UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Geociências e Ciências Exatas Câmpus de Rio Claro KAREN SILVA LUKO INFLUÊNCIA DE HIDROCARBONETOS DO PETRÓLEO NA MOBILIDADE DE ARSÊNIO EM SOLOS TROPICAIS Orientador: Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário Rio Claro, SP 2020 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Geociências e Ciências Exatas Câmpus de Rio Claro KAREN SILVA LUKO INFLUÊNCIA DE HIDROCARBONETOS DO PETRÓLEO NA MOBILIDADE DE ARSÊNIO EM SOLOS TROPICAIS Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Geociências e Ciências Exatas do Câmpus de Rio Claro, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos obtenção do título de Doutor em em Geociências e Meio Ambiente. Orientador: Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário Rio Claro, SP 2020 L954i Luko, Karen Silva Influência de hidrocarbonetos do petróleo na mobilidade de arsênio em solos tropicais / Karen Silva Luko. -- Rio Claro, 2020 108 p. : il., tabs., fotos, mapas Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Geociências e Ciências Exatas, Rio Claro Orientador: Amauri Antonio Menegário 1. Biogeoquímica. 2. Química Ambiental. 3. Contaminação do solo por petróleo. 4. Elementos traço no solo. 5. Solos poluição. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Geociências e Ciências Exatas, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. KAREN SILVA LUKO INFLUÊNCIA DE HIDROCARBONETOS DO PETRÓLEO NA MOBILIDADE DE ARSÊNIO EM SOLOS TROPICAIS Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Geociências e Ciências Exatas do Câmpus de Rio Claro, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos obtenção do título de Doutor em em Geociências e Meio Ambiente. Comissão Examinadora: Prof. Dr. Amauri Antonio Menegário Prof a . Dr a . Anne Hélène Fostier Prof. Dr. Ederio Dino Bidoia Prof. Dr. Marcelo Loureiro Garcia Prof a . Dr a . Vania Silvia Rosolen Resultado: Aprovada. Rio Claro/SP, 13 de maio de 2020 Agradecimentos Meus sinceros agradecimentos: A Capes e CNPq, pelo apoio financeiro essencial para realização deste trabalho. À UNESP, por ser minha casa desde 2007 e por todas as experiências me proporcionadas. Ao Prof. Amauri e ao grupo GEMB pelo conhecimento compartilhado, pelo tempo e paciência dispendidos e pela estrutura disponibilizada durante o processo de desenvolvimento deste trabalho. Aos professores Anne Hélène Fostier, Ederio Dino Bidoia, Marcelo Loureiro Garcia e Vania Silvia Rosolen, por participarem de minha banca, contribuindo para a melhora deste trabalho e para meu crescimento acadêmico. À Rô por todo suporte e atenção que sempre me proporcionou. Aos funcionários do CEA, Amanda, Eleni, Gleide, Jorbson, Lu e Miriã, pelo apoio pessoal, técnico e administrativo, essenciais para cumprimento em cada etapa deste processo. Ao Marcos Cururu, pelo grande suporte nas coletas. A Alexandre Oliveira e a CIEM, Kadu, Hendryk, Lucas e Siomara, pela ajuda nas coletas. A meus pais, Tereza e Pedro, pela compreensão e apoio que sempre me ofereceram e que me fizeram chegar até aqui, e por terem me inspirado, desde de muito criança, a seguir o caminho da Ciência. Às minhas irmãs, Cecília e Cibele, por me apoiarem e sempre terem sido grande exemplo, facilitando minha caminhada. Ao Everton, por ser um grande exemplo de seriedade e que tanto contribuiu para este trabalho e para que eu chegasse até aqui. À minha família de acolhimento, Rosa, Vail, Karina, Gilson e Henrique por todo apoio e torcida. A Carol, Joyce e Lucia, que tanto contribuíram para este trabalho, tanto pela enorme quantidade de horas que disponibilizaram para me ajudar a realizar os testes e coletas, quanto pelo apoio e confiança que sempre me fizeram querer ir além. A Raiza e Ana Marta por todo apoio e pelas muitas parcerias ao longo de todos esses anos. A Juliana e Lauren, pela confiança, pelo grande apoio e por tanto terem se esforçado para o crescimento de seus colegas. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 O presente trabalho foi realizado com apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Processo n 140625/2017-8) Existe apenas um bem, o saber, e apenas um mal, a ignorância. Sócrates INFLUÊNCIA DE HIDROCARBONETOS DO PETRÓLEO NA MOBILIDADE DE ARSÊNIO EM SOLOS TROPICAIS Resumo O objetivo deste trabalho foi investigar a influência da contaminação por gasolina e diesel na mobilidade das espécies inorgânicas de arsênio no solo. Para tanto, amostras de solo (n = 25) foram coletadas em uma área de mineração, uma área de cobertura vegetal e uma área agrícola, e foram contaminadas em laboratório. Foram coletados os extratos de saturação para as amostras dos três tratamentos (controle, gasolina e diesel) e os resultados de arsênio no extrato de saturação obtidos foram comparados através de testes estatísticos não paramétricos e análise multivariada de dados. Foi realizada análise de especiação redox para todas as amostras e o fracionamento químico do arsênio no extrato de saturação do solo para amostras selecionadas através da técnica Difusão em Filmes Finos por Gradiente de Concentração. As concentrações de arsênio também foram comparadas quanto a parâmetros físicos, químicos e quanto à presença de sete genes funcionais relativos ao metabolismo de arsênio (resistência, oxidação, respiração e metilação) em micro- organismos. A adição de gasolina e de diesel resultou no aumento das concentrações de arsênio extraível em água nos solos. O aumento da mobilidade do arsênio em solo na presença dos contaminantes, apesar de significativo, foi menos expressivo quando comparado a outros sistemas (e.g. aquífero e áreas úmidas) e outras fontes de matéria orgânica (e.g. biocarvão e serapilheira) reportados na literatura. As concentrações de As(III) foram menores em solos urbanos, quando comparadas às obtidas para solos rurais e com cobertura vegetal, possivelmente devida a uma menor atividade microbiológica nos solos urbanos. A respiração basal do solo foi a principal variável de influência na mobilidade de As(III). Uma taxa de biodegradação estimada em aproximadamente 7% foi o suficiente para extrair frações de As(III), antes imobilizadas pela fase sólida, para 60% dos solos estudados. A metilação, importante fator de regulação da concentração de As(III) nos solos não contaminados, não foi significante quando gasolina ou diesel foram adicionados ao sistema. A relação entre o teor de Mn no solo e As solúvel pode indicar a ocorrência de um mecanismo de reoxidação abiótica de As(III). A adição de gasolina ou diesel aos solos aumentou a fração de arsênio extraível em água em até 20 vezes, porém a adição destes contaminantes não influenciou a fração lábil de arsênio, sendo esta relacionada ao carbono orgânico dissolvido do solo natural do solo. Palavras-chave: Labilidade. Análise de especiação. Contaminantes orgânicos. Gasolina. Diesel. DGT. INFLUENCE OF PETROLEUM HYDROCARBONS ON ARSENE MOBILITY IN TROPICAL SOILS Abstract The aim of this work was to investigate the influence of gasoline and diesel contamination on the mobility of inorganic arsenic species in soil samples. Soil samples (n = 25) were collected in a mining area, in an area characterized by natural vegetation cover and in an agricultural area. The soil samples were contaminated in laboratory with gasoline and diesel. Saturation extracts were collected from soil subsamples of the three treatments (control, gasoline and diesel) and the results of arsenic concentration in the extracts were analyzed by non-parametric statistical tests and multivariate data analysis. Redox speciation analysis for all samples and chemical fractionation of arsenic were performed in some of the water extracts samples