossinteticamente derivados do metabolismo primário, e podem ser reconvertidos para açúcar e outros compostos utilizados na estrutura e manutenção das plantas (BALANDRIN et al., 1985; WARING e SCHLESINGER, 1985). Ao contrário dos metabólitos primários, são sintetizados preferencialmente em células especializadas e em distintos estádios de desenvolvimento da planta, o que muitas vezes dificulta seu doseamento, extração e purificação (BALANDRIN et al., 1985). De 30 a 40% da energia apreendida pela fotossíntese é utilizada para o crescimento das plantas, via síntese de novas moléculas, e para a manutenção das células vivas. Esta porcentagem, no entanto, varia entre algumas espécies. Algumas plantas, por exemplo, usam mais energia do que outras, como é o caso da síntese de compostos secundários como taninos ou alcalóides, ou compostos estruturais como a lignina (BIDWELL, 1974; KRAMER e KOZLOWSKI, 1979; SALISBURY e ROSS, 1992). Alguns compostos secundários são acumulados pelas plantas em menores quantidades, devido ao elevado custo energético dos complicados processos de síntese destes produtos (FLÜCK, 1954; COLEY et al., 1985). 16 A distribuição dos metabólitos secundários é mais limitada no reino vegetal, restringindo-se a grupos taxonômicos particulares (espécie, gênero, família, ou grupo de famílias) (BALANDRIN et al., 1985). Estes compostos aparentemente não apresentam nenhuma função específica no metabolismo primário da planta (KRAMER e KOZLOWSKI, 1979; SALISBURY e ROSS, 1992; ROBBERS et al., 1997), estando associados mais ao seu papel ecológico. Como exemplo de compostos secundários com função ecológica pode- se citar: atrativos de polinizadores (carotenos e antocianinas); adaptações químicas a estresses ambientais (mucilagens e gomas); defesas químicas contra microorganismos, insetos, predadores superiores e mesmo contra outras plantas (alcalóides, glicosídeos cianogênicos, terpenos e taninos) (FLÜCK, 1954; JANZEN, 1980; BALANDRIN et al., 1985; COLEY et al., 1985; WARING e SCHLESINGER, 1985; COLEY, 1987). Quando os compostos secundários presentes nas plantas exercem algum efeito fisiológico de propriedade terapêutica, é prática comum individualizar os responsáveis por tal efeito, denominando-os de princípios ativos. O princípio ativo de uma planta medicinal pode ser um composto ou um conjunto de compostos que interagem e proporcionam o efeito de tratamento (ROBBERS et al., 1997). Os fenóis vegetais são compostos secundários, não nitrogenados, baseados em cadeias de carbono, cujo elemento estrutural fundamental caracteriza-se por um anel benzênico ao qual está ligada pelo menos uma hidroxila (BRUNETON, 1991). Constituem um grupo quimicamente heterogêneo, com aproximadamente 10.000 compostos – alguns solúveis apenas em solventes orgânicos, outros solúveis em água, e há ainda aqueles que são grandes polímeros insolúveis (TAIZ e ZEIGER, 2004). Duas rotas metabólitas básicas estão envolvidas na síntese dos compostos fenólicos: a rota do ácido chiquímico e a rota do ácido malônico. Nas plantas superiores, a classe mais abundante de compostos fenólicos é derivada da fenilalanina, por meio da eliminação de uma molécula de amônia para formar o ácido cinâmico. Esta reação é catalisada pela fenilalanina amonioliase (PAL), situada em um ponto de ramificação entre os metabolismos primário e secundário, de forma que a reação que esta enzima catalisa é uma 17 etapa reguladora importante na formação de muitos compostos fenólicos (TAIZ e ZEIGER, 2004). Na Figura 1 encontra-se um esquema simplificado das vias de síntese dos compostos fenólicos. 18 Figura 1 – Vias de síntese dos compostos fenólicos (TAIZ e ZEIGER, 2004). Além de estarem relacionados a inúmeros processos ecológicos (RICE e PANCHOLY, 1974; FEENY, 1976; COLEY et al., 1985; WARING e SCHLESINGER, 1985; LARCHER, 1986; COLEY, 1987; HORNER et al., 1988; KUITERS, 1990; SALISBURY e ROSS, 1992), o grupo inclui substâncias com comprovada ação terapêutica e utilizadas tradicionalmente na medicina popular (POWEL e SMITH Jr., 1979; NOKAKI et al., 1990; ITOKAWA et al., 1991; PEREIRA et al., 1992; BRUNETON, 1991; ROBBERS et al, 1997). Dentre os compostos fenólicos, destaca-se o grupo dos polifenóis, polímeros dos fenóis simples, que apresentam grande peso molecular (ROBBERS et al., 1997). Os dois principais grupos de polifenóis são as ligninas e os taninos. SWAIN (1979), afirma que estes dois compostos são os mais importantes componentes dos vegetais, não só por sua distribuição quase universal, mas também pela sua história, mais antiga que a de qualquer outra classe de compostos secundários. Rota do ácido chíquímico Ácido gálico Taninos hidrolisáveis Fenilalanina Àcido cinâmico Fenóis simples Lignina Acetil CoEnzima A Rota do ácido malônico Compostos fenólicos variados Flavonóides Taninos condensados Eritrose-4 fosfato (resultante da rota da pentose fosfato) Ácido fosfoenolpirúvico (resultante da glicólise) 19 A lignina é um componente estável das paredes das células, atuando na defesa contra agentes patogênicos e estresse hídrico (KOZLOWSKA e KRZYWANSKI, 1994; KURUP et al., 1994). Pode responder por 20-30% da massa das células lenhosas. Desta forma, quando ocorre o crescimento dos tecidos de suporte e condução, a competição por recursos (p.ex. nutrientes do solo) pode limitar a produção de compostos secundários que possuem a mesma via de síntese, como os taninos (WARING e SCHLESINGER, 1985). Os taninos compreendem um grande grupo de substâncias complexas, e que ocorrem, em geral, como misturas de polifenóis difíceis de separar por não se cristalizarem. Por este motivo, muitos destes compostos nunca foram isolados e caracterizados, dificultando a compreensão da sua origem biogenética (ROBBERS et al., 1997). Apesar da sua solubilidade em água, os taninos são destruídos por fervura prolongada, e podem, também, reagir com o ar e tornarem-se inativos (MARTINS et al., 1994). Os taninos costumam ser divididos em: taninos hidrolisáveis, compostos de alto peso molecular, passíveis de sofrer hidrólise, produzindo os ácidos fenólicos (ácido gálico, p.ex.) e açúcar; e, taninos condensados, que não sofrem hidrólise e possivelmente são derivados de flavonóides. Estes taninos contêm, basicamente, núcleos fenólicos, algumas vezes ligados a carboidratos ou proteínas, e quando tratados com agentes hidrolíticos tendem a polimerizar-se, resultando em produtos insolúveis, geralmente de coloração vermelha, conhecidos como flobafenos (HASLAM, 1966; ROBBERS et al., 1997). ZUCKER (1983) sugeriu que os taninos condensados estariam relacionados à proteção contra microorganismos, enquanto que os hidrolizáveis protegeriam a planta contra