by Diffusive Gradients in Thin Films technique. Arsenic concentrations were compared to physical and chemical parameters as well as to the presence of seven functional genes related to arsenic microbial metabolism (resistance, oxidation, respiration and methylation). The addition of gasoline and diesel to surface soils resulted in an increase in the water extractable arsenic in surface soils. The increased mobility of arsenic in the presence of contaminants, although significant, was less expressive than what has been reported for other systems (e.g. aquifers and wetlands) and other sources of organic materials (e.g. litter and biochar). As(III) concentrations were lower in urban soils when compared to agricultural and vegetation cover soils, possibly due to a less expressive microbiologic activity in urban soils. Basal soil respiration was the main variable influencing As(III) mobility. An estimated biodegradation rate of approximately 7% was sufficient to make As(III) fractions, previously immobilized by solid phase, present in the solution for 60% of the studied soils. Methylation, an important factor in controlling the As(III) concentration in uncontaminated soils, was not significant when gasoline or diesel were introduced in the system. As(III) in the solution was negatively related to the content of Mn in the soil which may indicate an occurrence of an important mechanism of abiotic reoxidation of As (III). The addition of gasoline or diesel to the soils increased the fraction of arsenic extractable in water up to 20-fold. However, the addition of these contaminants did not influence the labile fraction of arsenic, which was strongly influenced by the soil dissolved organic carbon, naturally occurring in soils. Keywords: Lability. Speciation analysis. Organic contaminants. Gasoline. Diesel. DGT. Sumário 1 Introdução .............................................................................................................. 15 1.2 Objetivo............................................................................................................... 16 1.2.1 Objetivo geral ............................................................................................... 16 1.2.2 Objetivos específicos ................................................................................... 16 2 Revisão Bibliográfica ............................................................................................. 17 2.1 Comportamento biogeoquímico do arsênio ........................................................ 17 2.2 Conceitos ............................................................................................................ 18 2.2.1 Biodisponibilidade ........................................................................................ 18 2.2.2 Labilidade ..................................................................................................... 19 2.2.3 Especiação ................................................................................................... 19 2.2.4 Mobilidade .................................................................................................... 20 2.3 Influência da contaminação por hidrocarbonetos do petróleo na concentração de arsênio ...................................................................................................................... 21 2.4 Hidrocarbonetos do petróleo ............................................................................... 24 3 Área de estudo ...................................................................................................... 26 3.1 Vale do Ribeira (SP)........................................................................................ 26 3.1.1 Arsênio no Vale do Ribeira ........................................................................... 27 4 Material e Métodos ................................................................................................ 29 4.1 Material ............................................................................................................... 30 4.2 Representatividade do método de amostragem ................................................. 31 4.3 Uso do solo ......................................................................................................... 33 4.4 Preparo das amostras de solo ............................................................................ 33 4.5 Caracterização das amostras ............................................................................. 34 4.5.1 Descontaminação dos materiais para análise de arsênio e metais .............. 34 4.5.2 Teor total de metais...................................................................................... 34 4.5.3 Fator de enriquecimento .............................................................................. 35 4.5.4 Carbono Orgânico Total ............................................................................... 36 4.5.5 Carbono Orgânico Dissolvido ....................................................................... 37 4.5.6 Análises físicas............................................................................................. 38 4.6 Contaminação com hidrocarbonetos do petróleo ............................................... 39 4.6.1 Esterilização dos frascos para contaminação .............................................. 39 4.6.2 Testes preliminares ...................................................................................... 40 4.6.3 Tratamentos ................................................................................................. 41 4.6.4 Especiação de arsênio extraível em água .................................................... 42 4.7 Difusão em filmes finos por gradiente de concentração ..................................... 44 4.7.1 Fundamentos da DGT .................................................................................. 45 4.7.2 Dinâmica de reposição ................................................................................. 46 4.7.3 Montagem dos dispositivos .......................................................................... 47 4.7.4 Imersão dos dispositivos .............................................................................. 48 4.7.5 Eluição ......................................................................................................... 48 4.7.6 Cálculos ....................................................................................................... 48 4.8 Biodegradação .................................................................................................... 49 4.8.1 Esterilização das amostras para a caracterização microbiológica................ 49 4.8.2 Qualidade do solo ........................................................................................ 49 4.8.3 Umidade gravimétrica .................................................................................. 51 4.8.4 Temperatura ................................................................................................. 52 4.8.5 Monitoramento da biodegradação ................................................................ 52 4.8.6 Biologia Molecular ........................................................................................ 54 4.9 Parâmetros de Qualidade da Análise e Tratamento Estatístico ...................... 59 4.9.1 Geração de hidretos ..................................................................................... 59 4.9.2 Espectrometria de fluorescência atômica ..................................................... 59 4.9.3 Controle de qualidade da análise ................................................................. 60 5 Resultados ............................................................................................................. 62 5.1 Teste preliminar .................................................................................................. 62 5.2 Caracterização das amostras ............................................................................. 64 5.3 Mobilidade do arsênio em função da contaminação por gasolina e diesel ......... 71 5.4 Concentração de arsênio nas campanhas.......................................................... 74 5.5 Concentração de arsênio extraível em função do uso do solo e origem do arsênio ...................................................................................................................... 77 5.6 Fracionamento do arsênio extraível (DGT) ......................................................... 82 5.7 Influência da microbiota do solo ......................................................................... 85 5.8 Análise multivariada (PCA) ................................................................................. 89 5.9 Expressão de genes funcionais .......................................................................... 94 6 Conclusão ............................................................................................................ 101 Referências............................................................................................................. 103 Lista de Figuras Figura 1. Representação de um diagrama Eh-pH contendo exemplos de alguns corpos d’água. ................................................................................................... 23 Figura 2. Mapa com a localização dos pontos de coleta georreferenciados. ........... 26 Figura 3. Esquema contendo a síntese dos parâmetros abordados no presente estudo. ............................................................................................................... 29 Figura 4. Locais de coleta. ........................................................................................ 32 Figura 5. Detalhe dos pontos de coleta dos solos superficiais. ................................ 33 Figura 6. Representação esquemática do teste preliminar. ...................................... 40 Figura 7. Frascos com as amostras de solo dos três tratamentos (controle, contaminada - gasolina e contaminada - diesel). .............................................. 42 Figura 8. Cartuchos artesanais para a especiação redox de arsênio. ...................... 44 Figura 9. Dispositivos DGT montados. ..................................................................... 48 Figura 10. Estrutura para oxidação em sistema de refluxo. ...................................... 51 Figura 11. Extração de DNA ..................................................................................... 56 Figura 12. Concentrações de arsênio extraível em água (µg L - 1 ) obtidas no teste preliminar. .......................................................................................................... 63 Figura 13. Triângulo textural das amostras............................................................... 67 Figura 14. Carbono orgânico total por período de coleta. ......................................... 68 Figura 15. Carbono orgânico dissolvido por período de coleta. ................................ 70 Figura 16. Boxplot com as medianas das concentrações de As(III) em função do tratamento e campanha. .................................................................................... 74 Figura 17. Boxplot com as medianas das concentrações de As(V) em função do tratamento e campanha. .................................................................................... 75 Figura 18. Variação da razão As(III)/As(V) (redução) em função da campanha de coleta das amostras........................................................................................... 76 Figura 19. Concentração de As(III) (estação seca) nos tratamentos em função do uso do solo. ....................................................................................................... 77 Figura 20. Concentração de As(V) (estação seca) nos tratamentos em função do uso do solo ............................................................................................................... 78 Figura 21. Concentração das espécies inorgânicas de arsênio em função da origem do arsênio .......................................................................................................... 80 Figura 22. Concentração das espécies inorgânicas de arsênio em função da origem do arsênio. ......................................................................................................... 81 Figura 23. Concentração lábil de arsênio (CDGT) em função do COD. ...................... 83 Figura 24. Biomassa microbiana do solo por campanha. ......................................... 85 Figura 25. Respiração Basal do Solo inicial por campanha. ..................................... 86 Figura 26. Respiração basal do solo em função do uso do solo (Estação seca). ..... 87 Figura 27. Respiração basal do solo em função do uso do solo (Estação chuvosa). 87 Figura 28. Dinâmica da degradação dos contaminantes gasolina e diesel por campanha, estimados a partir do modelo exponencial. ..................................... 88 Figura 29. Análise dos Componentes Principais para a concentração de As(III) no tratamento gasolina (Estação seca) .................................................................. 90 Figura 30. Análise dos Componentes Principais para a concentração de As(III) no tratamento diesel (Estação seca). ..................................................................... 91 Figura 31. Análise dos Componentes Principais para a concentração de As(V) no tratamento gasolina (Estação seca). ................................................................. 92 Figura 32. Análise dos Componentes Principais para a concentração de As(V) no tratamento diesel (Estação seca). ..................................................................... 93 Figura 33. Gel com os produtos de PCR para o gene ArsB. .................................... 95 Figura 34. Gel com os produtos de PCR para o gene Arc3.1. .................................. 96 Figura 35. Gel com os produtos de PCR para o gene aoxB. .................................... 97 Figura 36. Gel com os produtos de PCR para o gene arrAb. ................................... 98 Figura 37. Gel com os produtos de PCR para o gene arsM. .................................... 99 Figura 38. Concentração das espécies de arsênio em função da expressão do gene ArsM nos três tratamentos. .............................................................................. 100 Lista de Tabelas Tabela 1. Recuperações da digestões semi-totais ................................................... 35 Tabela 2. Atributos dos solos usados no teste preliminar ......................................... 40 Tabela 3. Concentrações semi-totais dos elementos (média ± desvio padrão, n=2) 64 Tabela 4. Fatores de enriquecimento do arsênio usando o Mn e Fe como elemento de referência ...................................................................................................... 65 Tabela 5. Parâmetros físicos das amostras .............................................................. 66 Tabela 6. Carbono orgânico total (%) das amostras ................................................. 68 Tabela 7. COD (mg kg -1 ) das amostras (média ± desvio padrão, n=2) ..................... 