herbívoros. Alguns autores consideram que os taninos predominam entre as espécies arbóreas, devido ao grande investimento energético exigido na síntese destes compostos (FEENY, 1976; COLEY, 1987), ou à sua possível função como precursores no processo de lignificação (BATE-SMITH, 1972). Espécies que contêm taninos, como a hamamélis (Hamamelis virginiana) e a noz-de-galha (Quercus infectoria), bem como os taninos parcialmente purificados (ácido tânico, p.ex.) e seus derivados (ácido acetiltânico), são usadas como adstringentes das mucosas, principalmente do tubo digestivo, e em escoriações cutâneas. No tratamento de queimaduras, agem como cicatrizantes, a partir da precipitação das proteínas 20 dos tecidos expostos, formando um revestimento protetor ligeiramente anti-séptico, sob o qual pode ocorrer a regeneração dos tecidos (MARTINS et al., 1994; ROBBERS et al., 1997). MISIC (1986) ressaltou os efeitos do tanino no organismo humano, devido à sua ação adstrigente, bactericida, fungicida, antitóxica e antinflamatória, prevenindo inclusive a penetração de substâncias carcinogênicas no sangue. O autor chama a atenção para o fato de o tanino inibir o crescimento descontrolado de tecidos vegetais, como as galhas, e de preservar tecidos animais, sugerindo que estas ações podem ser de grande utilidade para a medicina. Cabe ressaltar que os taninos exercem sua ação terapêutica apenas em baixa concentração, quando tornam as mucosas impermeáveis, através da precipitação de pequenas quantidades de proteínas, prevenindo a penetração de agentes nocivos, como fungos e bactérias (ROBBERS, 1997); em grandes concentrações, podem exercer um efeito contrário, irritando as mucosas, e provocando inclusive o câncer (MORTON, 1979). SCUTAREANU e LINGEMAN (1994) observaram que, em folhas de Quercus robur, os fenóis totais correlacionaram-se positivamente com tanino, ácidos orgânicos, nitrogênio protídico, frutose e sacarose foliares, bem como com o pH, potássio, cálcio e magnésio do solo. Os teores de tanino também se correlacionaram positivamente com o nitrogênio e o fósforo do solo, e negativamente com pH, potássio, cálcio e magnésio. KAPEL e KARUNANITHY (1977) obtiveram uma correlação positiva entre a disponibilidade de manganês e a produção de taninos em Acacia catechu. VARANDA et al.(1998), estudando a vegetação da mata mesófila semidecidual e do cerrado, no Estado de São Paulo, observaram diferenças entre espécies congenéricas, para o teor de lignina e fenóis totais, em função do tipo de vegetação (mata e cerrado) e estação do ano (seca e chuvosa). BERNARDI e WASICKY (1959) foram os primeiros autores a relatar a presença de substâncias tânicas em diferentes tipos de folhas de M. ilicifolia. O teor de taninos nas folhas de espinheira-santa, coletadas em diversos ambientes, revelou grande variação. Isso foi associado às características morfológicas e às condições de insolação. Porém, num experimento com M. aquifolia, com árvores originadas de sementes de mesma procedência, foi encontrada diferença significativa no teor de fenóis totais dos indivíduos 21 (PEREIRA et al., 1994). Não se pode desprezar a hipótese de haver variação devido a fatores genéticos em relação ao teor de taninos nas folhas, pois não é raro que espécies medicinais apresentem raças químicas. 2.4 Variação genética e síntese de substâncias bioativas A habilidade das espécies vegetais em sintetizar compostos secundários tem sido selecionada no curso da evolução em diferentes linhagens de plantas, cuja composição química está relacionada diretamente a necessidades específicas. É o caso, por exemplo, da síntese de constituintes químicos tóxicos, como os alcalóides, com função de repelir agentes patógenos e herbívoros, ou suprimir o crescimento de plantas vizinhas (PICHERSKY e GANG, 2000). Fatores bióticos e abióticos desempenham uma forte influência sobre a produção de substâncias bioativas, mais freqüentemente denominados de compostos primários e secundários, nas plantas. De acordo com os autores (COLEY et al., 1985; COLEY, 1987; JING e COLEY, 1990; BRAM e QUINN, 2000), variações no ambiente podem levar as plantas a expressar de forma diferenciada, a produção destas substâncias, seja na sua forma ou na quantidade. Estudos relacionando aspectos genéticos e a síntese de substâncias bioativas são freqüentes e tem por objetivo, principalmente, o controle artificial da síntese destas substâncias. É o caso, por exemplo, do taxol, substância antitumoral produzida por Taxus brevifolia. Estudos sobre a diversidade genética baseados em características relacionadas à produção do taxol, identificaram que a maior parte da variação genética encontra-se dentro das populações, o que indica que há uma grande similaridade genética entre árvores, mesmo estando distantes umas das outras. Também foram observados baixos valores para a herdabilidade de características ligadas aos taxanos, fato que favorece a seleção de materiais genéticos visando a produção de maiores quantidades da substância (WHEELER et al., 1995). LINDROTH e HWANG (1996) avaliando 31 clones de Populus tremuloides, cultivados sob as mesmas condições ambientais, observaram diferenças 22 significativas na composição química foliar, em particular nos teores de N, amido, glicosídeos fenólicos e taninos condensados. CASTRO et al. (1999), avaliando dois acessos de Baccharis myriocephala observaram diferenças no rendimento de tanino obtido para os dois materiais, com variação significativa no rendimento em função de diferentes épocas de colheita. Estudos desenvolvidos com diferentes populações naturais de Mimulus aurantiacus, identificaram uma alta correlação entre populações geneticamente distintas e teor de resinas; indivíduos provenientes destas populações, cultivados em condição ambiental similar, mantiveram as mesmas variações na síntese de resinas (HARE, 2002). LINDROTH et al. (2002), concluíram que tanto fatores genéticos quanto ambientais (e suas interações) influenciam a composição química de Populus tremuloides durante a fase de senescência foliar. Estudos relacionando taxa de herbivoria com a variabilidade genética e ambiental em Qualea parviflora (Vochysiaceae), demonstraram uma maior predação de insetos em folhas mais ricas em nutrientes, e com menor concentração de fenóis totais e taninos, oriundas de populações localizadas sobre solos mais férteis; os autores não obtiveram relação entre a composição fitoquímica e a diversidade genética das diferentes populações avaliadas (GONÇALVES-ALVIM et al., 2004). 