69 Tabela 8. Concentrações (ng L -1 ) das espécies inorgânicas de arsênio na solução do solo para os três tratamentos (média ± desvio padrão, n=3) - Estação seca .... 72 Tabela 9. Concentrações (ng L -1 ) das espécies inorgânicas de arsênio na solução do solo para os três tratamentos (média ± desvio padrão, n=3) - Estação chuvosa .......................................................................................................................... 73 Tabela 10. Comparação das concentrações das espécies e frações de As (média ± desvio padrão, n=3) e COD (média ± desvio padrão, n=2) ............................... 82 Tabela 11. Comparação das concentrações das espécies e frações de As (média ± desvio padrão, n=3) nos tratamentos ................................................................ 84 Lista de abreviaturas e siglas Ácido monometilarsônico (MMA) Ácido dimetilarsônico (DMA) Ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) Biomassa microbiana do solo (BMS) Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e Xileno (BTEX) Carbono orgânico dissolvido (COD) Carbono orgânico total (COT) Carbono total biodegradado (CTB) Coeficiente metabólico do solo (qCO2) Condutividade elétrica (CE) Desoxirribonucleotídeos Fosfatados (dNTP) Diffusive boundary layer (DBL) Difusão em Filmes Finos por Gradiente de Concentração (DGT) Eficiência de biodegradação (EB) Espectrometria de Emissão Atômica com Plasma Indutivamente Acoplado (ICP OES) Espectrometria de Fluorescência Atômica com Geração de Hidretos (HG-AFS) Fase líquida não aquosa (NAPL, do inglês non-aqueous solid passe) Fator de enriquecimento geoquímico (EF) Hidrocarbonetos do petróleo totais (HPT) International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Limite de detecção (LD) Limite de quantificação (LQ) Matéria orgânica do solo (SOM, do inglês soil organic matter) Parque Estadual Turístico Alto do Ribeira (PETAR) Polimerase reação em cadeia (PCR, do inglês polimerase chain reaction) Análise das componentes principais (PCA, do inglês principal components analysis) Respiração Basal do Solo (RBS) Sistema Brasileiro de Classificação de Solos (SiBCS) Terra fina seca ao ar (TFSA) Tris-acetato-EDTA (TAE) United States Environmental Protection Agency (EPA) 15 1 INTRODUÇÃO Os metais e semimetais presentes no solo podem ser de origem litogênica ou antropogênica. Os primeiros advêm de fontes geológicas, principalmente de rochas, pela ação do intemperismo. Os segundos resultam de atividades humanas, principalmente da agricultura (e.g. agrotóxicos e fertilizantes) e mineração (ALLOWAY, 1995). O arsênio é um semimetal encontrado no ar, solo e água, sendo as rochas seu principal reservatório natural. Antes da utilização dos compostos organoclorados, compostos de arsênio foram amplamente empregados na fabricação de pesticidas (CHATTERJEE; MUKHERJEE, 1999), sendo os arsenatos empregados em inseticidas e, arsenitos, em herbicidas. A concentração de arsênio em insumos agrícolas varia de 2 a 4950 mg kg -1 , sendo que os valores mais altos são encontrados em fertilizantes inorgânicos, aproximadamente 170 vezes maior que os valores máximos para estercos bovinos, de granja e lodo de esgoto (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001). Uma vez que elementos traço no ambiente podem existir em uma variedade de espécies com mobilidades diferentes, a compreensão tanto da distribuição destas espécies, quanto dos fatores controladores desta distribuição é essencial. Apenas algumas destas espécies são biodisponíveis, sendo portanto fundamental o enfoque na avaliação das suas formas lábeis (PYRZYŃSKA; WIERZBICKI, 2004). O estudo da mobilidade de metais é muito importante para prever em que situações a fração adsorvida ao sedimento poderá tornar-se solúvel e causar problemas ambientais. Em relação aos perfis do solo, a camada superficial frequentemente apresenta os teores mais elevados de arsênio, reflexo da deposição de frações do elemento provenientes da atmosfera e a ciclagem de plantas (ALLOWAY, 1995). No entanto, segundo Gomez-Caminero et al. (2001), as interações entre arsênio e a fração mineral do solo e de aquíferos é dominante quando comparada com as interações do elemento com a matéria orgânica, sendo a principal forma de interação do arsênio com a matéria orgânica do solo através das interações da última com a superfície de minerais. Muitas espécies de micro-organismos, incluindo leveduras, bactérias e cianobactérias são capazes de usar hidrocarbonetos como fonte de carbono, sendo utilizadas como biorremediadores. Micro-organismos presentes no solo são capazes 16 de utilizar processos químicos, como redução e oxidação, para transformar metais, muitas vezes alterando sua toxicidade, por meio da alteração do estado de oxidação, metilação, etc. Alguns organismos presentes no solo são capazes de converter As(V) e As(III) a formas reduzidas, principalmente arsinas metiladas, que são voláteis (GOMEZ-CAMINERO, A et al., 2001). Ainda que um contaminante orgânico, como por exemplo hidrocarbonetos do petróleo, não apresente uma concentração significante de um metal ou semimetal, a introdução deste composto exógeno pode acarretar em modificações nas propriedades do solo e na comunidade de micro-organismos, alterando indiretamente a biogeodisponibilidade de elementos já presentes no meio (PINTO et al., 2014). 1.2 Objetivo 1.2.1 Objetivo geral O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de gasolina e diesel na labilidade de arsênio no solo e na mobilidade das espécies deste elemento da fase sólida para a água intersticial do solo em curto período. 1.2.2 Objetivos específicos 1. Avaliar a dinâmica e a extensão da especiação redox de arsênio após a introdução dos contaminantes orgânicos estudados no sistema, em comparação com outras fontes de carbono orgânico e outras matrizes já estudadas e reportadas na literatura; 2. Avaliar a influência de parâmetros físico-químicos e da expressão de genes funcionais associados a transformação microbiológica de arsênio na dinâmica da concentração de arsênio na solução dos solos após a introdução dos contaminantes gasolina e diesel; 3. Avaliação da influência das características da área de estudo (período de coleta, uso do solo e origem do arsênio). 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Comportamento biogeoquímico do arsênio As concentrações dos elementos no solo podem apresentar grande variação, mesmo sem influência antrópica. Um dos fatores predominantes para esta variação é da composição da rocha-mãe, assim como os processos pedogenéticos aos quais esta é submetida. Desta forma, é comum a existência de locais naturalmente enriquecidos em alguns elementos, dada a rocha de origem ou ao transporte de sedimentos alóctones (e.g. rios e cinzas vulcânicas) e principalmente dada a liberação, mobilidade e concentração destes elementos nos perfis de alteração e a pedogênese (MANDAL, 2002). A concentração basal (baseline) de arsênio em solos frequentemente reportada é de 5 a 10 mg kg -1 (GOMEZ-CAMINERO, A et al., 2001). Mas uma faixa mais ampla para a concentração basal de arsênio no solo também pode ser encontrada, sendo reportadas concentrações entre 1 e 20 mg kg -1 em solos naturais e 0,1 e 50 mg kg -1 em solos agrícolas. No estado de São Paulo, a Companhia Ambiental do Estado de São Paulo (RUBY et al., 2011), através da análise de solos de diferentes classes e profundidades, reportou a concentração de arsênio de 3,5 mg kg -1 como valor de referência para o estado. O arsênio ainda está presente em diversos depósitos de minérios e carvão, sendo liberado durante a extração ou queima destes. Assim, o material particulado emitido nestes dois processos segue caminho para solos e águas (MANDAL, 2002). O arsênio está presente em altas concentrações (até 200 mg kg -1 ) em minerais de apatita (GOMEZ-CAMINERO et al., 2001), principal matéria-prima para produção de fertilizantes no Brasil (SOUZA, 2001). Após a ação do intemperismo, visto que metais e semimetais possuem características diferentes, como níveis de eletronegatividade e estados de oxidação, estes podem passar por processos também diferentes, como precipitação, adsorção, complexação ou lixiviação, interagindo de maneiras distintas com os minerais e matéria orgânica presentes no solo. Desta forma, podem estar presentes na fração solúvel, lábil, inerte (forte adsorção com minerais ou precipitados com outros componentes), complexados com a matéria orgânica ou podem estar assimilados pela biomassa. 