23 3 MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi dividido em três estudos com populações de M. ilicifolia, relacionados a seguir: 1o. Em quatro populações naturais, localizadas sobre três regiões fisiográficas do Estado do Paraná; 2o. Em um Banco de Germplasma composto por 44 progênies, no município de Ponta Grossa, PR; 3o. Em uma população cultivada, onde foi estabelecido um ensaio para avaliar os efeitos da aplicação de Si em M. ilicifolia. 3.1 Caracterização das áreas de estudo de Maytenus ilicifolia e coleta de dados 3.1.1 Populações naturais Foram selecionadas quatro populações naturais, distribuídas nas três regiões fisiográficas do Estado do Paraná: 1- Uma população na Região Metropolitana de Curitiba (Primeiro Planalto), denominada RMC; 2- Uma população na Floresta Nacional de Irati (Segundo Planalto), denominada FLONA; 24 3- Duas populações na Região de Guarapuava (Terceiro Planalto), estando uma localizada na área da Fundação para o Desenvolvimento da Região Centro-Oeste, denominada RURECO, e outra na fazenda da empresa Manasa Florestal – Madeireira Nacional S.A., localizada no distrito da Palmeirinha, denominada MANASA. As três regiões fisiográficas do Paraná apresentam as seguintes características: • Primeiro Planalto: é a zona de eversão entre a Serra do Mar e a escarpa Devoniana, a qual constitui, a oeste o limite oriental dos sedimentos da Bacia do Paraná. Apresenta duas porções bem distintas – a região de Curitiba, na parte meridional, caracterizada por topografia ondulada, com colinas suavemente arredondadas e altitude uniforme (850 a 950 metros), e a parte setentrional, marcada por relevo mais enérgico, onde dominam cabeços de estrato, espigões e vales alongados. A população estudada encontra-se na primeira porção, particularmente nas áreas de depósitos fluviais recentes, onde ocorrem solos hidromórficos, gleizados ou não, e solos orgânicos, e também sobre a Formação Guabirotuba, onde ocorrem predominantemente os Cambissolos (EMBRAPA, 1984). • Segundo Planalto: constitui-se exclusivamente de rochas sedimentares da Era Paleozóica e rochas ígneas intrusivas, comportando-se como um imenso patamar de denudação, com altitudes de 1.100 a 1.200 metros. A área da FLONA caracteriza- se, particularmente, pela presença de sedimentos argilo-arenosos, pertencentes à formação Palermo (grupo Tubarão), além de feições geomórficas resultantes da ocorrência de diques de diabásio. A população natural estudada compreende indivíduos localizados nas planícies aluvionares dos rios Imbituva e Imbituvão, em altitudes que variam de 790 a 820 metros, onde predominam Neossolos e Cambissolos hidromórficos (OLIVEIRA, 1999). • Terceiro Planalto: representa a região dos grandes derrames de magma, sendo que a região em questão caracteriza-se pelos derrames ácidos, do Grupo Chapecó. As populações de espinheira-santa encontram-se sobre solos derivados da decomposição de rochas eruptivas ácidas que compõem o planalto de Guarapuava 25 (EMBRAPA, 1984). Nas regiões de estudo o tipo climático predominate é o Cfb - sempre úmido, com temperatura média do mês mais quente de 22 oC, temperatura média do mês mais frio superior a 10 oC, mais de cinco geadas noturnas por ano e precipitação média anual em torno dos 1500 mm (LEITE, 1994). A vegetação original nas áreas do estudo é a Floresta Ombrófila Mista (Floresta com Araucária), associada à Estepe Gramíneo-Lenhosa nas regiões de Guarapuava e Ponta Grossa (LEITE, 1994). Durante o outono de 2004 foram amostrados 10 indivíduos de cada uma das quatro populações naturais, indivíduos estes selecionados a partir de critérios estabelecidos previamente pela autora, como: indivíduos adultos, vigorosos, com copa ampla e galhos com grande quantidade de folhas. De cada indivíduo coletou-se ramos do terço médio da copa, separando-se para a análise folhas plenamente expandidas entre a porção mediana e terminal do ramo. Estas coletas foram efetuadas durante o outono de 2004. Para a caracterização química e granulométrica dos solos foram efetuadas duas amostragens: • Tradagem para coleta de horizontes e classificação dos solos, segundo Embrapa (1988, 1999); • Abertura de trincheiras junto ao tronco dos 40 indivíduos selecionados para coleta de amostras nas profundidades de 0-5, 5-10, 10-15 e 15-20 cm. Para caracterização do ambiente lumínico das populações foram efetuadas medidas da energia radiante do vermelho (655-665 nm), e vermelho-extremo (725- 735 nm), com o equipamento – SKYE MO, e da Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR – 400 a 700 nm) com o equipamento Li-Cor Quantum. Os equipamentos foram instalados junto a indivíduos representando cada uma das três condições básicas de ambiente lumínico em que se encontram as populações, pleno sol, meia sombra (incidência direta de luz solar por pelo menos parte do dia) e sombra (ausência de incidência direta de luz solar). Para realização das leituras, os equipamentos foram posicionados a 1,30 m de altura do solo, junto à copa das 26 árvores e voltados para a direção norte. Em cada ambiente lumínico foram efetuados dois registros, um em agosto de 2005, representando as medidas de inverno, e um em fevereiro de 2006, representando as medidas de verão. Cada registro foi obtido a partir de apenas uma leitura diária, efetuada no período das 7:00 às 18:50horas. 3.1.2 Banco de Germoplasma O banco de germoplasma de M. ilicifolia foi implantado em abril de 1998, na base física da Embrapa Negócios Tecnológicos, em Ponta Grossa, Paraná. A vegetação original do local do estudo é a Estepe Gramíneo-Lenhosa, com clima predominante do tipo Cfb (LEITE, 1994). As mudas foram plantadas a pleno sol, sobre LATOSSOLO VERMELHO Tb Distrófico típico A moderado textura argilosa relevo suave ondulado, derivado de arenito Formação Itararé6. Das 44 matrizes coletadas, 19 eram do Rio Grande do Sul (Viamão e Arroio do Conde), 10 de Santa Catarina (Campos Novos e Água Doce) e 15 do Paraná (Guarapuava, Laranjeiras do Sul, Campina Grande do Sul e Araucária), resultando em oito populações distintas, conforme consta na Tabela 1. Para o teste de progênies, encerrado em março de 2000, foi adotado o delineamento experimental de blocos completos ao acaso, com cinco repetições e quatro plantas por parcela. 6 Curcio, G.R. Pesquisador Embrapa Florestas. Comunicação Pessoal. 27 Tabela 1 – Identificação das matrizes coletadas de oito populações de Mayteuns ilicifolia na região Sul do Brasil, e que compõem o banco de germoplasma (BGEM), localizado no município de Ponta Grossa, Paraná. Estado População Matrizes/progênies Rio Grande do Sul Viamão Arroio do Conde 1, 3, 4, 6, 8, 9, 23, 24, 25, 36, 38, 39, 40, 99 10, 11, 12, 14, 15 Santa Catarina Campos Novos Água Doce 30, 31, 33, 34, 35, 49, 52, 53 69, 75 Paraná Guarapuava Laranjeiras do Sul Campina Grande do Sul Araucária 18, 42 43, 44, 45, 46, 48 55, 56, 58 85, 90, 94, 96, 97 Para a caracterização fitoquímica, em virtude do grande número de amostras, foram selecionadas apenas 25 das 44 progênies, de modo a representar as 8 populações dos três Estados, sendo analisados 3 indivíduos (repetições) por progênie. Para a caracterização química e granulométrica dos solos foram efetuadas duas amostragens: • Tradagem para coleta de horizontes e classificação dos solos, segundo Embrapa (1988, 1999); • Abertura de trincheiras junto à 5 indivíduos de M. ilicifolia, distribuídas ao acaso, para coleta de amostras às profundidades de 0-5, 5-10, 10-15 e 15-20 cm. 3.1.3 Ensaio de aplicação de Si O ensaio foi estabelecido no ano de 2004, em uma área de cultivo de espinheira-santa, com onze anos de idade, localizada na sede da Embrapa Florestas, no município de Colombo-PR, sobre CAMBISSOLO HÚMICO Tb Distrófico A proeminente textura argilosa. O clima predominante na região é o Cfb. 28 Nesta área os indivíduos encontram-se dispostos em 21 linhas, com espaçamento de 1 metro na linha por 2 metros entre linhas. Em algumas das linhas foram delimitadas parcelas lineares contendo 3 indivíduos de M. ilicifolia por parcela, com bordadura de pelo menos 2 metros entre parcelas na linha. Foram utilizadas cinco doses de Si, na forma de silicato de cálcio, CaSiO3 - 0, 150, 300, 450 e 600 mg dm-3 de Si. A fonte de Si foi o produto Recmix, uma escória da produção de aço inox. Em função do alto poder de neutralização deste produto, foi efetuada correção complementar do pH, com calcáreo, de modo a eliminar a interferência desta variável entre os tratamentos. Os produtos (Recmix e calcáreo) foram aplicados ao mesmo tempo sobre o solo e incorporados manualmente, já que o sistema radicular das plantas é superficial e não permite um revolvimento muito intenso do solo. Este procedimento foi efetuado após a realização da colheita da espinheira-santa, em maio de 2003. O delineamento foi inteiramente casualizado, com 6 repetições por tratamento, totalizando 30 parcelas, sendo cada parcela constituída por três plantas. As amostragens de material foliar e de solos foram efetuadas um ano após a aplicação do produto, em maio de 2004. Amostras de material vegetal foram obtidas a partir da coleta de folhas plenamente expandidas da porção mediana dos ramos localizados no terço médio da copa. Cada repetição constou de uma amostra composta por material coletado dos três indivíduos que compunham cada parcela. O solo foi coletado a uma profundidade de 0-15 cm, obtendo-se uma amostra composta por parcela a partir da coleta de duas sub- amostras retiradas nos intervalos entre a planta central as plantas laterais. 3.2 Determinações 3.2.1 Solos As amostras foram secas a 60O C, destorroadas e peneiradas à fração 2mm. Foram realizadas as seguintes análises, de acordo com EMBRAPA (1979): 29 • pH em solução 0,01 M de cloreto de cálcio. • Acidez potencial (H+ + Al+3) com acetato de cálcio 1N a pH 7,0. • Ca+2, Mg+2 e Al+3 com cloreto de potássio 1N. • K+ com ácido clorídrico 0,05N. • P com extrator de Melich. • C total determinado pelo método Walkley e Black, conforme descrito por PAVAN et al. (1992), e amostras com peso entre 0,1 e 0,5g. • Fe+2, Mn+2, Cu+ e Zn+2, disponíveis (extração com HCl 0,1N e leitura em espectrofotômetro de absorção atômica Perkin-Elmer). • Si disponível por colorimetria, com extrator cloreto de cálcio 0,01mol L-1, segundo KORNDÖRFER et al. (1999a), citado por CARVALHO (2000). • Granulometria pelo Método da Pipeta. 3.2.2 Material vegetal 3.2.2.1 Produção de biomassa aérea e massa específica foliar A massa específica foliar foi determinada apenas para as amostras das populações naturais. Do material coletado de cada uma das quatro populações foram selecionadas, aleatoriamente, 100 folhas (HAAG, 1983), para determinação da área (em planímetro Modelo AAC-400) e da massa seca. A partir destas variáveis foi calculada a massa específica de folhas, dividindo-se a massa de 100 folhas, em gramas, pela sua área foliar, em cm2. No Banco de Germoplasma foi efetuada uma poda total dos indivíduos, no outono de 2003, para avaliação da produção de biomassa. O material obtido das podas foi pesado e levado para estufa a 45o C, onde foi secado até peso constante. Posteriormente foram separadas as folhas dos ramos, para determinação da massa seca de cada porção. 30 No ensaio de aplicação de Si as amostras coletadas foram pesadas para determinação da massa verde (MV) e em seguida colocadas em estufa para secagem a 45o C, até peso constante, sendo pesadas novamente para determinação da massa seca (MS). A percentagem de matéria seca foi calculada através da fórmula: %MS = 100- {((MV-MS) x 100) /MV} 3.2.2.2 Morfotipos Nas amostras procedentes do Banco de Germoplasma efetuou-se uma classificação dos indivíduos na tentativa de se obter morfotipos para Maytenus ilicifolia. A classificação foi realizada com base nos caracteres foliares descritos por CARVALHO- OKANO (1992), e definidos de acordo com critérios estabelecidos por RADOMSKI para este estudo, quais sejam - espessura de folha ao tato (delgada ou coriácea), tamanho de folha, distribuição de espinhos no bordo foliar, tamanho de espinhos, espessura do bordo foliar. 3.2.2.3 Composição fitoquímica As amostras coletadas nos três estudos foram submetidas às seguintes determinações da composição fitoquímica: • Elementos químicos totais Foram determinados os teores totais de N, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, Al, conforme Embrapa (1999), sendo o N determinado pelo método Kjeldhal e o P determinado pelo método colorimétrico com vanadato-molibdato de amônio e as leituras realizadas em espectrofotômetro UV/VIS 554 Perkin-Elmer. O teor total de Si foi determinado pelo método amarelo-vanadato (KORNDÖRFER et al, 1999a) adaptando-se a digestão das amostras para forno de microondas. 31 • Polifenóis totais e taninos Em 0,25 g do material foliar seco e moído foram adicionados 250 ml de água deionizada. Esta mistura foi fervida em refluxo durante 30 minutos e filtrada. O extrato aquoso foi submetido à determinação dos polifenóis, segundo metodologia descrita por REICHER et al. (1981). • Lignina Determinada pelo método do Ácido Sulfúrico a 72% (v/v), segundo EMBRAPA (2005). 3.3 Análise estatística Para as populações naturais foi efetuada comparação de médias (teste de Duncan a 5%), e matriz de correlação para as variáveis analisadas nas plantas e nos solos; os dados obtidos também foram submetidos à análise de agrupamento (Cluster), transformando-se todas as variáveis analisadas a partir da fórmula: (xi/Mx), onde M = média; as distâncias foram calculadas pela fórmula: (1 – Pearson r), onde r = coeficiente de correlação. Para o banco de germoplasma também se efetuou análise de agrupamento, a partir dos dados referentes às características fitoquímicas das progênies (JOHNSON e WICHERN, 1992). No ensaio experimental com aplicação de diferentes doses de Si foi utilizada a metodologia citada por CARVALHO et al.