18 Os teores de óxidos de ferro, óxidos de alumínio e de argilominerais em uma região é um fator determinante para a adsorção de arsênio na fração mineral do solo (LIU et al., 2001), sendo que a adsorção de arsênio a óxidos de ferro foi reportada como menos estável quando comparada à adsorção a óxidos de alumínio em condições ácidas de pH (<5,75) (HALTER; PFEIFER, 2001). Em solos ácidos, o arsênio estará ligado ao ferro e alumínio, enquanto em solos alcalinos esta ligação ocorrerá com cálcio. Dada a similaridade química entre fosfato e arsênio, no solo, ambos competirão pelos mesmos sítios de adsorção e apresentarão as mesmas interações, formando complexos insolúveis com alumínio, ferro e cálcio (SADIQ, 1997). Assim, a quantidade de arsênio adsorvido da água intersticial do solo aumenta com o aumento de óxidos de ferro, manganês e alumínio livres e do aumento da fração argilosa do solo (GOMEZ-CAMINERO et al., 2001). A precipitação é um dos principais mecanismos de imobilização de arsênio do solo. Em solos oxigenados, arsenatos de ferro podem controlar a solubilidade de arsênio, enquanto que em solos anóxicos, sulfetos de arsênio controlam a concentração de arsênio dissolvido. A precipitação de arsenatos de ferro e cálcio e de sulfetos de arsênio podem limitar as concentrações de arsênio na água intersticial do solo (SADIQ, 1997). Além do pH, o tempo de contato do elemento com a fração adsortiva e a presença de ligantes orgânicos e inorgânicos são fatores influentes na labilidade de arsênio e na sua movimentação entre os perfis do solo (LIU et al., 2001). A mobilidade do arsênio será controlada pelo tipo de argila presente no meio, bem como sua quantidade, presença de matéria orgânica e outros íons. A mobilidade de arsênio juntamente com a água percolante para as camadas subjacentes é reduzida pela presença da camada de húmus, que atua como uma barreira, onde este elemento se acumula. Analogamente, em solos ricos em carbono, pode ser observado grande acúmulo do semimetal, dada a forte interação entre eles (MATSCHULLAT, 2000). 2.2 Conceitos 2.2.1 Biodisponibilidade Bioacessibilidade é a capacidade de uma substância de entrar em contanto com um organismo vivo, podendo ou não interagir e sofrer absorção por este. Desta 19 forma, substâncias aprisionadas no interior de partículas insolúveis não estarão bioacessíveis. Por sua vez, biodisponibilidade refere-se ao potencial que um organismo apresenta de absorver uma substância. Tanto a bioacessibilidade quanto a biodisponibilidade dependem da especiação química e de parâmetros biológicos, visto que mesmo quando uma substância encontra-se adsorvida à superfície de minerais, esta pode não ser bioacessível e, consequentemente, esta não será biodisponível se o organismo tiver a capacidade de absorver apenas aquelas substâncias presentes em solução (DUFFUS et al., 2017). 2.2.2 Labilidade O termo lábil refere-se a uma fração do teor total de um elemento em uma solução, fração esta livre ou fracamente complexada com ligantes inertes. Está intrinsecamente relacionado ao conceito de fracionamento, que baseia-se na classificação de um analito segundo suas propriedades físicas (tamanho) ou químicas (orgânico ou inorgânico, inerte ou lábil) (TEMPLETON et al., 2000). 2.2.3 Especiação O conceito de especiação química, segundo a IUPAC (TEMPLETON et al., 2000), refere-se a distribuição das espécies químicas de um elemento em um sistema. No caso do arsênio, seu comportamento geoquímico, bem como sua toxicidade, está fortemente relacionado às espécies químicas presentes no meio. Em sistemas aquáticos e em solos, o arsênio se encontra predominantemente em suas formas inorgânicas: o oxiânion pentavalente arsenato (H3AsO4) na faixa de pH entre 0 e 2 e em condições oxidantes (Eh > 400 mV); e a forma neutra trivalente arsenito (H3AsO3), em condições alcalinas (0 < pH <9) e redutoras (TAKENO, 2005). Ainda, estão presentes nestes sistemas, em menor proporção, as formas orgânicas ácido monometilarsônico (MMA) e dimetilarsônico (DMA). Devido a sua maior solubilidade, as formas inorgânicas são as mais tóxicas, sendo o As(III) o mais tóxico entre as duas espécies (SMEDLEY; KINNIBURGH, 2002; LEERMAKERS et al., 2006). Onishi e Sandell (2000) reportaram o arsenato, forma menos móvel de arsênio, como sendo espécie predominante de arsênio em solos, responsável por 60% entre todas as formas do elemento. 20 O equilíbrio entre essas espécies dependerá principalmente dos fatores do potencial de oxidação e redução (Eh) e do pH, mas também da ação de micro- organismos (SMEDLEY; KINNIBURGH, 2002). 2.2.4 Mobilidade Quando o termo mobilidade é considerado, o enfoque é dado aos processos físico-químicos que influenciam na capacidade de movimentação de um composto na fase aquosa do solo após sofrer dissolução da fase mineral. Esta capacidade irá depender de interações com outros compostos químicos, como também de alterações que venha a sofrer, e.g. especiação. A mobilidade de metais entre as fases sólida e a água pode ser influenciada por uma variedade de fatores, como presença de matéria orgânica, pH, potencial redox (Eh), presença de sulfetos, tamanho de sedimentos e micro-organismos. Ainda, a mobilidade de elementos em sistemas aquosos é altamente influenciada pelo potencial iônico deste elemento, i.e. é influenciado pela razão entre estado de oxidação da espécie e o seu raio iônico. Assim, quanto maior o raio iônico apresentado por um analito, menor será sua mobilidade (RIEUWERTS et al., 1998). No estudo da mobilidade e labilidade de elementos traço em solos, o conhecimento da distribuição das espécies presentes na fase sólida e água intersticial é imprescindível, visto que tanto a labilidade quanto a mobilidade podem variar de acordo com as formas químicas presentes no sistema (HARPER, M P et al., 1998). Como o conhecimento do teor total de um analito não é suficiente para uma compreensão aprofundada dos mecanismos envolvidos na distribuição de um elemento nos diversos compartimentos terrestres, muitas vezes, o entendimento do comportamento biogeoquímico de um elemento é dificultado por limitações analíticas. Em solo, a mobilidade de metais tem sido estudada por extração sequencial (WEI et al., 2016) e pelo uso de colunas de solo para avaliar a lixiviação de metais (LI; CAI, 2015). A extração de arsênio da fase sólida pode ocorrer sem a alteração das espécies presentes na amostra ou com a conversão parcial entre As(III) e As(V). No estudo das espécies químicas presentes em um sistema é imprescindível que estas espécies não sofram alterações, sendo que os procedimentos de extração adotados não devem interferir no equilíbrio entre as espécies e na determinação destas através da técnica analítica adotada. Durante o armazenamento das amostras, mudanças no estado de 21 oxidação induzidos por atividade microbiológica e pelo contanto com oxigênio, assim como perdas por volatilização ou adsorção aos frascos de armazenamento devem ser evitadas (LEERMAKERS et al., 2006). 