(1999), para determinação das variáveis mais influenciadas pela aplicação do Si. Inicialmente foram determinadas as correlações entre todas as variáveis analisadas (planta e solo). Todas as variáveis que apresentaram coeficiente de correlação não significativo a 1% foram descartadas. Em seguida, com a metodologia de componentes principais calculou-se os vetores e auto-valores para as variáveis que apresentaram correlações significativas. Considerando os primeiros vetores que explicaram 90% da variação total das variáveis, foi identificada, dentro de cada vetor, a variável com 32 coeficiente de maior valor absoluto. Assim, a variável com maior coeficiente no vetor de maior auto-valor foi a de maior importância. A seguir foi efetuado o ajuste de regressão, pelo método “stepwise” das variáveis selecionadas na análise de componentes principais. Todas as análises foram realizadas no pacote estatístico STATISTICA®, versão 2005. 33 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1Caracterização das populações naturais de Maytenus ilicifolia 4.1.1 Caracterização dos ambientes Na Tabela 2 encontram-se relacionadas as quatro populações estudadas e as informações referentes às características dos ambientes de ocorrência natural dos indivíduos de cada população, tendo-se relacionado informações do meio físico (posição geomórfica e classes de solo) e o ambiente lumínico. Como as populações do Terceiro Planalto concentram-se em áreas menores, não houve variação no tipo de solo, ao contrário das populações da FLONA e RMC onde houve maior variabilidade nos solos sob os indivíduos amostrados. Em relação ao ambiente lumínico, as populações do Terceiro Planalto também apresentaram maior homogeneidade, ao contrário das demais onde a variabilidade foi maior entre os indivíduos. 34 Tabela 2 – Posição geomórfica, classe do solos e ambiente lumínico das quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia estudadas no Paraná. População Posição geomórfica Classe do solo Ambiente lumínico MANASA Terço superior de encosta (10 indivíduos) Associação NEOSSOLO LITÓLICO Húmico típico textura média com cascalho pedregoso relevo plano a suave ondulado + Afloramentos de rocha (RLh) Pleno sol RURECO Terço médio de encosta (10 indivíduos) CAMBISSOLO HÁPLICO Tb Distrófico A proeminente textura muito argilosa relevo suave ondulado (CXbd) Meia sombra Dique marginal em plaino aluvial de várzea em superfície de umbral (2 indivíduos) GLEISSOLO HÁPLICO Tb Distrófico Típico Epieutrófico A moderado textura média relevo plano fase soterrado (camada antrópica) (GXbd - Dique marginal em plaino aluvial de várzea do Rio das Antas, em superfície de agradação (4 indivíduos) GLEISSOLO HÁPLICO Tb Distrófico A moderado textura argilosa relevo plano (GXbd) Meia sombra Plaino aluvial de várzea (3 indivíduos) CAMBISSOLO FLÚVICO1 Tb Distrófico A proeminente textura muito argilosa relevo plano (CUbd) Sombra FLONA Plaino aluvial fase paleoterraço (1 indivíduo) LATOSSOLO VERMELHO- AMARELO distrófico A proeminente textura argilosa relevo plano (LVAd) Pleno sol Dique marginal em plaino aluvial de várzea em superfície de umbral (2 indivíduos) CAMBISSOLO FLÚVICO1 Tb Distrófico A proeminente textura média relevo plano (CUbd) Sombra Dique marginal em plaino aluvial de várzea em superfície de degradação (2 indivíduos) NEOSSOLO FLÚVICO Tb Distrófico A proeminente textura argilosa relevo plano (RUbd) Meia sombra RMC Plaino aluvial de várzea (6 indivíduos) CAMBISSOLO HÚMICO Distrófico A proeminente textura argilosa relevo plano (CHd) Sombra 1Subordem não prevista em Embrapa (1999). Fonte: CURCIO, G.R. Entrevista concedida à Radomski, M.I. Curitiba, 03/05/2006. 35 As características lumínicas dos três ambientes onde encontram-se as populações de M. ilicifolia podem ser observadas nos Apêndices 2, 3, 4 e 5. Nos Apêndices 2 e 3 encontram-se os valores da radiação fotossinteticamente ativa (PAR), também denominada de densidade fotossintética de fluxo fotônico – PPFD (TAIZ e ZEIGER, 2004), e que corresponde à radiação na faixa de 400 a 700nm, incidente nas plantas no período do inverno e do verão, respectivamente. No verão, os valores da PAR são destacadamente superiores a pleno sol, entretanto as oscilações são menores se comparadas com as curvas obtidas para os ambientes de sombra. No inverno, entretanto, o comportamento é mais homogêneo entre os ambientes, sendo que na sombra a radiação que chega às plantas foi praticamente constante durante o período de mensuração. Os Apêndices 4 e 5 trazem as informações referentes à razão entre luz vermelha e vermelho-extremo – R/FR, para os três ambientes lumínicos. Esta razão pode ser definida como (TAIZ e ZEIGER, 2004): Segundo TAIZ e ZEIGER (2004), a razão R/FR diminui com o sombreamento; em comparação com a luz solar direta, há relativamente mais luz vermelho- extremo durante o pôr-do-sol, em uma profundidade de 5mm de solo, ou sob um dossel de outras plantas (como no subosque de uma floresta). No caso do dossel, as folhas verdes absorvem a luz vermelha devido ao seu alto teor de clorofila, sendo relativamente transparentes à luz vermelho-extremo. Nos ambientes avaliados, observa-se que a razão R/FR, também foi mais estável à pleno sol, em particular no verão, do que nas condições de sombra, onde ao contrário, as oscilações foram bastante evidentes, e com ocorrência de picos nos mesmos períodos no inverno e no verão. No verão entretanto a razão R/FR atingiu maiores valores ao longo do dia, no ambiente de sombra em relação aos demais ambientes. É importante ressaltar que os gráficos expostos têm por objetivo R/FR = Taxa de fluência de fótons em bandas de 10nm centradas em 660nm Taxa de fluência de fótons em bandas de 10nm centradas em 730nm 36 apenas a caracterização dos ambientes, já que as curvas obtidas referem-se à avaliação de apenas um dia de cada estação, o que limita as interpretações. De qualquer modo, as informações coletadas permitem perceber as diferenças entre os ambientes, sejam qualitativas, vide razão R/FR, sejam quantitativas, vide os valores de PAR e sua variação ao longo do ano. Na Tabela 3 encontram-se os resultados da análise química dos solos das quatro populações estudadas, e para as diferentes profundidades analisadas. A grande parte dos solos apresenta pH ácido, com apenas uma exceção, o solo RUbd da população RMC, cujo valor médio do