2.3 Influência da contaminação por hidrocarbonetos do petróleo na concentração de arsênio Mundialmente, existem muitos relatos do aumento de concentração de arsênio dissolvido em aquíferos relacionado com um aumento no aporte de matéria orgânica. Este aumento do arsênio ocorre concomitantemente ao aumento do ferro dissolvido. O aumento da matéria orgânica em um aquífero eleva as taxas de biodegradação, resultando na depleção de aceptores de elétrons e consequentemente na condição redutora do sistema. A redução do meio culmina na redução do Fe(III) a Fe(II), mais solúvel, liberando o As(V) adsorvido às superfícies dos óxidos de ferro para a solução. A redução do As(V) para As(III) pode ocorrer em seguida (BROWN et al., 2010). Apesar da matéria orgânica natural ser capaz de ocasionar mudanças no potencial redox na água subterrânea, este processo pode ser intensificado por contaminantes orgânicos antropogênicos. O aumento da concentração de arsênio concomitantemente à contaminação por compostos orgânicos, como derivados do petróleo, e subsequente redução do sistema, vem sendo descrita para aquíferos livres (BROWN et al., 2010) e áreas úmidas (ZIEGLER et al., 2015), apesar do arsênio ser encontrado em níveis traço (µg L -1 ) nestes compostos (TRINDADE et al., 2006; BECKER et al., 2012). No entanto, apesar do solo apresentar características semelhantes às envolvidas na dinâmica de labilização do arsênio em aquíferos, como presença de óxi- e hidróxidos de ferro e uma microbiota capaz da degradação da matéria orgânica e de contaminantes orgânicos (TRINDADE et al., 2005), nenhum estudo foi encontrado na literatura abordando a mobilização do arsênio para a água intersticial do solo, considerando as especificidades da zona não-saturada. A zona não-saturada é definida como o meio geológico da superfície do solo até o lençol freático. É composta de três fases: sólidos, i.e. fração mineral e matéria orgânica; líquido, água intersticial e seus solutos; e gasoso, ar, vapores e outros gases. A água é retida nas partículas do solo por forças capilares. A zona não-saturada e a 22 franja capilar podem ser agrupadas como zona de aeração, i.e. onde o ar pode ocupar os espaços porosos. Em períodos de alta precipitação, esses espaços porosos podem estar preenchidos por água. Na zona saturada, a água ocupa constantemente todos os espaços porosos (ARORA et al., 2019). Os trabalhos encontrados na literatura para aquíferos envolvem grandes programas de monitoramento in situ de áreas contaminadas, como o caso de uma área contaminada em Minnesota, EUA (COZZARELLI et al., 2016), amplamente estudada quanto a contaminação por arsênio. A zona não-saturada é frequentemente abordada em trabalhos que visam avaliar os riscos de contaminação da água subterrânea e como área de atenuação da contaminação da água subterrânea. No entanto, estes ambientes necessitam de atenção e enfoque de maneiras distintas, visto que diferenças nas condições físicas e químicas e, consequentemente, microbiológicas, levam a diferenças no comportamento de contaminantes, principalmente quanto sua toxicidade (SHEEHAN et al., 2003). McGuire et al. (2005) avaliaram o impacto da precipitação meteorológica no potencial redox de um aquífero arenoso não-confinado contaminado por hidrocarbonetos do petróleo. Segundo os autores, os efeitos da recarga na disponibilidade dos aceptores de elétrons foram observados principalmente na interface entre a área de infiltração e o aquífero, não sendo observada na porção média deste. Ainda, na interface entre o lençol freático e zona não-saturada foi reportada uma redução de cerca de 10 vezes no número de bactérias heterotróficas aeróbicas e protozoários em relação ao número destes organismos encontrado para os solos da superfície (DODDS et al., 1996). Ainda, a zona não-saturada apresenta uma característica que pode afetar completamente a solubilização de compostos: a transiência. Visto que, ao contrário da zona saturada, os poros na zona não-saturada permanecem a maior parte do tempo não totalmente preenchidos por água, o tempo de contato da água subterrânea com a fase sólida é significativamente menor, permitindo menor tempo para a solubilização dos compostos orgânicos para que sejam degradados e menos tempo para que a mobilização do arsênio ocorra, sendo importantes a realização de trabalhos que abordem a cinética desta reação. Quando o derramamento do petróleo ocorre em grandes concentrações na zona não-saturada, ocorre uma migração descendente dos compostos não retidos na 23 fase sólida do solo ou não dissolvidos na água intersticial, visto que a capacidade de retenção foi ultrapassada. Desta forma, quando a zona saturada é atingida, forma-se uma fase separada, conhecida como fase líquida não aquosa (NAPL, do inglês non- aqueous phase liquid) (BALSEIRO-ROMERO et al., 2018). Neste ponto, a biodisponibilidade dos contaminantes é regulada pela solubilidade destes na interface entre a água e a NAPL (JONGE et al., 2012). Por sua vez, NAPL não é formada quando o derramamento ocorre em baixa concentração, sendo que a biodisponibilidade dos compostos hidrofóbicos será determinada pelos processos de adsorção e dessorção pela fase sólida (GARCÍA-DELGADO et al., 2020). Quando comparados com sistemas aquáticos, a biodegradação no solo tem algumas vantagens. Primeiro, dada a estrutura do solo, hidrocarbonetos de baixo peso molecular tenderão a migrar para camada mais profundas do solo, o que irá minimizar a evaporação de compostos voláteis. Assim, biodegradação ao invés de evaporação será o principal mecanismo de remoção enquanto houver oxigênio disponível. Ainda, o solo apresenta capacidade de adsorver compostos tanto polares quanto apolares e, desta forma, a toxicidade efetiva destes compostos tende a ser reduzida (RONALD, 1981). A eficiência de biodegradação na zona não-saturada também é superior à da zona saturada (MCKEE et al., 1972). No entanto, conforme observado na figura 1, águas de solos alagados e águas subterrâneas são naturalmente mais propensas à condição redutora que águas que apresentam contato direto com a atmosfera (NEUMANN, 2012). Figura 1. Representação de um diagrama Eh-pH contendo exemplos de alguns corpos d’água. Fonte: Adaptado de NEUMANN (2012). 24 2.4 Hidrocarbonetos do petróleo Os combustíveis atualmente utilizados são obtidos a partir de frações do petróleo destiladas, sendo classificadas segundo o número de carbono em suas moléculas. Assim, a gasolina apresenta de 4 a 12 átomos de carbono e óleos combustíveis, 14 ou mais átomos de carbonos em sua composição (GROYSMAN, 2014). Em trabalhos que visam avaliar os impactos de hidrocarbonetos do petróleo presente em uma dada amostra ambiental, o termo hidrocarbonetos do petróleo totais (HPT) é frequentemente utilizado. Os HPT correspondem a uma ampla família de centenas de compostos químicos que têm sua origem no petróleo bruto (PINEDO et al., 2013). A gasolina é uma mistura complexa, podendo apresentar mais de 230 hidrocarbonetos, sendo que sua composição irá variar de acordo com a origem do petróleo e o processo de refinamento adotado. Dentre os compostos presentes na gasolina, o grupo de hidrocarbonetos aromáticos conhecido como BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno) são os que apresentam maior risco ambiental, uma vez que são os mais solúveis em água (COUNCIL, 2003). Com o intuito de diminuir às emissões de monóxido de carbono para a atmosfera, é exigência no Brasil que a gasolina comercial apresente etanol em sua composição em uma faixa de 20 a 25%. Ainda, a adição de etanol aumenta a octanagem da gasolina, ou seja, sua resistência à detonação, o que melhora o desempenho deste combustível e diminui o degaste do motor. No entanto, dado a alta solubilidade do etanol em água, esta adição aumenta o impacto da contaminação por gasolina no caso de um vazamento, visto que aumenta a solubilidade dos hidrocarbonetos presentes na gasolina pelo fenômeno de co-solvência. O efeito de co-solvência é maior quanto maior a hidrofobicidade do composto (CORSEUIL; FERNANDES, 1999). Os hidrocarbonetos que apresentam cadeia com 1 a 4 carbonos são biodegradados por poucos e específicos micro-organismos; os com 5 a 9 carbonos apresentam alta toxicidade e são altamente voláteis. Hidrocarbonetos que possuem uma cadeia com mais de 22 átomos de carbono apresentam baixa toxicidade, porém possuem baixa solubilidade em água, estando presentes geralmente no estado sólido. Dentro da faixa de hidrocarbonetos do petróleo abordada neste estudo, os compostos 25 com 10 a 22 carbonos são os menos tóxicos e mais biodegradados (HUESEMANN, 1995). Segundo Baseiro-Romero et. al (2018) baseado em estimativas da Centre of European Comission, juntos, metais e hidrocarbonetos do petróleo perfazem aproximadamente 60% do total de contaminantes do solo. Segundo estas estimativas (PANAGOS et al., 2013), existem mais de 3,5 milhões de pontos de contaminação apenas na União Européia, sendo que mais da metade corresponde a contaminação por hidrocarbonetos do petróleo. 26 3 ÁREA DE ESTUDO No Brasil, os estudos sobre a concentração de arsênio são escassos e restritos a poucas áreas. Altas concentrações de arsênio no solo foram reportadas em Santana (AM, água subterrânea: 2000 µg L -1 ), no Quadrilátero Ferrífero (MG, água superficial: 350 µg L -1 ) e no Vale do Ribeira (SP/PR, sedimento: 355 µg L -1 ). Nestes locais, a ocorrência natural de rochas e solos com altos teores de arsênio foi aumentada por processos antrópicos (extração de minérios de ouro e manganês), acarretando em severa contaminação (FIGUEIREDO et al., 2007). 3.1 Vale do Ribeira (SP) A região do Vale do Ribeira (Figura 2) possui grande interesse em estudos com enfoque ambiental, visto que abriga em seu território remanescentes da Mata Atlântica e um importante reservatório de água doce, formando pelo Rio Ribeira do Iguape e afluentes. Figura 2. Mapa com a localização dos pontos de coleta georreferenciados. Fonte: Elaborado para este estudo. 27 Em torno de 500.000 habitantes, caracterizados principalmente por comunidades ribeirinhas e litorâneas, se distribuem em 32 municípios dos Estados de São Paulo e Paraná, na região que apresenta um dos mais baixos indicadores de renda e desenvolvimento humano do sudeste e sul do país. A economia da região se baseia em atividades agrícolas e de mineração. Até 1996, atividades de mineração e refino de metais estiveram presentes na região do Alto Vale do Ribeira. Após esta data, a empresa Plumbum (Adrianópolis, PR) e outras minas de Pb encerraram suas atividades (FIGUEIREDO et al., 2007). 3.1.1 Arsênio no Vale do Ribeira As elevadas concentrações de arsênio nos solos do Vale do Ribeira devem-se a fontes geogênicas e antrópicas, sendo que, no segundo caso, destaca-se a presença da mineração de Au, Zn e Pb, responsável pela liberação de arsênio como subproduto. Décadas de atividades de mineração sem preocupação ambiental contribuíram para a poluição dos solos da região. Concentrações de até 80 mg kg -1 de arsênio foram encontradas nos solos do bairro Serra, localizado no município de Iporanga (SP), em uma área em que no passado esteve presente atividades de mineração de Pb-Zn (Mina de Furnas) (FIGUEIREDO et al., 2007). Dentre a fonte geogênica, destacam-se os veios de quartzo contendo sulfetos de Au, Cu, Pb, Zn e As, e um escudo rochoso muito alterado que, em alguns pontos, apresenta 9% de arsênio. Na região do Córrego de Piririca, uma importante anomalia de elevada ocorrência natural de arsênio foi identificada, a jusante da área de mineração. Nesta região, apesar da elevada contaminação, a vegetação está ainda preservada. Esta área é pouco povoada e os habitantes não são dependentes da água subterrânea (CPRM, 1982 APUD FIGUEIREDO et al., 2007). A fonte primária de arsênio no Cinturão de Piririca é a arsenopirita. A partir da oxidação da arsenopirita e da galena, novos minerais são incorporados, como neominerais sulfofosfatos e sulfoarsenatos. Estes novos minerais possuem uma alta estabilidade, apesar de uma certa desestabilização já ser observada nos mesmos, dada a presença de arsênio em oxihidróxidos de Fe no local. Desta forma, enquanto as condições oxidantes estiverem presentes no meio, mesmo que ocorra desestabilização total desses neominerais, oxihidróxidos de Fe impedirão a liberação 28 de As para ambiente (ROSA, 1993). A pirita (FeS2) é formada em condições redutoras, podendo ter arsênio incorporado a sua estrutura durante a formação, dando origem à arsenopirita (FeAsS2). Este processo, explica a alta incidência de arsênio em ambientes redutores/anaeróbios, como lagos e oceanos (SMEDLEY; KINNIBURGH, 2002). O arsênio pode ser mobilizado do sedimento para a água com a ocorrência de dissolução oxidativa de sedimentos ricos em arsenopirita (MANDAL, 2002). Apesar das altas concentrações encontradas na região, os teores de arsênio nas águas superficiais só ultrapassaram ocasionalmente os valores de referência vigentes na legislação brasileira (10 µg L -1 ), visto que a formação de solos enriquecidos de Al e Fe em climas tropicais atua como uma barreira química que impede a mobilização de arsênio para água. Ainda, o grande volume de precipitação característico do clima da região favorece a diluição das concentrações de arsênio presentes na água potável (FIGUEIREDO et al., 2007). 29 4 MATERIAL E MÉTODOS Na figura 3, observa-se um esquema com a síntese dos parâmetros físico- químicos e microbiológicos considerados neste estudo, a serem detalhados neste capítulo. Figura 3. Esquema contendo a síntese dos parâmetros abordados no presente estudo. Fonte: Elaborado para este estudo. 30 4.1 Material Os principais acessórios, equipamentos e reagentes que serão utilizados neste projeto são: 1. Espectromêtro de fluorescência atômica com geração de hidretos (HG-AFS) (PS Analytical, modelo 10.055 Millennium Excalibur); 2. Espectromêtro de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES) (Thermo Scientific); 3. Agitador orbital (Hoeter Pharmacia Biotech – modelo PR70, EUA); 4. Balança analítica (Gehaka, Brasil); 5. Dispositivos DGT (DGT ResearchLimited, Reino Unido); 6. Gel de poliacrilamida (DGTResearch, Reino Unido); 7. Gel de ferrihidrita imobilizada em poliacrilamida (DGTResearch, Reino Unido); 8. Capela de Fluxo laminar (Marconi, Brasil); 9. Geladeira (Eletrolux, Brasil); 10. Medidor de pH e condutividade (Jenway – modelo 3505, Reino Unido); 11. Pipetas automáticas (Gilson, França); 12. Sistema de purificação de água Milli-Q resistividade 18,2 MΩ cm -1 (Millipore, EUA); 13. Espectrofotômetro ThermoFisher TM Nanodrop TM (Alemanha); 14. Kit de extração para DNA em solos DNeasy PowerSoil (Qiagen, Alemanha); 15. Fluorômetro Promega Quantus TM ; 16. Disruptor de tecidos TissueLyser II (Qiagen, Alemanha); 17. Termociclador PCR; 18. Bico de Bunsen; 19. Cuba horizontal de eletroforese; 20. Filtro de acetato de celulose (45 µm); 21. Mufla; 22. Estufa; 23. Centrífuga; 24. Vórtex; 31 25. Placa aquecedora; 26. Condensadores de bola, kitassato, bureta, termômetros e vidrarias de rotina de laboratório; 27. Dessecadores com sílica gel; 28. Bomba a vácuo; 29. Peneiras de 0,053 µm; 30. Reagentes, todos de grau analítico. 