pH é igual a 6,24 em função da baixa saturação com Al (m% = 0,2) associada à alta concentração em bases trocáveis (V% = 85,6). Os teores de carbono dos solos também são elevados para a maior parte dos solos, com uma média de 2,98 %, ressaltando-se o teor de 7,27 % encontrado na Associação NEOSSOLO LITÓLICO Húmico + Afloramento de Rocha. Também chamam a atenção os elevados teores de P disponível nos solos, em particular sob as populações MANASA e RMC, relacionados parte aos elevados teores de C do solo, parte à ocorrência de atividade hortícola, no caso das populações da RMC, onde o intenso uso de adubos e corretivos em áreas circundantes aos solos CUbd e RUbd, contribuiu com os teores elevados de P, bem como de Ca e Mg. Cabe citar que ambos os solos estão localizados às margens de rios da região que por ocasião de chuvas mais intensas extravasam para fora do leito, depositando sedimentos e resíduos de adubos utilizados nas áreas adjacentes às populações de M. ilicifolia. Em relação ao Si, apesar das diferentes litologias de origem dos solos deste estudo, os teores obtidos foram superiores aos observados nos trabalhos de KORNDÖRFER et al. (1999a, 1999b), CARVALHO et al. (2000) e CARVALHO-PUPATTO et al. (2004). Observando os teores do elemento ao longo dos perfis (Apêndice 6 ), verificam- se poucas diferenças, fato relacionado ao baixo intemperismo da maior parte dos solos e ao alto teor de argila dos horizontes (Apêndice 5) . 37 Tabela 3 - Valores médios de pH, P, K+, Ca+2, Mg+2, Al+3, H+ + Al+3, C, CTC, V% e m%, por classe de solo, e nas profundidades de 0-5, 5-10, 10-15 e 15-20 cm, sob as populações naturais de Maytenus ilicifolia. População/ Prof. pH K Ca Mg Al H+Al CTC P C V m Classe de Solo* cm CaCl2 -------------------- cmolc.dm-3------------------- mg.dm-3 ---------%------- MANASA 0-5 4,37 0,40 2,27 0,85 1,65 11,09 14,61 12,7 7,24 24,6 11,3 RLh 5-10 4,45 0,32 1,16 0,47 1,74 10,70 12,65 18,0 7,20 15,5 13,8 10-15 4,39 0,29 1,04 0,38 1,63 10,97 12,68 10,1 7,37 14,3 12,9 15-20 4,41 0,27 0,93 0,29 1,65 10,36 11,85 9,1 7,28 13,6 13,9 RURECO 0-5 4,28 0,60 2,25 0,99 1,70 9,57 13,41 4,4 3,02 28,6 12,6 CXbd 5-10 4,24 0,45 1,48 0,45 2,00 9,67 12,05 2,0 2,55 19,8 16,6 10-15 4,21 0,34 1,09 0,28 1,99 9,40 11,11 2,4 2,58 15,4 17,9 15-20 4,23 0,26 0,79 0,45 1,96 9,29 10,79 2,2 2,25 13,9 18,2 FLONA Gxbd-fs 0-5 4,64 0,54 7,48 5,05 0,27 5,78 18,81 9,1 2,57 69,0 1,4 5-10 4,53 0,36 6,83 3,43 0,53 6,05 16,67 6,9 2,58 63,9 3,2 10-15 4,50 0,33 8,13 2,99 1,03 5,80 17,25 5,5 2,04 63,5 6,0 15-20 4,49 0,31 5,27 3,82 0,52 5,50 14,90 5,1 1,80 63,3 3,5 GXbd 0-5 4,19 0,40 5,43 4,56 0,72 8,08 18,47 10,5 3,00 35,2 3,9 5-10 4,22 0,39 7,03 3,88 1,00 9,17 20,47 7,9 2,78 54,9 4,9 10-15 4,19 0,41 7,57 3,52 1,16 9,57 21,07 6,8 2,56 54,4 5,5 15-20 4,06 0,36 6,53 2,52 1,37 9,19 18,60 5,4 1,97 50,7 7,4 CUbd 0-5 3,50 0,16 2,73 0,97 6,01 23,58 27,44 10,0 3,20 15,0 21,9 5-10 3,50 0,13 1,63 0,88 6,99 22,16 24,80 7,8 2,91 11,6 28,2 10-15 3,47 0,10 1,33 0,62 7,28 18,76 20,81 6,8 2,59 9,6 35,0 15-20 3,48 0,09 1,12 0,44 7,11 21,06 22,71 5,1 2,71 7,9 31,3 LVAd 0-5 4,94 2,34 7,81 1,41 0,14 5,76 15,41 22,9 2,25 66,7 0,9 5-10 4,65 1,92 3,42 0,72 0,43 8,36 14,42 17,0 2,76 42,0 3,0 10-15 4,03 1,26 2,96 0,99 2,84 11,68 16,89 10,7 2,49 30,9 16,8 15-20 3,85 1,98 1,74 1,65 7,22 14,07 19,44 8,1 2,46 27,6 37,1 RMC CUbd 0-5 5,53 0,32 14,17 5,58 0,13 4,29 24,36 36,0 6,32 82,4 0,5 5-10 4,81 0,24 10,80 5,35 0,28 5,77 22,16 19,5 4,52 73,9 1,3 10-15 4,50 0,20 8,91 6,30 0,64 6,82 22,23 14,2 3,57 69,1 2,9 15-20 4,22 0,16 7,82 6,45 1,50 8,05 22,48 9,7 2,97 64,0 6,7 RUbd 0-5 6,20 0,63 15,74 8,09 0,07 2,51 26,97 11,9 4,35 90,7 0,3 5-10 6,38 0,65 15,49 8,50 0,03 2,32 26,96 12,9 4,84 91,4 0,1 10-15 6,31 0,68 13,37 8,71 0,03 2,84 28,44 10,5 3,77 75,0 0,1 15-20 6,06 0,52 10,35 9,03 0,04 3,43 23,33 9,4 3,80 85,3 0,2 CHd 0-5 4,40 0,35 8,47 4,13 1,03 9,98 22,93 23,6 6,19 56,4 4,5 5-10 4,28 0,26 5,50 2,28 1,60 11,48 19,52 13,8 6,02 44,3 8,2 10-15 4,11 0,27 4,51 2,70 2,15 11,47 18,95 10,6 4,63 39,2 11,3 15-20 3,97 0,22 2,92 2,19 2,64 11,96 17,29 7,1 6,17 31,8 15,3 * Ver legendas na Tabela 1. 38 KORNDÖRFER et al (1999a) comentam que para solos com os mesmos teores de argila, os teores de Si solúvel podem ser maiores nos solos com horizonte B textural do que nos solos com B latossólico. O que se observa nos perfis dos solos analisados neste trabalho (Apêndice 6) são teores relativamente mais elevados de Si, nos Neossolos e solos com horizonte B câmbico, fato certamente relacionado ao menor grau de intemperismo destes solos. Também se observam teores de Si mais elevados nos solos da RMC, o que pode estar relacionado tanto ao menor grau de intemperismo quanto ao material de origem destes solos, mais ricos em silicatos. Além do quartzo, as principais reservas de Si dos solos são os minerais aluminossilicatados, como feldspatos alcalinos e plagioclásio, que com o processo de intemperismo contribuem significativamente com o conteúdo de Al e K nos solos, além do próprio Si (EXLEY, 1998). De acordo com MINEROPAR ( 2005), os materiais de origem dos solos avaliados neste estudo apresentam ambos os minerais em sua composição, com menor quantidade de feldspato em relação a plagioclásio nos solos das populações de Guarapuava (MANASA e RURECO). Estas diferenças podem ser observadas nos teores trocáveis de K e Al ao longo dos perfis dos solos (Apêndice 6), com incremento dos teores de Al em profundidade nos solos do segundo e terceiro planaltos. O Si também é citado como um elemento regulador da disponibilidade de P no solo, já que ambos ocupam os mesmos sítios de adsorção nas superfícies de óxidos de Fe (KABATA-PENDIAS e PENDIAS, 1992). Provavelmente os elevados teores de P estão sendo disponibilizados em função da ocupação preferencial do Si nestes sítios de troca. Cabe mencionar que os teores de Si dos solos apresentaram valores de correlação significativos com pH, e com os teores de Ca, Mg, P e Al trocáveis (Apêndice 10). Quanto aos micronutrientes disponíveis nos solos, cujos teores encontram-se relacionados no Apêndice 7, chamam a atenção os elevados teores de Fe e Mn sob a população Flona, em particular nos solos GXbd e CUbd, e os teores de Mn, sob o solo CUbd da população RMC. Estes valores estão associados ao fato destes solos apresentarem grande flutuação no regime hídrico, o que promove reações de redução ao longo do perfil, aumentando a solubilidade destes dois elementos. Os teores de Cu foram os que menos variaram entre as classes de solos e entre os horizontes, o que confirma o fato de que a maior 39 parte do conteúdo deste elemento origina-se da deposição de matéria orgânica nos horizontes superficiais (KABATA-PENDIAS e PENDIAS, 1992). 4.1.2 Massa específica foliar e composição fitoquímica. Na Tabela 4 encontram-se os dados médios de massa, área foliar e massa específica foliar, obtidos para as quatro populações avaliadas, indicando-se o ambiente lumínico predominante nos indivíduos analisados. Observa-se uma relação direta entre o ambiente lumínico e o acúmulo de biomassa indicado pelos valores de massa específica menores para plantas localizadas nos ambientes com menor exposição de luz (RURECO, FLONA e RMC). De acordo com JURIK et al (1982), o tamanho da folha é determinado por um complexo de fatores ambientais e endógenos, e que a intensidade de luz, mais do que sua qualidade, pode influenciar a estrutura da folha, o crescimento da planta e a alocação de biomassa. O menor valor de massa específica para as plantas de sombra está relacionado à adaptação das espécies a ambientes com menor disponibilidade de luz, através da diminuição da capacidade fotossintética e menor alocação de compostos a base de carbono (JURIK, 1986; MESSIER, 1992). No caso de M. ilicifolia, a maior disponibilidade de luz proporcionou um incremento da massa específica proporcional à produção de fenóis totais, cujos teores podem ser encontrados na Tabela 5. Estas variáveis apresentaram uma alta correlação (r2 = 0,73, Apêndice 9), confirmando resultados obtidos anteriormente por RADOMSKI et al., (2004a), cujo trabalho revelou, para uma mesma população de M. ilicifolia, a influência da maior luminosidade sobre a alocação de biomassa e síntese de fenóis. Interessante observar que os teores de lignina, relacionados na Tabela 5, foram maiores nos ambientes de sombra, o que parece compensar a menor síntese de fenóis. Além do papel deterrente, ou seja, de inibidor da herbivoria, os fenóis também protegem as plantas contra raios UV, via ativação da enzima fenilalanina amônia-liase pela luz 40 (GOTO et al., 2003; TAIZ e ZEIGER, 2004); em ambientes de sombra a incidência de radiação UV é menor (LARCHER, 1986), portanto a enzima responsável pela síntese de fenóis é menos estimulada e os carboidratos, produtos da fotossíntese, seguem preferencialmente a via de síntese da lignina. Em relação aos elementos minerais, cujos teores encontram-se na Tabela 6, N e K foram os que mais se relacionaram com as diferentes condições de luminosidade, sendo seus teores significativamente inferiores nas plantas crescendo a pleno sol. No caso das populações RURECO, FLONA e RMC, a baixa luminosidade, combinada com alto suprimento de nutrientes na maior parte dos solos deve estar contribuindo para a produção de uma alta concentração de aminoácidos e menor concentração de compostos a base de carbono. Este fato corrobora a teoria do balanço C/N nas plantas, conforme comentado por diversos autores (JANZEN, 1974; COLEY et al, 1985; VARANDA et al., 1998), tendo-se verificado, apenas no caso dos Fenóis não tanantes, uma correlação negativa com os teores de Ca e Mg do solo (Apêndice 9). Os teores foliares de Si e de P não diferiram entre os locais, apesar de diferenças significativas nos teores deste último elemento nos solos analisados. Os teores de Ca foliar foram significativamente influenciados pelas características dos solos, apresentando alta correlação com os teores de Ca, Mg e P trocáveis dos solos (Apêndice 9). RADOMSKI (1998) obteve diferenças significativas nos teores de Si foliar de M. ilicifolia sob diferentes condições de luz, com maior teor em indivíduos crescendo sob sombreamento. Como o Si tem um papel estrutural e de defesa (KORNDÖRFER et al., 2002), sua assimilação e síntese em formas orgânicas teria um menor custo em plantas desenvolvendo-se em ambientes sombreados; ao contrário, em ambientes a pleno sol, esta função estaria compartilhada com a síntese de compostos a base de carbono, como a lignina e os tanantes. Uma hipótese para a homogeneidade nos teores de Si foliar pode star relacionada ao fato da alta disponibilidade do elemento nos solos estudados, que seria o principal fator regulador da sua absorção, independente das distintas condições de luminosidade a que as populações encontram-se submetidas. 41 Tabela 4 – Massa seca foliar, área foliar e massa específica foliar de quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia (média de dez repetições). Massa Àrea foliar Massa específica População g cm2 mg cm-2 MANASA (pleno sol) 6,26 b 326,0 c 19,38 a RURECO (sombra parcial) 7,32 ab 571,7 b 13,08 b FLONA (sombra) 9,76 a 842,1 a 11,97 b RMC (sombra parcial) 9,61a 939,0 a 10,94 b Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si, pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade. Tabela 5 – Teores foliares de lignina, fenóis totais, fenóis não-tanantes, e taninos, em quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia (média de dez repetições). Lignina Fenóis totais Fenóis não tanantes Taninos População % MANASA (pleno sol) 21,5 b 19,3 a 6,6 a 12,7 a RURECO (sombra parcial) 25,6 a 8,6 b 5,1 b 3,5 b FLONA (sombra) 26,6 a 9,9 b 4,7 b 5,2 b RMC (sombra parcial) 24,7 a 8,0 b 4,2 b 3,8 b Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si, pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade. 42 Tabela 6 – Teores foliares dos elementos minerais, N, P, K, Ca, Mg, Si, Fe, Mn, Cu, Zn, e Al, em quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia (média de 10 repetições). N P K Ca Mg Si Fe Mn Cu Zn Al ---------------- g kg-1 ---------------- ------------- mg kg-1 ------------- MANASA (pleno sol) 17,7 c 0,94 a 8,3 c 3,2 c 2,4 b 3,50 a 68,1 b 54,3 b 5,5 b 9,3 b 54,7 b RURECO (sombra parcial) 24,3 a 1,11 a 15,0 a 4,2 c 4,0 a 3,50 a 104,6 a 83,0 ab 8,1 a 10,7 b 83,3 a FLONA (sombra) 19,9 b 1,20 a 13,6 ab 7,3 b 2,9 b 3,39 a 67,1 b 93,3 a 5,7 b 15,4 a 39,8 b RMC (sombra parcial) 18,0 c 1,09 a 12,4 ab 9,8 a 4,3 a 3,69 a 78,7 b 73,6 ab 5,5 b 11,6 ab 78,0 a Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si, pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade. Na Figura 2 está representado o resultado da análise de agrupamento baseada nas características foliares analisadas, massa e área foliar, massa específica foliar, teores de elementos minerais, lignina e fenóis, dos 40 indivíduos amostrados dentre as quatro populações naturais. Pela análise de componentes principais (Apêndice 11), verificou-se que seis vetores explicam 81,49% da variação total entre grupos, o que corresponde às variáveis fenóis totais, Al, Si, Ca, massa foliar e Fe (Apêndice 12). Pode-se observar a formação de quatro grupos principais: Grupo 1, com indivíduos pertencentes exclusivamente à População MANASA (MA1, MA2, MA5, MA7, MA8, MA9, MA10, MA6, MA4); Grupo 2, com três indivíduos pertencentes à População FLONA (FL6, FL7, FL8) e