4.2 Representatividade do método de amostragem As amostras foram coletadas em duas campanhas, uma na estação seca (agosto/2017) e outra na estação chuvosa (fevereiro/2018) através do método stratified random sampling, em que uma área de amostragem é dividida em subáreas menores, considerando a heterogeneidade do local, buscando representar variedade de habitats e padrões de uso do solo. Desta forma, três áreas foram selecionadas para a coleta das amostras, tendo em vista os diferentes usos do solo da região, ao longo da margem do Rio Ribeira do Iguape, sendo uma inserida dentro de uma unidade de conservação, o Parque Estadual Turístico Alto do Ribeira (Figura 4, a e b), uma pertencente a área de mineração de Au, Zn e Pb (Figura 4, c e d) e um pertencente a área agrícola (Figura 4, e e f), onde também se insere uma área de ocorrência litogênica de As, a unidade geológica da Faixa do Piririca. Em agosto de 2018, uma nova campanha foi realizada, desta vez, para a coleta de um volume menor de amostra, destinados aos estudos de Biologia Molecular. 32 Figura 4. Locais de coleta: a e b) pontos inseridos dentro dos limites do PETAR; c e d) pontos localizados entre as cidades de Apiaí, Ribeira e Adrianápolis, próximos a antigas áreas de mineração; e e f) pontos localizados entre as cidades de Iporanga e Eldorado. Fonte: Elaborado para este estudo. Um total de 25 pontos de coleta foram amostrados somando todas as três áreas. Em cada um dos pontos amostrados, três sub-amostras, de 2 kg cada, foram coletadas na camada superficial do solo (0-20 cm), selecionadas por caminhamento aleatório em zigue-zague. O solo foi exposto e raízes maiores foram removidas com o auxílio de uma enxada (Figura 5). A partir de cada amostra composta coletada por ponto, uma pequena alíquota (aproximadamente 200g) foi retirada e armazenada 33 separadamente, dentro de uma caixa de isopor, sendo destinada aos testes de caracterização da qualidade do solo. Figura 5. Detalhe dos pontos de coleta dos solos superficiais. Fonte: Elaborado para este estudo. 4.3 Uso do solo Os pontos de coleta foram divididos em três categorias, conforme observações registradas em campo: rural, urbano e natural (cobertura vegetal). Os critérios adotados para classificar uma paisagem como rural, neste trabalho, foi predomínio de pastos ou áreas de cultivo (Pinus sp, eucalipto e banana) no local. Áreas urbanas foram consideradas como aquelas próximas a cidades, indústrias ou que a coleta foi realizada em uma estrada altamente urbanizada. Por sua vez, como área natural foram considerados os locais com predomínio de cobertura vegetal ou próximas à rios, principalmente localizados dentro do perímetro do PETAR. 4.4 Preparo das amostras de solo As amostras coletadas foram submetidas ao procedimento de catação para retirada de cascalhos, pedaços de raízes, folhas e macrofauna. Uma alíquota de 3 kg de cada amostra foi retirada e armazenada a -20 ºC, segundo recomendado na ISO 34 18400-206 (ISO, 2018), com intuito de minimizar alterações na comunidade microbiológica devidas a armazenamentos por longos períodos em condições diferentes das autóctones. O restante do solo não congelado foi destinado a caracterização física do solo (granulometria e capacidade de campo). Previamente ao peneiramento, as amostras de solo foram secas ao ar, a partir do espalhamento de todo conteúdo das amostras em bandejas plásticas de aproximadamente 60x40x15 cm, sendo possíveis torrões quebrados manualmente antes da secagem. As amostras foram então homogeneizadas, maceradas, quando necessário, e passadas por peneira de nylon de 2 mm, com o intuito de evitar uma possível contaminação por metais pelo uso de peneiras de ferro. Para se evitar a contaminação tanto biológica quanto química entre uma amostra e outra, o primeiro centímetro de solo peneirado foi descartado a cada peneiramento, conforme recomendado em EMBRAPA (1997). 4.5 Caracterização das amostras 4.5.1 Descontaminação dos materiais para análise de arsênio e metais Antes de sua utilização, todo material envolvido no preparo e acondicionamento de soluções, como vidrarias e tubos de centrífuga, bem como os dispositivos DGT, seringas e filtros membranas foram descontaminados por meio da imersão em HCl 20% (v v -1 ) por quatro horas e posterior lavagem com água deionizada (7 vezes) e água ultrapura (3 vezes). 4.5.2 Teor total de metais O método de digestão para a determinação do teor total de arsênio e outros elementos (Al, Fe e Mn) foi realizado segundo descrito em MCGRATH e CUNLIFFE (1985), com o intuito de obter-se a concentração de elementos correspondente a somatória das frações lábeis, na fase trocável, complexados com a matéria orgânica, óxidos, adsorvidos a argilominerais e precipitados. O método consistiu na digestão ácida do solo em sistema aberto a partir da adição de 2 mL de HNO3 concentrado (65%, v v -1 ) e 8 mL de HCl concentrado (35%, v v -1 ) ao frasco de vidro contendo 0,5 g de amostra previamente seca em estufa. O conteúdo foi deixado reagindo por um período 35 de duas horas, sendo então aquecido em placa de digestão com temperatura controlada entre 90-100 ºC. A digestão foi realizada até a evaporação da solução. Após o resfriamento, foram adicionados 12,5 mL de HCl 20% (v v -1 ) e a mistura foi reaquecida a 80 °C por 20 minutos. O digerido foi transferido quantitativamente para um tubo de centrífuga e avolumado para 50 mL. A determinação do teor total de Fe, Al, Mn e As foi realizada através da espectrometria de emissão atômica com plasma acoplado indutivamente (ICP OES). Para garantir a qualidade do método de digestão, foi realizada a digestão também para o padrão de amostra de solo certificado IAEA Soil-7 (PSZONICKI et al., 2000). Na tabela 1 são apresentadas as recuperações obtidas no procedimento de digestão. Tabela 1. Recuperações da digestões semi-totais Al (mg kg-1) Fe (mg kg-1) Mn (mg kg-1) As (mg kg-1) Valor de referência 47000 25700 631 13,4 Concentração obtida 34354 23731 630, 11,3 Recuperação (%) 73,1 92,3 99,9 83,5 4.5.3 Fator de enriquecimento A partir dos resultados do teor total de Al, Fe, Mn e As, obtidos por meio dos procedimentos descritos acima, o fator de enriquecimento (FE) foi calculado para cada amostras de solo. O FE é um indicador usado para avaliar a natureza e a intensidade da contaminação do solo superficial por elementos químicos. A concentração de um elemento no solo é normalizada em relação à concentração de um elemento de referência (ER), que deve ser estável no solo, i.e. não apresentar mobilidade vertical, sofrer degradação ou ter sua concentração alterada por contaminação antrópica. Além disto, o ER deve estar associado a partículas mais finas do solo. Os elementos mais utilizados em estudos são Al, Fe, Mn e Rb. O fator de enriquecimento é expresso da seguinte forma: !" #(%&%'()*/,-)/*'* (%&%'()* ,-⁄ )12*/)% (Equação 1) Sendo (analito/ER)solo = razão entre o analito e o ER no solo estudado 36 (analito/ER)crosta = razão entre o analito e o ER em valores de referência para a crosta ou tipo de litologia da região. Os elementos Mn e Fe foram selecionados como elementos de referência neste trabalho. Os valores do analito e dos elementos de referência na crosta foram obtidos a partir do Índice de Taylor (Taylor Index) (FRIEDMAN; O’NIEL, 1977). A interpretação dos valores diferem na literatura. Comumente, sugere-se que quando FE ≤ 1,5 a concentração do analito advém de processos naturais de intemperismo. Para valores FE > 1,5 assume-se que uma porção significativa do analito provém de outras fontes além da geogênica (BARBIERI, 2016). Para Sutherland (2000), valores de 1,5 ainda podem abranger analitos de origem litogênica, sendo que o autor sugere cinco categorias de enriquecimento em função do valor obtido: depleção ou origem litogênica (FE<2), enriquecimento moderado (2