um indivíduo da População RMC (RMC2); Grupo 3, com quatro indivíduos da População FLONA (FL2, FL9, FL10, FL4) e um da População RMC (RMC4); Grupo 4, com oito indivíduos da População RMC (RMC1, RMC3, RMC5, RMC7, RMC6, RMC8, RMC9, RMC10) e oito indivíduos da População RURECO (RU1, RU8, RU2, RU6, RU9, RU4, RU5, RU3). Dentre as populações, FLONA é a que apresenta uma maior dispersão dos indivíduos, ou seja, uma menor similaridade dos indivíduos para as características foliares avaliadas. Este fato é conseqüência da maior variabilidade ambiental observada nesta 43 população, principalmente devido às diferentes características edáficas. No Grupo 2, os indivíduos FL6, F77 e FL8 de FLONA pertencem à classe de solo GXbd, cuja principal característica é a flutuação constante do lençol freático, e a deposição de sedimentos em função das inundações periódicas do Rio das Antas. No Grupo 3, os indivíduos FL9 e FL10 pertencem ao solo CUbd, que diferencia-se de GXbd principalmente pelos menores teores de Ca, Mg e Mn disponíveis na camada de 0-20 cm. Também cabe mencionar que os indivíduos desta população encontram-se expostos a diferentes ambientes lumínicos, resultando em diferenças principalmente nos teores de liginina e fenóis, como discutido no início deste item. População D is tâ nc ia e nt re g ru po s 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 F L 1 R U 7 M A 3 M A 4 M A 6 M A 10 M A 9 M A 8 M A 7 M A 5 M A 2 M A 1 F L 3 R U 10 R M C 2 F L 8 F L 7 F L 6 F L 5 F L 4 R M C 4 F L 10 F L 9 F L 2 R M C 10 R M C 9 R M C 8 R M C 6 R M C 7 R M C 5 R M C 3 R M C 1 R U 3 R U 5 R U 4 R U 9 R U 6 R U 2 R U 8 R U 1 Figura 2 – Análise de agrupamento baseada na similaridade das características foliares avaliadas nas quatro populações naturais de Maytenus ilicifolia. Comparando-se os grupos nota-se uma menor similaridade fitoquímica Grupo 1 Gr. 2 Gr. 3 Grupo 4 44 entre indivíduos pertencentes às populações de MANASA e RURECO. Em relação a estas populações, STEENBOCK (2003) em estudo avaliando a estrutura genética das mesmas, observou que em MANASA há maior possibilidade de troca de alelos entre os indivíduos devido a ocorrência de apenas um tipo floral por indivíduo, ou seja, os indivíduos apresentam ou flores funcionalmente femininas ou flores funcionalmente masculinas, ao contrário de Rureco, onde os indivíduos apresentam os dois tipos florais. Este fato sugere que a variação genética dentro da população de Manasa seja menor que a existente em Rureco, em função das diferentes taxas de endogamia. Outro fato interessante observado pelo autor é a associação da ocorrência dos tipos florais às distintas condições edafoclimáticas das duas populações. Neste sentido, JING e COLEY (1990) citam que a diferenciação de populações em indivíduos masculinos e/ou femininos em função de distintas condições ambientais, também leva à diferenças na produção de compostos secundários ligados à defesa vegetal, como é o caso dos taninos. Segundo os autores, indivíduos femininos alocariam mais recursos para a síntese de compostos de defesa do que indivíduos masculinos, de modo a garantir a reprodução e perpetuação da espécie, em detrimento do crescimento vegetativo. Também cabe comentar que além da reprodução sexuada, M. ilicifolia apresenta reprodução vegetativa via emissão de brotações radiculares, este fato foi observado em todas as áreas, entretanto, pode ser uma forma preferencial de reprodução em condições de maior sombreamento, onde a disponibilidade de luz seria uma limitante para a produção de flores e frutos. Neste caso, caberia em futuros estudos, vincular a análise fitoquímica, em particular a quantificação dos teores de fenóis, aos tipos florais e sistemas de reprodução de M. ilicifolia, identificando as relações entre estas características em distintas condições ambientais. . 45 4.2 Caracterização das progênies cultivadas no Banco de Germoplasma 4.2.1 Morfotipos A partir da observação de caracteres foliares típicos da espinheira- santa (presença e ausência de espinhos no bordo foliar, proeminência das nervuras e do bordo foliar, textura/espessura das folhas, tamanho do limbo), foram identificados 9 morfotipos foliares. Foi efetuada a distribuição das progênies entre estes morfotipos sendo que algumas apresentaram grande variabilidade não sendo possível classificá-las em um dos tipos. Por outro lado, algumas progênies apresentaram indivíduos com mais de um tipo característico, provavelmente resultado de cruzamento de indivíduos de diferentes morfotipos dentro destas populações. A distribuição das progênies nos morfotipos encontra-se na Tabela 7. Tabela 7 - Morfotipos identificados entre as progênies de Maytenus ilicifolia do Banco de Germoplasma de Ponta Grossa, PR. Progênies RS SC PR Morfotipo Viamão Arroio do Conde Campos Novos Laranjeiras do Sul Araucária 1 (Folhas coriáceas com espinhos curtos e distribuídos na metade apical do limbo) 44 46 2 (Folhas delgadas com espinhos curtos e distribuídos na metade apical do limbo) 25 14 30, 31, 33 44 85, 97 3 (Folhas longas e estreitas, coriáceas, maioria com margem inteira, poucas com até 4 espinhos) 45 4 (Folhas longas e largas, coriáceas, com margem inteira ou com espinhos distribuídos na metade apical do limbo) 33, 49 48 5 (Folhas longas e estreitas, coriáceas, poucas com margem inteira, maioria com espinhos longos distribuídos na metade apical do limbo) 15 33 43, 44 97 6 (Folhas longas e largas, coriáceas, com espinhos longos distribuídos ao longo de todo o limbo) 14 34 85, 94 7 (Folhas longas e estreitas, coriáceas, com espinhos longos distribuídos na metade apical ou ao longo de todo o limbo) 31, 34 46 97 8 (Folhas largas e curtas, coriáceas, com espinhos longos distribuídos ao longo de todo o limbo, nervuras muito pronunciadas na face adaxial) 8, 9, 25, 40 11, 15 9 (Folhas curtas, delgadas, com espinhos curtos distribuídos ao longo de todo o limbo) 34, 49, 52, 53 94 46 É interessante observar que os morfotipos que apresentam folhas com ausência ou menor número de espinhos (1 a 5) predominam entre as progênies oriundas das regiões de Santa Catarina e do Paraná onde a vegetação original é a Estepe Gramíneo-lenhosa (campos sulinos) associada à Floresta Ombrófila Mista (Floresta com Araucária) (IBGE, 2004). Já os morfotipos 6 e 7 foram os mais comuns ocorrendo em indivíduos de todas as populações amostradas. Também se verificou que no Rio Grande do Sul predominou o tipo 8 e também que a população de Viamão, RS, teve o comportamento mais homogêneo em relação à distribuição dos morfotipos foliares. Destaca-se que esta população é composta por indivíduos transplantados de várias regiões do Rio Grande do Sul e pode ter sido inf